DE4024350A1 - Immunologisches multiplex-testsystem - Google Patents
Immunologisches multiplex-testsystemInfo
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Description
Diese Erfindung betrifft chemische und biochemische Tests,
die einen oder mehrere Liganden umfassen, die sich spezi
fisch an entsprechende reaktive Komponenten binden, und
insbesondere Multiplex-Tests dieser Art.
Immunreaktionen, welche die Bildung von Antikörper/Antigen-
Komplexen umfassen, sind exemplarisch für bekannte chemische
oder biochemische Analyt/Ligand-Reaktionen, in denen ein
Komplex durch die Reaktion von Komponenten gebildet wird,
die sich hochspezifisch aneinander binden. Eine Reihe von
anderen derartigen Reaktionen sind bekannt, zum Beispiel
Nukleinsäurehybridisierungen, Enzym/Inhibitor-,
Enzym/Coenzym-, Hormon/Rezeptor- und ähnliche substrat
spezifische Reaktionen. Die Ausdrücke "Komponente" und
"Ligand", wie sie hier verwendet werden, beziehen sich im
allgemeinen austauschbar auf die reaktiven Teile eines
solchen Komplexes, und bezüglich eines Antigen/Antikörper-
Komplexes sind diese Ausdrücke zum Beispiel so gedacht, daß
sie alle immunologisch reaktiven Teile einschließen, wie
etwa Haptene, vollständige Antigene, reaktive Antigen/Anti
körper-Fragmente und vollständige Antikörper. Der Ausdruck
"Analyt" ist so gedacht, daß er sich auf die Komponente oder
den Liganden bezieht, der entweder qualitativ, quantitativ
oder in beiderlei Hinsicht untersucht werden soll, und der
Ausdruck "Fänger" ist so gedacht, daß er sich auf den
Liganden oder die Komponente bezieht, der (die) sich
spezifisch an den interessierenden Analyten bindet.
Tests, die auf diesen wohlbekannten Immun- und anderen
spezifischen Bindungsreaktionen beruhen, umfassen eine große
Vielfalt von Techniken. Einige Testverfahren verwenden
radioaktive, lumineszierende oder fluoreszierende Mar
kierungen, die entweder an den Liganden oder an den Analyten
gekoppelt sind und durch Messen der Strahlung, die vom
Reaktionsprodukt oder Komplex ausgeht, nachgewiesen werden
können. Typischerweise kann dort, wo ein Fänger, wie etwa
ein auf einem Substrat immobilisierter Antikörper, in einer
Lösung zur Reaktion gebracht wird, die eine unbekannte Menge
einer reagierenden Komponente oder eines reagierenden Ana
lyten enthält, wie etwa ein Antigen, das sich an den Fänger
binden soll, der Titer des Antigens leicht erhalten werden.
Zum Beispiel wird in der wohlbekannten Konkurrenztest
technik eine Mischung des Analyten und einer bekannten Menge
an markiertem Analyten auf die immobilisierte Phase
aufgebracht, wobei die einzelnen Komponenten miteinander um
die Bindungsstelle konkurrieren. Je größer die Menge an
vorhandenen Probenanalyten ist, je geringer wird das Ausmaß
sein, in dem sich der markierte Analyt an den Fänger binden
wird. Unter Verwendung vorbestimmter Eichkurven und unter
Messung der Intensität der Strahlung von demjenigen Antigen,
das mit dem gebundenen Fänger komplexiert ist, kann man die
Menge an unmarkiertem oder Probenanalyten bestimmen oder
testen.
Bei einer anderen üblichen Technik kann man die Testlösung,
die Analyten enthält, zu einem Fänger in Lösung hinzufügen.
Vorausgesetzt, daß der gebildete Komplex genügend aggre
gieren wird, um auszufallen oder zu verklumpen, würde die
Beobachtung einer derartigen resultierenden Verklumpungs-
oder Ausfällungsreaktion anzeigen, ob die Testlösung den
Analyten enthalten hat, für den der Fänger spezifisch ist,
oder nicht. Im letzteren Fall würde man Strahlung beob
achten, die entweder von der Verklumpung oder dem Nieder
schlag reflektiert oder gestreut wird oder deren Trans
mission von der Verklumpung oder dem Niederschlag abge
schwächt wird.
In immunologischen Tests, in denen Strahlung (z.B. α-Strah
lung, Lumineszenzstrahlung oder Fluoreszenzstrahlung) vom
Reaktionsprodukt ausgeht, kann man die Strahlung typischer
weise mit Geiger- oder Szintillationszählern, Autoradio
graphie, Fluorimetern und dergleichen nachweisen und/oder
messen.
Es wird postuliert, daß die Bindungskräfte, die bei Anti
körper/Antigen-Reaktionen betroffen sind, die kombinierte
Wechselwirkung von elektrostatischen, Wasserstoffbrücken
bindungs- und van der Waals-Kräften darstellen, in vielen
Fällen ähnlich zu anderer spezifischer Bindung, wie zum
Beispiel derjenigen, die in Enzym/Substrat- und bei der
Bildung von Enzym/Coenzym-Komplexen auftritt, wodurch eine
sehr starke, spezifische Bindung zur Verfügung gestellt
wird. Die Spezifizität solcher Bindungsreaktionen ist jedoch
nicht absolut. Da sich Komponenten, insbesondere markierte
Antikörper, die bei solchen spezifischen Reaktionen
betroffen sind, oft an andere Materialien binden können,
kann in Tests, wie etwa immunologischen Tests und Fänger
tests, die von der Spezifizität der Bindung abhängen, das
Auftreten einer solchen nicht-spezifischen Bindung nach
teilige Effekte auf die Empfindlichkeit und die Wieder
holbarkeit des Testes haben. Es soll offensichtlich sein,
daß der Ausdruck "gebunden", wie hier verwendet, so gedacht
ist, daß er sich auf Liganden bezieht, die durch eine be
liebige Art von Bindung, sei sie spezifisch oder nicht-
spezifisch, gebunden sind.
Frühere Versuche, die Effekte nicht-spezifischer Bindungen
auf Tests zu überwinden, sind primär chemisch gewesen und
auf die Verwendung von Reagenzien gerichtet, die Proteine
enthalten, die dazu gedacht sind, nicht-spezifische Bindung
zu unterdrücken oder zu blockieren. Solche Reagenzien sind
jedoch nicht universell wirksam, was sich in der Tatsache
wiederspiegelt, daß viele verschiedene Arten von Blockern
(z.B. Kalbsfötenserum, Gelatine, Kasein usw.) in
Antikörper/Antigen-Tests verwendet worden sind.
