-
Verfahren zur Untersuchung von Serum-Thyroxin, durch das Änderungen
des Gehaltes an thyroxin-bindendem Globulin durch physiologische Bedingungen kompensiert
werden Die Schilddrüse ist eine der wichtigsten Drüsen des endoeinen Systems. Ihre
Hauptfunktion ist die Regulierung des Zellstoffwechsels durch Synthese und Sekretion
von zwei Hormonen, Trijodthyronin (T3) und Tetrajodthyronin (Thyroxin oder T4).
Nachdem die Hormone von der Schilddrüse abgegeben sind, werden sie hauptsächlich
von drei Plasmaproteinen gebunden. Diese sind thyroxin-bindendes Globulin (TBG),
an das die Bindung am festesten ist; Prealbumin, an das die Bindung mit mittlerer
Affinität erfolgt; und Albumin, an das die Bindung verhältnismäßig schwach ist.
Zur Messung der Aktivität der Schilddrüse sind eine Anzahl in vitro-Tests entwickelt
worden. Eines der ersten Verfahren zur Messung des Gesamtserumthyroxins, das auf
dem Prinzip der konkurrierenden
Proteinbindung beruhte, wurde 1960
von R.P.Ekins in Clin.
-
Chim, Acta, 5:453, 1960, beschrieben und vom Autor als "Saturation
Analysis" bezeichnet. Ekins extrahierte das Thyroxin vom Serum durch Fällung mit
Butanol. Durch eine elektrophoretische Technik bestimmte er die Globulin-zu-Albumin-Verschiebung
von Thyroxin, die durch die Zugabe von Tracer-Thyroxin verursacht wurde. Kurz danach
beschrieben Murphy in Nature, 201:679, 1964, und Murphy und Patee in J.
-
Clin.Endocr.Metab., 24:187, 1964, ein rascheres und einfacheres Verfahren
zur Bestimmung des Gesamtserumthyroxins, das auf dem gleichen Prinzip beruhte und
das sie "Competitive Protein Binding Analysis" nannten. Durch eine einzige Extraktion
mit Äthanol wurde das Thyroxin von dem Serum abgetrennt; dann wurde der Thyroxingehalt
aus seiner Wirkung auf den Durchtritt einer Lösung von Standard-Tracer-Thyroxin
und Plasma durch eine Gelfiltrationskolonne bestimmt. Später wurde die Gelfiltration
durch die Verwendung von lockerem Anionenaustauscherharz in einem Reagenzglas ersetzt.
Wesentlich für solche Tests ist, daß TBG-gebundenes Thyroxin rasch und nach einem
nacharbeitbaren Verfahren von nicht-gebundenem Thyroxin abgetrennt werden kann,
nachdem sich bei dem Test das Gleichgewicht eingestellt hat. In den US-PS 3 206
602 und 3 376 114 sind eine Testmethode und eine Testvorrichtung beschrieben, bei
denen ein Harzschwamm verwendet wird, was gegenüber anderen, komplizierteren Maßnahmen
zur Trennung von gebundenem von nicht-gebundenem Thyroxin vorteilhaft ist. In seiner
derzeit verwendeten Form ist in einem solchen Harzschwamm ein fein-disperses Ionenaustauscherharz
verteilt. Nicht-gebundenes Thyroxin wird rasch und quantitativ an den Harzschwamm
gebunden, während TBG-gebundenes Thyroxin nicht gebunden wird.
-
Serum enthält nur eine geringe Menge an thyroxin-bindendem Globulin,
und die Bindungsstellen können leicht durch Zugabe geringer Mengen an Thyroxin abgesättigt
werden. Wenn eine geringe
Menge an 125J-Thyroxin als Tracer zugesetzt
wird, kann diejenige Thyroxinfraktion, die an Protein gebunden ist, bestimmt werden.
