DE2421035C3 - Diagnostiziermittel zur Durchführung radioimmunologischer Bestimmungen - Google Patents

Description

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Die Erfindung bezieht sich auf ein Diagnostiziermittel der im Oberbegriff des Patentanspruchs 1 definierten Art

Ein solches Reagenz ist in »Immunochemistry« 1969, -*o Band 6, S. 481 —484, beschrieben. Bei Verwendung eines derartigen Diagnostiziermittels wird die Menge der aufgenommenen Flüssigkeitsprobe durch das Wasseraufnahmevermögen und das Volumen der angewandten Gelteilchen bestimmt, so daß ein genaues Abmessen und Pipettieren überflüssig wird. Bei der Durchführung der radioimmunologischen Bestimmungen werden die Gelteilchen mit der zu untersuchenden Probe zusammengebracht, die nicht in das Gel eingedrungenen Substanzen ausgewaschen, die Gelteilchen einer konkurrierenden radioaktiv markierten Substanz ausgesetzt das System inkubiert, die Gelteilchen erneut gewaschen und die Radioaktivität des gebundenen oder nicht gebundenen Anteils gemessen. In jedem Falle muß jedoch die radioaktiv-markierte Substanz getrennt zu den Gelteilchen zugegeben werden.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Diagnostiziermittel zur Durchführung radioimmunologischer Bestimmungen zu entwickeln, das unter stark schwankenden atmosphärischen Bedingungen stabil und dadurch über längere Zeit lagerbeständig ist. Dieses Diagnostiziermittel soll die Durchführung radioimmunologischer Bestimmungen auf einfache Weise ermöglichen, zu genau reproduzierbaren Ergebnissen führen und die Handhabung und getrennte Zugabe der ^h'> radioaktiv-markierten Substanz überflüssig machen.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Diagnostiziermittcl der bekannten Art. das dadurch gekennzeichnet, ist, daß es Gelteilchen enthält, die eine radioaktiv-markierte Form der zu bestimmenden Substanz tragen.

Durch die Verwendung dieses erfindungsgemäßen Diagnostiziermittels, das neben dem bindenden Protein gleichzeitig die markierte Form der zu bestimmenden Substanz enthält, werden die radioimmunologischen Bestimmungen wesentlich vereinfacht Dabei kann die markierte Substanz sowohl in den gleichen Gelteilchen vorhanden sein wie das spezifisch bindende Protein oder in getrennten Gelteilchen, die mit den das Protein enthaltenden Gelteilchen vermischt werden. Dabei hat es sich gezeigt, daß das Diagnostiziermittel in beiden Fällen lagerstabil ist, ohne daß eine vorzeitige Bindung der markierten Substanz an die bindenden Stellen des Proteins stattfindet

Die Herstellung und die Art des Gels, aus dem die Teilchen gebildet werden, sind nicht kritisch, da irgendein gelbildendes Material angewandt werden kann, das zu porösen, unlöslichen, stark hydrophilen Teilchen mit geregelter Porengröße zerkleinert werden kann. So können verschiedene, stark hydrophile Gele, die die gewünschte Porengröße bilden und getrocknet oder lyophilisiert werden können, angewandt werden. Es ist jedoch bevorzugt Polyacrylamidgele anzuwenden, bei denen ein Acrylamidmonomer mit ausreichend Vernetzungsmittel zusammengegeben wird, um die gewünschte PorengrötSe zu ergeben und zu stabilisieren und die gewünschte Geldichtigkeit zum schnellen Absetzen der Teilchen und um eine ausreichende Starrheit der Gelteilchen zu ergeben. Das Verhältnis von 1 Gewichtsteil Vernetzungsmittel zu 4 bis 10 Gew.-Teilen Monomer ist ausreichend, um ein Gel zu ergeben mit einer gesamten Polymerkonzentration im Bereich von 12 bis 35%.