In der folgenden Diskussion werden aus Gründen der Zweck
dienlichkeit Tests, die spezifische Bindungsreaktionen be
treffen, am Beispiel von immunologischen Tests veranschau
licht werden, wobei es jedoch selbstverständlich ist, daß
die betroffenen Prinzipien, auch wenn dies nicht besonders
angegeben wird, auf andere Arten von Tests, die spezifischen
Bindungsreaktionen betreffen, angewendet werden können.
Das Erreichen der höchsten Meßgenauigkeit bei einer
spezifischen Bindungsreaktion ist nicht eine Sache des
stärksten Signals und der empfindlichsten Instrumente. Eine
gewisse Empfindlichkeit kann wegen der durch die Antikörper
affinität auferlegten Grenzen nicht durch Verbesserungen bei
der Markierungssubstanz und bei den Instrumenten erreicht
werden.
Betrachten wir zum Beispiel einen immunologischen Einfang-
oder nicht-konkurrierenden Test. Im Prinzip besitzt der
letztere ein Potential für größere Empfindlichkeit als ein
konkurrierender immunologischer Test, weil die Effekte
niedriger Antikörperaffinität durch eine Erhöhung in der
Konzentration an markiertem Antikörper überwunden werden
kann. Der Vorteil der potentiellen Empfindlichkeit eines
nicht-konkurrierenden Verfahrens gegenüber einem
konkurrierenden Verfahren steigt, bei Verwendung desselben
Antikörpers, mit der abnehmenden Affinität des Antikörpers.
Bei Verwendung einer Antikörperaffinität von 1012M ginge die
potentielle Testempfindlichkeit, wenn zum Beispiel der
Effekt nicht-spezifischer Bindung von 1% auf 0,01%
verringert werden kann, von 105 auf 103 Moleküle/ml herauf.
Die Erhöhung der Menge an markiertem Antikörper wäre jedoch
begleitet von einer Erhöhung in der absoluten Menge nicht
spezifischer Bindung des markierten Antikörpers, was die
Möglichkeit verringert, die geringeren Mengen an Antigen zu
unterscheiden, und könnte tatsächlich den Empfindlichkeits
vorteil des nicht-konkurrierenden Verfahrens beseitigen oder
verringern.
Für einen konventionellen Ansatz bei Ligandbindungs
messungen wird nicht-spezifische Bindung üblicherweise
dadurch geschätzt, daß man zunächst eine Reihe von externen
Messungen (d.h. getrennt von oder vor der tatsächlichen
Messung der Bindung) für die Nullreaktion des verwendeten
Instrumentensystems durchführt, d.h. eine Messung nicht-
spezifischer Bindungen außerhalb des durchzuführenden Tests,
die durch den Test einer Probe erzielt wird, von der man
weiß, daß sie keinen interessierenden Analyten enthält. Im
allgemeinen sind solche Messungen nicht konstant, sondern
schwanken um irgendeinen Mittelwert. Aus einer solchen Meß
reihe kann man eine mittlere Antwort auf für nicht
spezifische Bindung (NSB) und einen NSB-Rauschpegel
definieren, bei dem das quadratisch gemittelte (RMS)
Rauschen bei den NSB-Messungen gleich der Standardabweichung
der NSB-Antworten ist. In nachfolgenden Tests von unbe
kannten Analytkonzentrationen, kann die spezifische Antwort
als die Systemantwort minus der mittleren NSB-Antwort ange
nommen werden. Um natürlich sicher zu sein, daß eine vor
gegebene Probe Analyt enthält, ist es notwendig, daß die
spezifische Antwort größer ist als das Rauschen. Bei sehr
kleinen Analytgehalten wird die Antwort üblicherweise vom
NSB-Rauschen beherrscht.
Demgemäß ist es eine Hauptaufgabe der vorliegenden Erfindung
ein Ligandbindungs-Messungssystem zur Verfügung zu stellen,
das eine "interne" Bezugsgröße verwendet, die für die
Ergänzung "externer" Kontrollmessungen verwendet werden
kann, um die Empfindlichkeit des Systems zu verbessern. Eine
andere wichtige Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es,
ein derartiges System zur Verfügung zu stellen, bei dem die
Effekte nicht-spezifischer Bindung markierter Liganden, wie
etwa Antikörper, unterdrückt oder minimiert werden, wodurch
die Empfindlichkeit des Tests über die gegenwärtig von
bekannten immunologischen Testsystemen erreichbare hinaus
gesteigert wird.
Andere Aufgaben der vorliegenden Erfindung sind teilweise
offensichtlich und werden teilweise im weiteren noch deut
lich werden.
Die Erfindung umfaßt dementsprechend die Vorrichtung, welche
die entsprechende Konstruktion, Elementkombination und
Teileanordnung aufweist, und das Verfahren, das die
verschiedenen Schritte und die Beziehung eines oder mehrerer
solcher Schritte im Bezug auf jeden der anderen umfaßt, was
alles in der folgenden detaillierten Offenbarung beispiel
haft veranschaulicht ist, und wobei der Schutzumfang der
Anmeldung in den Ansprüchen angegeben ist.
Für ein vollständigeres Verständnis der Art und der Ziele
der vorliegenden Erfindung soll Bezug genommen werden auf
die folgende detaillierte Beschreibung, die im Zusammenhang
mit der beiliegenden Zeichnung zu sehen ist, in der
- eine idealisierte, teilweise schematische, teilweise im Querschnitt dargestellte Ansicht der Vorrichtung gezeigt ist, welchen die Prinzipien der vorliegenden Erfindung verkörpert.
Das System der vorliegenden Erfindung umfaßt im allgemeinen
ein Multiplex-Testsystem, in dem Signale proportional zum
Ausmaß der Bindung zweier unterschiedlicher Liganden im
System erzeugt und in Echtzeit typischerweise gleichzeitig
ausgewertet werden, d.h. entweder im wesentlichen simultan
oder in einer Sequenz von Beobachtungen oder Messungen, die
innerhalb einer vergleichsweise kurzen Zeit in Bezug auf
dieselbe Probe im Test vorgenommen werden. Es ist in den
meisten Fällen bevorzugt, die Beobachtungen so simultan wie
möglich durchzuführen, um irgendwelche Effekte schneller
Veränderungen im Hintergrund zu verringern.
Das Multiplex-System der vorliegenden Erfindung sollte von
bekannten Mehrkanaltests unterschieden werden, in denen zwei
oder mehr Analyten im wesentlichen simultan unter Verwendung
verschiedener markierter Liganden getestet werden, die sich
entsprechend einmalig spezifisch an die passenden Analyten
binden. Vgl.: A Dual Radioimmunossay for the Detection of
Morphine and Cocaine in Urine, A.S. Young, F. Rubio and
S.E. Wagner, Clinical Chemistry, Bd. 34, Nr. 6, 1988, S.