Wenn mehr und mehr nicht-gekennzeichnetes Standard-Thyroxin zugesetzt wird, sinkt
die Menge an durch 125J gekennzeichnetem gebundenem Thyroxin, da gekennzeichnetes
und nicht-gekennzeichnetes Thyroxin um die gleichen Bindungsstellen konkurrieren.
Wenn Gleichgewicht erreicht ist, wird durch die Harzschwamartechnik TBG-gebundenes
Thyroxin von nicht-gebundenem Thyroxin getrennt. Auf diese Weise kann eine Normkurve
aufgezeichnet werden. Wenn statt reinem Standard-Thyroxin ein Serumextrakt zugesetzt
wird, kann das darin enthaltene Thyroxin (durch die von ihm erzeugte Infreiheitsetzung
von gebundenem, gekennzeichnetem Thyroxin) durch Vergleich mit einer Normkurve gemessen
werden.
-
Die Methode der Bestimmung des Gesamtserumthyroxins beruht dann auf
der in vitro-Konkurrenz zwischen Thyroxin und Tracer-125J-thyroxin für die Bindungsstellen
von thyroxin-bindendem Globulin. Der Harzschwamm wirkt als eine sekundäre Bindungsstelle
für das nicht-gebundene Thyroxin. Die Harzschwammethode mißt diejenige Menge an
Thyroxin, die irreversibel an den Harzschwamm gebunden wird. Diese Menge hängt von
der Dissoziationskonstante der Thyroxinbindung mit Serumproteinen, der Anzahl Bindungsstellen
am Protein, den pH, der Temperatur und der Inkubationszeit unter den Testbedingungen
ab.
-
Da Thyroxin (T4) vorwiegend an thyroxin-bindendes Globulin (TBG) gebunden
wird und da der TBG-Pegel durch verschiedene physiologische Zustande, Hormone, Medikationen
und Schwangerschaft verändert wird, spiegeln sich diese Faktoren im Wert des Serumthyroxins,
und demzufolge kann die Messung irreführend sein und ein diagnostisches Problem
bei einer beträchtlichen Anzahl von Patienten darstellen. Beispielsweise ergeben
Schwangerschaft und dstrogen-Therapie erhEAte Thyroxinwerte, während Nephrose-Dilantin-
und Androgen-Therapie die Thyroxinwerte senken.
Serumthyroxin ist
ein Maß für die Gesamtmenge an Hormon in dem Serum. Es hängt direkt von dem protein-gebundenen
Anteil, der die Hauptmenge an Gesamtserumthyroxin darstellt, ab.
-
Thyroxin wird vorwiegend (im normalen Individuum 99,95%) an thyroxin-bindendes
Globulin (TBG) gebunden. Die Menge an TBG im Serum wird durch verschiedene physiologische
Zustände, Hormone, Medikationen und Schwangerschaft verändert, und diese Änderungen
reflektieren sich in den Meßwerten für das Gesamtserumthyroxin.
-
Das Dualkonkurrenzproteinbindungsverfahren (T4N) gemäß der Erfindung
ist ein Verfahren zur Kompensation der physiologischen Veränderungen im TBG, die
sich nicht in einer tatsächlichen Änderung des Thyroidstatus reflektieren. Diese
normalisierende Wirkung wird dadurch erreicht, daß das Serum des Patienten in zwei
Stufen verwendet wird, nämlich erstens um eine Probe für die Extraktion zu stellen
und zweitens um irreführende Abnormalitäten im ersten zu korrigieren. Das vom Patienten
extrahierte Thyroxin reagiert dann mit TBG, das mit radioaktiv gekennzeichnetem
Thyroxin gesättigt ist, unter Infreiheitsetzung einer proportionalen Menge an gekennzeichnetem
Thyroxin, das später durch ein anionisches Harz abgetrennt wird. Daraus resultiert
eine neue Bindung bis zu freiem Gleichgewicht, bei dem die Menge an Thyroxin-Harz-Bindung
der Anzahl der im zweiten Serumteil des Patienten verfügbaren Bindungsstellen umgekehrt
proportional ist. Die Gleichgewichtsumsetzung erfolgt zwischen den TBG in der Serum-125
probe und beispielsweise dem TBG-125J-Thyroxin. Die Standardkurve wird auch durch
die Zugabe von normalem Vergleichs serum zu jeder Standardmenge an Thyroxin normalisiert,
wobei der sich ergebende Abfall in der Harzbindung demjenigen in den normalen oder
pathologischen Schilddrüsenzuständen proportional ist. D.h.
