DE3125538A1 - "immunometrische sandwich-assaymethode mit zweiseitiger cross-reaktion" - Google Patents
"immunometrische sandwich-assaymethode mit zweiseitiger cross-reaktion"Info
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Description
Immunometrische Sandwich-Assaymethode mit zweiseitiger
Cross-Reaktion
Die Erfindung bezieht sich allgemein auf immunologische Assaytechniken
zur Bestimmung eines Analyten im Serum und insbesondere auf eine Immunoassay-Sandwichtestmethode mit zweiseitiger
Cross-Reaktion, die bei der qualitativen und quantitativen Bestimmung des Spiegels von Kreatin-phospho-kinase MB-Isoenzym
(CK-MB) im menschlichen Serum besondere Anwendung findet.
Die herkömmlichen immunometrisehen Techniken basieren auf der
immunochemischen Reaktion zwischen einem markierten Antikörper und dem zu bestimmenden Analyten. Solche Antikörper werden
vorgegeben, damit sie mit dem speziellen Analyten spezifisch reagieren, und sie können in radioaktiver, fluoreszierender,
chemolumineszierender, enzymatischer oder in anderer Form
und Weise markiert werden. Viele Antikörper weisen jedoch
Cross-Reaktionen mit anderen Materialien als denen des zu bestimmenden
spezifischen Analyten auf, wodurch die Ergebnisse von einfachen Antikörper-Analyt-Tests unzuverlässig werden.
Um dieses Problem zu beheben, sind Assaytechniken des Sandwich-Typs entwickelt worden, die zwei Antikörper verwenden,
um den Analyten sandwichartig zwischen ihnen einzubetten.
Herkömmliche Sandwich-Techniken verwenden drei Assay-Typen. Beim ersten Typ wird die unerwünschte Cross-Reaktion herabgesetzt,
basierend auf der Beobachtung, daß der unerwünschte Cross-Reaktant nicht gleichzeitig mit Antikörpern reagiert,
die in zwei unterschiedlichen Tierarten spezifisch vorgegeben
werden. Beide Antikörper werden deshalb dem spezifischen Analyten von Interesse ausgesetzt, sie unterscheiden sich
jedoch darin, daß sie in unterschiedlichen Tierarten vorgegeben werden, z.B. von menschlichen Lebewesen und von Guinea-Schweinen.
Durch Benutzung dieser Sandwich-Technik wird der unerwünschte Effekt der ungewollten Cross-Reaktionen des
ersten Antikörpers durch die Verwendung des zweiten Antikörpers herabgesetzt, wodurch ein genauer Test für den Analyten von
Interesse erhalten wird. Dieser Typ von Sandwich-Assaytechnik
wird beim Nachweis von Hepatitis angewendet.
Der zweite Typ von Sandwich-Assay kommt zur Anwendung, wenn
das Serum als metabolische Nebenprodukte Fragmente des zu mes-
senden Analyten enthält. Zwei für diese Assaymethode benutzte
Antikörper werden spezifisch eingesetzt gegen den Analyten von Interesse. Ein Antikörper reagiert jedoch spezifisch mit
einem Teil des Analyten, während der andere Antikörper spezifisch mit dem anderen Teil des Analyten reagiert. Diese bisherige
immunometrische Sandwichtechnik benutzt somit Antikörper, die spezifisch gegen den speziell zu messenden Analyten
eingesetzt werden. Die ungewollten Cross-Reaktionen
des spezifischen Antikörpers mit einem Fragment des Analyten von Interesse hat Forscher veranlaßt, diese zweiseitige
Immunoassay-Sandwich-Technik so weiterzuentwickeln, daß die
Wirkungen der unerwünschten Cross-Reaktionen von einem Fragment des Analyten minimiert werden.
des spezifischen Antikörpers mit einem Fragment des Analyten von Interesse hat Forscher veranlaßt, diese zweiseitige
Immunoassay-Sandwich-Technik so weiterzuentwickeln, daß die
Wirkungen der unerwünschten Cross-Reaktionen von einem Fragment des Analyten minimiert werden.
Die dritte Sandwichtechnik benutzt den gleichen spezifischen Antikörper zweimal, um den Analyten von Interesse zu bestimmen,
Bei dieser Technik wird ein Antikörper, der für den Analyten von Interesse spezifisch ist, auf einer Festphase immobilisiert
und mit dem Analyten umgesetzt. Alle anderen störenden Substanzen werden entfernt, bevor der Analyt ein weiteres
Mal mit dem gleichen Antikörper umgesetzt wird, abgesehen
davon, daß der Antikörper jetzt für die Assayzwecke markiert ist.
Mal mit dem gleichen Antikörper umgesetzt wird, abgesehen
davon, daß der Antikörper jetzt für die Assayzwecke markiert ist.
Wie man aus der folgenden Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
sofort erkennen wird, unterscheidet sich die Erfindung vom Stand der Technik darin, daß sie gerade und speziell
das bisher vermiedene Cross-Reaktionsvermögen von zwei unterschiedlichen Antikörpern ausnutzt, um eine spezifische
Sandwich-Assaytechnik zu schaffen.
Die Immunoassaytechnik der vorliegenden Erfindung sieht die
Wahl von zwei unterschiedlichen Antikörpern vor, von denen jeder für einen unterschiedlichen AnaIyten spezifisch ist,
aber jeder von ihnen mit dem Analyten von Interesse in Cross-Reaktion
reagiert. Der erste solche Antikörper wird an einer Festphase fixiert und reagiert dann mit der unbekannten Probe,
Nach der umsetzung werden die Reaktanten getrennt und der
Festphasenteil derselben wird zurückbehalten. Der zweite Antikörper,
er ist markiert, wird dann mit dem zurückbehaltenen Festphasenteil umgesetzt. Nach der Reaktion werden die Reaktanten
getrennt und der Festphasenteil wird dem Test auf Vorliegen einer Markierung unterzogen. Kalibrierungstests
werden gleichzeitig mit bekannten Mengen des Analyten von Interesse durchgeführt. Die Ergebnisse des Tests auf die Unbekannte
können hiermit verglichen werden, um eine qualitative und quantitative Bestimmung des Analyten von Interesse
zu erhalten.
