DE2731028A1 - Verfahren zur bestimmung von ungebundenen hormonen oder pharmaka - Google Patents

Verfahren zur bestimmung von ungebundenen hormonen oder pharmaka

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Description

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Patentanwälte KadorA Klunkpr Knoi-b<lstr..% KMiinilicn22
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iisi-r/i-ii-lii-n:/()iirrrl'.: K 1 1 885/3 S
Dip.-Chem. Dr. Hans A. Thoma
Giselastr. 3
München 40
Verfahren zur Bestimmung von ungebundenen Hormonen oder
Pharmaka
809884/0210
Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Bestimmung von ungebundenen Hormonen oder Pharmaka.
Steroide werden im menschlichen Serum an Proteine gebunden. In der klinisch-chemischen Hormonanalytik basieren die Hormonbostimmungen fast ausschließlich auf dem Prinzip, die Bindung der Transportproteine zu den Hormonen zu lösen und die Gesamtkonzentration des Hormons zu messen. Als Techniken zur Bindungslösung kommen die verschiedensten Verfahren, wie Lösungsmittelextraktion, Hitzedenaturierung, enzymatische Hydrolyse und Säure- oder Alkalieneinwirkung in Frage.
Der Gehalt der Bindungsproteine im menschlichen Serum ist aber nicht immer gleich groß. Es ist bekannt, daß bei Patientinnen unter Antiovulantientherapie oder in der späten Schwangerschaft deutlich erhöhte Werte von z.B. cortisol-bindendem Globulin bzw. tyroxin-bindendem Globulin gemessen werden. Daneben wurden isolierte Vermehrungen oder Verminderungen des Bindungsproteingehaltes gefunden, deren familiäre Häufung und
Erblichkeit noch diskutiert wird.
Solche veränderten Bindungsproteinspiegel führen bei
der Bestimmung des Gesamthormons zu Werten, die ein
Syndrom anzeigen, während die Patienten aber das klinische Bild des entsprechenden Syndroms nicht zeigen, da die Regulation dor Hormone offenbar nur über den
nicht an Protein gebundenen Anteil erfolgt, wogegen
der an Protein gebundene Anteil biologisch inaktiv
ist.
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Bekannte Techniken zur Bestimmung von proteingebundenem und freiem Hormon sind entweder solche, bei denen das Gleichgewicht zwischen gebundenem und freiem Hormon während der Trennung aufrechterhalten wird, wie z.B. bei der klassischen Gleichgewichtsdialyse oder der Ultrafiltration, oder Techniken, bei denen zwar das Gleichgewicht während der Trennung nicht aufrechterhalten wird, wie z.B. bei der Säulenchromatographie oder den Adsorptionsmethoden, die aber dennoch ein Maß für den tatsächlich freien Anteil des Hormons liefern. Bei diesen Techniken ist die Reaktionszeit ein kritischer Faktor, da die Bindung zwischen Adsorbent und Steroid irreversibel ist.
Die bekannten Trennverfahren sind sehr aufwendig und liefern nur den prozentualen Anteil des freien Hormons. Der Absolutwert muß durch zusätzliche Ermittlung der Gesamthormonkonzentration berechnet werden. Durch diese indirekte Bestimmung ist die Messung mit entsprechender Ungenauigkeit verbunden, abgesehen von den äußerst aufwendigen Techniken, die nötig sind, um den Prozentanteil zu bestimmen.
Aufgabe der Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Bestimmung von ungebundenen Hormonen oder Pharmaka, das die Bestimmung der absoluten Konzentration der freien Hormone und nicht lediglich des prozentualen Anteils gestattet. Das Verfahren soll ferner einfach und automatisierbar sein. 30
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Bestimmung von ungebundenen Hormonen oder Pharmaka durch Reaktion der Hormone oder Pharmaka mit einem Anti-
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körper und radioimmunologischer Auswertung, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine ungebundene Hormone, an Bindungsproteinc gebundene Hormone und Bindungsproteine enthaltende Lösung auf einen immobilisierten Antikörper aufgegeben wird, das ungebundene Hormon mit dem Antikörper reagieren gelassen wird, die an Bindungsproteine gebundenen Hormone und die Bindungsproteine mit einer Lösung, die markiertes Hormon enthält, eluiert wird, das markierte Hormon mit dem Antikörper reagieren gelassen wird, das nicht mit dem Antikörper umgesetzte markierte Hormon eluiert wird und das markierte Hormon bestimmt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet die Bestimmung der absoluten Konzentration von ungebundenen Hormonen oder Pharmaka in einem Verfahren. Diese Bestimmungsmethode ist äußerst einfach, schnell und automatisierbar.
