DE3618101C2

DE3618101C2 -

Info

Publication number: DE3618101C2
Application number: DE3618101A
Authority: DE
Inventors: Masumi Suzuki; Kyoko Katsuta Jp Makiguchi; Yasushi Mito Jp Nomura
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1985-05-31
Filing date: 1986-05-30
Publication date: 1989-04-27
Also published as: DE3618101A1; JPH076984B2; JPS61277059A; US4939098A

Description

Die Erfindung betrifft eine Immunoassay-Testanordnung und ihre Verwendung in einem Analyseverfahren, das die Analyse einer Vielzahl von Bestandteilen bei der Untersuchung einer Probe mittels Immunoreaktionen erlaubt.

Als Analysenverfahren, die unter Anwendung von Immunoreaktionen arbeiten, sind verschiedene Varianten bekannt. So sind z. B. in Ishikawa, Kawai und Kani "Kosomen-eki Sokuteiho" (Enzymimunoassays) Igakushoin, S. 1-3 (1978) verschiedene Methoden, wie Radioimmunoassays, Fluoreszenzimmunoassays und Enzymimmunoassays beschrieben.

Radioimmunoassays erfordern wegen der Verwendung radioaktiver Stoffe bestimmte Vorkehrungen, was allgemein als nachteilig empfunden wird. Bei Radioimmunoassays und Enzymimmunoassays ist es schwierig, eine Vielzahl von Komponenten in kleinen Mengen der gleichen Probe gleichzeitig zu bestimmen, und zwar wegen der Beschränkung, die von den Grundlagen der Immunoassays selbst herrührt. Aus diesem Grund wird bei der Durchführung von Immunoassays verschiedener Komponenten in einer Probe diese Probe verdünnt und entsprechend der Anzahl der zu untersuchenden Bestandteile unterteilt. Herkömmliche Immunoassays sind somit mit dem Nachteil behaftet, daß große Mengen sowohl an Proben als auch an Reagentien für die Analyse einer Vielzahl von Bestandteilen erforderlich sind.

Aus der DE-PS 24 06 959 ist nun ein Verfahren bekannt, bei dem die Entwicklerschicht einer Immunoassay-Testanordnung in getrennter Anordnung aber aneinandergereiht in Laufrichtung der Entwicklerschicht mehrere verschiedener Reaktanten für eine Antigen/Antikörperreaktion enthält.

Die Methode der DE-AS 25 00 218 stellt eine Vervielfältigung der klassischen Anordnung zur Durchführung einer Immunoreaktion dar. Statt einer einzigen Entwicklerschicht findet eine Vielzahl von Entwicklerschichten Verwendung, und statt einer Probenaufgabestelle eine Aufgaberinne. Jede Entwicklerschicht enthält nur einen einzigen Antikörper, der spezifisch mit einem in der Probe enthaltenen Antigen zu reagieren vermag.

Gegenstand der Erfindung ist nun eine Immunoassay-Testanordnung zur gleichzeitigen qualitativen oder quantitativen Bestimmung mindestens zweier Antigene oder Antikörper in einer Probe, mit einer Entwicklerschicht, die in getrennter Anordnung in Laufrichtung der Entwicklerschicht mehrere verschiedener Reaktanten für eine Antigen/Antikörperreaktion enthält, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die Reaktanten in der Entwicklerschicht im Abstand zueinander angeordnet sind.

Mit anderen Worten, die erfindungsgemäß aufgebaute Entwicklerschicht besitzt voneinander unabhängige, isolierte Auftragstellen für ein spezifisches Antigen (bzw. Antikörper), die durch "freie" Entwicklerschicht auf Abstand gehalten werden. Demzufolge findet die Immunoreaktion nur in diesen isolierten Aufgabestellen statt, wodurch einerseits die Nachweisempfindlichkeit erhöht wird und andererseits die benötigte Menge an Antigen bzw. Antikörper herabgesetzt werden kann, weil Antigen bzw. Antikörper sich nur in den isolierten Bereichen befinden.

Darüber hinaus bietet die erfindungsgemäße Anordnung einen weiteren wichtigen Vorteil. Sollte es nämlich zu einer unerwünschten Diffusion von in der Entwicklerschicht enthaltenem Antigen oder Antikörper kommen, geschieht dies allenfalls in die freie Entwicklerschicht, so daß eine Überlagerung von Immunoreaktionen in Folge Anwesenheit von mehr als einem Antigen (bzw. Antikörper) an der gleichen Stelle ausgeschlossen ist. Es versteht sich von selbst, daß in letzterem Fall die Analyse unbrauchbar wird.

Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung der beschriebenen Immunoassay-Testanordnung zur gleichzeitigen qualitativen oder quantitativen Bestimmung mindestens zweier Antigene oder Antikörper in einer Analysenprobe.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung handelt es sich somit um ein Analysenverfahren, bei dem man zumindest zwei Reagentien, die jeweils ein Antigen oder einen Antikörper enthalten, die unterschiedlich von denjenigen der anderen Reagentien sind, an verschiedenen Stellen einer Entwicklerschicht als Trägermaterial aufbringt, die eine Entwicklung der Probe erlaubt, die Probe an einer bestimmten Stelle der Entwicklerschicht aufbringt, die Probe über die Entwicklerschicht wandern läßt und die Reaktionsprodukte nach dem Passieren der reagenshaltigen Stellen durch die Probe identifiziert.

Es wird somit ein einfaches Verfahren zur Verfügung gestellt, daß es ermöglicht, eine Vielzahl von Gegenständen (Bestandteile und dgl.) in einer Probe, wie Blut, Urin od. dgl., gleichzeitig unter Anwendung von Immunoreaktionen zu bestimmen. Dieses Verfahren ist insbesondere vorteilhaft zur gleichzeitigen Analyse einer großen Anzahl von Proben, bei denen jeweils eine Vielzahl von Komponenten zu bestimmen ist.

Die zur Durchführung des Verfahrens verwendete Testset-Anordnung enthält ein Entwicklungsschichtmaterial mit einer Entwicklerschicht, die eine Entwicklung einer Probe erlaubt, mindestens zwei, vorzugsweise drei oder mehr Reagentien, die sich an beliebigen Stellen der Entwicklerschicht als Träger befinden und individuell einen Antikörper oder ein Antigen, unterschiedlich von denjenigen der anderen Reagentien, enthalten, und eine Probeaufgabestelle, vorzugsweise von konkaver Form, die auf dem Entwicklerschichtmaterial an der gleichen Stelle wie eine der Stellen wo die vorgenannten Reagentien aufgebracht sind oder an einer Stelle vorgesehen ist, die von allen genannten Stellen entfernt ist.

Als Entwicklerschicht kann eine Schicht aus beliebigem Material verwendet werden, solange eine Fixierung oder Immobilisierung der Reagentien durch physikalische Adsorption oder chemische Bindung und eine Wanderung der Probe, z. B. mittels Elektrophorese, Lösemittel od. dgl. gewährleistet sind. Geeignete Beispiele sind Gele von organischen Stoffen, wie synthetische Polymere, Polysaccharide oder Proteine; Gele von Metallhydroxiden; Tonmineralien, wie Zeolithe oder Montmorillonite; sowie poröse Glasperlen oder poröse Kunststoffilme, die in einigen Fällen oberflächlich polare Gruppen, wie Amidgruppen, erhalten durch Oberflächenbehandlung mit Ionenaustauscherharzen, aufweisen.

Beispiele für geeignete synthetische Polymere sind solche mit polaren Gruppen, wie Polyacrylamid, Polyurethan, Polyvinylalkohol oder Polyvinylpyrrolidon. Ein Beispiel für ein geeignetes Polysaccharid ist Agarose. Beispiele für geeignete Proteine sind Kollagen oder Gelatine. Beispiele für geeignete Metallhydroxide sind Aluminiumhydroxid oder Titaniumhydroxid.

Bei der Herstellung der Entwicklerschicht kann eine ebene Platte, z. B. aus Glas, als Hilfsmaterial verwendet werden.

Die Herstellung der Entwicklerschicht kann nach üblichen Methoden erfolgen. Bei Verwendung von Agarosegel wird z. B. eine 2 mm dicke Glasplatte von 4 × 7 cm mit einer Vielzahl konkaver Stellen zur Fixierung der Reagentien hergestellt (wie in Fig. 2 gezeigt,), worauf eine Liposomenlösung in die konkaven Stellen (Vertiefungen) eingebracht wird. An die Liposomen ist zuvor ein Antikörper oder ein Antigen gebunden worden, das mit einer bestimmten Substanz als zu bestimmendes Objekt reagiert. Nachdem man die Lösung mit einem Sieb (hergestellt aus einer porösen Substanz mit einer Porengröße von 0,2 µm) abgedeckt hat, wird hierauf Agarosegel (2%), hergestellt durch Auflösung in Phosphatpuffer (pH 7,4), aufgebracht. Die Bereiche außerhalb der Vertiefungen, die das Liposom enthalten, und derjenigen für die Probenaufgabe, d. h. die Glasoberfläche, die das Gel nicht adsorbiert, wird dann zur Adsorption des Agarosegels bis zu einer Dicke von 1 bis 1,5 mm erwärmt.

Die Form der Entwicklerschicht ist im allgemeinen rechteckig, sie kann jedoch auch kreisförmig oder quadratisch sein.

Die Größe der Entwicklerschicht hängt z. B. von der Art der Probe oder der Art der zu bestimmenden Substanzen oder, im Fall der Messung mittels optischer Systeme, vom Meßgerät ab. Die Auswahl der Größe ist dem Fachmann geläufig; die Abmessungen liegen üblicherweise im Rahmen von 4 × 12 cm

Auch die Dicke der Entwicklerschicht richtet sich im allgemeinen nach dem Anwendungszweck. Übliche Dicken sind z. B. 2 mm im Fall der Verwendung von Cellulosegel, wie Sepharose, oder 1 bis 1,5 mm im Fall der Verwendung von Agarose. Der Ausdruck "Dicke der Entwicklerschicht" bezeichnet hier die Dicke des Gels oder der Entwicklerschicht selbst, wobei die Dicke eines Trägers, wie Glas, nicht mit inbegriffen ist.

