DE4429409C1 - Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Proteinen und Kit zur Durchführung des Verfahrens - Google Patents
Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Proteinen und Kit zur Durchführung des VerfahrensInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur immuno
logischen Bestimmung von Proteinen oder Polypeptiden, die
als Tumormarker geeignet sind, in einer Probe einer biologi
schen Flüssigkeit durch deren Umsetzung mit immunologischen
Bindungspartnern für das zu bestimmende Protein oder Poly
peptid in einer Meßlösung und Gewinnung eines Meßergebnis
ses, das unter Verwendung von Standardkurven, die mit Hilfe
von Standardproben und eines Nullstandards erstellt werden,
ausgewertet wird, wobei in der biologischen Flüssigkeit mit
der Anwesenheit von weiteren Bestandteilen proteinischer
oder peptidischer Natur, die zu einer methodischen Meßwert
verfälschung führen, gerechnet werden muß.
Im Rahmen der klinischen Diagnostik hat der Nachweis und die
quantitative Bestimmung von Proteinen und Polypeptiden,
deren Auftreten in Körperflüssigkeiten von Patienten einen
Hinweis auf die Existenz von Tumorgewebe verschiedenen Typs
im Körper eines Patienten liefert und die daher als Tumor
marker bezeichnet werden, erhebliche Bedeutung. Als der
artige Tumormarker im Sinne der Verwendung dieses Begriffs
in der vorliegenden Anmeldung können beispielsweise genannt
werden - unter Verwendung der üblichen Abkürzungen - das
prostataspezifische Antigen (PSA), das carcino-embryonale
Antigen (CEA), die Tumorantigene CA 19-9, CA 1-5,
CA 72-4, CA 15-3, das Alpha-Fetoprotein (AFP), PAP und
andere dem Fachmann geläufige Tumorantigene proteinischer
oder polypeptidisicher Natur sowie insbesondere das Protein
Thyreoglobulin, auf das nachfolgend noch besonders eingegan
gen wird und für dessen Bestimmung die vorliegende Erfindung
besondere Bedeutung hat
(vgl. hierzu M. SCHLUMBERGER et al., Europ. J. Nuct. Med. 18 (1991), 152-157;
H. J. HEINZE et al., Thyroid 3 (1993) 1, 37-40).
Die vorliegende Erfindung wird
daher in erster Linie anhand der Bestimmung von humanem
Thyreoglobulin näher erläutert. Die Bestimmung der als
Tumormarker dienenden Proteine und Polypeptide erfolgt im
Rahmen der klinischen Diagnostik in erster Linie unter
Verwendung von immunologischen Bestimmungsverfahren oder
Immunoassays, deren wesentlichstes Kennzeichen es ist, daß
man die selektiven Bindungsreaktionen der als Antigene
wirkenden Tumormarker mit ihren immunologischen Bindungs
partnern ausnutzt. Dem Fachmann sind heute zahlreiche ver
schiedene Grundverfahren für die immunologische Bestimmung
von Proteinen oder Polypeptiden bzw. generell Antigenen be
kannt, die teilweise, wie der klassische RIA, nach einem
Konkurrenzprinzip arbeiten, indem beispielsweise die zu be
stimmende Substanz sowie eine bekannte Menge der gleichen,
jedoch markierten Substanz um in begrenzter Anzahl vorhande
ne Bindungsstellen eines immunologischen Bindungspartners,
z. B. eines Antikörpers, konkurrieren, oder die sogenannte
immunometrische Bestimmungen darstellen, bei denen mit
markierten Bindungspartnern gearbeitet wird. Die bekannteste
Variante der sogenannten immunometrischen Bestimmungen ist
der klassische "Sandwich-Assay", bei dem mittels eines
Überschusses eines ersten immunologischen Bindungspartners
die zu bestimmende Substanz aus der Probe extrahiert und an
eine Festphase gebunden wird, wonach die gesamte extrahierte
Menge der zu bestimmenden Substanz durch Umsetzung mit einem
weiteren markierten Bindungspartner, der an ein anderes
Epitop der zu bestimmenden Substanz bindet, markiert wird;
"DYNOtest Tg", Arbeitsanleitung, Henning Berlin GmbH;
"THYROGLOBULINE IRMA PASTEUR, Firmenschrift, E.R.J.A.
Diagnostics Pasteur, Marnes La Coquette, Frankreich.
Es sind dem Fachmann zahlreiche für eine Markierung geeigne
te Substanzklassen und Reaktionssysteme bekannt, zu denen
radioaktive Isotope, Enzyme oder Substrate einer enzymati
schen Reaktion gehören oder auch Substanzen, die aufgrund
ihrer Fluoreszenz oder ihres Beitrags zu einer Chemilumi
neszensreaktion als Marker dienen. Im Rahmen der vorliegen
den Erfindung ist die Wahl eines geeigneten bekannten Mar
kers nicht kritisch, und die vorliegende Erfindung erstreckt
sich grundsätzlich auf alle bekannten oder gegebenenfalls
noch gefundenen Marker.