Unter besonderer Berücksichtigung der Bestimmung von CK-MB sieht die Immunoassaytechnik der Erfindung das Umsetzen des
unbekannten Humanserums mit CK-BB-Antikörper vor, der an einer
Festphase fixiert ist. Nachdem die Umsetzung abgeschlossen ist, werden die Reaktanten gewaschen, zentrifugiert und der
flüssige Teil derselben wird abgesaugt. Der zurückbehaltene Festphasenanteil wird dann erneut in eine Lösung gegeben, die
markierten CK-MM-Antikörper enthält, und damit umgesetzt.
Nach Abschluß der Reaktion werden die Reaktanten gewaschen und zentrifugiert und der flüssige Teil wird abgesaugt. Der
zurückbehaltene Festphasenteil wird nun auf Anwesenheit der Markierung getestet. Kalibrierungstests werden gleichfalls
durchgeführt, wobei man Serum mit bekannten Mengen an CK-MB verwendet, um eine Grundlage zu schaffen, gegen die die Menge
an CK-MB in der unbekannten Probe zu bestimmen ist.
Ein primärer Vorteil der Erfindung besteht darin, daß kein für den Analyten von Interesse spezifischer Antikörper geschaffen
werden muß, um einen immunologischen Assaytest für den Analyten bereitzustellen. Was allein erforderlich ist,
sind zwei vorzugebende unterschiedliche Antikörper, die nur mit dem Analyten gegenseitig Cross-Reaktionen eingehen. Diese
Technik ist sehr geeignet für jene Analyten, die instabil sind und deshalb in der Praxis nicht benutzt werden können, um Antikörper
herzustellen. Sie ist auch sehr geeignet, wenn es
außerordentlich schwierig ist, den Analyten zu reinigen, wie
im Falle der Cancer-Antigene.
Ein weiterer Vorteil der Erfindung besteht bei Anwendung auf den Test für CK-MB darin, daß sie die Antikörper für CK-MM
und CK-BB verwendet, die im Handel zur Verfügung stehen und billig sind.
Ein weiterer zusätzlicher Vorteil der Erfindung ergibt sich in Anwendung auf den Test auf CK-MB damit, daß der Test
schnell und mit größerer Genauigkeit durchgeführt werden kann, als Testprozeduren, die zur Zeit zur Verfügung stehen.
Diese und andere Ziele und Vorteile der Erfindung werden für den Durchschnittsfachmann ersichtlich nach Studium der detaillierteren
Beschreibung bevorzugter Aüsführungsformen, die im folgenden und anhand mehrerer Abbildungen der Zeichnung
erläutert werden.
Fig. 1 ist ein Schaubild, das die
immunometrische Sandwichassaymethode
- I
der Erfindung /mit zweiseitiger Cross-Reaktion wiedergibt;
der Erfindung /mit zweiseitiger Cross-Reaktion wiedergibt;
Fig. 2 ist ein schematisiertes Diagramm der
Assaymethode der Erfindung;
Fig. 3 ist ein Schaubild, das die Assay-
methode der Erfindung in Anwendung
auf die Bestimmung von CK-MB wiedergibt;
Fig. 4 ist ein Schaubild/ das eine andere Ausführungsform der erfindungsgemäßen
Assaymethode wiedergibt.
Bei Standardsandwich-Assaytechniken werden zwei Antikörper
benutzt, von denen jeder gegen den speziellen Analyten von
Interesse gesetzt wird. Die Verwendung der beiden spezifischen Antikörper ergibt eine sehr hohe Wahrscheinlichkeit für die
Bestimmung des Analyten und eine sehr geringe Fehlerwahrscheinlichkeit infolge unerwünschter Cross-Reaktanten. Solche
Sandwich-Techniken können jedoch nicht angewendet werden, wenn ein gegenüber dem Analyten von Interesse spezifischer Antikörper
noch nicht erzeugt oder isoliert worden ist. Die Erfindung findet gerade unter solchen Umständen Anwendung.
Wo es sich als schwierig erwiesen hat, einen spezifischen Antikörper zu schaffen und/oder zu isolieren, geht der Antikörper
für die Bestimmung eines Analyten von Interesse, obwohl es sehr wohl so sein kann, daß bekannte Antikörper existieren,
die spezifisch für andere Analyten sind, gegenseitige Cross-
Reaktionen nur mit dem Änalyten von Interesse ein. Wenn zwei
derartige Antikörper existieren und jeder für einen unterschiedlichen Änalyten spezifisch istf aber jeder von ihnen
Cross-Reaktionen mit dem Änalyten von Interesse ergeben kann und kein weiterer Analyt vorliegt, mit dem beide Cross-Reaktionen
ergeben, ermöglicht die Testprozedur der Erfindung die Bestimmung und Analyse des gegenseitig zur Cross-Reaktion
befähigten Änalyten von Interesse. Man ersieht, daß eine solche Situation gerade hinsichtlich der immunologischen
Bestimmung auf Kreatin-phospho-kinase (CK-MB) existiert.
Wie die Fig. 1 und 2 wiedergeben, wird die allgemeine Testprozedur
der Erfindung mit einer Serumprobe (12) durchgeführt, die drei verwandte Änalyten enthält, welche schematisch als
diamantförmiger Analyt (14), nachfolgend AA genannt, als kreisförmiger Analyt (16) , nachfolgend CC bezeichnet, und
als Hybridanalyt (18) aus den beiden anderen Änalyten wiedergegeben
sind, wobei letzterer sowohl mit teilweiser Diamantform als auch mit Kreisform dargestellt ist, nachfolgend kurz
AC genannt. Es wird angenommen, daß Antikörper existieren, die für AA spezifisch sind, nachfolgend Anti-AÄ genannt, und
für CC spezifisch sind, nachfolgend Anti-CC bezeichnet, daß aber der Antikörper für AC instabil und deshalb für Testzwecke
nicht-existent ist. Sowohl Anti-AA als auch Anti-CC
ergeben Cross-Reaktionen mit AC infolge der Ähnlichkeit der Molekülstruktur der A- und der C-Stellen des AC-Moleküls
gegenüber den AA- und den CC-Molekülen.
