AT371606B

AT371606B - Immunologische bestimmung von ungebundenen hormonen oder pharmaka

Info

Publication number: AT371606B
Application number: AT291078A
Authority: AT
Inventors: Hans A Dipl Chem Dr Thoma
Original assignee: Chandon Investment Planning
Priority date: 1978-04-24
Filing date: 1978-04-24
Publication date: 1983-07-11
Also published as: ATA291078A

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von in Acrylamid-Copolymerisaten eingeschlossenen
Antikörpern zur immunologischen Bestimmung ungebundener Hormone und Pharmaka.

Steroide werden im menschlichen Serum an Proteine gebunden. In der klinisch-chemischen
Hormonanalytik basieren die Hormonbestimmungen fast ausschliesslich auf dem Prinzip, die Bindung der Transportproteine zu den Hormonen zu lösen und die Gesamtkonzentration des Hormons zu messen.
Als Techniken zur Bindungslösung kommen die verschiedensten Verfahren, wie Lösungsmittel- extraktion, Hitzedenaturierung, enzymatische Hydrolyse und Säure- oder Alkalieneinwirkung in
Frage.

Der Gehalt der Bindungsproteine- im menschlichen Serum ist aber nicht immer gleich gross.

Es ist bekannt, dass bei Patientinnen unter Antiovulantientherapie oder in der späten Schwanger- schaft deutlich erhöhte Werte von z. B. cortisol-bindendem Globulin bzw. thyroxin-bindendem
Globulin gemessen werden. Daneben wurden isolierte Vermehrungen oder Verminderungen des
Bindungsproteingehaltes gefunden, deren familiäre Häufung und Erblichkeit noch diskutiert wird.

Solche veränderte Globulinspiegel führen bei der Bestimmung des Gesamthormons zu Werten, die ein Syndrom anzeigen, während die Patienten aber das klinische Bild des entsprechenden
Syndroms nicht zeigen, da die Regulation der Hormone offenbar nur über den nicht an Protein gebundenen Anteil erfolgt, wogegen der an Protein gebundene Anteil biologisch inaktiv ist.

Bekannte Techniken zur Bestimmung von proteingebundenem und freiem Hormon sind entweder solche, bei denen das Gleichgewicht zwischen gebundenem und freiem Hormon während der Trennung aufrechterhalten wird, wie z. B. bei der klassischen Gleichgewichtsdialyse oder der Ultrafiltration, oder Techniken, bei denen zwar das Gleichgewicht während der Trennung nicht aufrechterhalten wird, wie z. B. bei der Säulenchromatographie oder den Adsorptionsmethoden, die aber dennoch ein Mass für den tatsächlich freien Anteil des Hormons liefern. Bei diesen Techniken ist die Reaktionszeit ein kritischer Faktor, da die Bindung zwischen Adsorbens und Steroid irreversibel ist.

Die bekannten Trennverfahren sind sehr aufwendig und liefern nur den prozentualen Anteil des freien Hormons. Der Absolutwert muss durch zusätzliche Ermittlung der Gesamthormonkonzentration berechnet werden. Durch diese indirekte Bestimmung ist die Messung mit entsprechender Ungenauigkeit verbunden, abgesehen von den äusserst aufwendigen Techniken, die nötig sind, um den Prozentanteil zu bestimmen.

Aus der GB-PS Nr. l, 452, 010 ist eine Hormonbestimmung mit bestimmten Antikörpergelen bekannt. Die Bindungsspezifität der verwendeten Gele ist jedoch nicht befriedigend, ihre Quellung erfolgt nicht genügend schnell.

Die Erfindung stellt sich die Aufgabe, durch Verwendung bestimmter Acrylamid-Copolymerisate die Bestimmung von ungebundenen Hormonen oder Pharmaka, u. zw. die Bestimmung von deren absoluten Konzentrationen und nicht lediglich von deren prozentualem Anteil zu ermöglichen. Die Bestimmung soll ferner einfach, gut reproduzierbar und automatisierbar sein.