-
er löscht aus; jedoch ist der Abfall disproportional in den
physiologischen
Bedingungen, so daß eine Normalisierung jener irreführenden abnormalen Werte resultiert.
Die sich aus der Anwendung des Verfahrens gemäß der Erfindung ergebende normalisierende
Wirkung unterstützt die Verminderung abnormaler Meßwerte zufolge physiologischer
Veränderungen, ist jedoch ohne Einfluß auf die normalen oder pathologischen Zustände
und korrigiert die Messung, so daß, verglichen mit den mit den herkömmlichen Proteinbindungsanalysen
auf der Grundlage der konkurrierenden Bindung, richtige Werte erhalten werden.
-
Die Dualkonkurrenzproteinbindungs<T4N)-Analyse gemäß der Erfindung
verringert also irreführende physiologische Änderungen im Serunthyroxin, ohne normale
oder pathologische Werte zu verzerren, und kompensiert besser als die herkömmlichen
Verfahren den aktuellen klinischen Zustand des Patienten.
-
In den Zeichnungen ist Figur 1 eine Auftragung der T3-Versuchswerte
beim normalen Serum sowie bei Schwangerschaft oder Östrogeneinnahme, Hypothyreose
und Hyperthyreose, Figur 2 eine Auftragung der T4-Versuchswerte beim normalen Serum
sowie bei Schwanger schaft oder Östrogeneinnahme, Hypothyreose und Hyperthyreose,
Figur 3 eine Auftragung der T4N-Versuchswerte beim normalen Serum sowie bei Schwangerschaft
oder Östrogeneinnahme, Hypothyreose und Hyperthyreose, und Figur 4 zeigt Standardkurven
für T4- und T4N-Versuche, bei denen 10 Serumprobe wieder in die untersuchte Probe
eingeführt wurden.
-
Vorzugsweise wird für die Durchführung des Verfahrens gemäß der Erfindung
ein Anionenaustauscherharz in einen Polyurethanschaumschwamm eingebracht. Das Harz
in dem Schwamm wirkt als sekundäre Bindungsstelle für das gekennzeichnete Thyroxin,
das TBG-125 dem Serum als TBG J-Thyroxin zugesetzt wird. Das extrahierte Thyroxin
reagiert mit dem TBG J-125 Thyroxin unter Infreiheitsetzung einer proportionalen
Menge an gekennzeichnetem Thyroxin.
-
Wenn dem GemiSch der Schwamm mit dem Anionenaustauscherharz zugesetzt
wird, reagiert das in Freiheit gesetzte gekennzeichnete Thyroxin mit dem Harz in
dem Schwamm. Die dem Serum zugesetzte Gesamtradioaktivität wird in einem Szintillationszähler
gezählt.
-
Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird das Serumgemisch verworfen,
und der Schwamm wird gewaschen. Dann wird die in dem Schwamm verbleibende Radioaktivität
bestimmt. Diese Menge repräsentiert das in Freiheit gesetzte gekennzeichnete Thyroxin.
-
125 Die prozentuale 125J-Thyroxinaufnahme durch den Harzschwamm kann
dann berechnet werden, und unter Verwendung einer Standardkurve kann die Konzentration
an Serumthyroxin in der unbekannten Probe ermittelt werden.
-
Beispiel 1 Das Verfahren gemäß der Erfindung wird wie folgt durchgeführt:
1 ml einer Serumprobe wird mit einem Lösungsmittel extrahiert.