Für die Probenaufgabenstelle auf der Entwicklerschicht ist es ausreichend, daß sie eine Vertiefung bzw. ein Loch ausreichender Größe bildet. Dieses Loch besitzt z. B. rechteckige, kreisförmige oder quadratische Form mit einer Tiefe von z. B. 1 mm oder darunter.

Für das Aufbringen der Reagentien auf die Entwicklerschicht können z. B. die physikalische Adsorption oder chemische Bindungen dienen. Eine chemische Bindung läßt sich erreichen, indem man Stoffe verwendet, die einen Antikörper oder ein Antigen an ein Antigen bzw. einen Antikörper zu binden vermögen, wobei der Untersuchungsgegenstand sowohl ein Antikörper als auch ein Antigen sein kann.

Die Reagentien können z. B. direkt an das Material gebunden werden, das zur Herstellung der Entwicklerschicht dient. Die Reagentien können auch in Mikrokapseln eingebracht werden, die auf der Entwicklerschicht mittels physikalischer oder chemischer Bindung fixiert werden. In diesem Fall kann man ein poröses Material zwischen die Mikrokapseln und die Entwicklerschicht einbringen, wobei als poröses Material z. B. poröse Glasperlen verwendet werden können. Es sind beliebige Mikrokapseln geeignet, solange deren Oberfläche eine Lyse durch eine Antigen/ Antikörper-Reaktion oder Komplementaktivität eingeht. Geeignete Beispiele sind Erythrozyten vom Tier, z. B. vom Schaf, und Liposomen. Es können auch andere Tiererythrozyten als diejenigen vom Schaf und andere Tierzellen als Erythrozyten verwendet werden, sofern die Antikörper oder Antigene an die Zellmembranen gebunden werden können.

Im Fall der Verwendung von Erythrozyten oder Tierzellen können die Dialysemethoden von Mitsuru Furusawa "Seikagaku" (Biochemistry) 53 (9) 1066 (1981) angewendet werden. Bei dieser Methode werden Zellflüssigkeit und dgl. aus den Erythrozyten oder Tierzellen entfernt, und z. B. durch Enzyme ersetzt.

Im Falle von Liposomen erfolgt die Verwendung als Kapselmembran durch Bindung an den Antikörper (oder das Antigen) nach üblichen Verfahren, z. B. nach Lee et al., Nature, 288, 602 (1985), gefolgt von der Bildung einer Liposomenmembran, z. B. nach der Methode von S. W. Chan et al., Methods in Enzymology 74, 152-161.

Der Antikörper (oder das Antigen) wird der Membran in üblicher Weise einverleibt.

Weitere Substanzen, die in die Mikrokapseln, zusätzlich zu dem Antikörper oder dem Antigen, die mit der zu identifizierenden Substanz reagieren, eingebracht werden können, sind detektorempfindliche Markierungssubstanzen, die mit der zu identifizierenden Substanz reagieren. Geeignete Beispiele für Markierungssubstanzen sind Chelatbildner, Enzyme, Coenzyme und fluoreszierende Stoffe.

Beispiele für geeignete Chelatbildner sind 2-(2-Thiazolylazo)- 4-methyl-5-sulfomethylaminobenzoesäure (nachfolgend als TAMSMB bezeichnet), das spezifisch mit Kupfer- und Kobaltionen reagiert; das Natriumsalz von 2-(5-Brom-2-pyridylazo)-5-(N-propyl-N-sulfopropylamino)- phenol (abgekürzt auch 5-Br-PAPS), das mit Zinkionen reagiert; 2-Nitroso-5-(N-propyl-N-sulfopropylamino)-phenol (abgekürzt auch Nitroso-PSAP); sowie das Natriumsalz von 2-(5-Brom-2-pyridylazo)-5-(N-propyl-N-sulfopropylamino)- anilin, das mit Eisenionen reagiert.

Beispiele für geeignete Enzyme sind sowohl die eigentlichen Enzyme, die eine enzymatische Aktivität per se besitzen als auch Apoenzyme, die enzymatische Aktivität in Gegenwart von Coenzymen entwickeln.

Es ist auch möglich, eine detektorempfindliche Markierungssubstanz nachfolgend zu entwickeln, die nicht mit den auf bzw. in der Entwicklungsschicht befindlichen Substanzen sondern mit Reaktionsprodukten reagiert, die durch Reaktionen der trägergebundenen Substanzen mit Untersuchungssubstanzen neu gebildet werden.

Die Ausbildung einer Probeaufgabenstelle in Form einer Vertiefung auf der Entwicklerschicht ist zweckmäßig für die Aufgabe einer Probe zum Zwecke ihrer Entwicklung in der Entwicklerschicht.