Die gestellte Aufgabe wird erfindungsgemäss durch die Verwendung von in Copolymerisaten aus Acrylamid und einer oder mehrerer der Verbindungen Acrylsäure, Methacrylsäure, Methacrylamid, Acrylsäurederivate Acrylsäuresalze, Methacrylsäurederivate, Methacrylsäuresalze und Methacrylamidderivate eingeschlossenen Antikörpern gelöst.

Bei einer solchen Bestimmung wird eine ungebundene Hormone, an Bindungsproteine gebundene Hormone und Bindungsproteine enthaltende Lösung auf ein erfindungsgemäss verwendetes Copolymerisat-Gel mit immobilisierten Antikörpern aufgegeben, das ungebundene Hormon wird mit dem Antikörper reagieren gelassen, die an Bindungsproteine gebundenen Hormone und die Bindungsproteine werden mit einer Lösung, die markiertes Hormon enthält, eluiert, das markierte Hormon wird mit den immobilisierten Antikörpern reagieren gelassen, das nicht mit dem Antikörper umgesetzte markierte Hormon wird eluiert und das markierte Hormon wird bestimmt.

Erfindungsgemäss ist die Bestimmung der absoluten Konzentration von ungebundenen Hormonen oder Pharmaka mit einer Bestimmung möglich. Diese Bestimmungsmethode ist äusserst einfach, schnell und automatisierbar.

Der Bestimmungsmethode liegt folgendes Prinzip zugrunde : Im Serum oder Plasma befindet sich das Hormon oder Pharmakum (H) entsprechend dem Massenwirkungsgesetz mit dem Transport-

protein (B) im thermodynamischen Gleichgewicht :
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Wird das Serum auf getrocknetes Antikörpergelpulver aufgegeben, so beginnt die Matrix stark zu quellen. Dieser Quellvorgang, der sehr rasch verläuft, führt zur Trennung des diffusiblen, freien Hormons und dem Hormon/Bindungsprotein-Komplex, da während des Quellvorgangs auf Grund der kleinen Porengrösse der Matrix nur relativ kleine Moleküle in diese eindringen können. Das
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Proteine und die proteingebundenen Hormone wegen der kleinen Porengrösse des Gels nur das die Gelpartikel umgebende äussere Volumen Va benutzen können.

Mit dem Quellvorgang wird praktisch eine äusserst rasche, vollkommene Trennung von freiem und gebundenem Hormon erreicht.

Da sich in dem von den Gelpartikeln umschlossenen Volumen Vi, das etwa 80 bis 90% des gesamten Gelvolumens ausmacht, der Antikörper befindet, erfolgt dort die Reaktion des Antikörpers mit dem einströmenden Hormon :
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In einem zweiten Schritt erfolgt die Elution nur so lange, bis das Aussenkornvolumen Va eluiert wird. In Va befinden sich unter anderem auch das Bindungsprotein und der Hormon/Bindungsprotein-Komplex.

Das diffusible Hormon befindet sich nach dem Quellvorgang hauptsächlich in dem inneren Gelkornvolumen Vi. Während des Quellvorgangs hat sich der Antikörper bereits mit dem Hormon umgesetzt. Ferner ist das Volumen Vi bedeutend grösser als Va. Aus diesen Gründen wird durch eine Elution, die nur das äussere Gelkornvolumen Va umfasst, wenig von dem diffusiblen Hormon aus dem Gel ausgewaschen.

Wird die Elution des Hormon/Bindungsprotein-Komplexes mit einer Lösung durchgeführt, die markiertes Hormon enthält, kann in einer zweiten Reaktion der noch nicht vom unmarkierten Hormon komplexierte Antikörper mit dem markierten Hormon erfasst werden.

Da die Reaktionen des nichtmarkierten Hormons und des markierten Hormons mit dem Antikörper nacheinander ablaufen, muss bei der Inkubation mit dem markierten Hormon nicht die Einstellung des Gleichgewichts abgewartet werden. Nach einer gewissen Zeit kann die Trennung des antikörpergebundenen und des nichtgebundenen Hormons durch Elution mit Pufferlösung erfolgen.

