DE3618101A1

DE3618101A1 - Immunoassay und testset fuer seine durchfuehrung

Info

Publication number: DE3618101A1
Application number: DE19863618101
Authority: DE
Inventors: Kyoko Katsuta Makiguchi; Yasushi Mito Nomura; Masumi Suzuki
Original assignee: Hitachi Ltd
Current assignee: Hitachi Ltd
Priority date: 1985-05-31
Filing date: 1986-05-30
Publication date: 1986-12-04
Also published as: JPS61277059A; US4939098A; DE3618101C2; JPH076984B2

Description

Hitachi, Ltd. München, 30. Mai 1986

A 7068 D/ka

Beschre ibung

Immunoassay und Testset für seine Durchführung

Die Erfindung betrifft ein Analysenverfahren zur Untersuchung von mindestens zwei Bestandteilen, insbesondere ein Analysenverfahren, das die Analyse einer Vielzahl von Bestandteilen bei der Untersuchung einer Probe mittels Immunoreaktionen erlaubt, sowie Mittel zur Durchführung dieses Verfahrens.

Als Analysenverfahren, die unter Anwendung von Immunoreaktionen arbeiten, sind verschiedene Varianten bekannt. So sind z.B. in Ishikawa, Kawai und Kani "Kosomen-eki Sokuteiho" (Enzymoimmunoassays) Igakushoin, S. 1-3 (1978) verschiedene Methoden, wie Radioimmunoassays, Fluoreszenzimmunoassays und Enzymimmunoassays beschrieben.

Radioimmunoassays erfordern wegen der Verwendung radioaktiver Stoffe bestimmte Vorkehrungen, was allgemein als nachteilig empfunden wird. Bei Radioimmunoassays und Enzymimmunoassays ist es schwierig, eine Vielzahl von Komponenten in kleinen Mengen der gleichen Probe gleichzeitig zu bestimmen, und zwar wegen der Beschränkung, die von den Grundlagen der Immunoassays selbst herrührt. Aus diesem Grund wird bei der Durchführung von Immunoassays verschiedener Komponenten in einer Probe diese Probe verdünnt und entsprechend der Anzahl der zu untersuchenden

Bestandteile unterteilt. Herkömmliche Immunoassays sind somit mit dem Nachteil behaftet, daß große Mengen sowohl an Proben als auch an Reagentien für die Analyse einer Vielzahl von Bestandteilen erforderlich sind. Bis heute stehen keine einfachen Analysenmethoden zur gleichzeitigen Bestimmung von zumindest zwei Bestandteilen zur Verfügung .

Eine Aufgabe der Erfindung besteht somit darin, ein Analysenverfahren und ein Mittel zu seiner Durchführung zur Verfügung zu stellen, das für die gleichzeitige Analyse von mindestens zwei Bestandteilen in einer einzigen Probe, und zwar sowohl für qualitative als auch für quantitative Zwecke, geeignet ist.

Gegenstand der Erfindung ist somit ein Analysenverfahren gemäß Patentanspruch 1.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Testset zur Durchführung dieses Analysenverfahrens gemäß Patentanspruch 7.

Erfindungsgemäß handelt es sich somit um ein Analysenverfahren, bei dem man zumindest zwei Reagentien, die jeweils ein Antigen oder einen Antikörper enthalten, die unterschiedlich von denjenigen der anderen Reagentien sind, an verschiedenen Stellen einer Entwicklungsschicht als Trägermaterial aufbringt, die eine Entwicklung der Probe erlaubt, die Probe an einer bestimmten Stelle der Entwicklungsschicht aufbringt, die Probe über die Entwicklungsschicht wandern läßt und die Reaktionsprodukte nach dem Passieren der reagenshaltigen Stellen durch die Probe identifiziert.

Erfindungsgemäß wird somit ein einfaches Verfahren zur Verfügung gestellt, das es ermöglicht, eine Vielzahl von

Gegenständen (Bestandteile und dgl.) in einer Probe, wie Blut, Urin od.dgl., gleichzeitig unter Anwendung von Immunoreaktionen zu bestimmen. Dieses Verfahren ist insbesondere vorteilhaft zur gleichzeitigen Analyse einer großen Anzahl von Proben, bei denen jeweils eine Vielzahl von Komponenten zu bestimmen ist.

