DE4340129C1 - Verfahren zur Trennung von zellulären Hybriden durch Selektion mittels membrangebundener Marker - Google Patents

Description

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Trennung von durch Fusion von mindestens zwei Zelltypen ent­ standenen zellulären Hybriden durch Selektion mittels membran­ gebundener Marker.

Um agronomisch essentielle Zuchtziele in kultivierten Nutz­ pflanzen durchsetzen zu können, müssen ertrags- und qualitäts­ bestimmende sowie ertragssichernde Merkmale übertragen werden können. Hier gerät die klassische Züchtung oftmals an ihre Grenzen, wenn zu kreuzende Spezies sexuell inkompatibel oder deren interspezifische Hybride steril sind. Durch die Entwick­ lung der somatischen Zellfusion wurde eine in vitro-Technik nutzbar, die es ermöglicht, die genetische Variabilität von Wildarten für die Züchtung neuer, potenter Kultursorten zu nutzen.

Seit der Einführung der PEG-Induzierten Fusion nach Kao und Michayluk in "Planta" 115, Seiten 355 bis 367 (1974) und der Zellfusion im elektrischen Feld nach Zimmermann und Scheurich in "Planta" 151, Seiten 26 bis 32 (1981) ist es möglich, Mas­ senfusionen pflanzlicher Protoplasten durchzuführen. In den Fusionsansätzen befinden sich neben den erwünschten binären Heterokaryonten sowohl unfusionierte Protoplasten als auch Fusionsprodukte aus identischen Ausgangszellen. Die Selektion und Anreicherung der Hybride aus dem Fusionsansatz spielt eine sehr wichtige Rolle bei der weiteren Kultivierung putativ somatischer Fusionsprodukte.

Gleba in "Naturwissenschaften" 65, Seiten 158 bis 159 (1978) und Schweiger et al. in "TAG" 73, Seiten 769 bis 783 (1987) beschreiben die gezielte Fusion von zwei ausgewählten Einzel­ zellen in einem Mikrosystem. Dabei bedarf die Manipulation, die Fusion und die Kultivierung von Einzelzellen spezieller Apparaturen sowie ausgefeilter Kulturbedingungen, beispiels­ weise um die Austrocknung der Zellen zu verhindern oder eine Teilung der Fusionsprodukte zu stimulieren.

Ebenfalls bekannt ist, daß durch den Einsatz chloroplastenrei­ cher Mesophyll-Protoplasten in Kombination mit chloroplasten­ armen Suspensions- oder Hypokotyl-Protoplasten sich binäre Hybride leicht identifizieren lassen. Diese auf visueller Selektion beruhenden Methoden werden von Bates in "Planta" 165, Seiten 217 bis 224 (1985), Bates und Hasenkampf in "TAG" 70, Seiten 227 bis 233 (1985), Kao in "J. Plant Physiol." 126, Seiten 55 bis 58 (1986) , Kao in "MGG" 155, Seiten 225 bis 230 (1977), Kao und Michayluk in "Planta" 115, Seiten 355 bis 367 (1974), Kao und Saleem in "J. Plant Physiol." 122, Seiten 217 bis 225 (1986) sowie Tempelaar und Jones in "Plant Cell Re­ ports" 4, Seiten 92 bis 95 (1985) beschrieben.

Auch eine Trennung im iso-osmotischen Dichtegradienten wird vorgeschlagen. Nach Auftrennung der Ausgangszellen im ge­ schichteten Dichtegradienten und Fusion von Protoplasten un­ terschiedlicher Dichte können binäre Fusionsprodukte nach Dichtegradientenzentrifugation in einer intermediären Bande angereichert werden (Harms und Potrykus in "TAG" 53, Seiten 49 bis 55 und 57 bis 63 (1978) sowie Kamata und Nagata in "TAG" 75, Seiten 26 bis 29 (1987)).