Die Messung der Konzentration des markierten Hormons kann im Eluat oder im Gel in bekannter Weise radiologisch erfolgen. Die radioimmunologische Bestimmung von nichtmarkierten Hormonen ist gleichfalls bekannt. Eine ausführliche Beschreibung des Radioimmunoassays findet sich beispielsweise in Clinical Chemistry, Vol. 19, Nr. 2, 1973, Seite 145. Gegebenenfalls kommen auch alternative Bestimmungsmethoden, wie die fluoroimmunologische Bestimmung oder die Bestimmung mittels enzymatischer Markierung, in Betracht.

Erfindungsgemäss wird die Bestimmung der verschiedenen Hormone und Pharmaka, die im Serum oder Plasma zum Teil an spezifische oder nichtspezifische Bindungsproteine gebunden vorliegen, ermöglicht. In Betracht kommen die Schilddrüsenhormone, insbesondere Thyroxin und Trijodthyronin, die Steroidhormone, wie Cortisol, Testosteron, Progesteron, Östron, Östradiol und Östriol und die Herzglycoside, wie Digitoxin und Digoxin. Ferner können bestimmt werden Vitamine, besonders Vitamin B12 und Folsäure, sowie Pharmaka mit starker Proteinbindung, wie beispielsweise Antikoagulantien, Dicumarol, Analgetika und Salizylate.

Die Vorteile der in einer Matrix eingeschlossenen Antikörper liegen im Ausschluss von störenden Molekülen höheren Molekulargewichts, der Einsparung von Pipettier- und Zentrifugierschritten und der langen Haltbarkeit des immobilisierten Antikörpers bei Raumtemperatur.

Durch die Copolymerisation des Acrylamids mit damit copolymerisierbaren Verbindungen kann die Mikroumgebung der Polymermatrix beeinflusst werden. Die Wirkung beruht im wesentlichen auf hydrophoben und hydrophilen sowie elektrostatischen Effekten.

Durch die Variation der Polymermatrix mittels Copolymerisation ist eine wesentliche Er-

höhung der Bindungsspezifität des Antikörpers und eine Unterdrückung unerwünschter Kreuzreaktivi- täten möglich.

Der Anteil des Acrylamids im Copolymerisat kann zwischen 1 und 99 Mol-%, vorzugsweise
5 bis 95 Mol-%, und insbesondere 20 bis 80 Mol-%, betragen.

Besonders geeignet sind Copolymerisate aus Acrylamid und Methacrylsäure und insbesondere solche, bei denen der Methacrylsäureanteil 20 bis 60 Mol-% ausmacht.

Durch den Einsatz von Copolymerisaten, die Acrylsäure oder Methacrylsäure oder deren Salze enthalten, lässt sich ferner ein Neutralisationseffekt oder eine Pufferwirkung für saure bzw. al- kalische Lösungen erzielen. Als Salze werden die Alkali- und ! oder Erdalkalisalze bevorzugt.

Die Herstellung der Polymermatrices mit immobilisiertem Antikörper kann beispielsweise derart erfolgen, dass eine Lösung des Antikörpers dem Monomergemisch zugegeben wird. Der Ansatz wird beispielsweise radikalisch polymerisiert und das erhaltene Polymerisat zerkleinert, gewaschen und getrocknet.

Zur Erzielung einer geeigneten Porengrösse der Polymermatrix wird die Monomerkonzentration variiert. Eine Monomerkonzentration im Bereich von etwa 20% führt zu einer Porengrösse von etwa
0, 7 bis 1, 0 nm.

Eine Anordnung zur automatisierten Durchführung einer Bestimmung ist in der Zeichnung gezeigt.

