DE2920289A1 - Festphasen-untersuchungsverfahren - Google Patents

Festphasen-untersuchungsverfahren

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DE2920289A1
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Description

DR.-ING. DIPL.-tNQ Μ.5Γ. DIPL-PHYS. DH. DIPI PHYS. D(PL-PHYS DR
HÖGER - STELLRECHT - GRIESSBACH - HAECKER BOEHME
PATENTANWÄLTE IN STUTTGART
A 43 544 b Anmelder: Becton Dickinson and Company
UO - 168 Mack Centre Drive
17. Mai 1979 Paramus, N.J. 07652
USA
Beschreibung Festphasen-Untersuchungsverfahren
Die Erfindung betrifft ein Festphasen-Untersuchungsverfahren nach dem Oberbegriff des Hauptanspruchs.
Bei herkömmlichen Festphasen-Untersuchungsverfahren, die mit konkurrierender Bindung der quantitativ zu bestimmenden Spezies arbeiten, wird üblicherweise ein Antigen oder Hapten verwendet, welches an einen bestimmten Protein-Rezeptor gebunden wird. Das Verfahren benutzt eine Konkurrenzreaktion zwischen der zu untersuchenden Spezies bzw. dem Liganden (der nachfolgend allgemein als Analyt bezeichnet wird) und einer isotopisch markierten Form hiervon. Die Konkurrenzreaktion geht dabei um eine beschränkte Anzahl von Bindungsplätzen eines Rezeptors, der an einen festen Träger .gebunden ist. Die Moleküle der isptopisch markierten Form wetteifern mit denen der nichtmarkierten Form auf im wesentlichen gleicher Basis um die Rezeptorplätze. Aufgrund der Markierung können die beigemischten Moleküle unterschieden werden. Die isotopische~ Markierung ist nicht entscheidend; andere Markierungsformen können dazu verwendet werden, das Schicksal der beigemischten Moleküle zu verfolgen. Wenn das Tracer-Verhältnis, d.h. das Verhältnis der markierten Form zur unmarkierten Form in der Mischung aus dem Analyten und dem markierten Analyten wächst, dann wächst auch die Aufnahme des Tracers durch den Rezeptor.
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Wenn somit beispielsweise eine bestimmte Menge einer markierten Form eines Haptens oder Antigens mit wiederum verschiedenen bekannten Mengen des natürlichen, nichtmar- v. kierten Haptens oder Antigens vermischt wird, und wenn die Mischungen jeweils mit einer bestimmten Rezeptormenge, die an einen festen Träger gebunden ist, stehengelassen wird, stellt sich heraus, daß die prozentuale Aufnahme des markierten Haptens oder Antigens durch den Rezeptor umgekehrt mit der Menge des nichtmarkierten Haptens oder Antigens , das ursprünglich in der Mischung vorlag, variiert. Wenn bei jeder Inkubation das ungebundene Hapten oder Antigen von dem an den Rezeptor gebundenen Hapten oder Antigen getrennt wird, kann die Menge der markierten Komponente in einer oder beiden Fraktionen bestimmt und eine Eichkurve konstruiert werden.
Danach kann eine Untersuchung dadurch ausgeführt werden, daß eine bestimmte Probe des Haptens oder Antigens mit einer bekannten Menge der markierten Form vermischt wird, worauf die Mischung mit der bekannten Menge des Rezeptors stehengelassen (inkubiert) wird. Hiernach wird das nichtgebundene Hapten oder Antigen vom gebundenen Hapten oder Antigen abgetrennt und die Menge der markierten Komponente in einer oder beiden Fraktionen bestimmt. Unter Bezugnahme auf die Eichkurve erfolgt eine Korrelation der bestimmten Menge der markierten Komponente mit der Menge des Haptens oder Antigens in der ursprünglichen Probe.
Die vorliegende Erfindung befaßt sich mit einer Festphasen-Untersuchung, die eine Modifikation der bisher verwendeten Verfahren darstellt. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren der eingangs genannten Art anzugeben, wel-
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ches insbesondere bei Anwendung auf Antigene oder Haptene eine größere Empfindlichkeit erzielen kann.