Dem erfindungsgemäßen Verfahren liegt folgendes Prinzip zugrunde. Im Serum oder Plasma befindet sich das Hormon oder Pharmaka (H) entsprechend dem Massenwirkungsgesetz mit dem Transportprotein (B) im thermodynamischen Gleichgewicht:
H + B HB.
Wird das Serum auf getrocknetes Antikörpergelpulver aufgegeben, so beginnt die Matrix stark zu quellen. Dieser Quellvorganq, der sehr rasch verläuft, führt zur Trennung des diffusiblen, freien Hormons und dem Hormon/Bindungsprotein-Komplex, da während des
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Quellvorgangs aufgrund der kleinen Porengröße der Matrix nur relativ kleine Moleküle in diese eindringen können. Das kleine freie Hormon wird mit der Flüssigkeit in das Gelinnere V. mitgenommen, während die Proteine und die proteingebundenen Hormone wegen der kleinen Porengröße des Gels nur das die Gelpartikel umgebende äußere Volumen V benützen können. Mit dem Quellvor-
gang wird praktisch eine äußerst rasche, vollkommene Trennung von freiem und gebundenem Hormon erreicht.
Da sich in dem von den Gelpartikeln umschlossenen Volumen V., das etwa 80 bis 90 % des gesamten Gelvolumens ausmacht, der Antikörper befindet, erfolgt dort die Reaktion des Antikörpers mit dem einströmenden Hormon:
Ak + H ^ -*» AkH.
In einem zweiten Schritt erfolgt die Elution nur so lange, daß das Außenkornvolumen V eluiert wird.
In V befinden sich unter anderem auch das Bindungsa
protein und der Hormon/Bindungsprotein-Komplex.
Das diffusible Hormon befindet sich nach dem Quellvorgang hauptsächlich in dem inneren Gelkornvoluraen V.. Während des Quellvorgangs hat sich der Antikörper bereits mit dem Hormon umgesetzt. Ferner ist das Volumen
V. bedeutend größer als V . Aus diesen Gründen wird durch ι a
eine Elution, die nur das äußere Gelkornvolumen V umfaßt, wenig von dom diffusiblen Hormon aus dem Gel ausgewaschen.
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Wird die Elution des Hormon/Bindungsprotein-Komplexes mit einer Lösung durchgeführt, die markiertes Hormon enthält, kann in einer zweiten Reaktion der noch nicht vom unmarkierten Hormon komplexierte Antikörper mit dem markierten Hormon erfaßt werden.
Da die Reaktionen der, nicht-markierten Hormons und des markierten Hormons mit dem Antikörper nacheinander ablaufen, muß bei der Inkubation mit dem markierten Hormon nicht die Einstellung des Gleichgewichts abgewartet werden. Nach gewisser Zeit kann die Trennung des antikörpergebundenen und des nicht-gebundenen Hormons durch Elution mit Pufferlösung erfolgen.
Die Messung der Konzentration des markierten Hormons kann im Eluat oder im Gel in bekannter Weise radiologisch erfolgen. Di 12 radioimmunologische Bestimmung von nicht-markierten Hormonen ist gleichfalls bekannt. Eine ausführliche Beschreibung des Radioimmunoassays findet sich beispielsweise in Clinical Chemistry, Vol. 19, Nr. 2, 1973, Seite 145. Gegebenenfalls kommen auch alternative Bestimmungsmethoden, wie die fluoroimmunologische Bestimmung oder die Bestimmung mittels enzymatischer Markierung, in Betracht.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich zur Bestimmung der verschiedenen Hormone und Pharmaka, die im Serum oder Plasma zum Teil an spezifische oder nichtspezifische Bindungsproteine gebunden vorliegen. In Betracht kommen die Schilddrüsenhormone, insbesondere Thyroxin und Trijodthyronin, die Steroidhormone, wie Cortisol, Testosteron, Progesteron, östron, östradiol und östriol und die Herzglycoside, wie Digitoxin und
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Digoxin. Ferner können bestimmt werden Vitamine, besonders Vitamin B12 und Folsäure, sowie Pharmaka mit starker Proteinbindung, wie beispielsweise Antikoagulantien, Dicumarol, Analgetika und Salyzilate. 5
Die Antikörper können mittels verschiedener Matrices immobilisiert sein. Beispiele für Matrices sind Agarose, Zellulose, Glaspartikel, Polyamide, Polyacrylamide und Copolymerisate des Acrylamids. Letztere werden besonders bevorzugt. Die Vorteile der in einer Matrix eingeschlossenen Antikörper liegen im Ausschluß von störenden Molekülen höheren Molekulargewichts, der Einsparung von Pipettier- und Zentrifugierschritten und der langen Haltbarkeit des immobilisierten Antikörpers bei Raumtemperatur.