Eine Modifizierung der iso-osmotischen Dichtegradienten in ein spezifisches Zwei-Komponenten-System zur Trennung der binären Fusionsprodukte schlagen Naton et al. in "Plant Cell Reports" 5, Seiten 419 bis 422 (1986) sowie Thomas und Rose in "Planta" 51, Seiten 396 bis 402 (1988) vor. Danach können durch Ver­ wendung von zu fusionierenden Ausgangszellen unterschiedlicher Dichte die Hybride nach der Fusion an der Phasengrenze des Systems entnommen werden. Dieses Verfahren ist auch unter dem Schlagwort Percoll-Floating bekannt.

Die Flow-Cytometry wird ebenfalls zur Trennung von Fusions­ produkten eingesetzt. Dabei können beispielsweise Mesophyll- Protoplasten (hohe Eigenfluoreszenz der Chloroplasten) mit cytoplasmatisch-fluoreszenzmarkierten Hypokotyl- oder Suspen­ sions-Protoplasten fusioniert und die Fusionsprodukte aus beiden Ausgangszellen über einen Durchflußzytometer angerei­ chert werden (Hammat et al. in "Plant Sci." 85, Seiten 215 bis 222 (1982), Redenbaugh et al. in "Z. Pflanzenphysiol." 107, Seiten 65 bis 80 (1982) sowie Radbruch in "Flow cytometry and cell sorting", Springer Verlag, Berlin 1992).

Die Methoden des Standes der Technik weisen jedoch nur limi­ tierte Einsatzmöglichkeiten auf. Sie sind im übrigen relativ aufwendig und teilweise mit sehr hohem Kostenaufwand verbun­ den. Auch die Zuverlässigkeit der Trennung ist nicht immer hinreichend gewährleistet. Auch die Vitalität der gereinigten Produkte ist oftmals reduziert.

Das der Erfindung zugrundeliegende technische Problem besteht darin, ein Verfahren anzugeben, mit dem es gelingt, die oben genannten Nachteile zu vermeiden.

Gelöst wird das der Erfindung zugrundeliegende Problem durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Patentanspruchs 1. Die sich daran anschließenden Unteransprüche betreffen bevorzugte Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht die Trennung von durch Fusion von mindestens zwei Zelltypen entstandenen zel­ lulären Hybriden durch Selektion mittels membrangebundener Marker. Zunächst werden die zu fusionierenden Zelltypen mit jeweils unterschiedlichen Markierungen versehen. Die zu fusio­ nierenden Zellen können durch mit der Zelloberfläche in Reak­ tion tretende Substanzen markiert werden. Als gleichbedeutend mit Markierungen, die nachträglich an den Zellen angebracht werden, sind auch Markierungen zu verstehen, die von vornher­ ein auf der Zelloberfläche vorhanden sind, sofern es typische Oberflächenmoleküle einer bestimmten Zellsorte sind, die hin­ reichend verschieden sind von entsprechenden Molekülen der jeweils anderen bei der Fusion teilnehmenden Zellsorte oder Zellsorten.

Als Substanzen, die die Plasmamembranen von zu fusionierenden Zellen markieren können, seien amin-reaktive Fluorophore, wie Fluorescein-isothiocyanat (FITC), carboxyfluorescein-N-hydro­ xysuccinimidester (FLUOS), Dichlorotriazinyl-aminofluorescein (DTAF), Iodoacetamido-tetramethylrhodamin (ITMR), Texas Red (TexR), Lissamin-rhodamin-B-sulfonyl-chlorid (LRB-SC), sub­ stituiertes Rhodamin-isothiocyanat (XRITC), Rhodamin-B-iso­ thiocyanat (RBITC), Lucifer Yellow VS (LY-VS), Carboxy-X-rho­ damin-N-hydroxysuccinimidester (RHODOS), Dansyl-chlorid sowie Scopoletin genannt. Auch aktivierte Biotin-Derivate, vorzugs­ weise Biotinamidocapronat-N-hydroxysuccinimdester, werden kovalent an freie Amino-Gruppen integraler Membranproteine oder Oberflächenproteine gekoppelt und sind als Markierungs­ reagenzien geeignet.