In einem vorbereitenden ersten Arbeitsgang, der vor dem oder gleichzeitig neben dem hier beschriebenen ersten Reaktionsschritt ausgeführt wird, wird Anti-AA (19) an einer Festphase
(20) unter Verwendung einer immunologischen Standardprozedur hierfür fixiert. In einem weiteren getrennten immunologischen
Arbeitsgang, der vor dem eigentlichen Test ausgeführt wird, markiert man zur späteren Bestimmung auch Anti-CC. Die Arbeitsweisen
zur Markierung von Antikörpern sind allgemein bekannt und radioaktive, fluoreszierende, chemoluminesζierende,
enzymatische oder andere Arten von Markierungen sind für diese
Testprozedur geeignet.
Im ersten Reaktionsschritt (22) wird das Serum (12) mit der Anti-AA Festphase (20) kombiniert und hiermit eine geeignete
Zeit lang und bei geeigneter Temperatur umgesetzt. Zeit und Temperatur variieren bei den speziellen Antikörpern und Ana-Iyten,
die für die Testprozedur in Frage kommen, sowie mit den Konzentrationen derselben. Bei der Reaktion bindet die
Anti-AA-Festphase (20) immunochemisch (23) mit dem AA (14)
und entfernt sämtliches AA vom Serum, wenn es für jenen AnaIyten
spezifisch ist. Da das Anti-AA (19) eine Cross-Reaktion mit
dem AC (18) eingeht, wird zusätzlich auch alles AC aus dem
Serum entfernt.
Im nächsten Schritt der Testprozedur werden die Reaktanten
getrennt (24), wobei die Festphasenprodukte (26) zurückbleiben und die Flüssigkeit (28) verworfen wird. Es werden Standardtrennmethoden/
wie Zentrifugieren und Absaugen, angewendet. Anzumerken ist, daß die verworfene Flüssigkeit (28) alles vom CC-Analyten
enthält.
Die zurückbehaltene Festphase (26) wird dann mit dem markierten Anti-CC (30) umgesetzt (32) . Die Reaktion (32) dauert
eine geeignete Zeit lang bei einer geeigneten Temperatur an. Wiederum variieren Zeit und Temperatur bei den speziellen
Antikörpern und Analyten, die bei der Testprozedur in Betracht kommen, sowie mit den Konzentrationen derselben.
Danach wird ein Standardtrennsehritt (34) ausgeführt, bei
dem die Festphase (36) zurückbleibt und die Flüssigkeit (38) verworfen wird. Wie Fig. 2 schematisch wiedergibt, kann das
markierte Anti-CC nur eine Cross-Reaktion (39) mit dem AC
eingehen, das zuvor eine Cross-Reaktion mit der Anti-AA-Festphase (26) eingegangen ist, wobei alles CC in dem flüssigen
Teil (28) aus dem ersten Trennschritt (24) verworfen worden ist.
Man erkennt nun, daß die verbleibende Pestphase (36) ein markiertes Molekülsandwich (40) enthält, in dem das AC
(der Analyt von Interesse) sandwichartig zwischen zwei Antikörpern eingebettet ist, wobei keiner von ihnen für jenen
Analyten spezifisch ist, jedoch jeder eine Cross-Reaktion
mit dem Analyten eingeht.
Die Festphase (36) kann dann auf Markierung getestet werden (42), welcher Test eine Anzeige für das Vorliegen des Analyten
von Interesse liefert.
Kalibrierungstests, die bekannte Mengen des Analyten von Interesse
benutzen, und die oben beschriebene Testprozedur werden gleichzeitig durchgeführt, um eine Kalibrierungskurve
aufzunehmen, gegen die die Ergebnisse des Tests auf die unbekannte Probe verglichen werden. Weitere Tests, die bekannte
Verdünnungen der unbekannten Probe verwenden, und die oben beschriebene Testprozedur können auch durchgeführt werden,
um Testergebnisse zu erhalten, die auf empfindliche Teile der Kalibrierungskurve fallen.
Eine spezielle Anwendung der oben beschriebenen Testprozedur wird im folgenden in Anwendung auf die Bestimmung von
CK-MB-Antigen in Humanserum beschrieben.
Wie allgemein bekannt, enthält Humanserum drei Kreatin-phosphokinase-Isoenzyme:
Kreatiii-phospho-kinase-MM (ein Skelettgewebeextrakt,
nachfolgend CK-MM abgekürzt), Kreatin-phosphokinase-BB (ein Hirngewebeextrakt, nachfolgend mit CK-BB abgekürzt)
und Kreatin-phospho-kinase-MB (ein Herzgewebeextrakt, nachfolgend CK-MB bezeichnet), die eine Hybridform von CK-MM
und CK-BB darstellt, umfangreiche Untersuchungen sind durchgeführt
worden, um einen Test auf CK-MB zu entwickeln, da dessen Anwesenheit eine spezifische Anzeige für myocardialen
Infarkt oder ähnliche Herzstörungen ist. Das Testen auf CK-MB nach verschiedenen Methoden hat sich jedoch als sehr schwierig
erwiesen, da dessen Eigenschaften denen des CK-MM und CK-BB sehr ähnlich sind, wobei die Anwesenheit der letzteren
in bedeutender Weise kleine Mengen an CK-MB maskieren kann. Mit besonderem Bezug auf immunometrische Assaytechniken zur
Bestimmung von CK-MB ist festzustellen, daß diese durch die derzeitige Unfähigkeit der Wissenschaft erschwert werden,
einen stabilen Antikörper herzustellen und zu entwickeln, der für das CK-MB spezifisch ist (im folgenden Anti-CK-MB genannt),
und daß kein derartiges Anti-CK-MB zur Zeit im Handel zur Verfügung steht. Es ist jedoch bekannt, daß die Antikörper sowohl
für CK-MM als auch CK-BB (im folgenden mit Antl-CK-MM und Anti-CK-BB entsprechend abgekürzt) mit CK-MB eine Cross-Reaktion
eingehen, und zwar zusätzlich zu ihren spezifischen Reaktionen mit CK-MM und CK-BB. Die oben beschriebene Test-
Prozedur ist deshalb auf die Bestimmung von CK-MB gemäß der folgenden Beschreibung anwendbar.