Bei der immunologischen Bestimmung von Substanzen proteini
scher oder polypeptidischer Natur durch Umsetzung mit ge
eigneten immunologischen Bindungspartnern ist es für die
Gewinnung eines aussagekräftigen Meßwerts erforderlich, daß
die dem jeweiligen Bestimmungsverfahren zugrundeliegende
immunologische Bindungsreaktion zwischen den spezifischen
Bindungspartnern reproduzierbar abläuft. Es gibt nunmehr
jedoch Fälle, bei denen bekannt ist, daß die einem Bestim
mungsverfahren zugrundeliegende immunologische Bindungs
reaktion dadurch gestört werden kann, daß im Serum oder
anderen Körperflüssigkeiten einzelner Patienten Bestandteile
enthalten sind, die mit der immunologischen Bestimmungs
reaktion interferieren. Beispiele für derartige Bestandteile
sind reaktive Proteine oder Polypeptide, die ähnlich wie die
zu bestimmende Substanz an irgendeinen Partner der jeweili
gen immunologischen Bindungsreaktion binden und diesen damit
hindern, in die immunologische Bindungsreaktion einzutreten,
auf der das jeweilige Bestimmungsverfahren beruht. So können
beispielsweise bei bestimmten Patienten neben den zu bestim
menden Proteinen oder Polypeptiden auch Autoantikörper gegen
die gleichen Proteine der Polypeptide vorhanden sein, die
durch ihre Bindung die eigentliche Bindungsreaktion ganz
oder teilweise verhindern.
Andere mögliche Bestandteile, die die Messung verfälschen
können, sind Fremdproteine oder Fragmente des zu bestimmen
den Proteins, die mit einem der Bindungspartner reagieren,
z. B. einem für den Test vorgesehenen Antikörper, und somit
ebenfalls die Bestimmung stören. Die Anwesenheit derartiger
weiterer Bestandteile äußert sich in einer methodischen
Meßwertverfälschung, die dazu führt, daß kein oder ein zu
niedriger Meßwert erhalten wird, so daß auf der Basis des
erhaltenen Meßwerts keine zuverlässige Aussage mehr gemacht
werden kann.
Es ist daher wichtig, durch in der Probe vorhandene Bestand
teile verursachte methodische Meßwertverfälschungen klar zu
erkennen, was durch eine zusätzliche sogenannte Wiederfin-
dungsmessung geschieht
(s. z. B. R. SAPIN et al., Clin. Chem. 38 (1992) 9, 1820-1921;
"SYNCHROM ENZYME LINKED IMMUNE SORBENT ASSAY", Firmenschrift,
elias Medizintechnik GmbH, Freiburg 1990; "DYNOtest Tg", zweiter
vorläufiger Bericht über eine multizentrische Studie,
Henning Berlin GmbH).
Bei der Wiederfindungsmessung wird
einer weiteren Probe der gleichen vermessenen biologischen
Flüssigkeit eine geringe, bekannte Menge der zu bestimmenden
Substanz zugesetzt, und die Messung wird wiederholt. Wenn
das angewandte Bestimmungsverfahren für die gemessene Pa
tientenprobe korrekte Werte liefert, muß bei der Wieder
findungsmessung die der Wiederfindungsprobe zugesetzte Menge
der zu bestimmenden Substanz als eine entsprechende Erhöhung
des vorher in der ersten Probe gefunden Meßwerts erscheinen.
Dabei werden in der Regel Meßergebnisse innerhalb eines
bestimmten normierten Bereichs um den Bereich einer 100%igen
Wiederfindung (englisch: Recovery) als für eine Diagnose
verwertbare positive Meßergebnisse angesehen. Da eine Fehl
diagnose aufgrund einer Einzelbestimmung, die nicht durch
eine Wiederfindungsmessung überprüft wurde, ernste Folgen
haben kann, ist für die immunologische Bestimmung zahlrei
cher Substanzen, insbesondere von Tumormarkern, die Durch
führung einer Wiederfindungsmessung vorgeschrieben. Das
zeigt sich auch daran, daß für derartige Tests, die mit Wie
derfindungs- oder Bestätigungsmessung durchgeführt werden
müssen, erhöhte Gebührensätze angesetzt werden, die das
Mehrfache einfacher immunologischen Untersuchungen betragen
(vgl. z. B. in Deutschland die "Vertragsgebührenordnung der
Kassenärztlichen Bundesvereinigung" (EBW), Januar 1994, Pos. 4152, "huma
nes Thyreoglobulin mit Bestätigungstest").
Die Durchführung einer zweiten Wiederfindungs- oder Bestäti
gungsmessung ist mit einer Reihe von Nachteilen verbunden.