Es kommen auch aldehyd-reaktive Fluorophore in Betracht, wie Fluorescein-thiosemicarbazid (FTSC), Fluoresceinamin Isomer II (FA), Lucifer Yellow CH (LY-CH) und Texas Red-hydrazid (TRH). Diese Stoffe können dann zur Markierung verwendet werden, wenn die Zellen vorher mit Natriumperiodat oder Galactose-Oxidase vorbehandelt worden sind. Dabei entstehen durch Oxidation von Oberflächenkohlenhydraten Aldehydfunktionen, die dann mit dem Fluoreszenzfarbstoff kovalente Bindungen eingehen können.

Als weitere Markierungen für die unterschiedlichen Zelltypen kommen Phycobiliproteine (durch heterobifunktionelle Reagen­ zien aktiviert), wie R-Phycoerythrin, B-Phycoerythrin, C-Phy­ cocyanin sowie Allophycocyanin in Betracht. Markierungen kön­ nen auch mit Lektinen vorgenommen werden, die unter Umständen mit den weiter oben bereits genannten Markierungsreagenzien (Fluorophoren) umgesetzt wurden, wobei als Lektine RCA (Rici­ nus communis Agglutinin) und/oder APA (Abrus precatorius Ag­ glutinin) verwendet werden können. Die Membranen der einzelnen Zelltypen lassen sich auch mit Triglyceriden, Phospholipiden und Sphingolipiden markieren. Diese Lipide sind vorzugsweise mit den weiter oben genannten Substanzen (Fluorophoren) mar­ kiert. Als Beispiel seien FITC-Sphingosin oder N-{6[(7-Nitro­ benz-2-oxo-1,3-diazol-4-yl)-amino]-caproyl}-ceramid (NBD-ce­ ramid) genannt.

Nach der Markierung der Zellen wird die Zellfusion durchge­ führt. In etablierten Fusionssystemen werden dabei die Zellen miteinander fusioniert und gesammelt.

Die nach der Fusion erhaltene Probe, die im Falle von zwei fusionierten Zelltypen A und B im wesentlichen drei unter­ scheidbare Zelltypen (A, B, AB) enthält, wird dann mit einer Substanz versetzt, die mit einer der Markierungen, vorzugs­ weise kovalente Membranmarkierungen, der Zelltypen A oder B in eine hochaffine reversible Wechselwirkung treten kann. Diese Substanz (Affinitätsligand I) weist gleichzeitig eine weitere Stelle auf, die eine zweite spezifische Wechselwirkung einge­ hen kann. Diese zweite spezifische Wechselwirkung dient dazu, die gebildeten Komplexe aus zellulärem Hybrid mit spezifischer Markierung als auch nicht fusionierte Zellen mit derselben Markierung, die auf die erste affine Stelle des Affinitäts­ liganden I anspricht, reversibel temporär zu immobilisieren.

Vorzugsweise ist der Affinitätsligand I eine Substanz, die mit einer der Markierungen der Zellen in eine hochaffine Wechsel­ wirkung treten kann, ein Antikörper mit einer spezifischen Affinität gegen eine der oben genannten Markierungsstoffe mit weiterer Stelle, die eine reversible hochaffine Wechselwirkung eingehen kann, entweder die F_c-Region des Antikörpers selbst oder eine weitere Substanz, die mit dem Antikörper konjugiert ist (Sandwich), wie beispielsweise Biotin.