Beim Aufbringen der Reagentien auf die Trägerschicht spielt der Abstand zwischen den Reagentien an sich keine besondere Rolle; es können mit anderen Worten beliebige Stellen der Entwicklerschicht ausgewählt werden. Es ist hinreichend, daß der Abstand zwischen den Reagentien so bemessen ist, daß das Detektorsystem, z. B. durch Verunreinigungen, nicht beeinträchtigt wird.

Die auf die Entwicklerschicht als Träger aufzubringenden Antikörper oder Antigene können nach Maßgabe der Art der Untersuchungsubstanzen ausgewählt werden.

Bei der erfindungsgemäßen Verwendung handelt es sich um ein Analyseverfahren zur gleichzeitigen qualitativen oder quantitativen Be stimmung von zwei oder mehr Komponenten in der gleichen Probe unter Anwendung optischer oder elektrischer Detek torsysteme. Hierbei geht man so vor, daß man eine Probe an der Probeaufgabenstelle der Entwicklungsschicht auf gibt, die Probe auf bzw. in der Entwicklerschicht in Richtung der in der Trägerschicht enthaltenen Reagentien laufen läßt, jedes auf der Entwicklerschicht als Träger befindliche Reagens einer für jede in der Probe befindliche Untersuchtungssubstanz spezifischen Immunoreaktion (zugehöriges Antigen oder zugehöriger Antikörper in der Probe) an einer Stelle nach Maßgabe der in der Probe enthaltenen Komponente unterwirft, und eine Auswertung derjenigen Stoffe vornimmt, die eine physikalische Änderung (Farbänderung oder Austritt aus den Mikrokapseln) mit fortschreitender Immunoreaktion eingegangen sind. In diesem Fall erhält man vorteilhafte Ergebnisse, wenn man Mikrokapseln verwendet, die an ihre Oberflächen gebunden ein für die in der Probe enthaltene Untersuchungs komponente reaktionsspezifisches Antigen (bzw. Antikörper) und im Inneren eine detektorempfindliche Substanz enthalten. Die auf der Entwicklerschicht als Träger enthaltenen Reagentien müssen nicht notwendigerweise eine detektorempfindliche Substanz enthalten; es ist vielmehr ausreichend, wenn sie Substanzen enthalten, die mit den in der Probe enthaltenen Untersuchungssub stanzen spezifisch reagieren. In diesem Fall ist es auch möglich, die Probe derart zu entwickeln, daß die Reagentien spezifisch mit den Untersuchungskomponenten reagieren, gefolgt von der Entwicklung einer detektorempfindlichen Markierungssubstanz, die mit den erhaltenen Reak tionsprodukten reagieren.

In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendung können z. B. drei Komponenten in der gleichen Probe gleichzeitig analysiert werden, wie nachfolgend beschrie ben.

Zunächst wird in einer Entwicklerschicht mit einem Träger, in dem die Entwicklung einer Probe erfolgen soll, eine Probe, z. B. eine Blutprobe, einer elektrophoretischen Wanderung durch Anlegen eines elektrischen Feldes an die Entwicklerschicht, oder einer säulenchromato graphischen Wanderung, oder einer Dünnschichtwanderung unterworfen. Die wandernde Probe trifft dann auf ein erstes Reagens, das spezifisch mit einer in der Probe enthaltenen Untersuchungskomponente reagiert, d. h. beim Eintreffen der Probe regagiert lediglich die entsprechende Komponente, indem ein Antigen oder ein Antikörper in der Blutprobe spezifisch mit dem ersten Reagens reagiert. Die restlichen in der Probe enthaltenen Komponenten, die nicht mit dem Reagens reagieren, setzen ihre Wanderung fort, wobei sie auf das zweite Reagens treffen und eine Reaktion nur der entsprechenden zweiten Komponente statt findet.

Die Probe trifft dann bei ihrer weiteren Wanderung auf ein drittes Reagens, das mit einer in der Probe enthal tenen Komponente reagiert, die sich von den Komponenten unterscheidet, die mit dem ersten und zweiten Reagens reagiert haben. Das heißt, beim Zusammentreffen der Probe mit dem dritten Reagens reagiert ein Antigen oder ein Antikörper spezifisch mit dem dritten Reagens. Nachdem die in der Probe enthaltenen restlichen biologischen Komponenten, die weder mit dem ersten noch mit dem zwei ten noch mit dem dritten Reagens reagieren, den Bereich des dritten Reagens vollständig passiert haben, werden die drei in der Entwicklerschicht vorhandenen Reak tionsprodukte, z. B. optisch, ausgemessen, wobei die Konzentrationen der Komponenten in der Probe gleichzeitig oder sukzessive berechnet werden.