Vor dem eigentlichen Serum-Assay wird Anti-CK-BB an einer Pestphase fixiert, wie nachfolgend beschrieben. Wie jedoch
gleichfalls im folgenden erläutert, kann eine alternative Ausführungsform der oben beschriebenen Testprozedur durchgeführt
werden, bei der dieser Schritt nicht notwendig ist. Außerdem muß vor der Analyse das Anti-CK-MM markiert werden,
zum Beispiel wie unten beschrieben durch Verwendung von
1 25
radioaktivem Jod ( J).
radioaktivem Jod ( J).
Anti-CK-BB (Kaninchen) zur Fixierung an einer Festphase ist aus vielen Quellen im Handel erhältlich. Die zur Bindung
mit dem Anti-CK-BB ausgewählte Festphase sind Bio-Rad Immuno-Beads (Catalog No. 170-5602), obwohl Festphasen
als Latexkügelchen oder Cellulosekügelchen oder Membranstreifen benutzt werden könnten. Bio-Rad Immuno-Beads sind
Polyacrylamid-Kügelchen bzw. -Perlen mit einem Durchmesser von annähernd 10 μπι; sie sind zur Verwendung als feste
Phase in Immunoassaytests bestimmt. Gemäß der vom Hersteller empfohlenen Prozedur werden die Kügelchen zunächst kovalent
an Ziegen-Antikaninchen-Igg gebunden. 50 mg Kügelchen werden
dann in 25 - 50 ml PBS suspendiert, das 10 % Kalbserum enthält, obgleich andere Proteine verwendet werden können",
um eine unspezifische Bindung zu minimieren. Danach werden die Kügelchen mit PBS-Puffer gewaschen (pH ungefähr 7,4,
0,02 M PO4, ο,15 M NaCl). Die Kügelchen werden dann in 25 ml
PBS aufgeschlämmt, das 1 % BSA enthält. Annähernd 10 μΐ Anti-CK-BB
werden dann mit den Kügelchen umgesetzt, um das Anti-CK-BB an den Kügelchen zu binden. Die mit Antikörper beschichteten
Kügelchen werden dann gewaschen und von nichtumgesetztem Anti-CK-BB
mit PBS-Puffer abgetrennt. Die mit Anti-CK-BB beschichteten Kügelchen sind dann fertig zur Verwendung für die Testprozedur.
125 Vor dem Testen wird das Anti-CK-MM mit radioaktivem Jod ( J)
jodiert, das als Markierung zur Bestimmung des CK-MB dient. Solche Markierungsweisen sind bekannt, siehe Fraker, T. und
Speck, J., in Biochemical and Biophysical Research Commission,
Vol. 80, Nr. 4, Februar 1978. Bei der Prozedur wurden 100 μg Anti-CK-MM (Ziege) in 100 μΐ Wasser gelöst. 16 μΐ dieser Lösung
wurden zur Verwendung für das Markieren mit 20 μΐ (0,25 M PO4) PBS-Puffer (pH 7,5) in einer Reaktionsphiole
1 25
kombiniert. 480 Mikrocurie NaJ wurden zu diesem Puffer gesetzt. Dem folgten 10 μΐ Chloramin-T-Lösung (3,5 mg/ml in 0,05 Phosphatpuffer). Dieses wurde 60 s gemischt, danach wurden 10 μΐ Natriummetabisulfit-Lösung zugesetzt (3,5 mg/ml 0,05 Phosphatpuffer). Das Reaktionsgemisch wurde über einer Sephadex G-50-Säule fraktioniert (mit Ziegenserum gewaschen und behandelt), wobei die Fraktionen Nr. 18 bis 23 gesammelt und gepoolt wurden. Der Fraktionspool wurde über einer Dowex 1 χ 8-Säule gereinigt und gesammelt. Dieses Material wurde
kombiniert. 480 Mikrocurie NaJ wurden zu diesem Puffer gesetzt. Dem folgten 10 μΐ Chloramin-T-Lösung (3,5 mg/ml in 0,05 Phosphatpuffer). Dieses wurde 60 s gemischt, danach wurden 10 μΐ Natriummetabisulfit-Lösung zugesetzt (3,5 mg/ml 0,05 Phosphatpuffer). Das Reaktionsgemisch wurde über einer Sephadex G-50-Säule fraktioniert (mit Ziegenserum gewaschen und behandelt), wobei die Fraktionen Nr. 18 bis 23 gesammelt und gepoolt wurden. Der Fraktionspool wurde über einer Dowex 1 χ 8-Säule gereinigt und gesammelt. Dieses Material wurde
- 20 verdünnt, um einen geeigneten Aktivitätspiegel zu erhalten.
Unter Verwendung der zuvor hergestellten Festphasen-Anti-CK-BB
und radiojodierten Anti-CK-MM wird die Testprozedur auf CK-MB so durchgeführt, wie es Fig. 3 wiedergibt.
Humanserum (62), das die Isoenzyme CK-MM (64), CK-MB (66)
und CK-BB enthält, wird umgesetzt (72) mit den mit Anti-CK-BB beschichteten Immuno-Beads (70). Reaktionszeit und Reaktionstemperatur sind Parameter, die je nach der Konzentration des
Serums und der Stärke des Anti-CK-BB auf den Immuno-Beads variiert werden können. Wie in Beispiel 2 nachfolgend erläutert,
können diese Variablen so eingestellt werden, daß bei Anwendung von Raumtemperatur und einer Reaktionszeit von
1 Stunde gute Testergebnisse erhältlich sind.
Nach der Reaktionsphase (72) ist es notwendig, die Flüssigkeit von den Kügelchen abzutrennen. Hierzu werden annähernd
2 ml zusätzlicher PBS-Puffer zu den Reaktanten als Waschmedium (74) gesetzt. Die Reaktanten werden dann zentrifugiert
(76), um ein regulusartiges Präzipitat (78) zu erhalten.
Zentrifugieren bei Raumtemperatur für annähernd 10 min bei einer Geschwindigkeit von annähernd 2.000 Upm ergibt gute
Resultate.