-
Nach Eindampfen des Extraktes bis zur Trockne wird der Rückstand in
1 ml thyroxin-bindendem Globulin, das mit 125 J (TBG-125J) gesättigt ist, gelöst.
Dann werden wieder 0,002 ml (2 ) Serumprobe zugesetzt. Nach 10 Minuten bei Zimmertemperatur
hat sich das Gleichgewicht eingestellt, d.h. in dieser Zeit hat sich in Freiheit
gesetztes Thyroxin an TBG-Bindungsstellen an dem TBG-125J gesetzt und eine proportionale
Menge an 125J-Thyroxin in Freiheit gesetzt. Sowohl das freie radioaktive als auch
das nicht-radioaktive Thyroxin werden dann an die neuen offenen Bindungsstellen
an dem TBG, das durch die zweite Zugabe
von Serumprobe eingeführt
wurde, gebunden, so daß sich ein neues Gleichgewicht von gebundenem zu freiem Thyroxin,
das von der Anzahl verfügbarer TBG-Bindungsstellen in der Serumprobe abhängt, einstellt.
Das nicht-gebundene 125 J-Thyroxin wird dann durch ein anionisches Harz von demjenigen,
das an das TBG gebunden ist, getrennt. Wenn die prozentuale Aufnahme durch das Harz
mit einer Standardkurve, die aus Standardproben mit bekanntem Gehalt an Thyroxin,
denen 0,002 ml Vergleichsserum zugesetzt war, erhalten war, verglichen wird, so
kann die in den Serum anwesende Menge an Thyroxin bestimmt werden.
-
100 Patienten mit physiologischen und pathologischen Änderungen im
Serumthyroxin wurden untersucht. Zu der Gruppe gehörten 40 normale Patienten, 33
bis 35 schwangere Frauen oder Frauen, denen Östrogen verabreicht wurde, 13 Hypothyreose-Patienten
und 16 Hyperthyreose-Patienten.
-
Die Patienten wurden klinisch untersucht, und ihre T3-Aufnahme sowie
ihr T4- oder Serumthyroxin wurden durch Konkurrenzproteinbindungsanalyse und T4N
durch die Dualkonkurrenzproteinbindungsanalyse gemäß der Erfindung bestimmt. Die
Ergebnisse werden durch die Figuren 1 bis 3 veranschaulicht.
-
Die Ergebnisse der Tests auf Aufnahme von T3 durch das Harz ergaben
einen Mittelwert von 29,3% bei einer Standardabweichung von 5,8 und einem Normalbereich
zwischen 24 und 36, und in nur 52% der Fälle entsprachen die Werte den tatsächlichen
klinischen Zustand. Bei nur 12% der schwangeren Frauen oder der Frauen mit Östrogen-Therapie
lagen die Werte in den normalen Bereich (Figur 1).
-
Die Ergebnisse der Untersuchungen auf T4 oder Gesamtserumthyroxin
ergaben einen Mittelwert von 8,74 und eine Standardabweichung von 1,78 bei einem
Normalbereich zwischen 5,5 und 12,5, wobei in 7740 der Fälle die Werte dem tatsächlichen
klinischen Zustand entsprachen. 694 der schwangeren Frauen oder der Frauen mit Östrogen,
Therapie
hatten erhöhtes Serumthyroxin (Figur 2).
-
Das T4N oder normalisierte Serunthyroxin entsprach in allen untersuchten
Fällen dem klinischen Zustand. Alle schwangeren Frauen und Frauen mit Östrogen-Therapie
hatten Werte im Normalbereich von 5,5 bis 12,5 Cigo, d.h. die Übereinstimmung betrug
100% (Figur 3).