Die WO 90/07380 beschreibt die Verwendung von Magnetobeads zur Trennung biologischer Materialien in einem magnetischen Hoch­ gradienten-Feld. Vorzugsweise sind die Magnetobeads superpara­ magnetische Partikel, die gegebenenfalls mit Polysacchariden oder anderen, gewöhnlicherweise organischen Materialien, über­ zogen sind. Bezüglich weiterer Einzelheiten wird auf diese Publikation verwiesen. Vorzugsweise werden die Affinitätsli­ ganden mit den Magnetobeads konjugiert. Dabei werden vorteil­ hafterweise die entsprechenden mit Magnetobeads konjugierten Antikörper als Affinitätsligand verwendet. Es ist ebenfalls möglich, das Avidin mit den Magnetobeads zu konjugieren, zur Affinitätsreaktion mit Biotin markierten Zellen bzw. Zellhy­ briden.

Vorzugsweise sind die weiteren Substanzen, sofern die Affini­ tätsliganden nicht mit Magnetobeads konjugiert sind, die mit der weiteren Stelle des Affinitätsliganden in Wechselwirkung treten können, an einer festen Phase immobilisiert. So sind beispielsweise Substanzen, wie Protein A auf einer festen Phase immobilisiert, wobei das Protein A dann mit der F_c-Re­ gion des Antikörpers (als Affinitätsligand), der gegen die Zellmarkierung des einen Zelltyps gerichtet ist, in Wechsel­ wirkung treten kann. Somit ist es möglich, den Komplex aus fusionierten Zellen oder Zellen des einen Zelltyps, welche die entsprechende Markierung tragen, über den Antikörper an einer festen Phase temporär zu immobilisieren. Ähnliches gilt für Biotin markierte Zellen bzw. Zellhybride, die beispielsweise über ein entsprechend immobilisiertes Avidin ebenfalls an der festen Phase immobilisiert werden können.

Die immobilisierten Substanzen, die in der Lage sind, die ent­ sprechend markierten und mit Affinitätsliganden versehenen Zellen bzw. Zellhybride zu erkennen, sind vorzugsweise über einen sogenannten Spacer an die feste Phase gebunden. Diese Spacer sind Ketten vorzugsweise aus gesättigten Kohlenstoff­ atomen, die eine definierte Distanz zwischen der immobilisier­ ten Substanz und dem entsprechenden Träger gewährleisten. Einschlägige Reaktionen zur Immobilisierung von Substanzen auf Oberflächen sind dem Fachmann geläufig.

Im Falle der Verwendung von Magnetobead-markierten Affinitäts­ liganden, werden diese nach Reaktion mit den entsprechenden daran gebundenen Zelltypen und Zellhybriden in einem starken Feld eines Permanent- oder Elektromagneten zurückgehalten. Das starke Magnetfeld wird von außen einem Trennungsraum über­ lagert. In einem typischen Fall ist der Trennungsraum eine Chromatographie-Säule, in der sich die Probe befindet. Die Feldstärke, die das magnetische Feld aufweist, ist so gewählt, daß die Magnetobead-markierten Komplexe zurückgehalten werden. Dies ist typischerweise bei Feldstärken von 0,3 bis 0,9 Tesla, insbesondere 0,6 Tesla der Fall.

Die jeweils nicht affinitätsmarkierten Zelltypen der anderen Sorte, beispielsweise der Zellsorte B (wenn Antikörper gegen A eingesetzt werden) werden nicht retardiert, weder durch das magnetische Feld noch durch Immobilisierung an einer festen Phase, vermittelt über die weitere oben beschriebenen Sand­ wich-Strukturen, so daß durch geeignete Maßnahmen dieser Zell­ typ abgetrennt werden kann.

Dies kann in einfacher Weise z. B. dadurch geschehen, daß die an die feste Phase gebundene Substanzen, die mit dem Affini­ tätsliganden in Wechselwirkung treten können, beispielsweise in Form einer chromatographischen Säule vorliegen. Die das Zell­ gemisch enthaltende Probe wird dann über das Säulenmaterial gegossen, wobei die mit Affinitätsmarker des Zelltyps A ver­ sehenen Zellen (A, AB) zurückgehalten werden, wohingegen der Zelltyp B letzlich ungehindert die Säule passiert.