Gelteilchen mit radioaktiv-markierter Substanz sollen in einer genau bestimmten Menge in dem Diagnostiziermittel enthalten sein. Dabei ist es günstig, eine solche Menge anzuwenden, daß die vorhandene radioaktiv-markierte Substanz nicht vollständig ausreicht um alle bindenden Stellen des in den Gelteilchen enthaltenen Proteins abzusättigen.

Spezifisch bindende Proteine, mit einer Bindungskapazität für bestimmte kleinere Moleküle, die leicht in dem Polymergel unbeweglich gemacht werden können, sind verschiedene Proteinglobuline und Antikörper.

Gelsysteme, in denen solche Globuline oder Antikörper eingeschlossen sind, können wirksam angewandt werden zur Bestimmung einer Vielzahl von Antigenen und Haptenen, wie Arzneimitteln, Polypeptidhormonen und Steroidhormonen. Antigene und Haptene, die mit Hilfe eines Systems der angegebenen Art bestimmt werden können, umfassen z. B. Angiotensin, Insulin, Wachstumshormone, gonadotrope Hormone, Parathyroidhormone, Glucagon, Cortisol, Protoglandin, Corticosteroide, cyclische Fettsäurehormone und Östrogene sowie Arzneimittel wie Digoxin, Thyrosin, Morphin, Digitalis und ähnliche. Zum Beispiel erlauben spezifische Corticosteroid-bindende Globuline, die durch Einschluß in das Gelsystem unbeweglich gemacht worden sind, die Bestimmung von Corticosteroidhormonen sowie der vielen Polypeptidhormone. 7S y-Globulin (MG 150 000) kann zur Bestimmung von Angiotensin (MG 1000) angewandt werden.

Die Beladung der Gelteilchen mit der radioaktiv-markierten Substanz kann entweder während der Herstellung der trockenen Gelteilchen oder durch anschließende Behandlung der vorher hergestellten trockenen Gelteilchen, in denen das Protein eingeschlossen ist,

erfolgen.

Bei Anwesenheit von bindendem Protein und markierter Substanz in den gleichen Gelteilchen ist es wichtig, den Einbau der markierten Substanz in Abwesenheit von Wasser vorzunehmen, das dazu führen würde, daß die markierte Substanz die bindenden Stellen des Proteins erreicht Daher ist es zweckmäßig, die markierte Substanz zu den trockenen Gelteilchen aus einem nicht-wäßrigen Medium zuzugeben.

Zwei grundsätzlich verschiedene Trocknungsverfahren können angewandt werden: 1. Lyophilisieren und 2. Entwässern in Aceton-Äthanol oder einem anderen niedrig siedenden Alkohol und anschließendes Lufttrocknen. Bei keinem Verfahren tritt ein Verlust der Antikörperaktivität auf. Die Entwässerung mit Äthanol ist jedoch bevorzugt wegen der Einfachheit und Schnelligkeit der Trocknung. Zu diesem Zweck suspendiert man die Gelteilchen in 5 Volumina 95%igem Äthanol und läßt sie absetzen. Die überstehende Flüssigkeit wird verworfen und die Äthanolbehandlung ein oder mehrere Male wiederholt Die mit Äthanol entwässerten Gelteilchen werden da>sn durch Ausbreiten auf einem Nylonnetz an der Luft getrocknet

Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel näher erläutert:

Beispiel

A. Ein Gel, in dem ein verdünntes Anti-Angiotensin-Immunserum, enthaltend 7S y-Globulin (MG 150 000) in einer Gelmatrix mit einer solchen Porengröße eingeschlossen ist, die die Diffusion von Antiotensin (MG 1000) zur Bestimmung ermöglicht, kann folgendermaßen hergestellt werden:

8 g Acrylamid und 1 g Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid werden bis zu einem Volumen von 36 ml in Natriumphosphatpufferlösung (0,1 m, pH 7,4), enthaltend eine geeigneteVerdünnung von Antiserum, gelöst Zu der entstehenden Lösung werden 0,1 ml einer Suspension von 100 mg Riboflavin in 20 ml destilliertem Wasser und 0,02 ml Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethyläthylendiamin zugegeben und anschließend 0,2 mg Natriumhydrogensulfit