Einmal verteuert der Zwang zur Durchführung der Wiederfin
dungs- oder Bestätigungsmessung eine diagnostische Untersu
chung erheblich, zum anderen wird in der Praxis immer wieder
beobachtet, daß vorschriftswidrig auf die Wiederfindungs-
und Bestätigungsmessung verzichtet wird, so daß die Gefahr
einer unrichtigen Interpretation des erhaltenen Meßergebnis
ses durch den Arzt besteht. Zum anderen wird eine Wieder
findungsmessung so durchgeführt, daß zwar einerseits ein
genau gleiches Volumen einer ursprünglichen Patientenprobe
wie bei der Originalmessung vermessen wird, daß die Messung
jedoch aufgrund der in Form einer Lösung zugesetzten bekann
ten Menge der Substanz in einem etwas größeren Flüssigkeits
volumen als die Originalmessung erfolgt. Zwei getrennte
Messungen wurden bisher jedoch als unumgänglich angesehen,
und die oben genannten Nachteile wurden in Kauf genommen.
Eine etwas andere Situation liegt in Fällen vor, bei denen es
um die Messung des sogenannten "freien Anteils" einer zu
bestimmenden Substanz, insbesondere eines Hormons wie Thyroxin
oder Triiodthyronin, geht. Die Menge des freien Anteils einer
solchen Substanz in z. B. einem Serum kann bei an sich ver
gleichbaren Absolutkonzentrationen aufgrund veränderlicher
Mengen an physiologischen Bindeproteinen sehr unterschiedlich
sein. Aufgrund seiner physiologischen Bedeutung soll bei
solchen Messungen möglichst selektiv der freie Anteil oder
ggf. die diesen Anteil beeinflussende Bindungskapazität der
physiologischen Bindeproteine in einem Serum gemessen werden.
Dabei besteht das Hauptproblem darin, durch die Messung nach
Möglichkeit das natürlich existierende Gleichgewicht frei/
gebunden nicht zu stören. Es geht nicht um die Überprüfung
einer Messung auf systematische Meßfehler durch eine gesonder
te Wiederfindungsmessung.
Ein Verfahren zur Messung des freien Anteils von Thyroxin ist
beispielsweise beschrieben in der EP-A-0 015 687. In der
Firmenschrift zum Enzymun-Test® System der Fa. Boehringer
Mannheim ist ein etwas anderes Verfahren beschrieben, bei dem
im Zusammenhang mit der Messung von freiem Thyroxin die Thyro
xinbindungskapazität eines Serums gemessen wird, wobei man
während der Messung neben einem markierten Thyroxin u. a. auch
noch exogenes Thyroxin zusetzt. Es geht dabei jedoch um ein
normales Bestimmungsverfahren, ohne daß eine Problematik eine
Rolle spielt, die bei anderen Arten von Messung, insbesondere
der Messung von Proteinen, eine gesonderte Wiederfindungsmes
sung erforderlich macht. Das als exogenes Thyroxin in einem
Kit zur Durchführung des Verfahrens vorhandene Reagens ist
kein Protein oder Polypeptid.
Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein gattungs
gemäßes Verfahren, d. h. ein Verfahren zur immunologischen
Bestimmung von Proteinen oder Polypeptiden, die als Tumor
marker geeignet sind, in einer Probe einer biologischen
Flüssigkeit durch deren Umsetzung mit immunologischen Bin
dungspartnern für das zu bestimmende Protein oder Polypeptid
in einer Meßlösung und Gewinnung eines Meßergebnisses, das
unter Verwendung von Standardkurven, die mit Hilfe von
Standardproben und eines Nullstandards erstellt werden,
ausgewertet wird, wobei in der biologischen Flüssigkeit mit
der Anwesenheit von weiteren Bestandteilen proteinischer
oder peptidischer Natur, die zu einer methodischen Meßwert
verfälschung führen, gerechnet werden muß, so auszugestal
ten, daß bei der Originalmessung direkt festgestellt werden
kann, ob die durchgeführte Bestimmung mit einer methodischen
Meßwertverfälschung belastet ist.
Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß man
bei einem Verfahren der gattungsgemäßen Art sowohl die
Bestimmung der Proteine oder Polypeptide in der Probe als
auch die Erstellung der Standardkurven mit Hilfe der Stan
dardproben und des Nullstandards in Gegenwart einer der
Meßlösung von einer vornherein zugesetzten festen Menge des
zu bestimmenden Proteins oder Polypeptids durchführt und daß
man die Auswertung so vornimmt, daß man einen für eine Probe
erhaltenen Meßwert, der oberhalb des für den Nullstandard
erhaltenen Meßwerts liegt, als positiven Meßwert ansieht,
der die Anwesenheit und Konzentration des zu bestimmenden
Proteins oder Polypeptids anzeigt, während man einen für
eine Probe erhaltenen Meßwert, der unterhalb des Meßwerts
für den Nullstandard liegt, als Zeichen für eine methodische
Meßwertverfälschung ansieht.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren so durch
geführt, daß man die Bestimmung in einem speziellen Proben
gefäß durchführt, das die zugesetzte Menge des Proteins oder
Polypeptids bereits vorgelegt enthält. Das Probengefäß ist
vorzugsweise ein beschichtetes Teströhrchen (coated tube,
CT) oder eine beschichtete Mikrotiterplatte, die außerdem
einen immobilisierten immunologischen Bindungspartner, z. B.
einen Antikörper, für das zu bestimmende Protein oder Poly
peptid aufweist.