1161.
Eine typische Ausführungsform des Multiplex-Testsystems der
vorliegenden Erfindung ist jedoch eine, welche die
spezifische Bindungsreaktion mit einem spezifischen interes
sierenden Analyten in einer Probe bestimmt, wobei in diesem
System zwei oder mehr unterschiedlich markierte Liganden,
jeder mit seinen eigenen unterschiedlichen Bindungseigen
schaften, gleichzeitig in Bezug auf die Probe im System be
obachtet werden. Die erhaltenen Reaktionen werden ver
arbeitet, um die Effekte nicht-spezifischer Bindungen in
solch einem Test zu verringern, so daß die spezifische
Bindungsreaktion genauer bestimmt werden kann.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt daher einen
Test für einen interessierenden Analyten in einer Probe zur
Verfügung. Das Verfahren umfaßt den Schritt des Zur-Ver
fügung-Stellens wenigstens zweier unterschiedlicher
Liganden, von denen jeder an eine entsprechend unterschied
liche Art von Markierungen gebunden ist, die voneinander
unterscheidbar sind, und wenigstens ein erster von diesen
Liganden in der Lage ist, sich spezifisch mit diesem Ana
lyten zu binden. Die Liganden und die Probe werden mitein
ander in Kontakt gebracht, z.B. durch Vermischen, um einen
Testkörper zu bilden (der ein flüssiges Volumen sein kann),
der einen Komplex einschließt, der wenigstens diesen ersten
Liganden und den Analyten umfaßt. Gleichzeitig, quantitativ
und getrennt voneinander wird dann die Messung des Teils von
jeder Markierung durchgeführt, der ausschließlich an ge
bundene Liganden im Testkörper gekoppelt, und diese
Messungen werden verglichen. Messungen können natürlich
dadurch einfacher durchgeführt werden, daß zuerst die ge
bundenen von den ungebundenen Liganden getrennt werden, z.B.
durch Auswaschen der ungebundenen Liganden.
Die vorliegende Erfindung wird in eine Vorrichtung zum
Testen auf den Analyten in der Probe durch spezifische
Bindung des Analyten an einen immobilisierten Liganden auf
einer Reaktionsoberfläche zur Bindung eines Komplexes ver
körpert. Spezifische Bindung wird durch In-Kontakt-Bringen
der Probe mit dem immobilisierten Liganden und einem unter
schiedlichen und unterschiedlich markierten zweiten Liganden
bewirkt. Die zwei unterschiedlichen Liganden liegen in vor
bestimmtem Anteilsverhältnis zueinander vor und sind nicht
immunologisch kreuzweise reaktiv. Vorzugsweise wird sich der
zweite Ligand nicht spezifisch an den Analyten oder andere
Komponenten in der Probe binden. Die unterschiedlichen
Markierungen auf den Liganden können quantitativ gemessen
werden. Die relativen nicht-spezifischen Bindungseigen
schaften dieser Liganden im Bezug auf die Vorrichtung
drücken sich in einer bekannten oder vorbestimmten Funktion
oder Beziehung aus. Quantitative Messung dieser nur an ge
bundene Mengen der Liganden gekoppelten Markierungen wird
dann im wesentlichen gleichzeitig durchgeführt. Ausgehend
vom bekannten Verhältnis von Liganden im Testkörper, der
bekannte Beziehung zwischen den nicht-spezifischen Bindungs
eigenschaften der Liganden zur Vorrichtung und der
quantitativen Messung der gebundenen Markierungen kann man
relativ genau die spezifische Bindung des ersten Liganden an
den Analyten bestimmen.
Insbesondere die unterschiedlichen Markierungen sind so
ausgewählt, daß sie entsprechend Signale zur Verfügung
stellen können, die leicht voneinander unterscheidbar sind,
z.B. bei verschiedenen Wellenlängen fluoreszieren. Die
durchgeführten quantitativen Messungen betreffen die
Amplitude derjenigen Signale, die von den angeregten
Markierungen geliefert werden, die an diejenigen Liganden
gekoppelt sind, die sowohl spezifisch als auch nicht-
spezifisch im Verlauf des Testes gebunden sind. Weil das
relative Verhältnis von Liganden zueinander im Testkörper
oder Reagenz bekannt ist und weil auch die Beziehung
zwischen den nicht-spezifischen Bindungseigenschaften dieser
Liganden bezüglich der Testvorrichtung bekannt oder vorbe
stimmt ist, ist es dann relativ einfach, in Echtzeit das
Ausmaß zu bestimmen, in dem die im Hinblick auf den einzigen
Liganden, der spezifisch an den Analyten gebunden ist, ge
messene Signale auf solche spezifisch gebundenen Liganden
zurückzuführen sind.
Man nehme zum Beispiel an, daß der Ligand (Ls), der sich
spezifisch an den Analyten bindet, und der Ligand (Ln), der
sich nicht spezifisch an den Analyten bindet, in einem Ver
hältnis (R1) von 1:1 im Testkörper in Form eines Reagenzes
vorliegt. Man nehme weiter an, daß ein Vortesten des
Reagenzes in der Testvorrichtung in Abwesenheit von irgend
einem interessierenden Analyten ergeben hat, daß die
Liganden sich nicht-spezifisch im Verhältnis (R2) von 1:2
(Ls:Ln) binden werden. Der Test erfordert dann, daß die
Probe mit dem interessierenden Analyten, falls vorhanden,
mit dem Reagenzkörper in Kontakt gebracht wird. Dies wird
sowohl zur spezifischen Bindung von Analyten und Ls als auch
zur nicht-spezifischen Bindung der Liganden an die Testvor
richtung führen (wobei dieser Ausdruck in diesem Zusammen
hang so verstanden werden soll, daß er alle andere auf
tretenden Bindungsreaktionen neben der spezifischen Bindung
des Analyten an Ls einschließt). Simultane Messung der
charakteristischen und getrennten Signale (d.h. separate
Kanalmessungen) aus den entsprechenden Markierungen auf den
gebundenen Liganden wird dann durchgeführt. In einem ideali
sierten Fall gehen die Signale aus Ln ausschließlich auf den
Liganden Ln zurück, der nicht-spezifisch gebunden ist,
wohingegen die Signale Ls von einem Liganden stammen werden,
der sowohl spezifisch als auch nicht-spezifisch gebunden
ist. Weil es bekannt ist, daß die Liganden im Verhältnis R1
vorlagen und die relativen nicht-spezifischen Bindungseigen
schaften dieser Liganden im Reagenz R2 betrug, kann man dann
diese Beziehungen verwenden, um das Ausmaß des Signals zu
bestimmen, das aus spezifisch gebundenem Ls stammt.
