DE3530870C2

DE3530870C2 -

Info

Publication number: DE3530870C2
Application number: DE19853530870
Authority: DE
Inventors: Hermann J. Dr. 7900 Ulm De Wolter
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1985-08-28
Filing date: 1985-08-28
Publication date: 1987-12-17
Also published as: WO1987001459A1; DE3530870A1; EP0267918A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von reinen Rezeptorkomponenten und an Trägermaterial über Antikörper gebundenen Liganden.

Eine biochemische, sowie licht- und elektronenmikroskopische Darstellung von spezifischen Rezeptoren gelingt bisher nur durch Inkubation des biologischen Materials (Gewebe, Zellen, Zellbestandteile, Zellinhaltsstoffe) mit radioaktiv markierten (³H, ¹²⁵J) Liganden oder mit Liganden, die zuvor mit einem fluorezierenden Stoff (z. B. Fluoreszin-isothiocyanat) oder einem Enzym (z. B. Peroxidase) markiert wurden. Diese Verfahren erlauben jedoch lediglich den physiologischen bzw. licht- und elektronenmikroskopischen Nachweis von spezifischen Rezeptoren an biologischen Materialien, nicht jedoch die Extraktion des spezifisch Rezeptor-Ligand-markierten Materials aus einem Gemisch bestehend aus heterogenen biologischen Materialien. Außerdem sind im Umgang mit radioaktiv-markierten Substanzen strenge Sicherheitsvorschriften zu befolgen.

R. Maneckjee et. al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 594-598, 1985) berichten über ein Verfahren zur Reinigung von Rezeptoren mittels Affinitätschromatographie. Die Affinitätschromatographie (AC) ist ein säulenchromatographisches Verfahren und beruht auf der reversiblen und biospezifischen Wechselwirkung zwischen den funktionellen Gruppen des zu bindenden Proteins und denen eines meist niedermolekularen Liganden, der an einen unlöslichen inerten Träger kovalent gebunden ist. Die Ablösung des Proteins von seinem Liganden kann entweder durch Änderung des pH oder der Ionenstärke oder durch Zugabe eines kompetitiven Inhibitors zur Elutionslösung erfolgen. Maneckjee et. al. setzten dabei einen synthetischen Ligand ein, der an ein festes Trägermaterial gebunden ist. Das solubilisierte Rezeptor-Protein tritt dabei in Wechselwirkung mit dem synthetischen Ligand und kann so aus der Lösung entfernt werden.

Da bspw. die exakte Struktur und Rezeptorbindungsstellen der synthetischen Liganden oft unzureichend bekannt sind und die Verknüpfungsprozedur dieser Liganden mit dem festen Trägermaterial die Bindungsfähigkeit der Liganden zu ihren Rezeptoren mindern kann, ist eine Reindarstellung von spezifischen Rezeptor-Komponenten erschwert.

Y. AIDA und K. ONOUE (J. Biochem. 95, 1055-1065, 1984) beschreiben eine affinitätschromatographische Isolierung von Rezeptoren, bei der ein trägergebundener spezifischer Antikörper mit dem zu isolierenden Rezeptor in Wechselwirkung tritt.

T. M. Cho et. al. (Life Sciences 36, 1075-1085, 1985) berichten über ein Verfahren zum Isolieren und Reinigen von Morphin-Rezeptoren durch Affinitätschromatographie gegenüber einem 6-succinyl-Morphin modifizierten Trägermaterial. Es liegt hier wiederum eine Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung mit den zuvor beschriebenen Nachteilen vor.

M. G. Caron et. al. (Adv. Biochem. Psychopharmacol. 21, 151-158, 1980) beschrieben ein weiteres affinitätschromatographisches Verfahren bei dem ein immobilisierter Ligand mit einem solubilisierten Rezeptor in Wechselwirkung tritt. Der anschließend abgelöste Rezeptor wird zur Charakterisierung von Antikörpern herangezogen.

N. H. Wassermann et. al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4810-4814, 1982) berichten über Wechselwirkungen zwischen Rezeptoren und Antiligand bzw. Antiligand-Antikörpern.

A. D. Strosberg et. al. (Recept. Biochem. Methodol. 4, 151-162, 1984) geben eine Übersicht über die Wechselwirkungen zwischen Rezeptor, Ligand, Ligandantikörper I und Ligandantikörper II. Dabei wird vorgeschlagen, zur Reinigung von Rezeptoren entweder Rezeptor-Antikörper (anti-R) oder Ligand-Antikörper II einzusetzen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren der eingangs genannten Art zu schaffen, wobei die zuvor geschilderten Nachteile überwunden werden sollen.

Die Aufgabe wird durch die im Kennzeichen des Anspruchs 1 vorgeschlagenen Verfahrensschritte gelöst.

Weitere vorteilhafte Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Verfahrens sind den Unteransprüchen zu entnehmen.

Die Erfindung wird nachfolgend beschrieben. Die Zeichnung enthält einen schematischen Ablauf eines bevorzugten Ausführungsbeispiels eines erfindungsgemäßen Verfahrens.

Gewebe, Zellen, Zellbestandteile und Zellinhaltsstoffe (biologisches Material), die entweder intakt oder vorbehandelt (z. B. homogenisiert) wurden, werden mit einem Ligandbindungspuffer (LBP) inkubiert zu Bedingungen, die eine maximale Ablösung des gebundenen Liganden von seinem Rezeptor bewirkt. Das biologische Material weist danach ausschließlich nicht-Ligand-gebundene, freie Rezeptoren auf. Da das biologische Material auch den endogenen, nicht-Rezeptor-gebundenen "Liganden" enthalten kann, wird dieses mit einem Antikörper (AK I) - der mono- oder polyklonal sein kann - inkubiert, der spezifisch den endogenen, nicht-Rezeptor-gebundenen "Liganden" erkennt und bindet.