-
Bei den 100 Patienten, zu denen 33 bis 35 schwangere Frauen oder Frauen
mit Östrogen-Therapie gehörten, ergab die durch physiologische Veränderungen bewirkte
Erhöhung des TBG bei 23% der Gesamtzahl der Patienten bei Anwendung des T4-Verfahrens
einen zu hohen Wert für das Serumthyroxin. Dagegen zeigte bei diesen Patienten das
T4N oder normalisierte Serumthyroxin keine Änderungen gegenüber der Normalgruppe,
da der physiologische Thyroxinanstieg durch die zweite Zugabe von Serum normalisiert
wurde.
-
Die Dualkonkurrenzproteinbindungsanalyse verwendet das Serum des Patienten
in zwei Stufen mit offenen Bindungsstellen an der zweiten Probe von TBG zur Korrektur
einer abnormalen Erhöhung des Hormonspiegels zufolge der anfangs erhöhten Bindung.
Wenn Vergleichs-, Hyperthyreose- oder Hypothyreose-Serum zur Normalisierung der
Ergebnisse verwendet wurde, so erfolgte eine gewisse Senkung des Thyroxinwertes,
jedoch nicht in dem Ausmaß, wie wenn das Eigenserum des Patienten verwendet wurde.
Das zeigt an, daß TBG bei Schwangerschaft mehr offene Bindungsstellen hat'als bei
normalen, Hypothyreose- oder Hyperthyreose-Patienten anwesend sind. Die obigen Angaben
und Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengefaßt und in den Figuren 1
bis 3 veranschaulicht.
-
Tabelle 1 Serum Type Test Anzahl Anzahl mit % Über-Sera Überein-
einstimmung Bestimmung Euthyreose T-3 39 30 76,9 T-4 40 40 100 T-4N 40 40 100 Euthyreose
Schwangerschaft T-3 35 4 11,4 + T-4 33 9 27,3 Euthyreose und T-4N 34 34 100 Oralkontrazeptive
Hypothyreose T-3 13 6 46,1 T-4 13 13 100 T-4N 13 13 100 Hyperthyreose T-3 16 13
81,3 T-4 16 16 100 T-4N 16 16 100 Beispiel 2 10 ml venöses Blut werden vom Patienten
entnommen und in ein Reagenzglas eingebracht. Das Blut wird koagulieren gelassen,
und das Serum wird abgetrennt. Gewünschtenfalls kann die Abtrennung durch Zentrifugieren
der Probe, sobald sich eine Blutgerinnung zeigt, beschleunigt werden. 1 ml Serum
wird in ein Zentrifugenrohr, das 2 ml Äthanol enthält, überge£ührt und wenigstens
30 Sekunden-lang gründlich mit dem Äthanol vermischt, da ein unzureichendes Vermischen
eine unvollständige Extraktion des Thyroxins aus den Serum zur Folge hat. Dann läßt
man das Rohr 5 Minuten stehen, wonach es zentrifugiert wird.
-
3/10 ml der überstehenden Flüssigkeit werden dann in ein eigenes Polypropylenrohr
überführt. Da das Gesamtvolumen der Probe 3 ml betrug (1 ml Serum plus 2 ml Äthanol),
stellt die 0,3 ml-Probe 1/10 des in 1 ml Serum enthaltenen extrahierbaren Thyroxins
dar.
-
Dann wird die Probe eingedampft, und 1 ml 125J-TBG wird dem Bodenkörper
jedes Rohrs, sowohl der Serumprobe des Patienten als auch der Vergleichsprobe, zugesetzt.
10 # (0,010 ml) des unbehandelten Serums des Patienten werden dann der TBG-Lösung
in dem Rohr, das den (Thyroxin)-Extrakt des Serums des Patienten enthält, zugegeben.