Man nehme zum Beispiel an, daß die Amplituden der Signale zu
As und An gemessen sind, die entsprechend das spezifisch und
nicht-spezifisch gebundene Ls und das nicht-spezifisch ge
bundene Ln repräsentieren, dann kann der Anteil S des
Signals As, der nur auf das spezifisch gebundene Ls zurück
geht, ausgedrückt werden als:
(1) S=As-Anf(R1,R2),
in der f(R1,R2) eine Funktion (nicht notwendigerweise
entweder linear oder nicht-linear) der Werte R1 und R2 ist.
Eine einfache exemplarische Form der Funktion als ein
Produkt ist:
(2) f=k1R1k2R2,
in der k1 und k2 einfach Proportionalitäts- oder Wichtungs
konstanten sind, die empirisch bestimmt werden.
Eine Variation der vorliegenden Erfindung ist in einer Test
vorrichtung, wie oben beschrieben, verkörpert, wobei aber
zusätzlich noch ein anderer oder dritter Ligand verwendet
wird, der mit einer Markierung versehen ist, die quantitativ
gemessen und leicht von den Markierungen auf den anderen
zwei Liganden unterschieden werden kann und sich entweder an
eine unterschiedliche Stelle auf dem interessierenden
Analyten oder an einen unterschiedlichen Analyten spezifisch
bindet. Alle drei Liganden stehen natürlich in einem vorbe
stimmten Anteilsverhältnis zueinander, wobei die Liganden
nicht immunologisch kreuzweise reaktiv sind. Die relativen
nicht-spezifischen Bindungseigenschaften dieser drei
Liganden im Bezug auf die Vorrichtung drücken sich in einer
bekannten oder vorbestimmten Funktion oder Beziehung aus.
Dieses System stellt dann drei Kanäle zur Verfügung, zwei
spezifische und einen nicht-spezifischen, wobei aus diesen
Kanälen die spezifischen Bindungseigenschaften der zwei sich
spezifisch bindenden Liganden bestimmt werden können.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann vor
teilhafterweise im Zusammenhang mit einem immunologischen
Fluoreszenzen Testsystem beschrieben werden, das fluores
zierende Markierungen verwendet, insbesondere mit einem
Test, der Zellen mit gedämpfter Totalreflektion (ATR) ver
wendet, aber selbstverständlich erstrecken sich die
Prinzipien der Erfindung sich auch auf andere Arten von
Tests die spezifische Bindungsreaktionen umfassen und andere
Arten von nachweisbaren Markierungen verwenden.
Die Verwendung einer ATR-Zelle in Form einer Platte aus
strahlungsdurchlässigem Material zum beobachten und messen
von Fluorezenz, die an einer Zelloberfläche durch die
Dämpfungswelle induziert ist und durch die Zelle im wesent
lichen senkrecht zur Ebene der Zelloberfläche wandert, wurde
zuerst von T. Hirschfeld im U.S.-Patent Nr. 36 04 927 vorge
schlagen. Eine ausgeklügeltere immunologische ATR-Testvor
richtung ist im Detail im U.S.-Patent Nr. 45 58 014 (erteilt
am 10. Dezember 1985) dargestellt und beschrieben, und die
Beschreibung und Funktionsweise einer solchen ATR-Zelle wird
hier durch Bezugnahme aufgenommen. Ein klarer Vorteil wird
dadurch erreicht, wenn solch eine ATR-Zelle bei der vor
liegenden Erfindung verwendet wird, weil Fluoreszenzsignale,
die mit solch einer Zelle nachgewiesen werden, ausschließ
lich in der Dämpfungszone nahe der Reaktionsoberfläche der
Zelle entstehen. Die Zelle trennt somit per se automatisch
freie Liganden von denjenigen Liganden, die nicht-spezifisch
an die Reaktionsoberfläche gebunden sind und die spezifisch
in an der Reaktionsoberfläche gebildeten Komplexen gebunden
sind.
Unter Bezugnahme auf die Zeichnung ist dort ein Querschnitt
eines Fragments einer völlig nach innen reflektierenden
Zelle 10 dargestellt. Eine bevorzugte Ausführungsform der
Zelle 10 umfaßt einen zylindrischen Stab oder eine Faser 12,
der (die) ein länglicher, im wesentlichen zylindrischer,
optisch transparenter Körper ist, der so ausgelegt ist daß,
optische Strahlung, die an einem Ende der Faser in einem
feststehenden Winkel im wesentlichen drehsymmetrisch zur
Längsachse der Faser eintritt, sich entlang seiner Länge
durch mehrfache innere Totalreflexionen fortpflanzt.
Beispielhaft kann Faser 12 aus irgendeinem aus einer Anzahl
von optisch transparenten Materialien sein, wie etwa Glas,
Quarz, Saphir, Polypropylen, Polyolefine, Nylon und der
gleichen, mit einem größeren Brechungsindex als demjenigen
der zu testenden flüssigen Probe. Wie im weiteren noch
beschrieben wird, ist ein synthetisches Polymer insofern
bevorzugt, als die Anbringung einer im weiteren
beschriebenen Beschichtung darauf leichter durchgeführt
werden kann als auf einem anorganischen Substrat, wie etwa
Glas. Vorzugsweise ist die Faser 12 in einem Kapillarrohr 14
eingeschlossen, das aus einem Material gebildet ist, das
relativ unlöslich und nicht-reaktiv gegenüber der zu testen
den Flüssigkeit ist. Faser 12 durchläuft das Kapillarrohr 14
und wird darin typischerweise von einem Stopfen 16 koaxial
gehalten, wodurch die Faser mit Ausnahme ihrer Endfläche 18
in ihrer Gesamtheit innerhalb des Rohr 14 angeordnet ist.