Diese Aufgabe wird durch die im Kennzeichen des Hauptanspruchs beschriebene Erfindung gelöst; vorteilhafte Weiterbildungen sind in den Unteransprüchen angegeben.
Erfindungsgemäß werden somit Probe und Tracer nicht miteinander vermischt und nicht zusammen mit dem Rezeptor in Berührung gebracht. Statt dessen erfolgt die Berührung aufeinanderfolgend, wobei zunächst die Probe und danach der Tracer den spezifischen Rezeptor berühren. Abgesehen von diesem Unterschied in der Berührungsart ist die vorliegende Üntersuchungsart im wesentlichen ähnlich bekannten Untersuchungsverfahren. Die Menge des gebundenen und/oder ungebundenen Tracers wird bestimmt; aus dieser Bestimmung wird der Analyt-Gehalt in der Probe, beispielsweise durch Bezugnahme auf eine Eichkurve, ermittelt.
Der Analyt ist üblicherweise ein biologischer Ligand und befindet sich beispielsweise in einer biologischen Flüssigkeit. Die Erfindung ist besonders zur Untersuchung von Ana-Iyten in Serum und anderen Flüssigkeiten geeignet, wo ihre größere Empfindlichkeit von Vorteil ist.
Geeignete Analyten sind beispielsweise: ein Antigen, d.h. eine Substanz, die zur Ausbildung eines für das Antigen spezifischen Antikörpers führt, wenn sie in den Blutstrom eines Wirbeltieres gebracht wird; ein Hapten, d.h. eine Substanz, die zur Ausbildung eines für das Hapten spezifischen Antikörpers führt, wenn sie an einen Antigenträger gebunden und in den Blutstrom eines Wirbeltieres gebracht wird; andere
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Liganden, die natürlich auftretende, spezifische Rezeptoren besitzen und die ebenfalls als Hapten wirken können, wenn sie an ein Protein gebunden sind.
Analyte, auf welche die vorliegende Erfindung anwendbar ist, sind ferner beispielsweise Proteine und andere Peptide, Sacharide, Nukleotide, Nukleoside, Steroide und Derivate derartiger Verbindungen. Repräsentative Beispiele derartiger Analyten sind: ACTH, Oxytocin, luteinisierendes Hormon, Insulin, Proinsulin, Bence-Jones-Protein, chorionisches Gonadotropin, Hypophysenhinterlappen-Gonadotropin, Wachstumshormon, Rennin, Thyroxin-bindendes Globulin, Bradykinin, Angiotensin, Follikel-stimulierendes Hormon, zyklisches AMP, Cholyl-Glycin (glycocholische Säure), zyklisches CMP, Östrogene, Gestrogene, Androgene, adrenocortische Steroidhormone, Gallensäure, kardiotonische Glycoside, Aglycone und Saponine. Als weitere Beispiele können erwähnt werden: Thyroxin, Triiodothyronin, Testosteron, Adrosteron, Equilenin, östron, östriol, Progesteron, Prägnenolon, 17-Hydroxydxoxycorticosteron (Verbindung S) , Deoxycorticosteron, Cortison, Corticosteron, Cortisol, Aldosteron, Digoxin, Digitoxin; Vitamine, beispielsweise Vitamin A, Folsäure, die Gruppe der B-Vitamine, Vitamin C, die D-Vitamine und die Vitamine E und K; verschiedene Liganden, beispielsweise die Antigene für Virus Hepatitis A xind B, Rubella, Herpes Simplex oder & -Fötoprotein oder carcinoembrionisches Antigen.
Die oben erwähnten Substanzen sind nur repräsentativ. Es versteht sich, daß diese Substanzen als Analoge verwendet werden können.
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Der Tracer ist der Analyt bzw. ein geeignetes Analog hiervon mit einer Radiomarkierung oder einer anderen Markierung, bei der es sich beispielsweise um ein Enzym oder um eine Fluoreszenzgruppe handeln kann. Die Verwendung derartiger Markierungen und die Verfahren zur Herstellung eines Tracers, der eine radioisotopische Markierung oder eine andere Markierung enthält, sind bekannt. Diesbezüglich werden zum vollständigen Verständnis der vorliegenden Erfindung keine weiteren Einzelheiten benötigt. Der bevorzugte Tracer ist radiomarkiert; bei bekannten Radiountersuchungen ist das radioaktive Isotop im allgemeinen Tritium oder ein Radioisotop von Iod. Als besonderes Beispiel kann radioiodinisiertes Thyroxin als Tracer für Thyroxin verwendet werden. Der Tracer wird üblicherweise als Lösung in einem Puffer verwendet.
