DE3530870A1 - Verfahren zur herstellung von spezifisch rezeptor-ligand-ligandantikoerper (rll)- markierten geweben, zellen, zellbestandteilen und zellstoffen (biologisches material) und dessen reindarstellung - Google Patents

Verfahren zur herstellung von spezifisch rezeptor-ligand-ligandantikoerper (rll)- markierten geweben, zellen, zellbestandteilen und zellstoffen (biologisches material) und dessen reindarstellung

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Description

Die biochemische sowie licht- und elektronenmikroskopische Darstellung von spezifischen Rezeptoren gelingt bisher nur durch Inkubation des biologischen Materials (Gewebe, Zellen, Zellbestandteile, Zellinhaltsstoffe) mit radioaktiv mar­ kierten (3H, 125 J) Liganden oder mit Liganden, die zuvor mit einem fluoreszierenden Stoff (z. B. Fluoreszein-isothiocyanat) oder einem Enzym (z. B. Peroxidase) markiert wurden. Diese Verfahren erlauben jedoch lediglich den physiologischen bzw. licht- und elektronenmikroskopischen Nachweis von spezifischen Rezeptoren an biologischen Materialien, nicht jedoch die Extraktion des spezifisch Rezeptor-Ligand-markierten Materials aus einem Gemisch bestehend aus heterogenen biologischen Materialien. Außerdem sind im Umgang mit radioaktiv-markier­ ten Substanzen strenge Sicherheitsvorschriften zu befolgen, die bei der hier vorgestellten Methode gänzlich entfallen.
Die hiermit geltend gemachten Patentansprüche ergeben sich aus folgender Beschreibung:
  • Gewebe, Zellen, Zellbestandteile und Zellinhaltsstoffe (biologisches Material), die entweder intakt oder vorbe­ handelt (z. B. homogenisiert) wurden, werden mit einem Ligandbindungspuffer inkubiert zu Bedingungen, die eine maximale Ablösung des gebundenen Liganden von seinem Re­ zeptor bewirkt. Das biologische Material weist danach ausschließlich nicht-Ligand-gebundene, freie Rezeptoren auf. Da das biologische Material auch den endogenen, nicht-Rezeptor-gebundenen "Liganden" enthalten kann, wird dieses mit einem Antikörper (AK I) - der mono- oder poly­ klonal sein kann - inkubiert, der spezifisch den endogenen, nicht-Rezeptor-gebundenen "Liganden" erkennt und bindet.
Danach wird das biologische Material mit einem Antikörper (AK II) - der mono- oder polyklonal sein kann - inkubiert, der spezifisch den AK I erkennt und bindet. Der endogene, native "Ligand" ist somit blockiert und dadurch von allen nachfolgenden Schritten ausgeschlossen. Sowohl die Inku­ bation des biologischen Materials mit dem AK I als auch mit dem AK II sind unter solchen Bedingungen (z. B. Puffer­ wahl, Inkubationszeit- und temperatur) auszuführen, die eine maximale Antigen-Antikörper-Bindung ermöglichen. Da viele biologische Materialien keinen endogenen, nativen "Liganden" enthalten und nur Rezeptoren für die Bindung von Liganden aufweisen, kann die Inkubation des biologischen Materials mit dem AK I und AK II entfallen.
Das biologische Material mit seinen freien Rezeptoren wird nun inkubiert mit einem spezifischen Liganden zu Be­ dingungen, die eine maximale, spezifische Bindung des Liganden an seinen Rezeptor ermöglicht. Danach wird das biologische Material mit einem Antikörper (AK I) inkubiert zu Bedingungen, die eine maximale, spezifische Bindung des AK I an den rezeptorgebundenen Liganden ermöglicht. Das hieraus resultierende biologische Material wird als "Re­ zeptor-Ligand-Ligandantikörper (RLL)-markiertes biologisches Material" bezeichnet. Dieses biologische Material kann nun aus einem Gemisch von heterogenen biologischen Materialien (RLL-markiertes und unmarkiertes biologische Materialien sind gemischt) spezifisch und rein dargstellt werden, in­ dem ein Affinitätsmaterial, das mit einem spezifischen Antikörper (AK III) - der mono- oder polyklonal sein kann - verknüpft ist, und der spezifisch den Rezeptor-Ligand-ge­ bundenen AK I erkennt und bindet, inkubiert wird zu Be­ dingungen, die eine maximale, spezifische Bindung des AK III an AK I ermöglicht. Danach wird das nicht-RLL-markierte, nicht-Affinitätsmaterial-gebundene, biologische Material vom RLL-markierten, AK III-Affinitätsmaterial-gebundenen biologischen Material getrennt, indem das Gemisch (freies und gebundenes biologisches Material) mit einem Puffer ge­ waschen wird, der die AK I-AK II-Bindung nicht löst. Hieraus resultiert reines, RLL-markiertes biologisches Material, das über dem AK III mit dem Affinitätsmaterial verbunden ist. Dieses biologische Material - das die Rezeptorkomponenten enthält - wird von seinem Liganden wieder gelöst, indem das Affinitätsmaterial mit einem Ligandbindungspuffer inkubiert wird, der eine maximale Ablösung des Liganden von seinem spezifischen Rezeptor bewirkt. Die Inkubationsbedingungen hierzu sind so zu wählen, daß eine maximale Ablösung des Liganden von seinem Rezeptor erfolgt. Im Eluat befindet sich jetzt das rein dargestellte biologische Material, das, wenn homogenisiertes Ausgangsmaterial verwendet wurde, rein dargestellte spezifische Rezeptorkomponenten enthält. Sowohl das rein dargestellte biologische Material als auch die rein dargestellten Rezeptorkomponenten können zur Herstellung von spezifischen mono- oder polyklonalen Antikörpern, die spezifisch gegen diese biologischen Materialien und Rezeptorkomponenten gerichtet sind und diese spezifisch erkennen und binden, verwendet werden.

Claims (2)

1. Verfahren zur Herstellung von spezifisch Rezeptor- Ligand-Ligandantikörper (RLL)-markierten Geweben, Zellen, Zellbestandteilen und Zellstoffen (biologisches Material) und dessen Reindarstellung, gekennzeichnet durch folgende Stufen:
  • a) Inkubation des biologischen Materials mit einem Anti­ körper (AK I), der spezifisch den Liganden erkennt und bindet,
  • b) Inkubation des biologischen Materials mit einem Anti­ körper (AK II), der spezifisch den AK I erkennt und bindet,
  • c) Inkubation des biologischen Materials mit einem Liganden, der von dem AK I spezifich erkannt und gebunden wird,
  • d) Wiederholung der Stufe (a),
  • e) Inkubation des RLL-markierten biologischen Materials mit einem Affinitätsmaterial, das mit einem Antikörper (AK III) verknüpft ist, der spezifisch den Rezeptor-Ligand-ge­ bundenen Antikörper (AK II) erkennt und bindet,
  • f) Trennung der Rezeptorkomponenten vom Affinitätsmaterial - AK III - AK II - gebundenen Liganden.
2. Abwandlung des Anspruchs aus (1) dahingehend, daß Stufe (a) und (b) entfallen.
DE19853530870 1985-08-28 1985-08-28 Verfahren zur herstellung von spezifisch rezeptor-ligand-ligandantikoerper (rll)- markierten geweben, zellen, zellbestandteilen und zellstoffen (biologisches material) und dessen reindarstellung Granted DE3530870A1 (de)

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