Auf einem Teil der Außenfläche von Faser 12 ist eine immo
bilisierte oder vorgebundene Beschichtung 20 angeordnet, die
zum Beispiel aus einem der Reaktanten einer immunartigen
Reaktion gebildet sein kann, d.h. einer Komponente eines
Antigen/Antikörper-Komplexes. Typischerweise kann die Be
schichtung so aufgebracht werden, daß die Faseroberfläche
oder das Substrat zunächst mit einer Vielzahl von Kopplungs
stellen versehen wird und dann eine Anzahl der gewünschten
Komponenten eines Antikörper/Antigen-Komplexes an diese
Stellen gebunden werden kann, vorzugsweise kovalent und in
bekannter Art und Weise. Die Kopplungsstellen auf dem
Substrat, an denen die ausgewählten Komponenten des Anti
gen/Antikörper-Komplexes zu Anfang immobilisiert werden,
sind so ausgewählt, daß sie die erforderliche Immobili
sierung zur Verfügung stellen, ohne die Affinität und die
Avidität der Komponente gegenüber dem komplementären Teil
des Komplexes nennenswert zu beinflussen. Für den Fall, daß
Faser 12 aus Glas ist, können geeignete Befestigungsstellen,
wie wohlbekannt ist, zum Beispiel dadurch zur Verfügung
gestellt werden, daß eine Silylverbindung mit der Glasober
fläche zur Reaktion gebracht wird. Kopplung anderer
geeigneter Silylverbindungen und Verfahren, durch die
Carboxyl-, Amino- und andere reaktive Gruppen von Antikörper
oder Antigen kovalent an verschiedene anorganische
Materialien gebunden werden können, sind bei Weetall im
U.S.-Patent Nr. 36 52 761 beschrieben. Die Bindung an
Polymere ist oft einfacher, und es gibt ausgiebige
Literatur, welche die Immobilisierung von Antikörpern und
Antigenen auf der Oberfläche von Polymeren beschreibt. Die
Beschichtung 24 kann auch in einigen Fällen durch Adsorption
aufgebracht werden, indem die Zelloberfläche mit einem
geeigneten Reagenz, das eine geeignet ausgewählte Komponente
enthält, einfach benetzt wird.
Zum Beispiel wäre die ausgewählte Komponente, die auf dem
ATR-Substrat immobilisiert werden soll, für den wohlbe
kannten Sandwich-Test, ein Ligand, der sich spezifisch an
die interessierenden Analyten binden wird. Solch ein Ligand
wird vorzugsweise in genügender Menge zur Verfügung ge
stellt, um eine Anzahl von Reaktionsstellen zu liefern, die
gegenüber der Anzahl der Analytmoleküle oder zu testenden
Komponenten deutlich im Überschuß ist, so daß die Reaktions
stellen anschließend nicht abgesättigt werden. Die be
schichtete Zelle würde dann sowohl mit der Probe, welche den
zu testenden Analyten enthalten kann, als auch mit dem
Reagenz, das die zwei markierten Liganden enthält, in
Kontakt gebracht. Man würde dann die Reaktanten für einen
genügenden Zeitraum inkubieren lassen, um sicherzustellen,
daß die Bindungsreaktionen im wesentlichen abgeschlossen
sind. Signale, die von den markierten Liganden erhalten
werden, die sich an den immobilisierten Analyten gebunden
haben und sich nicht-spezifisch an andere Teile der Testvor
richtung gebunden haben, werden dann gemessen. Das Signal,
das vom zweiten gebundenen Liganden (d.h. demjenigen, der
nicht in der Lage ist, sich spezifisch an den Analyten zu
binden) gemessen wird, kann dann verwendet werden, um (durch
ein Nomogramm, eine Tabelle oder eine Formel) vorherzusagen,
welche Menge oder welcher Anteil des erhaltenen Signals aus
dem ersten gebundenen Liganden von der spezifischen Bindung
des letzteren an den Analyten stammt.
Im exemplarisch beschriebenen ATR-System ist eine Licht
quelle 24 zum Liefern eines Lichtstrahls 22 zur Zelle 10
vorgesehen. Obgleich die Lichtquelle 24 eine Breitbandlicht
quelle sein kann, wie etwa ein mit Licht von einer Glühlampe
beleuchteter Kondensor, eine lichtemittierende Diode, Sonnen
licht und dergleichen, ist es bevorzugt, daß die Lichtquelle
24 eine Dualquelle darstellt, die Anregungsstrahlung inner
halb eines Paars enger Wellenlängenbänder liefert. Zu diesem
Zweck kann sie geeignete Bandpaßfilter einschließen. Die
Mittenwellenlängen der zwei Bänder werden in Übereinstimmung
mit den Adsorptionseigenschaften der Fluorophore gewählt,
die als Markierungen auf den markierten Liganden verwendet
werden, um die letzteren bei Beleuchtung zur Fluoreszenz
anzuregen. Lichtquelle 24 kann auch Strahlformungsmittel
einschließen, wie diese von den Fachleuten auf diesem Gebiet
verstanden werden, um eine Objektivlinse mit einem Strahl
geeigneter Begrenzung zu beleuchten, um es der Linse 28 zu
ermöglichen, die Lichtquellenblende auf die Endfläche 18
abzubilden, vorzugsweise mit keinem der Strahl, in einem
größeren Winkel auf die Fläche 18 auftrifft als demjenigen,
welcher der numerischen Apertur der Faser entspricht.
Mittel, wie etwa Strahlenteiler 30 werden zwischen Licht
quelle 24 und Linse 28 angeordnet. Für eine bevorzugte Aus
führungsform ist ein Strahlenteiler 30 so ausgebildet, daß
dieser die zwei Anregungswellenlängenbänder reflektiert und
die entsprechenden Fluoreszenzemissionen von Fläche 18
durchläßt.
Wenn die analythaltige Probe in den Zwischenraum 32 zwischen
Faser 12 und Rohr 14 eingeführt ist, wird der Analyt mit dem
immobilisierten Liganden in der Beschichtung 20 reagieren,
vorausgesetzt, daß der Ligand so ausgewählt worden ist, daß
er sich spezifisch an diesen Analyten bindet und etwas
Analyt in der Probe vorhanden ist. Wenn man nun, um einen
Sandwich-Test durchzuführen, die zwei unterschiedlich mar
kierten unterschiedlichen Liganden in den Zwischenraum 32
einbringt, wird sich der erste markierte Ligand spezifisch
sowohl mit dem freien Analyten und mit dem Analyten, der an
die immobilisierten Liganden gebunden worden ist, binden.
Der zweite markierte Ligand wird sich nicht spezifisch an
den Analyten binden, sondern von ihm kann man erwarten, daß
er sich nicht-spezifisch an die Oberfläche der Faser bindet,
wie dies ein Teil des ersten markierten Liganden auch tun
wird.