Es ist ebenfalls möglich, im sogenannten Batch-Verfahren zu arbeiten. Im Falle der Verwendung von Magnetobead-konjugierten Affinitätsliganden wird der Zellfusionsansatz über eine Säule, die sich im Feld eines Permanent- oder Elektromagneten befin­ det, gegeben. Dabei werden die affinitätsmarkierten Zellen, d. h. die entsprechende Ausgangszellenart, die Fusionsprodukte daraus und die binären Heterokaryonten ebenfalls zurückgehal­ ten, wohingegen anders markierte Zellen ausgewaschen werden.

Die Mobilisierung gemäß Stufe e) des erfindungsgemäßen Verfah­ rens erfolgt beispielsweise durch Zugabe von Puffersystemen, die in der Lage sind, die Affinitätsbindungen aufzuheben. Dazu kommen insbesondere Substanzen, wie chaotrope Ionen oder dena­ turierende Agenzien in Frage. Es kann ebenfalls ein pH-Shift zur Aufhebung der Affinitätsbindungen führen. Die bei Aufhe­ bung der Affinitätsbindung vom Festphasenträger abgelösten Zellen (Zellen ohne den Affinitätsliganden I) werden aufgefan­ gen und einer zweiten Trennungsoperation unterzogen. Dazu wird eine weitere Substanz (Affinitätsligand II) zugegeben. Diese Substanz tritt mit der Markierung des anderen Zelltyps, bei­ spielsweise Zelltyp B, in Wechselwirkung hoher Affinität. Auch dieser Affinitätsligand weist eine weitere Stelle auf, die eine zweite spezifische Wechselwirkung eingehen kann, welche zu einer reversiblen temporären Immobilisierung der gebildeten Komplexe aus Hybriden mit Markierungen für den zweiten Zelltyp (in diesem Falle Typ B) und dem Affinitätsliganden II führen kann. Zur Natur des Affinitätsliganden II gilt das weiter oben für den Affinitätsliganden I bereits beschriebene entspre­ chend. Durch diese Behandlung wird nun eindeutig das Hybrid aus Zelltyp A und B (AB) markiert, wohingegen der noch ver­ bliebene Zelltyp A auf die bereits oben näher beschriebene Weise abgetrennt werden kann.

Sollen beispielsweise ternäre Hybride abgetrennt werden, müßte ein zusätzlicher Schritt mit einem Affinitätsliganden III durchgeführt werden und so weiter.

Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt mithin die Abtrennung höchst komplexer Zellgemische durch ein mehrmaliges Durchlau­ fen der Verfahrensschritte c) bis e).