Nach Erhalt eines regulusartigen Präzipitats (78) am Boden der Testphiole wird die darin enthaltende Flüssigkeit (80)
abgesaugt und verworfen, und das Präzipltat (78) wird für die zweite Phase der Testprozedur zurückbehalten.
Es wird bemerkt, daß die mit Anti-CK-BB beschichteten Kügelchen
mit allen CK-BB- und CK-MB-Antigenen reagiert haben und deshalb aus der Lösung entfernt werden. Da das CK-MM-Antigen
nicht mit dem CK-BB reagiert, verbleibt das CK-MM in Lösung und wird mit dem abgesaugten Abwasser (80) verworfen.
Die zweite Reaktionsphase (86) der Testprozedur wird nun begonnen,
indem man radiojodiertes Anti-CK-MM (88) zu dem Präzipitat gibt. Die Reaktanten werden in Vibration versetzt
oder aufgewirbelt, um das Präzipitat für die Umsetzung zu rekonstituieren (84). Reaktionszeit und Reaktionstemperatur
sind Parameter, die in Abstimmung mit den Konzentrationen der Reaktanten variiert werden können. Wie in Beispiel 2 erläutert,
können bei Anwendung von Raumtemperatur und einer Reaktionszeit von angenähert 1 Stunde gute Testergebnisse
erhalten werden.
Nach der Reaktion (86) erfolgt eine zweite Abtrennung in der
gleichen Weise wie die vorherige Abtrennung. D.h. es werden
annähernd 2 ml PBS-Waschpuffer (90), die 0,1 % Tween 20 enthalten,
zu den Reaktanten gegeben, und die Reaktanten werden
bei Raumtemperatur eine geeignete Zeit von 10 min bei einer ungefähren Geschwindigkeit von 2.000 Upm zentrifugiert (92),
um ein regulusartiges Präzipitat (94) am Boden der Testphiole
zu erhalten. Die Flüssigkeit (96) in der Testphiole wird dann abgesaugt (98) und in geeigneter Weise verworfen, da sie überschüssiges
radioaktives Anti-CK-MM enthält. Das regulusartige Präzipitat (94) wird dann getestet (100) mit einem Szintillationsdetektor,
um das Vorliegen von Strahlung in dem Testserum als mögliche Anzeige festzustellen.
Es ist wichtig festzuhalten, daß alles CK-MM abgesaugt (82) und mit der Flüssigkeit (80) verworfen wird, so daß kein
CK-MM in der zweiten Reaktion (86) vorhanden ist, mit der das Anti-CK-MM spezifisch reagieren könnte. Die einzig mögliche
Reaktion für das Anti-CK-MM besteht dann darin, eine Cross-Reaktion mit dem CK-MB einzugehen, das an die Kügelchen
gebunden ist, und zwar vermittels Cross-Reaktion mit dem Anti-CK-ßB.
Wie bei allen Radioimmunoassay-Techniken ist es notwendig,
gleichzeitig Kalibrierungstests mit bekannten Mengen an CK-MB durchzuführen, um eine Kalibrierungskurve zu erhalten, gegen
die die Ergebnisse des Tests auf Unbekannte verglichen werden.
Es ist anzumerken, daß immer etwas Strahlung aus einer CK-MB-Probe
mit Null-Spiegel gegeben ist wegen der Bindung von radiojodiertem Anti-CK-MM an den Wänden der Testphiole und des Verbleibs
von Feuchtigkeit innerhalb des Präzipitats (94) nach dem Zentrifugieren (92) . Somit liegt Strahlung aus einer
CK-MB-Probe mit Null-Spiegel vor, aber es ist die Zunahme
der Strahlung gegenüber dem Blindstrahlungswert, die eine
Anzeige für das Vorliegen von CK-MB in der Testprobe liefert.
Außerdem ist aus Radioimmunoassaytests allgemein bekannt, daß
sich die Zunahme in der Radioaktivität nicht linear mit steigenden
Mengen an Analyt in dem Testserum ändert. Die Strahlungsänderung
mit der Konzentration des Analyten hängt von vielen Variablen ab, wie der Menge an Antikörper, Verdünnung des Antikörpers, dem Antikörper-Analyt-Verhältnis und
anderen Variaolen. Die Standardtestprozedur, die zur Überwindung
dieser Testunzulänglichkeiten benutzt wird, besteht darin, daß eine Testreihe mit variierenden Verdünnungen des
unbekannten Testserums ausgeführt wird. Man erhält dann eine
Serie von Ergebnissen, von denen eines oder mehrere auf einem empfindlichen Teil der Kaliorierungskurve liegen, um eine
genaue Anzeige für den Gehalt des Analyten in der Probe zu erhalten.
Die Beispiele 1, 2 und 4 geben im folgenden eine Erläuterung für die Anwendung dieser Testprozedur.
Wie der Fachmann ohne weiteres erkennt, können anstelle der Inununo-Beads andere Festphasenmaterialien, wie ein Membranfilter
verwendet werden. Bei Verwirklichung dieser Alternative wird eine Membran (120) unter Verwendung eines Whatman-Filterpapiers
No. 1 hergestellt, das nach der Perjodat-Technik oxidiert wurde, siehe Ferrung, B., Maiolini, R. und Masseyeff,
R. in Journal of Immunological Methods, Vol. 25, S. 49, 1979. Streifen der Membran werden in Ziegen-Antikaninchen-I
G-Lösung getränkt und ansonsten weitgehend in der Weise verwendet, wie die Immuno-Beads im Test zur Anwendung
gelangen. Die Verwendung von Membranen als Festphase schaltet die Notwendigkeit zum Zentrifugieren aus, und die
Trennschritte bestehen im einfachen Waschen der Membran zwecks Entfernung von überschüssigen Immunoreagenzien, über
Ergebnisse bei Verwendung einer Membran-Festphase wird im folgenden Beispiel 4 berichtet.