Das Gemisch wird in einem geeigneten Gefäß mit einem Stopfen verschlossen und bewegt und dann dem Licht einer üblichen Wolframlampe ausgesetzt, um die Polymerisation einzuleiten. Die Polymerisation ist nach 5 bis 15 Minuten vollständig. Das Rtaktionsgefäß wird kontinuierlich in einem Eiswasserbad je nach Bedarf gekühlt, um zu verhindern, daß die durch die exotherme Polymerisationsreaktion auftretende Wärme die bindenden Proteine nachteilig beeinflußt.

Das Aiitikörpergel wird zerteilt, indem man es durch ein Messin^sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,42 mm stößt Die Gelteilchen werden auf einem Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,25 mm gesammelt und mit 51 destilliertem, entionisiertem Wasser gewaschen. Die Gelteilchen setzen sich schnell ab und sind steif genug, um mäßige Fließgeschwindigkeiten (0,5 bis 2,0 ml/min) in einer chromatographischen Säule zu vertragen, ohne daß sie zusammenklumpen. Nach dem Sieben werden die Gelteilchen mit 0,1 m Phosphatpufferlösung, pH 7,4 äquiiibriert. Die Gelteilchen sind jetzt fertig zum Trocknen.

B. Trockene Gelteilchen mit unbeweglich gemachter Antikörperaktivität, die entsprechend A hergestellt worden sind, werden mit einer Lösung von markiertem Hormon in 95% Äthanol oder einem anderen Alkohol oder Lösungsmittel in Be ι ihrung gebracht. Die Teilchen werden z. B. an der Luft oder in einer chromatographischen Säule, durch die reine Luft strömt, getrocknet, wodurch der Alkohol entfernt wird.

Die entstehenden trockenen Gelteilchen enthalten sowohl bindende Antikörper-Proteinaktiyität als auch

markiertes Hormon in nicht-komplexer (nicht-gebundener) Form. Das markierte Hormon diffundiert nicht an die bindenden Stellen bis das Gel mit der zu untersuchenden Probe rehydratisiert wird. Zu diesem Zeitpunkt wird das markierte Hormon freigesetzt und

tritt mit dem Hormon der Probe in Konkurrenz um die bindenden Stellen.

C. Die radioimmunologische Bestimmung wird durchgeführt unter Anwendung einer Vorrichtung in Form einer Spritze, wie sie in der Figur angegeben ist In dieser Vorrichtung werden 33 mg trockener Gelteilchen in ein Volumen von 0,14 ml gepackt, das durch die poröse Trennwand abgetrennt ist, wobei ungefähr 2/3 des Volumens in dem Gel und ungefähr 1/3 außerhalb des Gels ist und die trockenen Gelteilchen ein Wasseraufnahmevermögen von 100 rng Wasser pro 33 mg Gelteilchen besitzen.

Bei der manuellen Anwendung wird die Nadel 10 in die Probe (Serum, Plasma oder ganzes Blut, das direkt aus der Vene entnommen worden ist) eingetaucht und der Stempel zurückgezogen, um einen Teil der flüssigen Probe in die Spritze 10 in einer solchen Menge aufzuziehen, daß mindestens das Volumen 20 unterhalb der Trennschicht 18 ausgefüllt ist und vorzugsweise in einer solchen Menge, daß zumindest das Netz bedeckt ist

Wenn die Probe in die Spritze aufgezogen wird, absorbieren die stark hydrophilen Gelteilchen 22 eine vorher bestimmte und reproduzierbare Menge niedermolekularer Bestandteile in der Probe durch Rehydratisierung. Um eine Koagulation zu vermeiden, wenn frisches ganzes Blut oder Plasma untersucht wird, ist es günstig, ein Koagulanz dem Gelgemisch zuzusetzen, aus dem die Gelteilchen gebildet werden.