Beim Einführen eines Lichtstrahls aus Lichtquelle 24 in
einem geeigneten Winkel in Fläche 18 von Faser 12 wird sich
der Strahl durch innere Totalreflexion durch die Faser hin
durch fortpflanzen, wobei er eine Dämpfungwelle in einer
Dämpfungszone (nicht gezeigt) erzeugt, die benachbart zur
Faseroberfläche verläuft. Die Dämpfungswelle, wird die
Markierungen dort, wo sie auf solche gebundenen Liganden
auftrifft, zum Fluoreszieren in zwei unterschiedlichen
Wellenlängen oder in zwei unterschiedlichen Kanälen veran
lassen, und ein großer Teil dieser Fluoreszenz wird in das
Medium von Faser 12 zurückgerichtet oder -getunnelt werden,
ein Teil bei oder oberhalb des kritischen Winkels und ein
Teil unterhalb des kritischen Winkels. In die Zelle zurück
gerichtetes Licht bei oder oberhalb des kritischen Winkels
wird durch die Faser 12 hindurch fortgepflanzt, wobei ein
Teil aus der Einlaßfläche 18 austritt.
Messung der entsprechenden Amplituden der zwei unterschied
lichen Wellenlängen von Fluoreszenzlicht, das aus Fläche 18
austritt, durch elektro-optische Nachweismittel 34 wird das
entsprechende quantitative Vorhandensein der gebundenen
Liganden anzeigen. Zu diesem Zweck können die Mittel 34 zwei
elektro-optische Detektoren umfassen, die jeweils gegenüber
den entsprechenden Wellenlängen ansprechen. Alternativ dazu
kann man anstelle von Lichtquelle 24 und Nachweismitteln 34
ein Fluorimeter mit umschaltbarer Anregung und zur Anregung
und zum Emissionsnachweis aus den jeweiligen Markierungen
entsprechend passenden Emissionsfiltern verwenden. Solche
Messungen der Amplituden der Signale von Markierungen können
dann zusammen mit den anderen vorbestimmten Informationen,
im Hinblick auf die Werte von R1 und R2 in Mittel 36 einge
geben werden, wie etwa in einen in geeigneter Weise pro
grammierten digitalen Computer oder eine passende festver
drahtete Schaltung, um die erwünschte Bestimmung, wie oben
beschrieben, des Ausmaßes der erreichten spezifischen
Bindung vorzunehmen.
Die Brauchbarkeit eines Multiplex-Systems für die Bestimmung
nicht-spezifischer Bindung in Gegenwart von spezifischer
Bindung wurde in einem Testsystem gezeigt, daß im folgenden
detaillierten Beispiel exemplarisch dargestellt werden soll.
Das Testreagenz wurde von Ziegen-anti-Rinder-IgG (als dem
ersten Liganden, von dem man erwartet, daß er sich spezi
fisch an Rinder-IgG bindet), markiert mit Fluorescein in
bekannter Weise, und aus Ziegen-anti-Maus-IgG (als dem
zweiten Liganden), markiert mit Rhodamin in bekannter Weise,
gebildet. Die ATR-Zelle, eine polystyrolbeschichtete Quarz
faser wurde zumindest in einer Reaktionszone auf ihrer Ober
fläche mit Rinder-IgG beschichtet. Diese Reagenzien wurden
von der Jackson Immunological Corporation erhalten, und die
Antikörper waren vom Lieferanten auf kreuzweise Reaktivität
vorgescreent.
Eine vorläufige Bestimmung der nicht-spezifischen Bindung
beider Antikörper wurde zunächst bezüglich einer Anzahl im
wesentlichen identischer nackter polystyrolbeschichteter
Quarzfasern durchgeführt, indem man letzteren zunächst in
phosphatgepufferter Kochsalzlösung(PBS) (pH 7,4), erhalten
von Sigma Chemical, inkubierte. Nach der Inkubation wurde
jede der Fasern in einer Durchflußzelle in einem ATR-Fluori
meter angebracht, der ein Paar Detektorkanäle aufwies, die
jeweils auf die Hauptwellenlängen von Fluorescein
beziehungsweise Rhodamin (530 nm und 580 nm) ansprachen.
Eine bevorzugte Ausführungsform verwendete ein Fluorimeter
mit umschaltbarer Anregung und zur Anregung und zum Fluores
cenznachweis von Floureszein und Rhodamin entsprechend ge
eignete Emissionsfilter, d.h. Anregungsfilter 480/20 (480 nm
Mittenwellenlänge, 20 nm Durchlaßbereich) für Fluorescein
und 530/30 für Rhodamin; Fluoreszenzfilter von 530/30 für
Fluorescein und 580/20 für Rhodamin.
Jede Faser wurde 2 Minuten in fließender PBS gewaschen. Der
Durchfluß wurde gestoppt, Anregungslicht (480 und 530 nm in
Sequenz) festgelegter Intensität wurde an einem Ende in die
Faser eingeführt und Hintergrundablesungen (in mV) wurden
für jeden der zwei Kanäle aufgezeichnet, eine Ablesung für
den Hintergrund im Fluorescein-Nachweiskanal und eine im
Rhodamin-Nachweiskanal. Dann ließ man die PBS aus der Durch
flußzelle ausströmen und ersetzte sie durch einen Strom
einer Lösung gleicher Volumenteile von 7,5 µg/ml rhodamin
markiertem anti-Maus-IgG und 7,0 µg/ml fluorescein
markiertem anti-Rinder-IgG. Der Durchfluß wurde gestoppt,
und man ließ die Faser für zwei Minuten bei Raumtemperatur
inkubieren. Die Antikörperlösung wurde dann in einem Strom
von PBS vier Minuten ausgewaschen. Dasselbe Anregungslicht
wurde wieder in die Faser eingeführt, und Ablesungen
(in mV), welche die Summe der entsprechenden Hintergründe
und der nicht-spezifischen Bindung repräsentierten, wurden
vorgenommen um Werte für Af und Ar für die Flourescein-
beziehungsweise Rhodaminkanäle für vier solcher Fasern zu
erhalten.
Die Daten sind in der folgenden Tabelle A zusammengefaßt in
der Af und Ar jeweils die Amplitude in mV der Signale sind,
die vom gebundenen fluorescein- und rhodaminmarkierten IgG
erhalten wurden. Vor- und Nach-ink. bezieht sich auf
Signale, die entsprechend vor Inkubation und nach Inkubation
und Waschen gemessen wurden. Die Bindungsantwort ist
einfach die Differenz zwischen den entsprechenden Vor-Ink.-
und Nach-Ink.-Signalen, und das Bindungsverhältnis ist das
Verhältnis der Bindungsantworten.
Es ist anzumerken, daß das mittlere Bindungsverhältnis 1,215
mit einer Standardabweichung von 0,070 und einem C.V. von
5,798% betrug. Die mittlere NSB-Reaktion für Af betrug 521
mV mit einer Standardabweichung von 172,5 mV (C.V. 33%), was
tatsächlich an Maß für das Rauschen bei einem Nullanalyt
Pegel ist.