Vorzugsweise wählt man die bekannte zugesetzte Menge des
Proteins oder Polypeptids so, daß sie einen signifikanten
Basis-Meßwert (Meßwert für den Nullstandard) liefert, was
erfahrungsgemäß dann gewährleistet ist, wenn die zugesetzte
Menge des Proteins oder Polypeptids bei der Messung im
Bereich des 5- bis 10fachen der Menge für die untere Nach
weisgrenze des Proteins oder Polypeptids im jeweiligen
speziellen immunologischen Bestimmungsverfahren liegt.
Eine für die Anmelder besonders interessante Ausführungsform
des erfindungsgemäßen Verfahrens betrifft die immunologische
Bestimmung von humanem Thyreoglobulin. Thyreoglobulin ist
ein hochmolekulares Protein, an dem die Schilddrüsenhormon
synthese stattfindet, und ist gleichzeitig der Hauptbestand
teil des Schilddrüsenkolloids. Ohne daß Thyreoglobulin
selbst eine direkte physiologische Wirkung aufweist, ist
sein Auftreten und seine Menge im Serum ein Zeichen für die
Aktivität, insbesondere Wachstumsaktivität, von Schilddrü
senzellen. Bei Gesunden liegt der Gehalt an Thyreoglobulin
im Bereich von etwa 10-50 ng Tg/ml. Liegt ein schnell
wachsendes Schilddrüsenkarzinom vor, ist der Thyreoglobulin
spiegel im Serum drastisch erhöht. Von besonderer Bedeutung
ist die Bestimmung von Thyreoglobulin jedoch im Zusammenhang
mit der Beobachtung des Erfolgs einer operativen Entfernung
eines Schilddrüsenkarzinoms, da nicht entfernte Karzinomzel
len und auch als Metastasen vorhandene Zellen des Karzinom
gewebes Thyreoglobulin erzeugen, das im Serum des Patienten
nachweisbar ist. So sollte nach einer Totalentfernung der
Schilddrüse der Thyreoglobulinwert auf 0 ng Tg/ml sinken.
Ist noch Thyreoglobulin nachweisbar, bedeutet das, daß der
Körper noch Schilddrüsengewebe, evtl. in Form von Metastasen
des Karzinoms, enthält.
Bei der Bestimmung von humanem Thyreoglobulin ist eine
Wiederfindungsmessung deshalb bisher unbedingt erforderlich,
weil bei einem signifikanten Prozentsatz von Patienten
gleichzeitig Bestandteile auftreten, die zu einem methodi
schen Meßfehler der oben beschriebenen Art im Sinne einer
Erniedrigung des Meßwerts für die in der Probe tatsächlich
vorhandene Konzentration der zu bestimmenden Substanz füh
ren. Derartige Bestandteile sind insbesondere anti-Tg-Auto
antikörper, es ist jedoch davon auszugehen, daß die Proben
auch noch andere Bestandteile enthalten können, die die Be
stimmung stören, da nicht immer eine Parallelität zwischen
den Ergebnissen von Wiederfindungsmessung und einer direkten
Bestimmung der Menge an anti-Tg-Autoantikörpern festgestellt
wird. Als derartige andere Bestandteile werden z. B. protei
nische oder polypeptidische Bruchstücke des Thyreoglobulins
diskutiert.
Wenn im Rahmen der vorliegenden Erfindungsbeschreibung
Thyreoglobulin vorwiegend als Tumormarker bezeichnet wird,
ist damit keinerlei Einschränkung des erfindungsgemäßen
Verfahrens auf irgendeinen bestimmten Meßzweck beabsichtigt,
sondern jede Bestimmung von Thyreoglobulin nach einem Ver
fahren, das die wesentlichen erfindungsgemäßen Merkmale
aufweist, wird von der vorliegenden Erfindung umfaßt. Das
selbe gilt für die Messung anderer Tumormarker, wenn diese
auch noch zu anderen Zwecken als zum Nachweis eines Tumors
bestimmt werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wurde überraschend festge
stellt, daß ohne signifikante Einbußen an Meßgenauigkeit auf
die Wiederfindungsmessung bei der Bestimmung von humanem
Thyreoglobulin (hTg) verzichtet werden kann, wenn man alle
Bestimmungen sowie auch die Erstellung der Standardkurven in
Gegenwart einer von vornherein vorgelegten festen Zusatz
menge an humanem Thyreoglobulin durchführt, d. h. unter
Bedingungen, unter denen der Meßwert für das Basissignal für
hTg künstlich erhöht ist. Es zeigte sich, daß eine vorgeleg
te Menge an Thyreoglobulin keinen Einfluß auf die Genau
igkeit der Bestimmung der Thyreoglobulin-Konzentration in
der untersuchten Probe hat, wenn die Bestimmung durch keine
methodische Meßwertverfälschung belastet ist, so daß das
Bestimmungsverfahren in einem solchen Falle genauso exakt
ist, wie das bisher für die Originalbestimmung verwendeten
Verfahren.