Danach wird das biologische Material mit einem Antikörper (AK II) - der mono- oder polyklonal sein kann - inkubiert, der spezifisch den AK I erkennt und bindet. Der endogene, native "Ligand" ist somit blockiert und dadurch von allen nachfolgenden Schritten ausgeschlossen. Sowohl die Inkubation des biologischen Materials mit dem AK I als auch mit dem AK II sind unter solchen Bedingungen (z. B. Pufferwahl, Inkubationszeit- und -temperatur) auszuführen, die eine maximale Antigen-Antikörper-Bindung ermöglichen. Da viele biologische Materialien keinen endogenen, nativen "Liganden" enthalten und nur Rezeptoren für die Bindung von Liganden aufweisen, kann die Inkubation des biologischen Materials mit dem AK I und AK II entfallen.

Das biologische Material mit seinen freien Rezeptoren wird nun inkubiert mit einem spezifischen Liganden zu Bedingungen, die eine maximale, spezifische Bindung des Liganden an seinen Rezeptor ermöglicht. Danach wird das biologische Material mit einem Antikörper (AK I) inkubiert zu Bindungen, die eine maximale, spezifische Bindung des AK I an den rezeptorgebundenen Liganden ermöglicht. Das hieraus resultierende biologische Material wird als "Rezeptor-Ligand-Ligandantikörper (RRL)-markiertes biologisches Material" bezeichnet. Dieses biologische Material kann nun aus einem Gemisch von heterogenen biologischen Materialien (RLL-markiertes und unmarkierte biologische Materialien sind gemischt) spezifisch und rein dargestellt werden, indem ein Affinitätsmaterial bzw. Trägermaterial, das mit einem spezifischen Antikörper (AK II) - der mono- oder polyklonal sein kann - verknüpft ist, und der spezifisch den Rezeptor- Ligand-gebundenen AK I erkennt und bindet, inkubiert wird zu Bedingungen, die eine maximale, spezifische Bindung des AK II an AK I ermöglicht. Danach wird das nicht-RLL-markierte, nicht-Affinitätsmaterial-gebundene, biologische Material vom RLL-markierten, AK II -Affinitätsmaterial-gebundenen biologischen Material getrennt, indem das Gemisch (freies und gebundenes biologisches Material) mit einem Puffer gewaschen wird, der die AK I-AK II-Bindung nicht löst. Hieraus resultiert reines, RLL-markiertes biologisches Material, das über den AK II mit dem Affinitätsmaterial verbunden ist. Dieses biologische Material - das die Rezeptorkomponenten enthält - wird von seinem Liganden wieder gelöst, indem das Affinitätsmaterial mit einem Ligandbindungspuffer inkubiert wird, der eine maximale Ablösung des Liganden von seinem spezifischen Rezeptor bewirkt. Die Inkubationsbedingungen hierzu sind so zu wählen, daß eine maximale Ablösung des Liganden von seinem Rezeptor erfolgt. Im Eluat befindet sich jetzt das rein dargestellte biologische Material, das, wenn homogenisiertes Ausgangsmaterial verwendet wurde, rein dargestellte spezifische Rezeptorkomponenten enthält. Sowohl das rein dargestellte biologische Material als auch die rein dargestellten Rezeptorkomponenten können zur Herstellung von spezifischen mono- oder polyklonalen Antikörpern, die spezifisch gegen diese biologischen Materialien und Rezeptorkomponenten gerichtet sind und diese spezifisch erkennen und binden, verwendet werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von reinen Rezeptorkomponenten und an an Trägermaterial über Antikörper gebundenen Liganden, gekennzeichnet durch:

a) Inkubation von rezeptorhaltigem biologischem Material mit einem Liganden
b) Zugabe eines für den Liganden spezifischen Antikörpers (I) und weitere Inkubation
c) Zugabe eines für den Antikörper (I) spezifischen, an ein Trägermaterial gebundenen Antikörpers (II) und weitere Inkubation sowie Isolation der Rezeptor-Liganden-Antikörper(I)- Antikörper(II)-Träger-Verbindung, und
d) Auftrennung der Rezeptor-Liganden-Bindung in an sich bekannter Weise.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß vor Durchführung der Verfahrensschritte a) bis d):
ein ligandenfreie Rezeptoren aufweisendes biologisches Material mit Antikörper (I), der im biologischen Material vorliegende nicht-rezeptorgebundene Liganden spezifisch erkennt und bindet, inkubiert wird und daß das mit Antikörper (I) behandelte biologische Material mit Antikörper (II), der den Antikörper (I) spezifisch erkennt und bindet, inkubiert wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß vor Durchführung der Verfahrensschritte nach Anspruch 2:
ein biologisches, teilweise mit Liganden besetzte Rezeptoren aufweisendes Material in an sich bekannten Weise mit einem Puffer, der die Ablösung des endogenen Liganden von seinem Rezeptor bewirkt, unter Entfernung des Liganden von den Rezeptoren behandelt wird.

4. Verwendung des Verfahrens gemäß einem der vorangehenden Ansprüche zur Herstellung von über Antikörper (I) und Antikörper (II) an Trägermaterial gebundenen Liganden.