Die vorstehenden Reaktionen wurden natürlich von Oberflächen
erzeugt, die keinerlei Antigen aufwiesen. Man wird jedoch
einschätzen können, daß man eine ähnliche Meßreihe auf einer
Faser durchführen kann, die mit einem Protein oder irgend
einem anderen Blockierungsmittel, das nicht von irgendeinem
der Antikörper spezifisch gebunden wird, blockiert ist. Die
Verwendung derartiger Blocker sollte dazu dienen, mögliche
ungewollte Effekte aufgrund von Differenzen in den nicht
spezifischen Bindungseigenschaften der Antikörper im Hin
blick auf blockierte beziehungsweise nackte Fasern zu ver
ringern.
Die selbe Antikörpermischung wurde dann mit fünf identischen
Fasern, wie zuvor verwendet, zur Reaktion gebracht. Man
folgte dabei derselben Vorgehensweise, wie beschrieben, mit
der Ausnahme, daß die Fasern durch Inkubation für fünf
Minuten in 0,5 µg/ml Rinder-IgG statt durch Inkubation in
PBS vorbereitet wurden. Die Ergebnisse des Beispiels sind in
Tabelle B dargestellt.
Aus diesen letzteren Daten kann bestimmt werden, daß die
spezifische Reaktion, die vom fluoresceinmarkierten IgG
geliefert wird, die gesamte mittlere Af-Bindungsreaktion
minus 1,215 (das aus Tabelle A ermittelte vorbestimmte
Bindungsverhältnis) Mal den mittleren Ar betrug. Dies
lieferte eine mittlere Bindungsreaktion von 146,2 mV mit
einer Standardabweichung von 102 mV.
Die herkömmliche Methode der Datenanalyse aus dem Stand der
Technik besteht darin, den mittleren Af-Wert aus Tabelle B
zu nehmen und davon den mittleren Af-Wert abzuziehen, der
nur auf die nicht-spezifische Bindung zurückgeht, darge
stellt als mittlerer Af in Tabelle A. Unter Befolgung
dieser Methode beträgt die mittlere spezifische Bindungs
reaktion 284,6 mV und die Standardabweichung beträgt
284,3 mV. Eine passende Vergleichsmethode aus dem Stand der
Technik und die Methode nach der vorliegenden Erfindung
besteht darin, das mittlere Signal/Rauschen-Verhältnis (S/N)
beim verwendeten Analytgehalt zu bestimmen. Nach der Methode
aus dem Stand der Technik ist S/N dann 284,6/284,3 oder
1,00, wohingegen die Methode der vorliegenden Erfindung ein
S/N von 146,2/102 oder 1,43 ergibt. Dies stellt eine Ver
besserung in S/N von etwa 1,5 bei dem gewählten Analytgehalt
dar und eine Verringerung im Rauschen um einen Faktor von
2,5 in der Nullanalytantwort.
Ein anderes Beispiel einer Multiplex-Vorrichtung der vor
liegenden Erfindung, die verwendet wird, um NSB zu
bestimmen, kann aus dem folgenden ersehen werden. Es ist
bekannt, daß ein Virus die Bildung von mehr als einer Art
von Antikörper auslösen kann, z.B. zwei unterschiedliche
Antikörper, die entsprechend gegenüber der Hülle und dem
Kern des Virus spezifisch sind. Für diagnostische Zecke kann
man wünschen, eine Probe, zum Beispiel aus Blut, zu testen,
von der man vermutet, daß sie die Antikörper gegenüber einer
spezifischen Art eines solchen Virus enthält.
Folglich kann man Lysat von diesem Virus zum Beispiel als
eine Beschichtung auf der Oberfläche einer optischen Faser,
aufgebracht durch Adsorption, immobilisieren. Diese
beschichtete Faser wird dann mit der Probe in Kontakt ge
bracht, wodurch durch spezifische Bindung der Lysatfragmente
von Kern und Hülle mit irgendwelchen entsprechenden
passenden Antikörpern, die in der Probe vorhanden sein
können, Komplexe gebildet werden. Ein Reagenz wird herge
stellt, das ein bekanntes Verhältnis an einem ersten und
einem zweiten synthetischen oder natürlichen Protein ent
hält, die jeweils zu den Hüllen- und Kernproteinen des Virus
passen und jeweils mit fluoreszierenden Markierungen, wie
etwa Fluorescein und Rhodamin, in bekannter Weise markiert
sind. Das Reagenz wird mit der Probe und der beschichteten
Faser vermischt, so daß die Proteine in diesem Reagenz sich
ebenfalls spezifisch an die vorher an die Lysatbeschichtung
gebundenen Antikörper und nicht-spezifisch irgendwo an der
Faser binden können.
Das spezifische Bindungsverhältnis der zwei Proteine wird
durch das Verhältnis der Bindungsstellen festgelegt, die
durch die relativen Mengen der zwei in der Probe vorhandenen
und an die Beschichtung gebundenen Antikörper geliefert
werden. Wenn man a priori das Verhältnis solcher Bindungs
stellen kennt, wird das Reagenz mit einem Proteinverhältnis
hergestellt, das deutlich verschieden von dem Verhältnis der
Bindungsstellen ist.
Die markierten Proteine, die an die Faser gebunden sind,
werden nunmehr getrennt und im wesentlichen gleichzeitig in
der erfindungsgemäßen Vorrichtung zu Fluoreszenz angeregt,
was Signale liefert, die durch eine Kombination spezifischer
und nicht-spezifischer Bindung der markierten Proteine er
zeugt werden. Es ist jedoch offensichtlich, daß das Verhält
nis der entsprechenden Signale, die von den Markierungen auf
den Proteinen erzeugt werden, die spezifisch gebunden sind,
mit dem Verhältnis der Bindungsstellen übereinstimmt, aber
das Verhältnis der Signale, die von markierten Proteinen
erzeugt werden, die nicht-spezifisch gebunden sind, wird mit
dem bekannten Verhältnis übereinstimmen, in dem die
entsprechenden Proteine im Reagenz zugeführt werden. Wo das
Verhältnis von Bindungsstellen oder Antikörpern ebenfalls
bekannt ist, können dann, weil die zwei Verhältnisse
beträchtlich voneinander abweichen (wobei dies unter der
Kontrolle des Herstellers des Reagenzes steht), die
Amplituden der entsprechenden Signale passend eingestellt
werden, um den Effekt der nicht-spezifischen Bindung zu
beseitigen.