Sind in der biologischen Probe jedoch Substanzen vorhanden,
die das immunologische Bestimmungsverfahren stören, indem
sie beispielsweise bei einem immunometrischen Bestimmungs
verfahren nach der Sandwich-Methode die korrekte Ausbildung
des Sandwiches verhindern, äußert sich das bei dem erfin
dungsgemäßen Verfahren dann, wenn die Probe kein dem Patien
ten entstammendes Thyreoglobulin enthält, auf jeden Fall als
Ermittlung eines zu geringen Meßwerts für die zugesetzte
Thyreoglobulinmenge, d. h. als Meßwert, der unter dem für den
Nullstandard liegt.
Wenn die Patientenprobe gleichzeitig sowohl Thyreoglobulin
als auch Bestandteile enthält, die zu einer methodischen
Meßwertverfälschung führen, überlagern sich beide Effekte.
Der aus der Bestimmung erhaltene Meßwert ist jedoch trotzdem
in der Regel von hoher klinischer Wertigkeit: Wird eine
Abweichung von dem für die Zusatzmenge zu erwartenden Meß
wert nach unten beobachtet, ist das ein sicherer Hinweis auf
eine methodische Meßwertverfälschung, und der entsprechende
Wert ist zu verwerfen bzw. nach einem anderen Verfahren zu
überprüfen. Wird eine Thyreoglobulinmenge ermittelt, die
über der Erwartungsmenge (bei Gesunden 10-50 ng Tg/ml,
nach Totaloperation 0 ng Tg/ml) liegt, ist das auf jeden
Fall ein Hinweis auf einen erhöhten Thyreoglobulinspiegel im
untersuchten Serum, so daß auf jeden Fall eine wenigstens
qualitative Aussage gemacht werden kann und ggf. weitere
Untersuchungen veranlaßt werden können.
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet stets dann einen Vor
teil, wenn auf eine Wiederfindungsmessung verzichtet wurde,
da die Gefahr, einen unrichtigen Meßwert als korrekten
anzusehen, durch die deutliche Erkennbarkeit methodischer
Meßfehler in der Originalmessung stark verringert ist. Das
erfindungsgemäße Verfahren läßt sich ferner in Zweifels
fällen auf einfache Weise als Bestätigungsmessung durch
führen. In diesem Falle wiederholt man den Test einfach mit
einer anderen Verdünnung der Patientenprobe, wobei man im
gleichen Testvolumen arbeitet. Da sich durch die Verdünnung
der Patientenprobe die Relation von fester Zusatzmenge zu
den Bestandteilen der Patientenprobe verändert, wird ein
gegebenenfalls vorher maskierter Meßwert bei der anderen
Verdünnung als Abweichung von dem Erwartungswert für die
Zusatzmenge erkennbar. Das Verfahren hat auch in diesem Fall
den zusätzlichen Vorteil, daß mit gleichen Probenvolumina
gearbeitet werden kann, d. h. eine denkbare Beeinflussung des
Meßwerts durch die bei den bisherigen Wiederfindungsmessun
gen erhöhten Volumina der Meßlösungen vermieden werden kann.
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet ferner den erheblichen
praktischen Vorteil, daß es auch vollautomatisiert auf
üblichen Vollautomaten zu Durchführungen immunologischer
Bestimmungen durchgeführt werden kann, für die die bisher
erforderlichen Wiederfindungsmessungen ein unlösbares Pro
blem darstellten. In einem solchen Falle muß nicht unbedingt
mit Teströhrchen gearbeitet werden, die die Zusatzmenge in
lyophilisierter Form als Wandbeschichtung enthalten, sondern
es ist dann auch möglich, die feste Zusatzmenge in Form
einer Lösung durch den Vollautomaten in alle Meßröhrchen
geben zu lassen.
Wie das nachfolgende Anwendungsbeispiel zeigt, erweist sich
in der Praxis das erfindungsgemäße Verfahren in Einzelfällen
sogar als genauer als das bisherige, mit Wiederfindungs
messung durchzuführende Bestimmungsverfahren, indem es eine
sicherere Unterscheidung zwischen korrekten und unkorrekten
Meßwerten in der Grauzone, in der Zweifel an der Korrektheit
eines erhaltenen Meßergebnisses bestehen, ermöglicht.
Die Durchführbarkeit und Zuverlässigkeit des erfindungs
gemäßen Verfahrens wurde im Vergleich mit einem kommerziel
len Assay der Anmelderin, der als DYNOtest® Tg vertrieben
wird, untersucht, wobei das erfindungsgemäße Verfahren als
Ausgestaltung des genannten Assays direkt auf diesem auf
baut.
Zur Erläuterung wird Bezug genommen auf zwei Tabellen und
drei Figuren mit graphischen Darstellungen, die zeigen:
Fig. 1 zeigt typische Standardkurven für die Bestimmung von
hTg nach dem bekannten Test (b) und nach dem erfindungs
gemäßen Verfahren (a);
Fig. 2 zeigt die Korrelation des bekannten Tests mit dem
erfindungsgemäßen Test für Patientenproben mit korrekter
Wiederfindung, und
Fig. 3 zeigt eine entsprechende Korrelation für Proben, bei
denen aufgrund der Wiederfindungsversuche meßwertverfäl
schende Bestandteile in der Patientenprobe angenommen werden
mußten.