Der Rezeptor für den Analyten kann ein natürlich auftretender Rezeptor sein, beispielsweise kann er für ein Antigen oder Hapten der entsprechende Antikörper sein. In einigen Fällen ist der Analyt ein Antikörper, wobei dann der Rezeptor das entsprechende Antigen ist. Der Tracer ist dann eine markierte Form des Antikörpers.
Der Rezeptor ist an einen festen Träger, der als Substrat für eine derartige Untersuchung geeignet ist, gebunden. Derartige Trägermaterialien enthalten Polymere, beispielsweise Polystyrol, Polyäthylen, Polypropylen, Polytetrafluoräthylen, Polyamide, Polyacrylamide usw.; Glas, bakterielle Zellen, Ionenaustausch-Harze usw. Verfahren zur Anbindung der Rezeptoren an die festen Träger sind bekannt; diesbezüglich sind keine weiteren Einzelheiten zum vollen Verständnis der Erfindung erforderlich. Der Rezeptor kann kovalent oder
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nichtkovalent an den Träger gebunden sein.
Die vorliegende Erfindung ist besonders geeignet für eine Festphasen-Untersuchung, bei welcher der Rezeptor auf dem festen Träger in einer Durchströmungskaminer gehalten wird. Die Probe, welche den Analyten enthält bzw. vermutlich enthält, wird zunächst durch die Kammer geleitet, welche"den Rezeptor auf dem festen Träger enthält; es folgt der Durchgang des Tracers durch die Kammer. Unerwarteterweise hat sich herausgestellt, daß dieses Verfahren häufig eine Verbesserung gegenüber herkömmlichen Verfahren darstellt,'bei welchem der Analyt und der Tracer vor dem Durchgang durch die Kammer vermischt werden.
<->
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich außerordentlich gut für eine Untersuchung, bei der der Rezeptor regeneriert wird, und die automatisch durchgeführt werden soll. Automatische Untersuchungsverfahren mit Regeneration und hierfür geeignete Vorrichtungen sind allgemein in den US- ~ Patentschriften 3 896 217 und 4 009 005 beschrieben; bezüglich weiterer Einzelheiten wird auf diese beiden Vörveröffentlichungen Bezug genommen.
Erfindungsgemäß wird die Analyten-Probe in Abwesenheit des Tracers durch eine Kammer geleitet, welche den auf einem Träger, beispielsweise einem fein zerteilten Substrat, gehaltenen Rezeptor enthält. Es folgt ein Durchgang des Tracers für den Analyt durch die Kammer. Der Anteil des Tracers, der durch die Kammer passiert (d.h. der nichtgebundene Tracer), wird aufgefangen und die Menge des nichtgebundenen Tracers und/oder gebundenen Tracers wird bestimmt. Bei einer derartigen automatisierten Untersuchung mit Rege- ·
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/Ohne Festlegung auf die folgende Theorie wird die größere Empfindlichkeit folgendermaßen erklärt: Es gibt eine endliche Anzahl von Rezeptorplätzen, die in der Kammer zur Anbindung des Analyten in der Probe verfügbar sind. Nicht alle Plätze sind vom Analyten besetzt. Das Gleichgewicht stellt sich rasch innerhalb einer Zeit ein, die in der Größenordnung von Millisekunden liegt. Die Anzahl besetzter Plätze ist für jede Probe eine Konstante und wird durch die experimentellen Bedingungen, beispielsweise die Strömungsrate, mit welcher die Probe die Kammer passiert, bestimmt. Die unbesetzten Bindungsplätze sind dann für die darauffolgende Änbindung des Tracers verfügbar. Aufgrund des getrennten Gleichgewichts mit dem Analyten sind jedoch für den Tracer nicht so viele Plätze verfügbar, wie dies sonst möglicherweise der Fall ist. Somit wird die Tracer-Anbindung bei allen Analyten-Konzentrationen verringert./»
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neration wird der an den Träger gebundene Tracer darauffolgend unter Verwendung einer geeigneten Elutionslösung ausgewaschen, wodurch der Rezeptor wiederverwendet werden kann. Weitere Ausführungen sind entbehrlich. Die Verfahren und die Vorrichtungen, die in den beiden obengenannten US-Patentschriften beschrieben sind, können ohne weiteres auf die vorliegende Erfindung übertragen werden.