Durch die Copolymerisation des Acrylamids mit damit copolymerisierbaren Verbindungen kann die Mikroumgebung der Polymermatrix beeinflußt werden. Die Wirkung beruht im wesentlichen auf hydrophoben und hydrophilen sowie elektrostatischen Effekten.
Durch die Variation der Polymermatrix mittels Copolymerisation ist eine wesentliche Erhöhung der Bindungsspezifität des Antikörpers und eine Unterdrückung unerwünschter Kreuzreaktivitäten möglich.
Besonders werden Copolymerisate aus Acrylamid und einer oder mehrerer der Verbindungen Acrylsäure, Methacrylsäure, Methacrylamid, deren Derivaten und Salzen der Acrylsäure oder Methacrylsäure bevorzugt.
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Der Anteil des Acrylamide im Copolymerisat kann zwischen 1 und 99 Mol%, vorzugsweise 5 bis 95 Mol%, und insbesondere 20 bis 80 Mol%, betragen.
Besonders geeignet sind Copolymerisate aus Acrylamid und Methacrylsäure und insbesondere solche, bei denen der Methacrylsäureanteil 20 bis 60 Mol% ausmacht.
Durch den Einsatz von Copolymerisaten, die Acrylsäure oder Methacrylsäure oder deren Salze enthalten, läßt
sich ferner ein Neutralisationseffekt oder eine Pufferwirkung für saure bzw. alkalische Lösungen erzielen. Als Salze werden die Alkali- und/oder Erdalkalisalze bevorzugt.
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Die Herstellung der Polymermatrices mit immobilisiertem Antikörper kann beispielsweise derart erfolgen, daß eine Lösung des Antikörpers dem Monomergemisch zugegeben wird. Der Ansatz wird beispielsweise radikalisch polymerisiert und das erhaltene Polymerisat zerkleinert, gewaschen und getrocknet.
Zur Erzielung einer geeigneten Porengröße der PoIymermatrix wird die Monomerkonzentration variiert. Eine Monoinerkonzentration im Bereich von etwa 20 % führt zu einer Porengröße von etwa 7 bis 10 Ä.
Eine Anordnung zur automatisierten Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist in der Figur gezeigt.
Der immobilisierte Antikörper befindet sich in kleinen
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Säulchen 5. Diese sind in einer Adapterplatte 4 fixiert. Darunter werden die Aufgabe- und Auffanggefäße angeordnet, die in einer Einheit 6 zusammengefaßt sein können. Die Säulchen 5 sind mittels Zufuhrleitungen 7 mit den Pumpen 1 und 2 verbanden. Die Anordnung wird durch ein elektronisches Steuergerät 3 gesteuert.
Die zu bestimmende Probe wird in ein Reaktionsgefäß gegeben und unter ein Fertigsäulchen mit Antikörper geschoben. Dann wird durch das Steuergerät folgendes Programm eingestellt:
Eine oder beide Pumpen laufen eine Zeit lang rückwärts, wodurch die Probe in das trockene Antikörpergel eingesaugt wird.
Anschließend erfolgt ein kurzes Pausenintervall. Während dieser Zeit erfolgt der Quellvorgang des Gels und die Trennung von freien und proteingebundenen Hormonen. Diese Quellphase liegt in der Größenordnung von 1 min.