Der bekannte DYNOtest® Tg ist ein immunoradiometrischer
Assay zur Bestimmung von Thyreoglobulin (Tg) im Humanserum.
Dabei werden zwei antigenspezifische monoklonale Antikörper,
die das hTg (als Antigen) an jeweils verschiedenen Determi
nanten erkennen, im Überschuß eingesetzt. Einer der beiden
Antikörper ist radioaktiv markiert (Tracer), der andere ist
auf der Innenseite der Teströhrchen fixiert (coated-tube-
Technik).
Im Verlaufe der Inkubation der Probe mit den Assay-Reagen
zien reagieren beide Antikörper nacheinander mit den hTg-
Molekülen der Probe, wobei ein "Sandwich-Komplex" entsteht,
der auf der Röhrchenoberfläche haftet. Nach Reaktionsende
wird der verbliebene Tracerüberschuß in der Flüssigphase
durch Absaugen oder Dekantieren entfernt und verworfen.
Nach zweimaligem Waschen wird dann die Radioaktivität der
Röhrchen gemessen. Sie ist der hTg-Konzentration der jewei
ligen Probe bei Abwesenheit störender Bestandteile direkt
proportional. Anhand der dem Assay beigegebenen Standards
und eines Nullstandards wird eine Standardkurve erstellt,
woraus über die für die einzelnen Proben gemessenen Radio
aktivitäten der Patientenseren die Konzentration des darin
enthaltenen hTg ermittelt wird.
Ein Assay der genannten Art wird als Kit (Reagenziensatz)
vertrieben, der folgende Komponenten, in Mengen ausreichend
für 100 (2 × 50) Bestimmungen, enthält:
- 1. 125 I-anti-hTg-Antikörper (monoklonal; Maus) als radio aktiven Tracer in zwei Fläschchen à 10,5 ml, gebrauchsfer tig, Aktivität jeweils ca. 225 kBq (bei 70% Zählausbeute) entsprechend ca. 180 000 IpM/200 µl.
- 2. Coated tubes (Teströhrchen) beschichtet mit anti-hTg- Antikörper (monoklonal; Maus); 2 × 50 Stück; gebrauchsfertig.
- 3. 1 Fläschchen à 3 ml Humanserum als hTg-Nullstandard, ge brauchsfertig; definiert als 0,2 ng Tg/ml. Der Nullstandard ist auch als Verdünnungsmittel für Patientenseren vorgese hen, wenn relativ hohe hTg-Konzentrationen zu erwarten sind.
- 4. hTg-Standards (Humanserum), 6 Fläschchen à 0,4 ml; ge brauchsfertig; Konzentrationen, 1,6; 3,1; 12,5; 50; 200; 500 ng Tg/ml.
- 5. Tg-Wiederfindungsprobe, 1 Fläschchen à 0,7 ml; gebrauchs fertig; Konzentration: 500 ng Tg/ml. Pro Wiederfindungs messung werden davon 10 µl in die Meßlösung pipettiert.
- 6. Waschlösung in 2 Fläschchen à 10 ml als Konzentrat, das vor Gebrauch mit destilliertem Wasser auf jeweils 500 ml aufzufüllen ist.
- 7. Drei Kontrollseren I, II und III (Humanserum) in 3 Fläschchen à 0,4 ml; gebrauchsfertig.
Bei einem Test werden in die gekennzeichneten Teströhrchen
jeweils 50 µl Tg-Standard pipettiert, und in die Röhrchen
für die Proben werden je 50 µl Patientenserum pipettiert.
Für den Nullstandard und die Patientenproben ist ein par
alleler Wiederfindungsversuch erforderlich, wozu ein weite
rer Satz Teströhrchen mit 50 µl Patientenserum mit jeweils
10 µl Wiederfindungsprobe versetzt werden. Auch ein Röhrchen
mit 50 µl Nullstandard wird mit 10 µl Wiederfindungsprobe
versetzt.
Anschließend wird in jedes Teströhrchen 200 µl Tracer pipet
tiert, und nach einer Inkubation über Nacht bei Raumtempera
tur werden die Teströhrchen mit Waschlösung versetzt, dekan
tiert oder abgesaugt, wobei das Waschen zweimal wiederholt
wird.
Anschließend wird die Radioaktivität eines jeden Röhrchens
in einem gamma-Counter gemessen.
Aus den Messungen der sechs Standardproben wird eine Stan
dardkurve erhalten, und der Meßwert für die Patientenseren
wird unter Bezugnahme auf die genannte Standardkurve ausge
wertet. Eine typische Standardkurve für den bekannten
DYNOtest® Tg ist als Kurve b) in Fig. 1 gezeigt.
Der vorgeschriebene Wiederfindungsversuch dient dazu, metho
dische Verfälschungen des Meßwerts zu entdecken. Bei unge
störter Wiederfindung, d. h. wenn sich keine die hTg-Bestim
mung verfälschenden Faktoren im Patientenserum finden, muß
der hTg-Wert im Wiederfindungsversuch um etwa 100 ng/ml
(entsprechend der zugesetzten Wiederfindungsprobe) höher
liegen als der hTg-Wert der parallel bestimmten Originalser
umprobe.