Wenn man a priori keine Kenntnis vom Verhältnis der
Bindungsstellen hat, d.h. vom Verhältnis der Antikörper kann
man einen Vortest unter Verwendung eines anderen Reagenzes
durchführen, in dem die Proteine in einem ersten Verhältnis,
z.B. einheitlich, vorliegen. Unter Verwendung der Ergebnisse
dieses Tests wird dann ein zweiter Test mit einem zweiten
Reagenz durchgeführt, in dem das Verhältnis der Proteine zum
Beispiel als das Inverse der Messung der Signale im ersten
Test eingestellt worden ist. Die Messung der Signale im
zweiten Test liefert genügend Information, aus der heraus
man Berechnungen anstellen kann, durch die die Effekte der
nicht-spezifischen Bindung ausgesondert werden können.
Die in der vorstehenden Beschreibung, in der Zeichnung sowie
in den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können
sowohl einzeln als auch in beliebiger Kombination für die
Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Aus
führungsformen wesentlich sein.
Claims (16)
1. Verfahren zum Testen auf einen interessierenden Analyten
in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß wenigstens zwei
verschiedene Liganden bereitgestellt werden, die mit ent
sprechenden unterschiedlichen Markierungen gekoppelt ist,
die voneinander unterscheidbar sind, wobei wenigstens ein
erster der Liganden in der Lage ist, sich spezifisch an den
Analyten zu binden; daß die Liganden und die Probe in
Kontakt gebracht werden, um einen Körper zu bilden, der
einen Komplex einschließt, welcher wenigstens den ersten
Liganden und den Analyten umfaßt; daß gleichzeitig
quantitativ und getrennt der Teil jeder Markierung gemessen
wird, der ausschließlich an gebundene Liganden in besagtem
Körper gekoppelt ist; und daß die Messungen der Markierungen
verglichen werden.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß
eine Vorrichtung zur Verfügung gestellt wird, in der
besagter Test durchgeführt werden soll; daß die zwei unter
schiedlich markierten unterschiedlichen Liganden in einem
vorbestimmten Anteilsverhältnis zueinander bereitgestellt
werden, wobei jeder Ligand unterschiedliche spezifische
Bindungseigenschaften in Bezug auf den interessierenden
Analyten aufweist und die nicht-spezifischen Bindungseigen
schaften der Liganden im Bezug auf die Vorrichtung in einer
bestimmten Korrelation zueinander stehen; daß die Liganden
mit der Probe in der Vorrichtung in Kontakt gebracht werden,
um die spezifische Bindung zu bewirken und den Komplex zu
bilden; und daß die spezifische Bindung des ersten Liganden
in Bezug auf den Analyten aus dem Vergleich der Messungen,
des bekannten Anteilsverhältnisses und der bekannten Korre
lation bestimmt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß,
nachdem die Liganden mit der Probe in Kontakt gebracht
worden sind, im wesentlichen die Gesamtheit des Analyten und
der Liganden von denjenigen Liganden, die an den Analyten
und an die Vorrichtung gebunden sind, abgetrennt werden.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch ge
kennzeichnet, daß jede unterschiedliche Markierung, wenn sie
angeregt wird, entsprechend voneinander unterscheidbare
Signale liefern kann und daß die Messungen die Amplitude
der Signale von im wesentlichen ausschließlich gebundenen
Liganden betreffen.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
die unterschiedlichen Markierungen, wenn sie angeregt
werden, Fluoreszenzstrahlung bei Wellenlängen liefern, die
voneinander abweichen.
6. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß der zweite Ligand sich nicht spezifisch
an den Analyten oder andere Komponenten in der Probe bindet.
7. Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch
gekennzeichnet, daß der erste Ligand im Überschuß gegenüber
der Menge zur Verfügung gestellt wird, von der man erwartet,
daß sie sich spezifisch mit dem Analyten in der Probe
bindet.
8. Verfahren nach Anspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die
bekannte Korrelation dadurch bestimmt wird, daß vorbereitend
die Liganden in der Vorrichtung in Abwesenheit des Analyten
getestet werden, um quantitativ die Amplituden der ent
sprechenden Signale von den markierten Liganden zu messen,
die während des Vorbereitungstests nicht-spezifisch gebunden
werden; und daß das Verhältnis der gemessenen Signal
amplituden vom ersten und vom zweiten Liganden bestimmt
wird.
9. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
der Bestimmungsschritt so durchgeführt wird, daß gemäß einer
Funktion des bekannten Anteilsverhältnisses und des
bekannten Verhältnisses der Wert des Signals vom zweiten
Liganden modifiziert wird, um dadurch einen modifizierten
Wert zu erhalten, und daß die Amplitude des Signals vom
ersten Liganden mit diesem modifizierten Wert verglichen
wird.
10. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß
der Bestimmungsschritt so durchgeführt wird, daß von der
Amplitude des Signals vom ersten Liganden das Produkt des
bekannten Verhältnisses mal den bekannten Anteilsverhältnis
mal der Amplitude des Signals aus dem zweiten Liganden sub
trahiert wird.
11. Vorrichtung zum Testen einer Lösung auf einen
interessierenden Analyten, gekennzeichnet durch wenigstens
zwei unterschiedlich markierte Liganden, die jeder unter
schiedlich mit entsprechenden Markierungen markiert sind,
wobei das Vorhandensein der Markierungen quantitativ be
stimmt werden kann und wenigstens ein erster Ligand in der
Lage ist, sich spezifisch an den Analyten zu binden; eine
Reaktionsoberfläche, an der wenigstens der erste Ligand
einen spezifisch gebundenen Komplex mit dem Analyten bilden
kann; und Mittel zum gleichzeitigen quantitativen und ge
trennten Messen des Teils jeder Markierung, der an die Ober
fläche gebunden sein kann.
12. Vorrichtung nach Anspruch 11 dadurch gekennzeichnet, daß
der erste Ligand auf besagter Reaktionsoberfläche
immobilisiert ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch
gekennzeichnet, daß die Reaktionsoberfläche eine Oberfläche
einer Zelle mit gedämpfter Totalreflexion ist.
14. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 13, gekenn
zeichnet durch Mittel zum Einführen von Strahlung in besagte
Zelle bei Wellenlängen, die in der Lage sind, beide
Markierungen zum Aussenden entsprechender unterschiedlicher
Signale anzuregen.
15. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch
gekennzeichnet, daß die Mittel zum gleichzeitigen
quantitativen und getrennten Messen ein Paar Detektoren um
fassen, die jeweils auf eines der entsprechenden unter
schiedlichen Signale ansprechen.
16. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 11 bis 14, dadurch
gekennzeichnet, daß die Mittel zum gleichzeitigen
quantitativen und getrennten Messen ein Fluorimeter mit um
schaltbarer Anregung und entsprechend zur Anregung und zum
Emissionsnachweis der Markierungen geeignete Emissionsfilter
umfassen.
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