In der nächsten Stufe laufen beide Pumpen, wobei die Pumpe 1 Eluierflüssigkeit, beispielsweise eine Pufferlösung oder Wasser, fördert und die Pumpe 2 Eluierflüssigkeit mit markiertem Hormon (Tracer) fördert, oder nur die Pumpe 2 vorwärts. Auf diese Weise wird gleichzeitig die Proteinfraktion eluiert und der Tracer aufgegeben.
Damit der Tracer vor der Aufgabe ins Gel sich nicht mit der Pufferlösung vermischt, d.h. verdünnt wird, werden Pufferlösung und Tracerlösung durch getrennte Kanäle zugeführt, die direkt über dem Gel enden.
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Diese Elution und Traceraufgabe soll möglichst schnell erfolgen, damit das Hormon nicht Zeit hat, aus dem Gel herauszudiffundieren.
Die erforderliche Genauigkeit der Bestimmung wird erreicht, wenn entweder die Zugabe des markierten Hormons in genauer Dosierung erfolgt oder im Sättigungsbereich des Antikörpers gearbeitet wird.
Anschließend erfolgt ein weiteres Pausenintervall, während dem das markierte Hormon mit den noch freien Bindungsstellen des immobilisierten Antikörpers reagiert. Dieses Pausenintervall liegt üblicherweise in der Größenordnung von etwa 10 min. Anschließend erfolgt die Elution mit reiner Pufferlösung, indem die Pumpe 1 vorwärtsläuft. Mit dieser Elution wird die Trennung des am Antikörper gebundenen und nicht-gebundenen markierten Hormons bewirkt.
Die im Eluat bzw. im Säulchen verbleibende Radioaktivität ist ein Maß für die Konzentration der zu bestimmenden Substanzen.
Eine Eichkurve wird aufgestellt, indem bekannte Konzentrationen an Hormon ohne Protein den gleichen Schritten unterworfen werden.
Ein Vergleich der bekannten Bestimmungen mittels Dialyse und Kohleadsorption hat gezeigt, daß mit dem erfindungsgemäßen Verfahren tatsächlich nur die freien, diffusiblen Hormone gemessen werden.
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Das in der Zeichnung gezeigte System ist ein Mehrkanalsystem, das die Parnllelbestimmung zahlreicher Proben gestattet.
Bei der praktischen Durchführung hat sich gezeigt, daß eine Thermostatisierung auf 00C zur Verminderung der Dissoziation nicht erforderlich ist, sondern vielmehr auch bei 220C durchgeführte Messungen identische Werte ergaben.
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Die Erfindung wird nachstehend anhand eines Beispiels, das die Bestimmung des diffusiblen Cortisols im Serum zeigt, näher beschrieben.
Die Herstellung des Polymergels mit dem immobilisierten Antikörper wurde folgendermaßen durchgeführt. Für jeden Polymeransatz wurde die Konzentration so eingestellt, daß die totale Monomerkonzentration 3,13 Mol/l betrug. Für einen Ansatz wurden z.B. 5 g Acrylamid, 1,25 g N,N1-Methylenbisacrylamid in einem Becherglas in 24 ml Phosphatpuffer (pH 7,2) gelöst. Bei der Herstellung der Copolymerisate wurde Acrylamid äquimolar durch Acrylderivate ersetzt. Nach der Zugabe des Antiserums in 1 ml Phosphatpuffer wurde die Reaktion mit 0,15 mg Riboflavin und 0,10 ml N,N,N1,N"-Tetramethyläthylendiamin und UV-Bestrahlung gestartet. Während der Bestrahlungszeit von etwa 45 min wurde die Temperatur unter 5O0C gehalten. Der Gelblock wurde anschließend zerkleinert, mit destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet.