Eine Variation der oben beschriebenen Testprozedur (s. Fig. 4) kann in folgender Weise ausgeführt werden. Statt den ersten
Antikörper (130) an einer Festphase (132) zu fixieren, wird der erste Antikörper (130) direkt zu dem unbekannten Serum
(134) gegeben (136). Danach wird die Festphase (132), die nicht mit dem ersten Antikörper (130) beschichtet worden ist,
ansonsten jedoch wie oben beim Beschichten beschrieoen vorbe-
reitet worden war, zu den Reaktanten gegeben (138). Die Reaktion (13ö) schreitet dann in der oben beschriebenen Weise
fort und die restlichen Schritte der Testprozedur werden so durchgeführt, wie es oben für das Vorgehen im Anschluß an
Reaktion (72) von Fig. 3 beschrieben ist. Es wurde gefunden, daß ausreichende Mengen des Festphasen-Antikörper-Antigen-Komplexes
an den Kügelchen (132) binden und adäquate Testresultate liefern. Die folgenden Beispiele 4 und 5 sind
spezielle Beispiele für Ergebnisse, die unter Anwendung dieser Variation der Testprozedur erhalten wurden.
Die folgenden Beispiele erläutern die erfindungsgemäße Testmethode
anhand bevorzugter Ausgestaltungen und unter Vertirendung
mehrerer Kombinationen in den Testbedingungen.
Dieser Versuch wurde mit Anit-CK-BB-beschichteten Immuno-Beads
ausgeführt. 100 μΐ Probe wurden mit 200 μΐ Kügelchen
gemischt. Nach Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur wurden 0,5 ml PBS-Puffer mit 10 % Kalbserum zu dem Teströhrchen
gesetzt. Die Kügelchen wurden durch Zentrifugieren abgetrennt. Sie wurden dann 5 h oei Raumtemperatur mit radiojodiertem
Anti-CK-MM umgesetzt. Nach Inkubation wurden die Kügelchen mit 1 ml P3S-Puffer mit 10 % Kalbserum gewaschen.
Die Kügelchen wurden dann zentrifugiert und gezählt.
Normales Humanserum- Zählung (NHS):
Kalibratoren
(100 μΐ pro Teat)
(100 μΐ pro Teat)
E) 1 \ig/ml CK-MB-Pulver im Serum
D) 10 ug/ml CK-MB-Pulver im Serum
C) 50 ug/ml CK-MB-Pulver im Serum
B) 100 ug/ml CK-MB-Pulver im Serum
1090 Zählungen pro mir
Verhältnis:
NHS-Zählungen 1/17 3,20 5,71 6,65
Die Kaiibratorproben wurden durch Lösen eines Pulvers hergestellt
und enthielten 6,8 % CK-MB in normalem Humanserum üei verschiedenen Verdünnungen.
Patientenproben (mit bekanntem hohen Spiegel an CK-MB) Hoher Spiegel 10 μΐ 3,66
25 μΐ 7,44
50 μΐ 12,1
100 μΐ 14,9
Wie ersichtlich, wurde mit CK-MB-Kalibratoren eine gute Ansprechbarke
it skur ve erhalten, und die Patientenprobe, die nach anderen Techniken als eine Probe mit hohem CK-MB-Gehalt iden-
tifiziert worden war, konnte gemessen werden durch Benutzung von vier Verdünnungen, um einen Ablesungsspiegel sicherzustellen,
der mit der Kalibrierungskurve korreliert wurde.
Dieses Beispiel zeigt die Wirkung der Herabsetzung von Inkubationszeit
und Variierung der Menge an Kügelchen auf 200 μΐ und 500 ul. Der verwendete Waschpuffer waren 2 ml mit 5 % Kalbserum
und wurde zugesetzt, bevor jeweils zentrifugiert wurde. Die In-
kubationszeit betrug 1 h bei Raumtemperatur für jede der Reaktionen.
Die anderen Testbedingungen entsprachen denen des Beispiels 1.
Ergebnisse
1 | 50 μΐ | 200 μΐ Kügelchen 500 μΐ Kügelchen | 913 | /cpm/) | 2,85 | |
Kalibrator | 00 μΐ | (Zählungen | 1475 | 3,77 | ||
NHS | 50 \iq/j3 | Verhältnis: Probenzählung/NHS-Zählung |
3,25 | |||
100 μg/r | 2,35 | 4,50 | ||||
hoch | 3,31 | |||||
nl 2,24 | ||||||
al 2,8 |
Die erhaltenen Verhältnisse waren, obgleich bedeutend niedriger als bei der Ubernachtinkubation, noch recht akzeptabel.
Der Effekt der herabgesetzten Inkubationszeit kann insofern durch Erhöhung der Menge an Kügelchen kompensiert werden.
Die in Beispiel 2 beschriebene Methode wurde angewendet mit 200 μΐ Kügelchen und einer Inkubationszeit von 1/5 h für jede
Reaktion. Der bei diesem Versuch eingesetzte Tracer besaß eine höhere nichtspezifische Bindung. Mehrere Serienproben eines
gerade in ein Hospital wegen Myocardialinfarktes eingelieferten Patienten wurden getestet.
Probe NHS
Zählung
3835 Zählungen pro min
3835 Zählungen pro min
Verhältnis: Probenzählung/NHS-Zählung
Kalibratoren 50 μg/ml | Patient A | 2,2 |
100 μg/ml | 11 Uhr a.m. | 2,7 |
12 Uhr mittags | ||
1 Uhr p.m. | 2,24 | |
4 Uhr p.m. | 2,75 | |
8 Uhr p.m. | 3,00 | |
3,15 | ||
3,54 |
Normalpatienten | 0,94 |
B | 1,06 |
C | 0,99 |
D | |
Die steigenden Gehalte an CK-MB, die in diesem Beispiel ermittelt werden, verdeutlichen die allgemein bekannte Zunahme
in den CK-MB-Gehalten bei den Patienten nach einem Myocardialinfarkt
oder ähnlichen Vorfall.
In diesem Beispiel wurden Polyacrylamid-Kügelchen als präzipitierender
Antikörper eingesetzt. Im ersten Schritt wurde zur Probe 1:30 verdünntes Anti-CK-BB gegeben. Bio-Rad-Immuno-Beads
wurden in 50 ml PBS-Puffer mit 1 % MSA suspendiert, wobei 500 μΐ dieser Kügelchen in der Zahl mit 250 μΐ derjenigen
Kügelchen in den vorstehenden Beispielen vergleichbar waren. Diese Kügelchen wurden vorher nicht mit Anti-CK-BB beschichtet.