Der zur Durchführung des Verfahrens der Erfindung verwendete Testset enthält ein Entwicklungsschichtmaterial mit einer Entwicklungsschicht, die eine Entwicklung einer Probe erlaubt, mindestens zwei, vorzugsweise drei oder mehr Reagentien, die sich an beliebigen Stellen der Entwicklungsschicht als Träger befinden und individuell einen Antikörper oder ein Antigen, unterschiedlich von denjenigen der anderen Reagentien, enthalten, und eine Probeaufgabestelle, vorzugsweise von konkaver Form, die auf dem Entwicklungsschichtmaterial an der gleichen Stelle wie eine der Stellen wo die vorgenannten Reagentien aufgebracht sind oder an einer Stelle vorgesehen ist, die von allen genannten Stellen entfernt ist.

Als Entwicklungsschicht kann eine Schicht aus beliebigem Material verwendet werden, solange eine Fixierung oder Immobilisierung der Reagentien durch physikalische Adsorption oder chemische Bindung und eine Wanderung der Probe, z.B. mittels Elektrophorese, Lösemittel od.dgl. gewährleistet sind. Geeignete Beispiele sind Gele von organischen Stoffen, wie synthetische Polymere, Polysaccharide oder Proteine; Gele von Metallhydroxiden; Ton- mineralien, wie Zeolithe oder Montmorillonite; sowie poröse Glasperlen oder poröse Kunststoffilme, die in einigen Fällen oberflächlich polare Gruppen, wie Amidgruppen, erhalten durch Oberflächenbehandlung mit Ionenaustauscherharzen, aufweisen.

Beispiele für geeignete synthetische Polymere sind solche

mit polaren Gruppen, wie Polyacrylamid, Polyurethan, Polyvinylalkohol oder Polyvinylpyrolidon. Ein Beispiel für ein geeignetes Polysaccharid ist Agarose. Beispiele für geeignete Proteine sind Kollagen oder Gelatine. Beispiele für geeignete Metallhydroxide sind Aluminiumhydroxid oder Titaniumhydroxid.

Bei der Herstellung des Entwicklungsschichtmaterials kann eine ebene Platte, z.B. aus Glas, als Hilfsmaterial verwendet werden.

Die Herstellung des Entwicklungsschichtmaterials kann nach üblichen Methoden erfolgen. Bei Verwendung von Agarosegel wird z.B. eine 2 mm dicke Glasplatte von 4 χ 7 cm mit einer Vielzahl konkaver Stellen zur Fixierung der Reagentien hergestellt (wie in Fig. 2 gezeigt), worauf eine Liposomenlösung in die konkaven Stellen (Vertiefungen) eingebracht wird. An die Liposomen ist zuvor ein Antikörper oder ein Antigen gebunden worden, das mit einer bestimmten Substanz als zu bestimmendes Objekt reagiert. Nachdem man die Lösung mit einem Sieb (hergestellt aus einer porösen Substanz mit einer Porengröße von 0,2 um) abgedeckt hat, wird hierauf Agarosegel (2 %), hergestellt durch Auflösung in Phosphatpuffer (pH 7,4)_/ aufgebracht. Die Bereiche außerhalb der Vertiefungen, die das Liposom en ehalten,und derjenigen für die Probenaufgabe, d.h. die Glasoberfläche, die das Gel nicht adsorbiert, wird dann zur Adsorption des Agarosegels bis zu einer Dicke von 1 bis 1,5 mm erwärmt.

Die Form der Entwicklungsschicht ist im allgemeinen rechteckig, sie kann jedoch auch kreisförmig oder quadratisch sein.

Die Größe der Entwicklungsschicht hängt z.B. von der Art der Probe oder der Art der zu bestimmenden Substanzen

oder, im Fall der Messung mittels optischer Systeme, vom Meßgerät ab. Die Auswahl der Größe ist dem Fachmann geläufig; die Abmessungen liegen üblicherweise im Rahmen von 4 χ 12 cm.
5

Auch die Dicke der Entwicklungsschicht richtet sich im allgemeinen nach dem Anwendungszweck. Übliche Dicken sind z.B. 2 mm im Fall der Verwendung von Cellulosegel, wie Sepharose, oder 1 bis 1,5 mm im Fall der Verwendung von Agarose. Der Ausdruck "Dicke der Entwicklungsschicht" bezeichnet hier die Dicke des Gels oder der Entwicklungsschicht selbst, wobei die Dicke eines Trägers, wie Glas, nicht mit inbegriffen ist.