Bei der Bestimmung des diffusiblen Cortisols wurden
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zwei Kolbenpumpen mit Fördergeschwindigkeiten von 0,68 ml/min (Pumpe 1) und 0,5 ml/min (Pumpe 2) verwendet, die sich vorwärts wie rückwärts bewegen können. 60 mg trockenes Anticortisolantikörpergel wurden in kleinen Säulchen
mit eingelegtem Filter eindosiert. Aus einem Reaktionsgefäß wurden mit den Pumpen 320 μΐ Inkubationslösung in die Säulchen angesaugt, die folgende in Phosphatpufferlösung (pH 7,2) gelöste Substanzen enthielt:
für die Dosiswirkungskurve nicht-markiertes Cortisol in ansteigender Konzentration (0,56 bis 17,66 pMol), für die Serumbestimmung verdünntes Serum (1 : 12). Die Reaktionstemperatür wurde bei 00C _+ 0,50C konstant qehalten. Mit den Pumpen erfolgte nach 4 min Quellungszeit die Proteinelution aus den Säulchen mit 630 μΐ H-Cortisollösung in Szintillationsgläschen. Nach 10 min Inkubationszeit mit dem H-Cortisol wurde das freie vom Antikörper gebundene Cortisol durch Elution mit der Pumpe 2, die Phosphatpufferlösung (pH 7,2) förderte, getrennt. Das Eluat (1 ml bei 3 min Elutionsdauer) wurde in Szintillationsgläschen aufgefangen, mit 15 ml Szintillationslösung versetzt und die Radioaktivität im Flüssigkeitsszintillator gemessen. Aus den Impulsen je min (cpm) wurde die Konzentration des freien Indikatorhaptens Η-Cortisol errechnet. Auf der Dosiswirkungskurve wurde dann der Gehalt des diffusiblen Cortisols im Serum abgelesen.
Es wurden Antikörpermatrices untersucht, die folgende Acrylderivate enthielten: 100 % Acrylamid; 60 % Acrylamid und 40 % Methacrylsäureester; und 60 % Acrylamid und 40 % Methacrylsäure. Die Monomer-
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konzentration betrug jeweils 3,13 Mol/l, so daß eine Porengröße von ca. 0,8 bis 1,0 ntn erreicht wurde. Die Gelkorngröße betrug im Mittel etwa 400 μΐη. Bei einer Fördergeschwindigkcit von 0,5 ml/min sind nach 4 min 92 % der freien Haptene eluiert.
Die Bestimmung des diffusiblen Cortisols in ug/100 ml ergab unter verschiedenen Bedingungen folgende Werte: normal 1,5 bis 2,5; ACTH-Stimulationstest 4,5 bis 10,8; bei Dexamethasonsuppression 0,15 bis 1,0 und bei Schwangerschaft 3,0 bis 7,8. Diese Werte entsprechen jenen, die mit üblichen Methoden, wie der Gleichgewichtsdialyse, ermittelt werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde auch zur Bestimmung von Testosteron herangezogen. Die Arbeitsweise entsprach im wesentlichen der vorstehend beschriebenen Bestimmung des Cortisols. Es wurden jedoch 160 mg Antikörpergel verwendet, 1 ml Inkubationslösung in die Säulchen gesaugt sowie mit 1580 μΐ H-Testosteronlösung einer Konzentration von 270 pg/100 ul die Proteinelution durchgeführt. Es ergab sich eine formale Sensitivität von 10 pg/ml.
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Claims (3)

27 3 1023 Patentansprüche
1.'Verfahren zur Bestimmung von ungebundenen Hormonen oder Pharmaka durch Reaktion der Hormone oder Pharmaka mit einem Antikörper und radioimmunologischer Auswertung, dadurch gekennzeichnet , daß eine ungebundene Hormone, an Bindungsproteine gebundene Hor mone und Bindungsproteine enthaltende Lösung auf einen immobilisierten Antikörper aufgegeben wird, das ungebundene Hormon mit dem Antikörper reagieren gelassen wird,
die an Bindungsproteine gebundenen Hormone und die Bin dungsproteine mit einer Lösung, die markiertes Hormon enthält, eluiert werden,
das markierte Hormon mit dem Antikörper reagieren gelassen wird,
das nicht mit dem Antikörper umgesetzte markierte Hormon eluiert wird und
das markierte Hormon bestimmt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet, daß ein in einem Polymergel eingeschlossener Antikörper verwendet wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet , daß ein in einem Acrylamid- polymer oder Acrylamidcopolymer eingeschlossener Antikörper verwendet wird.
809884/0210 ORIGINAL INSPECTED
DE2731028A 1977-07-08 1977-07-08 Verwendung eines Antikörpergels zur immunologischen Bestimmung von Hormonen, Pharmaka und Vitaminen, welche in ungebundenem Zustand vorliegen Expired DE2731028C2 (de)

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