Die Wanderungsgeschwindigkeit der Probe in der Entwickler schicht wird so eingestellt, daß sie einerseits für die Reaktionen der Reagentien mit den in der Probe ent haltenen Untersuchungskomponenten ausreichend ist und andererseits die Reaktionsprodukte von der Entwickler schicht zurückgehalten werden. Bei derartigen Immuno assays werden bei der Messung der Reaktionsprodukte in der Probe enthaltene Verunreinigungen durch die Wanderung der Probe von den Detektorsystemen ferngehalten, so daß die Analyse ohne jegliche Beeinträchtigung durch Verun reinigungen durchgeführt werden kann. Dies ermöglicht in folgedessen eine Analyse von hoher Genauigkeit.

Wenn ein Chelatbildner als Markierungsmittel zur Auswer tung der Reaktionen verwendet wird und die Bestimmung von Chelaten durchzuführen ist, kann mit dem unbewaffneten Auge erkannt werden, ob Reaktionsprodukte anwesend sind oder nicht. Demgemäß ist das erfindungsgemäße Immuno assayverfahren auch zur Analyse zahlreihe Proben zum Zwecke des Screenens einer Vielzahl von Komponenten ge eignet. Wenn die Bestimmung der Reaktionsprodukte unter Verwendung optischer oder elektrischer Detektoren erfolgt, ist nicht nur eine qualitative sondern auch eine quantitative Analyse der in der Probe enthaltenen Unter suchungskomponenten möglich. Die optische Auswertung um faßt zweckmäßigerweise die Bestrahlung mit monochromatischem Licht, die Bestimmung des reflektierten Lichts, die Berechnung der Konzentrationen der Untersuchungskomponenten aus der Intensität des reflektierten Lichts, sowie entsprechende Anzeige. In einigen Fällen ist die Be stimmung auch auf Grund einer Auswertung des Durchgangs lichtes möglich.

Ein Beispiel für ein elektrisches System, z. B. im Fall eines Analyseverfahrens unter Anwendung einer Kombination von Elektrophorese mit Liposomen, ist ein Verfahren, wobei dem Liposom eine mittels Elektroden erfaßbare Sub stanz, z. B. Na⁺ zusammen mit einem Antigen od. dgl., einverleibt wird. Nach der Reaktion einer Untersuchungs komponente mit dem Liposom wird eine Lösung des Liposoms entnommen, eine Substanz die aus dem Liposom ausgeflossen ist, mittels eines Sensors der Elektrode bestimmt, und die Untersuchungskomponente aus der Signalstärke in der Elektrode quantitativ bestimmt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

In den Beispielen ist auf die Fig. 1 bis 8 Bezug ge nommen. Es zeigen:

Fig. 1 in schematischer Darstellung eine Entwickler schicht zur Verwendung in der Testanordnung der Erfindung,

Fig. 2 in schematischer Darstellung eine andere Ausführungsform einer Entwicklerschicht,

Fig. 3 eine Seitenansicht der Entwicklerschicht von Fig. 2,

Fig. 4 in Form einer Eichkurve die Abhängigkeit der Ab sorption von der T₄-Konzentration,

Fig. 5 in Form einer Eichkurve die Abhängigkeit der Ab sorption von der T₃-Konzentration,

Fig. 6 in schematischer Darstellung eine in Beispiel 5 verwendete Vorrichtung,

Fig. 7 in Form einer Eichkurve die Abhängigkeit der Fluoreszenz von der α-FP-Konzentration, und

Fig. 8 in Form einer Eichkurve die Abhängigkeit der Fluoreszenz von der CRP-Konzentration.

In den Fig. 1 bis 8 haben die verwendeten Buchstaben und Bezugsziffern folgende Bedeutung:

a . . . Anti-IgG, b . . . Anti-IgA; c . . . Anti-IgM, a₁ und a₂ . . . Mikrokapseln, d, e und f . . . Aufgabe stellen, g . . . Probenaufgabestelle, h . . . Entwicklungs schicht, i . . . Sieb, 10 . . . Entwicklungsschichtmaterial, 11 . . . Puffer für Elektroden, 12 . . . Gel, 12 a. . . Trenn- Gel, enthaltend ein Liposom mit daran gebundenem Anti- CRP, 12 a′ . . . Trenn-Gel, enthaltend ein Liposom mit daran gebundenem Anti-α-FP, 12 b . . . Konzentrier-Gel, B und C . . . Elektroden.

Beispiel 1

Fig. 1 zeigt eine Entwicklerschicht zur Verwendung bei der qualitativen Analyse von IgG, IgA und IgM (Immuno globuline). Als Träger für die Entwicklerschicht findet ein Cellulosesegel (Sepharose-4B) Verwendung. Die Bindung von Antikörpern an das Cellulosesegel erfolgt so, daß man mit Cyanbromid aktiviertes Cellulosegel mit einem 0,2 mo laren Carbonatpuffer (pH 8,8) wäscht, worauf man einen Antikörper in einer Menge von 10 mg (berechnet auf Trocken substanz) pro ml des mit Cyanbromid aktivierten Cellulosegels zusetzt und dann das erhaltene Gemisch über Nacht bei 4°C schüttelt, um das Antigen an das Cellulosegel zu binden.