Das erfindungsgemäße Verfahren benutzt zur Immobilisierung des Komplexes aus Zelle, Affinitätsligand und zum Affinitätsligan­ den eine spezifische Affinität aufweisenden weiteren Substanz physikalische oder chemische Bindungen. Dabei werden Immunoaf­ finitätsbindungen zur Immobilisierung ausgenutzt. So kann der Affinitätsligand gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ein Antikörper sein, der eine hohe Affinität für eine Zell­ markierung aufweist und seinerseits mit einem für ihn hoch­ affinen Molekül in Wechselwirkung zu treten vermag. Dies ist insbesondere bei in der Immunaffinitätschromatographie gut bekannten Systeme Avidin/Biotin oder immobilisierten Protein A/Antikörper Substanzpaaren möglich. In besonders vorteilhaf­ ter Weise kann zur Trennung der Zellen bzw. Zellhybride ein magnetisches Feld eingesetzt werden. Erfindungsgemäß werden dabei die fusionierten, markierten Zelltypen zusammen mit den nicht fusionierten Zelltypen vorzugsweise über eine Chromato­ graphie-Säule gegeben. Während des Säulenlaufes wird das Feld Zelltypen vorzugsweise über eine Chromatographie-Säule gege­ ben. Während des Säulenlaufes wird das Feld eines Permanent- oder Elektromagneten angelegt, wodurch die mit den Magneto­ beads markierten fusionierten und nicht fusionierten Zelltypen zurückgehalten werden. Die nicht markierten Zelltypen passie­ ren die Säule, können aufgefangen und gegebenenfalls kulti­ viert werden. Die an der Säule durch das Feld eines Permanent- oder Elektromagneten temporär immobilisierten Zellen können nach Abschalten des Feldes eluiert werden. Die Fraktionen werden gesammelt und dann erneut der beschriebenen Trennung unterworfen, wobei jeweils die Fraktionen mit Affinitätsligan­ den korrespondierend zu der jeweils anderen Zellmarkierung eingesetzt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren gewährleistet in einfacher Weise die Selektion membranmarkierter Zellen insbesondere Hybride. Die Methoden der Membranmarkierung sind dem Fachmann bekannt und optimiert. Die Sortierungeffizienz und der Sortie­ rungsgrad sind sehr hoch und lassen sich in einfacher Weise durch den Fachmann an die jeweiligen Trennprobleme anpassen. Die Vitalität der eingesetzten Zellen in Relation zur Stabili­ tät der Zellen kann reproduzierbar gewährleistet werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet zum Einsatz bei Zell- und Gewebekulturen und nutzt in idealer Weise die Kombination von biochemischen und immunochemischen Methoden sowie ande­ rerseits der magnetischen Zellsortierung. Die Anwendungsgebie­ te sind praktisch auf allen Gebieten der Zellfusion zu finden, insbesondere betreffend pflanzlicher (haploid und oligoploid), tierischer, bakterieller und pilzlicher Zellsysteme.

Daraus ergeben sich die Vorteile des erfindungsgemäßen Ver­ fahrens, wozu seine universelle Anwendbarkeit gehört, bei relativ niedrigem Kostenaufwand. Vorteilhaft ist ebenfalls die hohe Geschwindigkeit, mit der sich die Zellsortierung durch­ führen läßt, insbesondere in automatisierter Form bei großen Zellzahlen. Die Selektion erfolgt unabhängig von morphologi­ schen oder anatomischen Gesichtspunkten, wobei die Vitalität der Zellen erhalten bleibt, bei einer hohen Sortierungseffi­ zienz < 95% sowie hohem Reinheitsgrad < 70%.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird anhand der folgenden Bei­ spiele näher erläutert. Pflanzliche Protoplasten werden dabei an ihrer Plasmamembran kovalent markiert. Nach der anschlie­ ßenden Massenfusion werden die Fusionsprodukte über die je­ weils gegen den Marker spezifischen Antikörper, die mit super­ paramagnetischen Mikrokügelchen konjugiert sind, nach zwei Säulenläufen magnetisch gebunden und anschließend eluiert.

Beispiel 1

Eine Protoplastenfraktion, die in herkömmlicher Weise herge­ stellt wurde, wird mit Biotinamidocapronat-N-hydroxysuccinimi­ dester durch 20 bis 30 minütige Inkubation markiert. Die ande­ re Protoplastencharge wird mit FITC markiert. Die Markierungs­ lösung besteht aus 171,15 g/l Saccharose, 0,145 g/l Calcium­ chlorid, 4,9 g/l Bicin in deionisiertem Wasser bei einem pH- Wert von 7,5 bis 9,5. Etwa 0,4 g der entsprechenden Markie­ rungssubstanz werden frisch hinzugefügt.

Beispiel 2

Die Protoplasten werden bei einer Dichte von 5 bis 7,5 × 10⁵ Protoplasten/ml 0,5 M Mannit-Lösung elektrisch fusioniert und gesammelt. Die Anzahl der zu erwartenden Fusionsprodukte ist stark abhängig von der Größe der eingesetzten Zellen sowie deren Stabilität. Die entsprechenden Fusionsparametersätze können für jedes neue System optimiert werden. Vor dem ersten Säulenlauf werden durch 15minütige Inkubation, Anti-FITC monoklonale Antikörper, konjugiert mit Magnetobeads, an die Protoplasten gebunden.