Für die Probenaufgabensteile auf der Entwicklungsschicht ist es ausreichend, daß sie eine Vertiefung bzw. ein Loch ausreichender Größe bildet. Dieses Loch besitzt z.B. rechteckige, kreisförmige oder quadratische Form mit einer Tiefe von z.B. 1 mm oder darunter.

Für das Aufbringen der Reagentien auf die Entwicklungsschicht können z.B. die physikalische Adsorption oder chemische Bindungen dienen. Eine chemische Bindung läßt sich erreichen, indem man Stoffe verwendet, die einen Antikörper oder ein Antigen an ein Antigen bzw. einen Antikörper zu binden vermögen, wobei der Untersuchungsgegenstand sowohl ein Antikörper als auch ein Antigen sein kann.

Die Reagentien können z.B. direkt an das Material gebunden werden, das zur Herstellung der Entwicklungsschicht dient. Die Reagentien können auch in Mikrokapseln einbracht werden, die auf der Entwicklungsschicht mittels physikalischer oder chemischer Bindung fixiert werden. In diesem Fall kann man ein poröses Material zwischen die Mikrokapseln und die Entwicklungsschicht einbringen,

wobei als poröses Material z.B. poröse Glasperlen verwendet werden können. Es sind beliebige Mikrokapseln geeignet, solange deren Oberfläche eine Lyse durch eine Antigen/Antikörper-Reaktion oder Komplementaktivität eingeht. Geeignete Beispiele sind Erythrozyten vom Tier, z.B. vom Schaf, und Liposomen. Es können auch andere Tiererythrozyten als diejenigen vom Schaf und andere Tierzellen als Erythrozyten verwendet werden, sofern die Antikörper oder Antigene an die Zellmembranen gebunden werden können.

Im Fall der Verwendung von Erythrozyten oder Tierzellen können die Dialysemethoden von Mitsuru Furusawa "Seikagaku" (Biochemistry) 53 (9) 1066 (1981) angewendet werden. Bei dieser Methode werden Zellflüssigkeit und dgl. aus den Erythrozyten oder Tierzellen entfernt, und z.B. durch Enzyme ersetzt.

Im Fall von Liposomen erfolgt die Verwendung als Kapselmembran durch Bindung an den Antikörper (oder das Antigen) nach üblichen Verfahren, z.B. nach Lee et al., Nature, 288 , 602 (1985), gefolgt von der Bildung einer Liposomenmembran, z.B. nach der Methode von S.W. Chan et al., Methods in Enzymology TA_ , 152 - 161.

Der Antikörper (oder das Antigen) wird der Membran in üblicher Weise einverleibt.

Weitere Substanzen, die in die Mikrokapseln, zusätzlich zu dem Antikörper oder dem Antigen, die mit der zu identifizierenden Substanz reagieren, eingebracht werden können, sind detektorempfindliche Markierungssubstanzen, die mit der zu identifizierenden Substanz reagieren. Geeignete Beispiele für Markierungssubstanzen sind Chelatbildner, Enzyme, Coenzyme und fluoreszierende Stoffe.

-^ HO

Beispiele für geeignete Chelatbildner sind 2-(2-Thiazolylazo)-4-methyl-5-sulfomethylaminobenzoesäure (nachfolgend als TAMSMB bezeichnet), das spezifisch mit Kupfer- und Kobaltionen reagiert; das Natriumsalz von 2-(5-Brom-2-pyridylazo)-5-(N-propyl-N-sulfopropylamino)-phenol (abgekürzt auch 5-Br-PAPS), das mit Zinkionen reagiert ; 2-Nitroso-5-(N-propyl-N-sulfopropylamino)-phenol (abgekürzt auch Nitroso-PSAP); sowie das Natriumsalz von 2-(5-Brom-2-pyridylazo)-5-(N-propyl-N-sulfopropylamino)-anilin, das mit Eisenionen reagiert.

Beispiele für geeignete Enzyme sind sowohl die eigentlichen Enzyme, die eine enzymatische Aktivität per se besitzen als auch Apoenzyme, die enzymatische Aktivität in Gegenwart von Coenzymen entwickeln.

Es ist auch möglich, eine detektorempfindliche Markierungssubstanz nachfolgend zu entwickeln, die nicht mit den auf bzw. in der Entwicklungsschicht befindlichen Substanzen sondern mit Reaktionsprodukten reagiert, die durch Reaktionen der trägergebundenen Substanzen mit Untersuchungssubstanzen neu gebildet werden.