Bei Untersuchungsverfahren, welche Durchflußkaminern verwenden, kann die Rezeptormenge in der Kammer verglichen mit bekannten Verfahren reduziert werden, was die Empfindlichkeit erhöht. Außerdem kann das Volumen des Analyten, der in die Kammer eingeführt wird, gesteigert werden, was ebenfalls die scheinbare Empfindlichkeit der Untersuchung vergrößert. D.h. es hat sich herausgestellt, daß das Probenvolumen vergrößert werden kann, da in der Probe kein Tracer vorliegt. Die Vergrößerung des Probenvolumens erhöht die Empfindlichkeit. <—y
Die vorliegende Erfindung ist auch auf Untersuchungsverfahren anwendbar, bei denen keine Durchflußkammer verwendet wird. Bei derartigen Verfahren wird der nicht gebundene Analyt im allgemeinen durch einen Waschschritt vor der Zugabe des Tracers entfernt. Bei der Waschflüssigkeit kann es sich um jede Flüssigkeit handeln, welche den Rezeptor, den Analyten und den Träger nicht nachteilig angreift; es handelt sich im allgemeinen um einen der Puffer, die üblicherweise bei Untersuchungsverfahren verwendet werden. Ein Waschschritt nach der Zugabe des Analyten und vor der Zugabe des Tracers kann auch bei einem Untersuchungsverfahren benutzt werden, welches eine Durchflußkammer verwendet.
^Einfügung auf Seite 9
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«,^Anders ausgedrückt: Die Verbesserung in der Empfindlichkeit ermöglicht eine größere Genauigkeit bei derselben Probenverdünnung oder ermöglicht weniger Probe bzw. größere Verdünnung bei derselben Genauigkeit. Aufgrund der verbesserten Empfindlichkeit kann ein bevorzugtes kleines Probenvolumen in der automatischen Einrichtung verarbeitet werden, wie sie beispielsweise unter dem Warenzeichen "Aria 11" vertrieben wird.)>
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Die Erfindung wird im folgenden durch ein Beispiel erläutert:
Beispiel
Die folgenden Materialien wurden verwendet: <->
-g ö,
-- ■-- - ■ o -—aftär-· ;
Ein Adsorptionspuffer, pH 10,5, mit 0,1 M Glycinat, 0,01 % Bovin-Serum-Albumin, 5 % Äthylalkohol, 300^ug/ml 8-Anilino-1-Naphthalin-Sulphonsäure und 0,02 % Natriumazid.
In jedem Falle betrug das Probenvolumen 0,5 ml. Die Probe wurde zunächst durch die Kammer geleitet, worauf der Durchgang des Tracers durch die Kammer folgte. Der Prozentsatz des Tracers, der an den Antikörper gebunden war, wurde für jede Probe bestimmt.
Das Verfahren wurde entsprechend dem bekannten Verfahren wiederholt, bei dem Probe und Tracer vor dem Durchgang durch die Kammer vermischt werden. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt.