Der immobilisierte Antikörper befindet sich in kleinen Säulchen --5--. Diese sind in einer
Adapterplatte --4-- fixiert. Darunter werden die Aufgabe- und Auffanggefässe angeordnet, die in einer Einheit --6-- zusammengefasst sein können. Die Säulchen --5-- sind mittels Zufuhrleitungen - -7-- mit den Pumpen -1-- und --2-- verbunden. Die Anordnung wird durch ein elektronisches Steuergerät --3-- gesteuert.

Die zu bestimmende Probe wird in ein Reaktionsgefäss gegeben und unter ein Fertigsäulchen mit Antikörper geschoben. Dann wird durch das Steuergerät folgendes Programm eingestellt :
Eine oder beide Pumpen laufen eine Zeit lang rückwärts, wodurch die Probe in das trockene
Antikörpergel eingesaugt wird.

Anschliessend erfolgt ein kurzes Pausenintervall. Während dieser Zeit erfolgt der Quellvorgang des Gels und die Trennung von freien und proteingebundenen Hormonen. Diese Quellphase liegt in der Grössenordnung von 1 min.

In der nächsten Stufe laufen beide Pumpen, wobei die Pumpe --1- Eluierflüssigkeit, beispielsweise eine Pufferlösung oder Wasser, fördert und die Pumpe -2-- Eluierflüssigkeit mit markiertem Hormon (Tracer) fördert, oder nur die Pumpe -2- vorwärts. Auf diese Weise wird gleichzeitig die Proteinfraktion eluiert und der Tracer aufgegeben.

Damit der Tracer vor der Aufgabe ins Gel sich nicht mit der Pufferlösung vermischt, d. h. verdünnt wird, werden Pufferlösung und Tracerlösung durch getrennte Kanäle zugeführt, die direkt über dem Gel enden.

Diese Elution und Traceraufgabe soll möglichst schnell erfolgen, damit das Hormon nicht Zeit hat, aus dem Gel herauszudiffundieren.

Die erforderliche Genauigkeit der Bestimmung wird erreicht, wenn entweder die Zugabe des markierten Hormons in genauer Dosierung erfolgt oder im Sättigungsbereich des Antikörpers gearbeitet wird.

Anschliessend erfolgt ein weiteres Pausenintervall, während dem das markierte Hormon mit den noch freien Bindungsstellen des immobilisierten Antikörpers reagiert. Dieses Pausenintervall liegt üblicherweise in der Grössenordnung von etwa 10 min. Anschliessend erfolgt die Elution mit reiner Pufferlösung, indem die Pumpe-l-vorwärtsläuft. Mit dieser Elution wird die Trennung des am Antikörper gebundenen und nichtgebundenen markierten Hormons bewirkt.

Die im Eluat bzw. im Säulchen verbleibende Radioaktivität ist ein Mass für die Konzentration der zu bestimmenden Substanzen.

Eine Eichkurve wird aufgestellt, indem bekannte Konzentrationen an Hormon ohne Protein den gleichen Schritten unterworfen werden.

Ein Vergleich der bekannten Bestimmungen mittels Dialyse und Kohleadsorption hat gezeigt, dass erfindungsgemäss tatsächlich nur die freien, diffusiblen Hormone gemessen werden.

Das in der Zeichnung gezeigte System ist ein Mehrkanalsystem, das die Parallelbestimmung zahlreicher Proben gestattet.
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geführte Messungen identische Werte ergaben.

Die Erfindung wird nachstehend an Hand eines Beispiels, das die Bestimmung des diffusiblen Cortisols im Serum zeigt, näher beschrieben.

Die Herstellung des Polymergels mit dem immobilisierten Antikörper wurde folgendermassen
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stellung der Copolymerisate wurde Acrylamid äquimolar durch Acrylderivate ersetzt. Nach der Zugabe des Antiserums in 1 ml Phosphatpuffer wurde die Reaktion mit 0, 15 mg Riboflavin und 0, 10 ml N, N, N', N'-Tetramethyläthylendiamin und UV-Bestrahlung gestartet. Während der Bestrahlungszeit von etwa 45 min wurde die Temperatur unter 500C gehalten. Der Gelblock wurde anschliessend zerkleinert, mit destilliertem Wasser gewaschen und getrocknet.