Nach Zugabe von Glycin in einer Menge von 0,2 g pro ml der vorgenannten Reaktionslösung, wird das erhaltene Ge misch 8 g bei 4°C geschüttelt, um eine Reaktion des Glycins mit HN-Gruppen zu bewirken, die nicht an den Antikörper gebunden sind. In gleicher Weise werden Anti- IgG, Anti-IgA und Anti-IgM jeweils an Cellulosegel unter Bildung von Anti-IgG-Cellulosegel, Anti-IgA-Cellulosegel und Anti-IgM-Cellulosegel gebunden.

Die Herstellung der Entwicklerschicht erfolgt so, daß man in 0,1 molarem Phosphatpuffer (pH 7,4) suspendiertes Cellulosegel auf einer ebenen Glasplatte zu einer gleich mäßigen Schicht von 1 mm Dicke formt. Um die Anti-IgG-, Anti-IgA- und Anti-IgM-gebundenen Cellulosegel auf die gleichmäßige Schicht aufzubringen, wird an drei Stellen der gleichmäßigen Schicht eine dünne Decke entfernt, worauf die Antikörper-gebundenen Cellulosegele an den Stellen a, b und c der Fig. 1 so aufgebracht werden, daß eine glatte Beschichtung entsteht. In einiger Entfernung von diesen Stellen wird eine Vertiefung g als Probenauf gabestelle gebildet. Die Vertiefung g wird etwas konkav und mit etwa 1 mm Tiefe ausgebildet, um die Probenaufgabe zu erleichtern.

Das Entwicklerschichtmaterial 10 in Fig. 1 enthält das genannte Cellulosegel als Träger. An den Stellen a, b und c befinden sich Anti-IgG, Anti-IgA bzw. Anti-IgM.

Beispiel 2

Dieses Beispiel betrifft eine Testanordnung für die gleich zeitige quantitative Analyse von drei Hormonen im Serum mittels des Immunoassayverfahrens der Erfindung. Die Ent wickleranordnung ist in Fig. 2 und 3 dargestellt. Als Träger für die Entwicklerschicht dient Agarosegel. Die Probenaufgabestellung g wird durch Entfernen eines Teils des Agarosegels gebildet. An den Stellen a₁ und a₂ werden liposomhaltige Reagentien aufgebracht, die spezi fisch reaktiv für die in einer Probe enthaltenen Kompo nenten sind. Die Herstellung einer Liposomenmembran er folgt nach der Methode von C. T. Tain, Samuel W. Chan, et al., beschrieben in Methods in Enzymology 74, 152-161. Die Bindung jedes Antikörpers an das Liposom erfolgt nach der Methode von Lee et al., beschrieben in Nature, 288, 602 (1985). Ein handelsüblicher Chelatbildner TAMSMB ist in der Membran entsprechend einer üblichen Methode ent halten. Zwischen dem Gel und jedem Reagens, das die Liposomenmembran enthält, wird ein Sieb i aus porösem Material vorgesehen, um eine Bewegung der Liposomenmem bran zu vermeiden und um die Wanderung der Komponenten im Reagens zu ermöglichen.

Beispiel 3

An der Probenaufgabestelle g der Testanordnung gemäß Bei spiel 1 werden 5 µl einer IgG, IgA und IgM enthaltenden Probe aufgegeben und mittels eines 0,1 molaren Phosphat puffers als Entwicklerlösung entwickelt. Nachdem die Pro be am oberen Ende der Entwicklerschicht angekommen ist, werden Eosin-markiertes Anti-IgG an der Stelle d, Eosin- p markiertes Anti-IgA an der Stelle e und Eosin-markiertes Anti-IgM an der Stelle f aufgegeben. Die Entwicklung der Eosin-markierten Antikörper erfolgt in einer Richtung senkrecht zur Richtung der Entwicklung der Probe. Als Entwicklerlösung dient eine 0,1 molare Phosphatpuffer lösung (pH 7,4). Als Ergebnis läßt sich mit dem unbewaff neten Auge feststellen, daß IgG, IgA und IgM, d. h. Komponenten in der Probe, die in der Entwicklerschicht gehalten werden, durch Eosin markiert worden sind. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Anwesenheit von IgG, IgA und IgM, die der Probe zuge setzt worden waren, ist in Übereinstimmung mit der durch das Eosin verursachten Färbung, die mit dem unbewaffneten Auge beobachtet werden kann.

Bei Verwendung von Urin als Probe findet man, daß drei Proteine gleichzeitig qualitativ analysiert werden kön nen.