Die Wiederfindung errechnet sich nach der folgenden Formel
In der obigen Formel steht (W) für das Meßergebnis
einer Patientenprobe unter Zusatz der Wiederfindungsprobe
und (Probe) steht für den Meßwert einer Originalprobe.
Bei dem Verfahren wird weiterhin empfohlen, die methodische
Verläßlichkeit der Durchführung der Wiederfindung zu über
prüfen. Dazu wird ein zusätzlicher Wiederfindungsversuch für
den Nullstandard durchgeführt, der ca. 100 ng Tg/ml ergeben
muß, entsprechend 100% Wiederfindung.
Der Toleranzbereich für die korrekte Wiederfindung liegt
zwischen 70 bis 130% oder 80 bis 120%.
Bei dem DYNOtest® Tg-Assay wird eine untere Nachweisgrenze
von < 1 ng Tg/ml als Assayempfindlichkeit erhalten.
Zur Durchführung und Überprüfung des erfindungsgemäßen Ver
fahrens wurde der Kit (Reagenziensatz) bzw. das Meßprotokoll
des obigen DYNOtest® Tg dadurch abgewandelt, daß in alle
Teströhrchen, die bereits mit dem monoklonalen anti-hTg-
Antikörper beschichtet waren, eine Lösung von 0,3 ng hTg in
100 µl phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) mit einem Gehalt
an 1% bovinem Serumalbumin (BSA) pipettiert wurde. Durch
anschließende Lyophilisierung wurde die in die Teströhrchen
gegebene Menge an hTg in die Beschichtung der Teströhrchen
wände überführt.
Ein Reagenziensatz für die Durchführung des erfindungsgemä
ßen Verfahrens umfaßt keine gesonderte Tg-Wiederfindungs
probe.
Es wurde in einem Parallelversuch nach dem erfindungsgemäßen
Verfahren auf übliche Weise, jedoch in Anwesenheit der
zugesetzten Menge an hTg, eine Standardkurve (Kurve a) in
Fig. 1) erstellt, die der-für den kommerziellen DYNOtest®
Tg entsprach, und beide Standardkurven wurden zur Auswertung
von 179 Patientenseren herangezogen, die jeweils in beiden
Assaysystemen vermessen wurden.
Die nachfolgende Tabelle 1 gibt die Daten für die Erstellung
der beiden Standardkurven a) und b) in Fig. 1 wieder, und
zwar in IpM (Impulse pro Minute).
Tabelle 2 zeigt die erhaltenen Ergebnisse, und zwar in der
ersten Spalte die willkürliche Patientenkennziffer, in der
zweiten Spalte den nach dem erfindungsgemäßen Verfahren
erhaltenen Meßwert, in der dritten Spalte den nach dem be
kannten Verfahren erhaltenen Meßwert sowie in der vierten
Spalte die errechnete Wiederfindung (Recovery) für das bekannte Ver
fahren.
Die durch Auswertung der ursprünglichen Meßsignale erhalte
nen Meßergebnisse sind angegeben als ng/ml mit Ausnahme
derjenigen Fälle, bei denen in dem erfindungsgemäßen Test
anhand einer Erniedrigung des Meßwerts für die zugesetzte
Tg-Menge das Auftreten einer systematischen Meßwertverfäl
schung festgestellt wurde. In diesen Fällen ist das Meß
ergebnis als Prozentsatz des für die Zusatzmenge erwarteten
Basis-Meßwerts angegeben.
In Tabelle 2 sind zwei Klassen von Patientenseren zu erken
nen, nämlich solche, bei denen im bekannten Test im Wieder
findungsversuch die Korrektheit der Probenmessung bestätigt
wurde, sowie solche, bei denen im Wiederfindungsversuch das
Auftreten einer systematischen Meßwertverfälschung festge
stellt wurde.
Fig. 2 zeigt, daß eine hervorragende Korrelation zwischen
den Ergebnissen des bekannten DYNOtest® sowie des erfin
dungsgemäßen Tests bestand, wobei der Korrelationskoeffi
zient 0,99 betrug.
Fig. 3 zeigt ferner, daß auch bei den Proben mit nichtkor
rekter Wiederfindung im wesentlichen eine gute Korrelation
zwischen den beiden Tests bestand (Korrelationskoeffizient
0,79), daß nach dem erfindungsgemäßen Verfahren jedoch eine
ganze Reihe von Proben, die nach dem bekannten Test aufgrund
einer Wiederfindung von mehr als 70% als noch akzeptable
Meßergebnisse zu gelten hatten, bei dem erfindungsgemäßen
Verfahren aufgrund einer stärkeren Erniedrigung des Meßwerts
für das Basissignal deutlich als mit einem Meßfehler behaf
tet erschienen.