Beispiel 3

Der markierte Fusionsansatz wird über eine MACS-Säule, die mit Säulenpuffer äquilibriert worden ist, im permanent-magne­ tischen Feld gegeben. Der Säulenpuffer besteht aus 25 g/l Kaliumchlorid, 2 g/l Calciumchlorid, 5 g/l BSA, 100 ml/l Gly­ cerin und 0,6 g/l MES in deionisiertem Wasser bei einem pH- Wert von 5,6. Alle Fluoreszenz-markierten Zellen (die ent­ sprechende Ausgangszellenart, Fusionsprodukte daraus und binä­ re Heterokaryonten) werden zurückgehalten, wohingegen die Bio­ tin-markierten Protoplasten mit dem Säulenpuffer ausgewaschen werden. Daran schließt sich die erste Elution an: die Proto­ plasten werden im magnetischen Feld von den Anti-FITC monoklo­ nalen Antikörpern abgelöst. Die Entkopplung von Antikörper und Zellen findet durch einen pH-Sprung in den alkalischen Be­ reich, bevorzugt bei 11,5 bis 12,5 statt, woraufhin Antikör­ per-freie Protoplasten erhalten werden.

Es schließt sich ein zweiter Säulengang an. Zuvor wird der Antibiotin monoklonale Antikörper in oben beschriebenem Säu­ lenpuffersystem an die Protoplasten gebunden. Danach werden die markierten Protoplasten erneut im magnetischen Feld über eine MACS-Säule gegeben. Diesmal werden nur die binären Hete­ rokaryonten zurückgehalten.

Die zweite Elution kann dann durch Abschalten des magnetischen Feldes erfolgen. Die Hybride können mit Säulenpuffer eluiert oder durch Zentrifugation aus der Säule entfernt werden.

Claims (9)

1. Verfahren zur Trennung von durch Fusion von mindestens zwei Zelltypen entstandenen zellulären Hybriden durch Selektion mittels membrangebundener Marker, wobei

• a) die zu fusionierenden Zelltypen mit jeweils unter­ schiedlichen Markierungen versehen werden,
• b) die Zellfusion durchgeführt wird,
• c) die so erhaltene Probe mit Substanzen (Affinitäts­ liganden I) versetzt wird, die mit einer der Mar­ kierung der Zelltypen in eine hochaffine reversible Wechselwirkung treten können und diese Substanzen (Affinitätsliganden I) gleichzeitig eine weitere Stelle aufweisen, die eine zweite spezifische Wech­ selwirkung vermitteln kann, welche die gebildeten Komplexe aus zellulärem Hybrid mit Markierung und nicht fusionierten Zellen des einen Zelltyps mit derselben Markierung und der oben genannten Substanz reversibel temporär immobilisiert,
• d) die nicht immobilisierten anderen Zelltypen mit anderer Markierung und Fusionsprodukte dieser Zell­ typen abgetrennt werden, danach eine
• e) Mobilisierung der immobilisierten Komplexe erfolgt,
• f) gefolgt von der Zugabe einer weiteren Substanz (Af­ finitätsligand II), die aber mit der Markierung des anderen Zelltyps in eine Wechselwirkung hoher Affi­ nität eintreten kann und eine weitere Stelle auf­ weist, die eine zweite spezifische Wechselwirkung eingehen kann, welche zu einer reversiblen temporä­ ren Immobilisierung der gebildeten Komplexe aus Hybriden mit Markierungen für den zweiten Zelltyp und der oben genannten Substanz (Affinitätsligand II) führt, und
• g) Wiederholung des Schrittes d) unter Isolierung der so erhaltenen Probe, enthaltend die fusionierten Heterokaryonten, wobei die Schritte c) bis e) ge­ gebenenfalls wiederholt werden, bis ternäre Hybride etc. vorliegen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Markierung der zu fusionierenden Zelltypen durch chemische Reaktionen funk­ tioneller Gruppen der jeweiligen Zellmembranen mit ent­ sprechend aktiven Gruppen der Marker erfolgt, wobei die Markierung mit amin-reaktiven Fluorophoren, aktiviertem Biotin oder Biotin-Derivate, wie Biotinamidocapronat-N- hydroxysuccinimidester, aldehyd-reaktiven Fluorophoren, Phycobiliproteinen, Allophycocyaminen, (markierten) Lec­ tinen, markierten Triglyceriden, Phospholipiden sowie Sphingolipiden erfolgt.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und/oder 2, wobei die Substanz (Affinitätsligand), die mit den Markierungen der Zelltypen in eine hochaffine Wechselwirkung treten kann, ein Antikörper mit Affinität gegen die in Anspruch 2 genannten Stoffe ist und dessen weitere Stelle, die eine reversible hochaffine Wechselwirkung eingehen kann, entweder die F_c-Region des Antikörpers oder eine weitere Substanz ist, die mit dem Antikörper konjugiert ist, wie beispielsweise Biotin; oder Magnetobeads oder, falls die Markierung gemäß Anspruch 1 ein Biotinderivat ist, ein Avidin-Derivat oder -Konjugat oder Magnetobead markiertes Avidin ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die zur Immobilisierung führende Wechselwirkung eine chemische oder physikalische Bindung ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die chemische Bindung eine Immunoaffinitätsbindung ist und ausgebildet wird zwischen einer an einer festen Phase befindlichen, zu der Substanz (Affinitätsligand) mit hoher Affinität für die Zellmarkierung komplementären Struktur wie festphasen­ gebundenem Avidin/Biotin markiertem Zelltyp oder immobi­ lisiertem Protein-A/Antikörper (IgG) als Substanz (Affi­ nitätsligand), die mit der Zelltypmarkierung in Wechsel­ wirkung tritt.