Die Menge der Probe, die von den Teilchen

aufgenommen wird, hängt ab von dem Wert des Wasserrückhaltevermögens des Gels sowie der Menge der in der Säule vorhandenen Teilchen (angegeben als Gewicht oder Volumen). Dadurch kann die Größe der Probe automatisch durch die Menge und den Wert für das Wasserrückhaltevermögen der trockenen Gelteilchen gesteuert werden, wodurch die Untersuchung reproduzierbar und genau wird, unabhängig von der Flüssigkeitsmenge, die in die Spritze aufgezogen wird. Die Einheit wird dann eine bestimmte Zeit lang, die im

so Bereich von 30 Sekunden bis zu 30 Stunden liegen kann, bei Raumtemperatur inkubiert. Es ist nicht erforderlich für die radioaktive Konkurrenzbindungsbestimmung bia vollständig zum Gleichgewichtszustand zu gehen, bevor die endgültige Trennung der gebundenen von der freien

Radioaktivität durchgeführt wird.

Anschließend wird eine gepufferte Waschlösung durch die Säule geleitet. Dieser Schritt dient dazu, nichtgebundene Hormone von den gebundenen Hormonen zu trenner Die Säule wird schnell mit einem ausreichenden Volumen so lange gespült, bis im wesentlichen eine vollständige Trennung erreicht worden ist. Die Gesamtmenge an radioaktiv-markiertem aktiven Hormon, die angewandt wird, ist gleich der Menge an gebundenem und nicht-gebundenem Hörer, mon. Die Radioaktiviiät, die an die bindenden Stellen in der Säule gebunden ist, kann direkt gemessen werden oder sie kann indirekt bestimmt werden durch Messung der Radioaktivität in der Waschlösung. Es können

Standardwerte angewandt werden, um eine .Standardarbeitskurve zu konstruieren, bei der die prozentuale Bindung als Abszisse und der Logarithmus des Standards als Basis (Ordinate) angegeben sind, wobei der unbekannte Gehalt der Probe direkt von der Kurve abgelesen werden kann, entsprechend den Standardverfahren üblicher radioimmunologischer Bestimmungen.

D. Eine Modifizierung besteht darin, trockene Gelteilchen, enthaltend ein markiertes Hormon, auf ähnliche Weise wie die trockenen Gelteilchen, enthaltend das bindende Protein, getrennt von diesen herzustellen. Die Gelteilchen, enthaltend markiertes Hormon und die Gelteilchen, enthaltend den Antikörper oder das bindende Protein, werden dann in den beschriebenen Mengen miteinander vermischt und zur Bildung des Gelvolumens in der Testeinheit verwandt. Beim Rehydratisieren wird das markierte Hormon freigesetzt und erreicht die bindenden Stellen des Antikörpers.

Fliemi 1 Blatt Zeichnunpen

Claims (5)

Patentansprüche:

1. Diagnostiziermittel zur Durchführung radioimmunologischer Bestimmungen mittels Gelteilchen aus einem stark hydrophilen unlöslichen porösen Gel, in die ein für die zu bestimmende Substanz spezifisch bindendes Protein eingeschlossen ist und die ein vorbestimmtes Wasseraufnahmevermögen und Poren einer solchen Größe besitzen, die den Eintritt kleinerer Moleküle in das Innere der Gelteilchen ermöglicht, aber nicht ausreicht, um den Ein- oder Austritt hochmolekularer Bestandteile zu erlauben, dadurch gekennzeichnet, daß es Gelteilchen enthält, die eine radioaktiv-markierte Form der zu bestimmenden Substanz tragen. ι

2. Diagnostiziermittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das bindende Protein und die markierte Substanz in getrennten Teilchen vorhanden sind.

3. Diagnosiiziermittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das bindende Protein und die markierte Substanz in den gleichen Teilchen vorhanden sind.

4. Verfahren zur Herstellung der Gelteilchen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man zu getrockneten Gelteilchen die markierte Substanz in einem nicht wäßrigen Medium zugibt

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man durch Behandlung mit Aceton und/oder einer; niedrig siedenden Alkohol entwässerte und getrocknete Gelteilchen verwendet