Während bei dem bekannten Verfahren die gezeigten Werte mit
zwei Messungen pro Probe erhalten wurden, d. h. nämlich für
die Originalprobe und Probe + Wiederfindung, wurden nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren entsprechende Meßergebnisse von
gleicher Präzision und Aussagekraft mit einer einzigen
Bestimmung erhalten.
Damit erweist sich das erfindungsgemäße Verfahren als ein
dem bekannten Verfahren im Hinblick auf die Meßgenauigkeit
äquivalentes Verfahren, hat darüber hinaus jedoch den Vor
teil, daß bei Meßwerten, die nach dem bekannten Verfahren
nur die Aussage "kein oder so gut wie kein Tg" (Meßwerte im
Bereich von 0 ng Tg/ml in der Tabelle) liefern, bei dem
erfindungsgemäßen Verfahren gleichzeitig festgestellt wird,
ob der erhaltene Meßwert korrekt sein kann oder ob er auf
grund einer festgestellten Erniedrigung des Basis-Meßwerts
für die Zusatzmenge in einer mit einem methodischen Fehler
behafteten Messung ermittelt wurde.
Claims (10)
1. Verfahren zur immunologischen Bestimmung von Proteinen
oder Polypeptiden, die als Tumormarker geeignet sind, in
einer Probe einer biologischen Flüssigkeit durch deren
Umsetzung mit immunologischen Bindungspartnern für das zu
bestimmende Protein oder Polypeptid in einer Meßlösung und
Gewinnung eines Meßergebnisses, das unter Verwendung von
Standardkurven, die mit Hilfe von Standardproben und eines
Nullstandards erstellt werden, ausgewertet wird,
dadurch gekennzeichnet, daß man sowohl die
Bestimmung der Proteine oder Polypeptide in der Probe als
auch die Erstellung der Standardkurven mit Hilfe der Stan
dardproben und des Nullstandards in Gegenwart einer der
Meßlösung von vornherein zugesetzten festen Menge des
zu bestimmenden Proteins oder Polypeptids durchführt und daß
man die Auswertung so vornimmt, daß man einen für eine Probe
erhaltenen Meßwert, der oberhalb des für den Nullstandard
erhaltenen Meßwerts liegt, als positiven Meßwert ansieht,
der die Anwesenheit und Konzentration des zu bestimmenden
Proteins oder Polypeptids anzeigt, während man einen für
eine Probe erhaltenen Meßwert, der unterhalb des Meßwerts
für den Nullstandard liegt, als Zeichen für eine methodische
Meßwertverfälschung ansieht.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
man die Bestimmung der Proben und die Umsetzungen für die
Erstellung der Standardkurven in einem Probengefäß durch
führt, das die zugesetzte Menge des Proteins oder Polypep
tids als Wandbeschichtung vorgelegt enthält.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß
das Testgefäß ein beschichtetes Teströhrchen (CT) oder eine
beschichtete Mikrotiterplatte ist, die außerdem einen immo
bilisierten immunologischen Bindungspartner für das zu
bestimmende Protein oder Polypeptid aufweisen.
4. Verfahren nach Anspruch I, 2 oder 3, dadurch gekenn
zeichnet, daß das zu bestimmende Protein Thyreoglobulin (Tg)
ist.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch
gekennzeichnet, daß man die zugesetzte Menge des Proteins
oder Polypeptids so wählt, daß sie bei der Messung im Be
reich der 5- bis 10fachen Menge für die untere Nachweis
grenze für das zu bestimmende Protein oder Polypeptid im
jeweiligen speziellen immunologischen Bestimmungsverfahren
liegt.
6. Verfahren nach den Ansprüchen 4 oder 5, dadurch gekenn
zeichnet, daß das Bestimmungsverfahren ein an sich bekanntes
immunometrisches Bestimmungsverfahren unter Verwendung von
zwei monoklonalen, im Überschuß eingesetzten Antikörpern
ist, die an verschiedene Epitope des zu bestimmenden Pro
teins oder Polypeptids binden und von denen einer markiert
oder markierbar ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, dadurch
gekennzeichnet, daß man eine zugesetzte Menge an Thyreoglo
bulin im Bereich von 0,1 bis 0,5 ng Tg/CT, vorzugsweise von
0,3 ng Tg/CT, in lyophilisierter Form in einem Teströhrchen
für ein Meßlösungs-Volumen von 250 µl vorlegt.
8. Kit zur Bestimmung eines Protein oder Polypeptids nach
einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß er
neben den üblichen Kitkomponenten Tracerlösung, Standardlö
sungen, Nullstandard und Waschflüssigkeit ein Teströhrchen
aufweist, das neben einem immobilisierten immunologischen
Bindungspartner für das zu bestimmende Protein oder Polypep
tid eine feste Menge des zu bestimmenden Proteins oder
Polypeptids enthält.
9. Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die
feste Menge des zu bestimmenden Proteins oder Polypeptids in
lyophilisierter Form als Wandbeschichtung des Teströhrchens
vorliegt.
10. Kit nach einem der Ansprüche 8 oder 9, dadurch gekenn
zeichnet, daß das zu bestimmende Protein humanes Thyreoglo
bulin ist.
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