Bei der Bestimmung des diffusiblen Cortisols wurden zwei Kolbenpumpen mit Fördergeschwindigkeiten von 0, 68 ml/min (Pumpe 1) und 0, 5 ml/min (Pumpe 2) verwendet, die sich vorwärts wie rückwärts bewegen können. 60 mg trockenes Anticortisolantikörpergel wurden in kleinen Säulchen mit eingelegtem Filter eindosiert. Aus einem Reaktionsgefäss wurden mit den Pumpen 320 pl Inkubationslösung in die Säulchen angesaugt, die folgende in Phosphatpufferlösung (PH = 7, 2) gelöste Substanzen enthielt : für die Dosierwirkungskurve nichtmarkiertes Cortisol in ansteigender Konzentration (0, 56 bis 17, 66 Mol), für die Serumbestimmung verdünntes Serum (1 : 12). Die Reaktiontemperatur wurde bei 0 0, 5 C konstant gehalten.

Mit den Pumpen erfolgte nach 4 min Quellungs-
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Nach 10 min Inkubationszeit mit dem 3H-Cortisol wurde das freie vom an den Antikörper gebundenen Cortisol durch Elution mit der Pumpe --2--, die Phosphatpufferlösung (PH = 7, 2) förderte, getrennt. Das Eluat (1 ml bei 3 min Elutionsdauer) wurde in Szintillationsgläschen aufgefangen, mit 15 ml Szintillationslösung versetzt und die Radioaktivität im Flüssigkeitsszintillator gemessen.
Aus den Impulsen je min (cpm) wurde die Konzentration des freien Indikatorhaptens 3H-Cortisol errechnet. Auf der Dosiswirkungskurve wurde dann der Gehalt des diffusiblen Cortisols im Serum abgelesen.

Es wurden Antikörpermatrices untersucht, die folgende Acrylderivate enthielten : 100%
Acrylamid ; 60% Acrylamid und 40% Methacrylsäureester ; und 60% Acrylamid und 40% Methacrylsäure.

Die Monomerkonzentration betrug jeweils 3, 13 Mol/l, so dass eine Porengrösse von zirka 0, 8 bis
1,0 nm erreicht wurde. Die Gelkorngrösse betrug im Mittel etwa 400 pm. Bei einer Fördergeschwindigkeit von 0,5 ml/min sind nach 4 min 92% der freien Haptene eluiert.

Die Bestimmung des diffusiblen Cortisols in pg/100 ml ergab unter verschiedenen Bedingungen folgende Werte : normal 1,5 bis 2, 5 ; ACTH-Stimulationstest 4,5 bis 10, 8 ; bei Dexamethasonsuppression 0, 15 bis 1, 0 und bei Schwangerschaft 3,0 bis 7,8. Diese Werte entsprechen jenen, die mit üblichen Methoden, wie der Gleichgewichtsdialyse, ermittelt werden.

In erfindungsgemäss zu verwendenden Copolymerisaten eingeschlossene Antikörper wurden auch zur Bestimmung von Testosteron herangezogen. Die Arbeitsweise entsprach im wesentlichen der vorstehend beschriebenen Bestimmung des Cortisols. Es wurden jedoch 160 mg Antikörpergel verwendet, 1 ml Inkubationslösung in die Säulchen gesaugt sowie mit 1580 pl H-Testosteronlösung einer Konzentration von 270 pg/100 pl die Proteinelution durchgeführt. Es ergab sich eine formale Sensitivität von 10 pg/ml.

Claims

PATENTANSPRUCH : Verwendung von in Copolymerisaten aus Acrylamid und einer oder mehrerer der Verbindungen Acrylsäure, Methacrylsäure, Methacrylamid, Acrylsäurederivate, Acrylsäuresalze, Methacrylsäure- <Desc/Clms Page number 5> derivate, Methacrylsäuresalze und Methacrylamidderivate eingeschlossenen Antikörpern zur immunologischen Bestimmung ungebundener Hormone oder Pharmaka.