Tabelle 1. Ergebnis der qualitativen Analyse von IgG, IgA und IgM

Beispiel 4

Dieses Beispiel wird unter Verwendung der Testanordnung von Beispiel 2 durchgeführt. Unter Verwendung einer Phosphat pufferlösung (pH 6,0) als Elektrophoresepuffer werden 5 µl einer Probe an der Probenaufgabestelle g aufge bracht und der Elektrophoresewanderung durch Anlegen eines elektrischen Feldes zwischen den Elektroden B und C unterworfen. An der Stelle a₁ der Entwicklungsschicht 10 befinden sich Liposomen mit daran gebundenem Anti thyroxin (T₄), und an der Stelle a₂ befinden sich Liposomen mit daran gebundenem Antitrÿodthyronin (T₃). Beim Passieren der Probe der Stellen a₁ und a₂ reagiert jede Komponente der Probe spezifisch mit jedem Antikörper auf der Liposomenmembran, die auf der anderen Seite des in Fig. 3 gezeigten Siebes i enthalten ist, wodurch die Untersuchungs komponenten auf den Liposomenmembranen festgehalten werden. Die elektrophoretische Wanderung erfolgt von der Anode B zur Kathode C, worauf 10 µl eines Reagens, her gestellt durch Zugabe eines Komplements und eines Me talls zu Phosphatpuffer, jeweils bei a₁ und a₂ zur Reaktion mit der Liposomenmembran eingespritzt werden. Die an ein Antigen in der Probe gebundene Liposomenmembran wird unter der lytischen Aktivität des Komplements aufgebrochen bzw. lysiert, wodurch es zu einem Austritt des von den Liposomenmembranen eingeschlossenen Chelat bildners TAMSMB kommt. Der Chelatbildner TAMSMB reagiert mit dem Metall unter Bildung eines Chelats unter Farb entwicklung. 20 min nach dem Einspritzen des Komplements und des Metalls werden T₃ und T₄ in der Probe aus der Absorption bei einer Wellenlänge von 585 nm quantitativ bestimmt.

Die Eichkurven der Fig. 4 und 5 wurden mit fünf verschiedenen Konzentrationen, jeweils T₃ und T₄ erhalten. Aus den Eichkurven werden T₃ und T₄ in der Probe bestimmt.

Bei der experimentellen Bestimmung der zugegebenen und wiedergewonnenen Mengen zeigen sich, daß die gemessenen Werte in Übereinstimmung mit den zugesetzten Mengen stehen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, daß die gleichzeitige Bestimmung von T₃ und T₄ im Serum möglich ist.

Tabelle 2

Beispiel 5

In diesem Beispiel werden in einer Probe enthaltenes α-Fetoprotein (α-FP) und C-reaktives Protein (CRP) quanti tativ mittels Scheibenelektrophorese bestimmt. Die Her stellung des Liposoms erfolgt in gleicher Weise wie in Beispiel 2 beschrieben. Anti-α-FP und Anti-CRP werden an die Oberfläche des Liposoms nach einem herkömmlichen Verfahren gebunden.

Als Entwicklerschicht dient Polyacrylamidgel. Zur Herstellung des Gels werden als Monomere Acrylamid und N,N′- Methylbisacrylamid (Bis) und als Polymerisationskatalysa toren N,N,N′,N′-Tetramethylethylendiamin (TEMED) und Ammoniumpersulfat oder Riboflavin verwendet. Eine Rezeptur für ein 7%iges Gel (pH 9,5) ist in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3. Verfahren zur Herstellung von Reagentien zur Herstellung eines Gels für die Scheibenelektrophorese.

Zur Herstellung eines Gels wird ein Glasrohr (Innen durchmesser 8 mm, Außendurchmesser 10 mm, Länge 50 mm) vertikal auf einem Stativ montiert. Eine Lösung für Konzentrier-Gel wird durch Vermischen gemäß Tabelle 3 hergestellt, und die Lösungen a und b werden erhalten durch Vermischen gemäß Tabelle 3 unmittelbar nach Ent gasung. Nachdem man das Glasrohr bis zu einer Höhe von 10 mm vom Boden mit der Lösung für das Konzentrier-Gel beschickt hat, wird auf den oberen Teil der Lösung vor sichtig Wasser aufgegeben. Die Durchführung der Gelierung erfolgt mittels Photopolymerisation durch Bestrahlung mit Licht aus einer fluoreszierenden Lampe. Die Bestrahlungs dauer beträgt etwa 20 min. Hierauf wird eine Lösung für Trenn-Gel hergestellt durch Vermischen gemäß Tabelle 3, bereitet und nachdem man eine Lösung von Liposomen mit daran ge bundenem Anti-a-FP entgast hat, wird diese Lösung mit der gleichen Menge der Lösung für das Trenn-Gel vermischt. Das den oberen Teil des Gels im Glasrohr bedeckende Wasser wird entfernt, und die das Liposom enthaltende Lösung für das Trenn-Gel wird auf den Rückstand bis zu einer Dicke von 5 mm aufgegeben. Nachdem man auf den oberen Teil dieser Lösung vorsichtig Wasser aufgegeben hat, läßt man das Glasrohr etwa 30 min stehen. Nachdem man 15 mm der gleichen Lösung, wie vorstehend für das Konzentrier- Gel beschrieben, auf das Wasser aufgebracht hat, wird abermals Wasser aufgegeben, worauf die Lösung der Photo polymerisation unterworfen wird. Hierauf wird eine Lösung aus Liposomen mit daran gebundenem Anti-CRP mit der gleichen Menge einer Lösung für Trenn-Gel (ein Gemisch aus Lösung a und b) vermischt. Das erhaltene Gemisch wird auf das Wasser im Glasrohr aufgegeben und der Polymerisation unterworfen. Die gleiche Lösung, wie vorstehend für das Konzentrier-Gel beschrieben, wird auf das erhaltene Gel bis zu einer Dicke von 10 mm aufgebracht und der Photo polymerisation unterworfen.

Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Gels wird eine Vorrichtung gemäß Fig. 6 aufgebaut. Als Puffer für die Elektroden dient die in Tabelle 3 beschriebene Lö sung. Nachdem man eine Probe mit einer gleichen Menge einer 20%igen Saccharoselösung versetzt hat, werden 5 µl des erhaltenen Gemisches auf das obere Ende der Scheibe für die Elektrophorese aufgegeben. Nach Beendigung der Elektrophorese werden die jeweils liposomhaltigen Trenn- Gele ausgeschnitten und mit Komplementlösung versetzt, worauf die Antigen/Antikörper-Reaktion gemessen wird. Wenn die Liposomen zuvor Carboxylfluorescein enthielten, können α-FP und CRP quantitativ aus der Fluoreszenz be stimmt werden. Wenn die Liposomen einen Chelatbildner, z. B. TAMSMB enthielten, können die genannten Bestandteile aus der Lichtabsorption quantitativ bestimmt werden, sofern zusätzlich zu dem Komplement Kupferionen (Cu²⁺) zugesetzt worden sind.

Es werden Proben mit α-FP-Konzentrationen von 5 µg/l, 10 µg/l, 20 µg/l und 40 µg/l, sowie Proben mit CRP- Konzentrationen von 5 mg/l, 10 mg/l, 20 mg/l und 40 mg/l verwendet. Sämtliche Proben werden dann der Elektrophorese unterworfen, worauf das Trenn-Gel ausgeschnitten wird. Die Eichkurven werden aus der Fluoreszenz (Carboxy- fluorescein) bestimmt. Sie sind in den Fig. 7 und 8 dar gestellt.

Die Beispiele zeigen, daß erfindungsgemäß eine Immuno assay-Testanordnung zur Verfügung gestellt wird, mit der die gleichzeitige Analyse verschiedener biologischer Komponenten, und zwar sowohl qualitativ als auch quantitativ, möglich ist. Hierzu ist eine geringe Menge einer einzigen Untersu chungsprobe ausreichend. Das Immuno assayverfahren zeichnet sich insbesondere dadurch aus, daß keine Verunreinigungen zur Zeit der Analyse anwesend sind, da die Untersuchungskomponenten von den anderen Komponenten in der Einwicklerschicht durch Verwendung der erfindungsgemäßen Testanordnung abgetrennt werden können. Darüber hinaus ist die gleichzeitige Analyse einer Viel zahl von Untersuchungskomponenten durch Veränderung der Art und Anzahl der auf der Entwickerschicht als Träger enthaltenen Reagentien möglich.

Claims

1. Immunoassay-Testanordnung zur gleichzeitigen qualitativen oder quantitativen Bestimmung mindestens zweier Antigene oder Antikörper in einer Probe, mit einer Entwickler schicht, die in getrennter Anordnung in Laufrichtung der Entwicklerschicht mehrere verschiedener Reaktanten für eine Antigen/Antikörperreaktion enthält, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktanten in der Entwicklerschicht im Abstand zueinander angeordnet sind.

2. Immunoassay-Testanordnung nach Anspruch 1, dadurch gekenn zeichnet, daß die Entwicklerschicht aus einem Material, ausgewählt aus der Gruppe Synthetische Polymere, Polysaccharide, Proteine, Metallhydroxide, Zeolithe, poröse Glasperlen und poröse Kunststoffilme, besteht.

3. Immunoassay-Testanordnung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktanten in Mikrokapseln ein geschlossen sind.

4. Immunoassay-Testanordnung nach Anspruch 3, dadurch gekenn zeichnet, daß die Mikrokapseln aus Lipsosommembranen aufgebaut sind.

5. Immunoassay-Testanordnung nach Anspruch 3 oder 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokapseln durch ein Sieb abgedeckt sind.

6. Immunoassay-Testanordnung nach einem der Ansprüche 3 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokapseln zusätzlich eine Markierungssubstanz enthalten, die eine Farbreak tion verursacht.

7. Immunoassay-Testanordnung nach Anspruch 6, dadurch gekenn zeichnet, daß die Markierungssubstanz aus der Gruppe Chelatbildner, Enzyme, Coenzyme und fluoreszierende Stoffe ausgewählt ist.

8. Verwendung der Immunoassay-Testanordnung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur gleichzeitigen qualitativen oder quantitativen Bestimmung mindestens zweier Antigene oder An tikörper in einer Analyseprobe.