Dann werden 10 Minuten oder mehr bei Raumtemperatur verstreichen gelassen, damit
das Gleichgewicht sich einstellen kann. Das ist wichtig, weil für den Erfolg der
Bestimmung wesentlich ist, daß das Gleichgewicht zwischen gekennzeichnetem und nicht-gekennzeichnetem
Thyroxin und dem TBG-Molekül sich einstellt. Nach dieser Gleichgewichtseinstellungsperiode
werden die Rohre in ein Eisbad von 40C getaucht. Nach 5 Minuten wird ein Harz/Schwamm
in jedes Rohr eingebracht, während es sich noch in dem Eisbad befindet, und die
Rohre werden 1 Stunde inkubiert. Dann erfolgt die Auszählung bei jedem Rohr mit
einem geeigneten Szintillationszähler für eine ausreichende Zeit, um die gewünschte
statistische Genauigkeit zu erzielen. Gewöhnlich ist eine Zeit von 1 Minute oder
eine Auszählung von 10 000 zufriedenstellend. Die Untergrundzählung wird substrahiert.
Nach der Inkubation wird die in dem Rohr anwesende Flüssigkeit verworfen, und der
Schwamm wird ausgepreßt, damit alle Flüssigkeit abgetrennt wird. 4 bis 5 ml Wasser
werden in die Rohre eingebracht; der Schwamm wird vierbis fünfmal ausgepreßt, und
das Wasser wird verworfen. Diese Stufe wird insgesamt dreimal wiedernolt. Dann wird
die Restaktivität in dem Schwamm bestimmt, wobei wiederum die Unter-125 grundzählung
substrahiert wird. Die prozentuale 125,-Thyroxinaufnahme durch den Schwamm wird
dann nach der folgenden Formel berechnet: Nettoauszählunq/min (zweite Zählung) x
100 = , 2 5 125j Nettoauszänlung/min (erste Zänlung) x /o u nal.m Unter Verwendung
der Standardkurve von Figur 4 wird von dem Schnittpunkt der Horizontalen in der
Höhe der prozentualen Aufnahme
(Y-Achse) mit der Kurve das Lot
auf die X-Achse gefällt, um die Konzentration an Serunthyroxin in der untersuchten
Probe zu ermitteln.
-
Beispiel 3 Unter Anwendung des Verfahrens von Beispiel 3 für die Serumthyroxinbestimmung
wurden Sera, die zuvor als Euthyreose- oder Normal serum, Hypothyreose-, Hyperthyreose-,
Euthyreose/Schwangerschaft-Serum oder Östrogen-Therapie (Oralkontrazeptiv) -Serum
klassiert waren, gemäß T3, T4 und T4N-Test untersucht. Aus den T3- und T4-Werten
wurden auch T7-Werte berechnet. In der folgenden Tabelle sind die Anzahl Sera jeder
Klasse, die nach jedem Testverfahren untersucht wurden, die Anzahl Sera, bei denen
richtige Werte erhalten wurden (d.h., bei denen das Testergebnis mit der klinischen
Diagnose übereinstimmte), und die prozentuale Anzahl, die durch jeden Test richtig
identifiziert wurde, zusammengestellt. Der normale Bereich ist für den T3-Versuch
25 bis 35% Aufnahme, für den T4- und T4N-Versuch 5,4 bis 13,0 g% und für den T7-Index
1,35 bis 4,55.
-
T a b e l l e II Serum Type Test Anzahl Anzahl mit % Uberein-Sera
überein- stimmung stimmung ~~~~ ~~~~~~ stimmung ~~~~~~~~~~~ Euthyreose T-3 104 76
69,1 T-4 96 91 94,8 T-7 94 93 98,9 T-4N 96 95 99,0 Euthyreose T-3 317 12 3,8 Schwangerschaft
T-4 356 146 40,2 + T-7 317 307 96,8 Euthyreose und T-4N 356 301 84,6 Oralkontrazeptive
Hypothyreose T-3 24 11 45,9 T-4 66 56 84,7 T-7 24 22 91,6 T-4N 66 60 84,6 Hyperthyreose
T-3 21 13 61,9 T-4 35 34 97,1 T-7 18 16 88,9 T-4N 35 32 91,4