6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die zur Immobilisierung führende physikalische Bindung durch ein Magnetfeld ver­ mittelt wird, wenn die mit den Zelltypmarkierungen in Wechselwirkung tretende Substanz (Affinitätsligand) mit Magnetobeads versehen worden ist.

7. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Verfahren in einer Säule oder im Batch durch­ geführt wird.

8. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei die fusionierten, markierten Zelltypen zusammen mit den nicht fusionierten Zelltypen über eine Säule gegeben werden,
wobei im Verfahren gemäß Anspruch 4 in der Säule eine feste Phase befindlich ist, die eine hochaffine Wechsel­ wirkung mit der Substanz (Affinitätsligand) eingehen kann, dauerhaft immobilisiert ist, wodurch die fusionier­ ten Zelltypen und nicht fusionierten Zelltypen der einen Sorte zurückgehalten werden, die Zelltypen der anderen Sorte aus der Säule gewaschen werden und danach die Affi­ nität zwischen Festphase, Substanz (Affinitätsligand) mit Affinität zur Zellmarkierung und/oder der Substanz (Affi­ nitätsligand) mit hoher Affinität zur Zellmarkierung und der markierten Zelle aufgehoben wird,
und im Falle des Anspruchs 6 während des Säulenlaufes das Feld eines Permanent- oder Elektromagneten angelegt wird, wodurch die mit den Magnetobeads markierten fusionierten und nicht fusionierten Zelltypen zurückgehalten werden, wohingegen die nicht markierten Zelltypen die Säule pas­ sieren, gefolgt von einer Elution aus dem magnetischen Feld und Sammeln der dann eluierten Fraktion, welche einem zweiten oder je nach Anzahl der verschiedenen fu­ sionierten Zelltypen entsprechenden weiteren Trennungs­ operation unterzogen wird, wobei die jeweils andere Zell­ markierung spezifisch als Affinitätsträger angesprochen wird, gefolgt von weiteren Elutionen unter Aufhebung der Affinitätsbindung.

9. Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei als Zellen pflanzliche (haploide und/oder oligo­ ploide), tierische, bakterielle und/oder pilzliche Zell­ systeme fusioniert werden.