Nach einer 1 stündigen Inkubationszeit wurden die Reaktanten zentrifugiert und abgesaugt. Eine zweite Inkubation
von 1 Stunde wurde in normaler Weise durchgeführt. Danach
wurden 2 ml PBS-Puffer mit 1 % BSA und 1 % Tween zugesetzt? die Reaktanten wurden zentrifugiert, abgesaugt und die Festphase
wurde gezählt.
Die Ergebnisse waren wie | folgt: | Zählung |
Probe | 2076 | |
NHS | Verhältnis: Probenzählung/NHS-Zählung |
|
3,1 | ||
Kalibratoren 50 μg/ml | 4,2 | |
100 ug/ml |
Die obige Probe enthielt grob 5 mlü/ml und 10 mIU/ml CK-MB,
die ungefähr die Grenze des Normalbereichs darstellen.
Negative Proben wurden unter Verwendung der in Beispiel 4 diskutierten Methode ausgeführt.
Probe Zählungen Standardab-
weichungen
Versuch 1 NHS 2015
13 negative
Proben 2260 305
Versuch 2
NHS, 16fach 2017 199
12 negative
Proben m. hohem
Gesamt-CK 2172 300
Kalibrator 50 μg/ml 4281
100 μ9/πι1 5936
Somit würden negative Proben, selbst jene mit hohen Gesamt-CK-Spiegeln,
noch deutlich unterhalb der 50 μg/ml-Kalibratorprobe
liegen, und man sieht, daß sie eine Anzeige in Nähe der NHS-Proben
ergeben.
Die Verwendung einer Membran als Festphase wird veranschaulicht unter Benutzung von Anti-CK-BB, das wie oben beschrieben
auf einem Whatman-Pilterpapier No. 1 immobilisiert worden ist*
Die mit Antikörper beschichtete Membran (9,53 mm χ 25,4 mm) wurde in ein Gemisch aus der Probe und 2 ml PBS mit 5 % BSA-Puffer
gesetzt. Nach einer ersten 1-stündigen Inkubation wurden die Flüssigkeiten abgesaugt; die Membran wurde gründlich
gewaschen. Radiojodiertes Anti-CK-MM wurde zugesetzt. Nach
einer zweiten Inkubation von 1 Stunde wurde die Flüssigkeit abgesaugt. Die Membran wurde gründlich gewaschen und in ein
anderes Röhrchen überführt.
Die Ergebnisse waren folgende:
Ergebnisse
Probe
NHS 967 Zählungen pro min
Verhältnis: Probenzählungen/NHS-Zählungen
!Calibrator 400 μg/ml 3,3
100 ug/ml 1,9
3T2bb38
Man sieht# daß eine Membran-Festphase anerkennbare Ergebnisse
liefert, obwohl sie nicht so ausgeprägt sind, wie die Ergebnisse bei Verwendung der Kügelchen als Festphase.
Die Erfindung leitet ihre Einzigartigkeit aus der Nutzung des Cross-Reaktionsvermögens der Antikörper her, die zur
Verwendung ausgewählt werden. Dies stellt eine gegenläufige Erkenntnis zu den immunologischen Standardassaytechniken dar,
bei denen das Cross-Reaktionsvermögen der Antikörper gerade minimiert oder ganz vermieden wird durch die Verwendung multipler
Antikörper, welche jeweils spezifisch sind für den Analyten von Interesse. Die Benutzung der erfindungsgemäßen
Testtechnik zur Bestimmung von CK-MB in Humanserum liefert schnelle und wirksame Mittel zur Analyse und Identifizierung
von Myocardialinfarkten und ähnlichen Herζstörungen bei Patienten,
und zwar unmittelbar nach ihrem Auftreten.
Wenngleich voranstehend bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
beschrieben worden sind, werden andere Abänderungen und Modifikationen für den Fachmann nach dem Studium der beschriebenen
Erfindung ersichtlich. Die Patentansprüche sollen deshalb derartige andere Abwandlungen und Modifikationen als
unter den Gegenstand der Erfindung fallend mit einbeziehen.
Leerseite
Claims (11)
- MÖNCHEN Plenzenaueratr. 2 SOCO München BO Telefon: (089) 980324. 987263. 968800 Kabel: Quadratur Manchen Tetex: S 227 67BERLIN Kurfurttendamm 182/183 1000 Berlin 15 Teteton: (030) 8837078/78 KMwI: Quadratur BerlinRUSCHKE & PARTNER. PATENTANWÄLTEDr.-ing. H«fis -Rueehke*- bis «so -DlpK-lng. -hare E.-Ruschke DlpMng. *Ple? R4«ehke Dipl-Ing. Jürgen Rost Dlpl.-Chem. Dr. Ulrich RotterZugelassen beim Europäischen Palentamt Admitted to the European Patent Office' In Berlin29. Juni 198tJINTERNATIONAL IMMUNOASSAY LABORATORIES, INC., 2918 Scott Boulevard, Santa Clara, California 95 050, V.St.A.Patentansprüche( 1.)Immunometrische Sandwich-Assaymethode mit zweiseitiger Cross-Reaktion zur Bestimmung und Messung eines Analyten von Interesse im Serum,
dadurch gekennzeichnet, daß(a) ein erster Antikörper gewählt wird, der eine Cross-Reaktion mit dem Analyten von Interesse eingeht;(b) ein zweiter Antikörper gewählt wird, der sich vom ersten Antikörper unterscheidet und ebenfalls eine Cross-Reaktion mit diesem Analyten eingeht, wobei erster und zweiter Antikörper so gewählt werden, daß nur der Analyt von Interesse mit beiden eine Cross-Reaktion eingeht;(c) der erste Antikörper mit einem Serum umgesetzt wird, in dem man diesen Analyten vermutet, um eine ersteReaktionslösung zu bilden;(d) der erste Antikörper und andere an ihn immunochemisch gebundene Reaktanten aus dieser ersten Reaktionslösung vom Rest derselben abgetrennt werden;(e) dieser erste Antikörper und andere an ihn immunochemisch gebundene Reaktanten aus der ersten Reaktionslösung mit dem zweiten Antikörper umgesetzt werden, um eine zweite Reaktionslösung zu bilden;(f) der zweite Antikörper und andere immunochemisch an ihn gebundene Reaktanten aus dieser zweiten Reaktionslösung vom Rest derselben abgetrennt werden; und(g) dieser zweite Antikörper und andere immunochemisch an ihn gebundene Reaktanten aus dieser zweiten Reaktionslösung getestet werden, um den zweiten Antikörper und andere an ihn immunochemisch gebundene Reaktanten als Anzeige für die Anwesenheit des Analyten von Interesse zu analysieren. - 2. Assaymethode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß eine Festphase zur immunochemisehen Bindung mit diesem ersten Antikörper als Hilfsmittel bei Abtrennung dieses ersten Antikörpers und anderer immunochemisch an diesen gebundener Reaktanten vom Rest der Reaktanten aus dieser ersten Reaktions-lösung eingesetzt wird und dieser zweite Antikörper zur Analysierung markiert ist.