^Einfügung auf Seite 10a>
<VvEinfügung auf Seite 1C
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I-Thyroxin mit einer spezifischen Aktivität von 250mci/mg markiert und in einem Probenpuffer derart verdünnt, daß sich eine für statistische Zwecke brauchbare Zählung, im allgemeinen eine Zählung zwischen 10.000 und 15.000 ergab. Eine Thyroxin- Antikörper- Kammer wurde wie im US-Patent 405 9685 beschrieben hergestellt, mit der Ausnahme, daß als festes Trägermaterial Dextran-überzogenes Glas verwendet wurde. Eine 50μ1-Kammer aus PTFE wurde verwendet, welche kovalent an den Träger gebundenes Kaninchen-Antiserum enthielt»/
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Untersuchung wurde unter Verwendung eines automatischen Gerätes durchgeführt, wie es im US-Patent 4009 005 beschrieben ist. Eine derartige Vorrichtung ist unter der Handelsbezeichnung "Aria 11" von der Firma Becton Dickinson Immunodiagnostics, Automated Immunichemistry Systems, erhältlich. Es waren nur geringfügige Modifikationen in dem Mechanismus, der die Pumpen steuert, und in der Verrohrung erforderlich, damit die Vorrichtung entsprechend dem hier beschriebenen Verfahren automatisch arbeitete, wobei der Tracer die Kammer nach und getrennt von der Probe passierte.^
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Tabelle 1
Thyroxin-Kon zentration
(ng/ml)
Tracer-Bindung (%)
Erfindung Stand der Technik
1 2 4
7,5 15
43 49
35 48
28 40
19 33
15 25
Die Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens führt zu einer Empfindlichkeit, die ungefähr dreimal größer als die Empfindlichkeit ist, die sich bei bekannten Verfahren ergibt. Außerdem wurde eine nichtspezifische Bindung an Serum-Protein vermieden.
Eine Verunreinigung der Probe durch den Tracer fand nicht statt.
Das Untersuchungsverfahren nach Beispiel 1 ist in gleichem Maße bei Digoxin oder Cortisol wirksam.
£.—> Einfügung auf Seite 11a
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Es ist zu erkennen, daß das erfindungsgemäße Verfahren bei den niedrigeren Thyroxin-Konzentrationen eine größere Veränderung in der prozentualen Bindung zeigt, wie dies das Konkurrenzbindungsverfahren nach dem Stande der Technik aufweist. Die größeren Unterschiede in der Bindung bedeutet für die Punkte der Eichkurve über den gewünschten Konzentrationsbereich hinweg, daß die Resultate besser reproduzierbar sind. Der übliche Bereich der Thyroxin-Konzentration, die in klinischen Proben angetroffen wird, liegt zwischen 1 und 20 Mikrogramm/dl. Derartige Proben können ohne weiteres so verdünnt werden, daß sie auf denjenigen Abschnitt der Eichkurve fallen, der die größte Veränderung in der prozentualen Bindung mit der Veränderung in der Thyroxin-Konzentration aufweist. In der Praxis werden die Ausrüstung und die Verfahrensbedingungen üblicherweise so gewählt, daß die Kammer zwischen 40 und 65 % der Bindung bindet, die bei einer O-Eichung beobachtet wird, d. h. der Bindung, die erhalten wird, wenn beim Aufbau der Eichkurve eine Analyten-Konzentration von 0 benutzt wird, ^y-
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Claims (8)

DH.-ING. DIPL.-1NG. M. S^ DIPL-PMYS. DP. DIPU.-PHYS. OIPL.-PHYS D HÖGER - STELLRECHT - GRIESSBACH - HAECKER BOEHJVfE PATENTANWÄLTE IN STUTTGART A 43 544 b Anmelder: Becton Dickinson and Company UO - 168 Mack Centre Drive 17. Mai 1979 Paramus, N.J. 07652 USA Patentansprüche:
1.) Festphasen-Untersuchungsverfahren, bei dem eine Probe und ein Tracer für einen zu untersuchenden Analyten mit einem Rezeptor, der auf einem festen Träger getragen wird, in Berührung gebracht werden, dadurch gekennzeichnet , daß die Probe mit dem Rezeptor in Abwesenheit des Tracers in Berührung gebracht wird, daß der nichtgebundene Analyt entfernt und daraufhin der Rezeptor mit dem Tracer in Berührung gebracht wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Tracer radiomarkiert ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt ein Antigen ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt ein Hapten ist.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor ein Antikörper ist.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt Thyroxin und der Tracer radioiodinisiertes Thyroxin ist.
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7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Rezeptor auf seinem festen Träger in einer Kammer gehalten wird, wobei zunächst die Probe und danach der Tracer durch die Kammer geleitet werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß es sich um ein automatisches Verfahren handelt und der gebundene Tracer und etwa gebundener Analyt aus der Kammer zur Regeneration des Rezeptors ausgewaschen werden.
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DE19792920289 1978-05-19 1979-05-18 Festphasen-untersuchungsverfahren Withdrawn DE2920289A1 (de)

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