- 3. Assaymethode nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß Schritt (a)" den Schritt der Fixierung dieses ersten Antikörpers an einer Festphase einschließt, um einen gebundenen Antikörper zu bilden; daß Schritt (d) die Abtrennung des Festphasenteils dieser ersten Reaktionslösung vom flüssigen Teil derselben einschließt; daß Schritt (e) die Umsetzung dieses Festphasenteils der ersten Reaktionslösung mit dem markierten Antikörper einschließt, um eine zweite Reaktionslösung zu bilden? daß Schritt (f) die Abtrennung des Festphasenteils dieser zweiten Reaktionslösurig vom flüssigen Teil derselben einschließt; und daß Schritt (g) das Testen dieses Festphasenteils aus dieser zweiten Reaktionslösung einschließt, um den Markierungsgrad dieses zweiten Antikörpers als Anzeige für die Anwesenheit des Analyten von Interesse zu bestimmen,
- 4. Assaymethode nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein weiterer Schritt vorgesehen ist, bei dem diese Festphase zur ersten Reaktionslösung gegeben wird und diese erste Reaktionslösung hiermit weiter umgesetzt wird, und daß Schritt (d) die Abtrennung des Festphasenteils dieser ersten Reaktionslösung vom flüssigen Teil derselben vorsieht; daß Schritt (e) die Umsetzung dieses Festphasenteils der ersten Reaktions-lösung mit diesem markierten Antikörper einschließt, um die zweite Reaktionslösung zu bilden; daß Schritt (f) die Abtrennung des Festphasenteils aus dieser zweiten Reaktionslösung vom flüssigen Teil derselben einschließt; und daß Schritt (g) das Testen dieses Festphasenteils der zweiten Reaktionslösung einschließt, um den Markierungsgrad des zweiten Antikörpers als Anzeige für die Anwesenheit des Analyten von Interesse zu bestimmen.
- 5. Assaymethode nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß diese Festphase ein Material ist, das aus der Gruppe der Polyacrylamid-Kügelchen, Latexkügelchen, Cellulosekügelchen und einem Membranstreifen ausgewählt ist.
- 6. Assaymethode nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch gekenn ze;erfolgt.125 gekennzeichnet, daß die Markierung mit radioaktivem Jod J
- 7. Assaymethode nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Abtrennschritte ausgeführt werden, indem man die Lösungen zentrifugiert, um diese Festphasen zu fällen, und absaugt, um den flüssigen Teil derselben zu entfernen.
- 8. Assaymethode nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte der Methode mehrmals wiederholt werden, wobeian die Stelle dieses Serums bei jeder Wiederholung der Schritte eine Probe tritt, die eine unterschiedliche bekannte Menge dieses Analyten enthält, wodurch eine Kalibrierungskurve erhalten wird; und daß die Testergebnisse für dieses Serum mit der Kalibrierungskurve verglichen werden.
- 9. Assaymethode nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Schritte mit mehreren bekannten Verdünnungen dieses Serums wiederholt werden und die Ergebnisse dieser Tests mit der Kalibrierungskurve verglichen werden, um eine quantitative Bestimmung der Mengen dieses Analyten im Serum zu erhalten.
- 10. Assaymethode nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Methode auf Kreatin-phospho-kinase-MB (CK-MB) als Analyten von Interesse erstreckt und dieses Serum auch Kreatin-phospho-kinase-MM (CK-MM) und Kreatinphospho-kinase-BB (CK-BB) enthält, daß dieser erste Antikörper ein Antikörper für CK-BB und der zweite Antikörper ein Antikörper für CK-MM ist.
- 11. Assaymethode nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß dieser Testschritt die Bestimmung der Menge des zweiten Antikörpers einschließt.
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EP0125893A3 (de) * | 1983-05-12 | 1986-10-15 | Sumitomo Chemical Company, Limited | Quantitative Bestimmung von Antigenen durch Enzym-Antikörper-Brückenverfahren |
US4810639A (en) * | 1985-12-20 | 1989-03-07 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Immunoassay for CK-MB using bound and soluble antibodies |
IE892333A1 (en) * | 1989-07-19 | 1991-06-19 | Univ Galway College | Diagnostic assays and antibodies for use in said assays |
GB2270976A (en) * | 1992-09-18 | 1994-03-30 | Marconi Gec Ltd | Immunoassay/separation process using an auxiliary species on a support |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3006118A1 (de) * | 1979-02-23 | 1980-09-04 | Corning Glass Works | Verfahren zum nachweis von creatinkinase-isoenzymen |
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JPS56118671A (en) * | 1980-02-22 | 1981-09-17 | Amano Pharmaceut Co Ltd | Measuring method of specific enzyme immunity of hybrid type protein |
US4353982A (en) * | 1980-04-10 | 1982-10-12 | Hoffmann-La Roche Inc. | Immunochemical assay for creatine kinase-MB isoenzyme |
-
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Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3006118A1 (de) * | 1979-02-23 | 1980-09-04 | Corning Glass Works | Verfahren zum nachweis von creatinkinase-isoenzymen |
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
FEBS Letters, Vol. 99, No. 1, März 1979, S. 172-174 * |
Also Published As
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GB2078953A (en) | 1982-01-13 |
BE889443A (fr) | 1981-12-30 |
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