Die Ausbildung einer Probeaufgabenstelle in Form einer Vertiefung auf der Entwicklungsschicht ist zweckmäßig für die Aufgabe einer Probe zum Zwecke ihrer Entwicklung in der Entwicklungsschicht.

Beim Aufbringen der Reagentien auf die Trägerschicht spielt der Abstand zwischen den Reagentien an sich keine besondere Rolle; es können mit anderen Worten beliebige Stellen der Entwicklungsschicht ausgewählt werden. Es ist hinreichend, daß der Abstand zwischen den Reagentien so bemessen ist, daß das Detektorsystem, z.B. durch Verunreinigungen, nicht beeinträchtigt wird.

Die auf die Entwicklungsschicht als Träger aufzubringenden Antikörper oder Antigene können nach Maßgabe der Art der Untersuchungssubstanzen ausgewählt werden.

Erfindungsgemäß handelt es sich um ein Analysenverfahren zur gleichzeitigen qualitativen oder quantitativen Bestimmung von zwei oder mehr Komponenten in der gleichen Probe unter Anwendung optischer oder elektrischer Detektorsysteme. Hierbei geht man so vor, daß man eine Probe an der Probeaufgabenstelle der Entwicklungsschicht aufgibt, die Probe auf bzw. in der Entwicklungsschicht in Richtung der in der Trägerschicht enthaltenen Reagentien laufen läßt, jedes auf der Entwicklungsschicht als Träger befindliche Reagens einer für jede in der Probe befindliehe Untersuchungssubstanz spezifischen Immunoreaktion (zugehöriges Antigen oder zugehöriger Antikörper in der Probe) an einer Stelle nach Maßgabe der in der Probe enthaltenen Komponente unterwirft, und eine Auswertung derjenigen Stoffe vornimmt, die eine physikalische Änderung (Farbänderung oder Austritt aus den Mikrokapseln) mit fortschreitender Immunoreaktion eingegangen sind. In diesem Fall erhält man vorteilhafte Ergebnisse, wenn man Mikrokapseln verwendet, die an ihre Oberflächen gebunden ein für die in der Probe enthaltene Untersuchungskomponente reaktionsspezifisches Antigen (bzw. Antikörper) und im Inneren eine detektorempfindliche Substanz enthalten. Die auf der Entwicklungsschicht als Träger enthaltenen Reagentien müssen nicht notwendigerweise eine detektorempfindliche Substanz enthalten; es ist vielmehr ausreichend, wenn sie Substanzen enthalten, die mit den in der Probe enthaltenen Untersuchungssubstanzen spezifisch reagieren. In diesem Fall ist es auch möglich, die Probe derart zu entwickeln, daß die Reagentien spezifisch mit den Untersuchungskomponenten reagieren, gefolgt von der Entwicklung einer detektorempfindlichen Markierungssubstanz, die mit den erhaltenen Reak-

tionsprodukten reagiert.

Bei Anwendung des erfindungsgemäßen Analysenverfahrens können z.B. drei Komponenten in der gleichen Probe gleichzeitig analysiert werden, wie nachfolgend beschrieben.

Zunächst wird in einer Entwicklungsschicht mit einem Träger, in dem die Entwicklung einer Probe erfolgen soll, eine Probe, z.B. eine Blutprobe, einer elektrophoretischen Wanderung durch Anlegen eines elektrischen Feldes an die Entwicklungsschicht, oder einer säulenchromatographischen Wanderung, oder einer Dünnschichtwanderung unterworfen. Die wandernde Probe trifft dann auf ein erstes Reagens, das spezifisch mit einer in der Probe enthaltenen Untersuchungskomponente reagiert, d.h. beim Eintreffen der Probe reagiert lediglich die entsprechende Komponente, indem ein Antigen oder ein Antikörper in der Blutprobe spezifisch mit dem ersten Reagens reagiert.

Die restlichen in der Probe enthaltenen Komponenten, die nicht mit dem Reagens reagieren, setzen ihre Wanderung fort, wobei sie auf das zweite Reagens treffen und eine Reaktion nur der entsprechenden zweiten Komponente stattfindet.

Die Probe trifft dann bei ihrer weiteren Wanderung auf ein drittes Reagens, das mit einer in der Probe enthaltenen Komponente reagiert, die sich von den Komponenten unterscheidet, die mit dem ersten und zweiten Reagens reagiert haben. Das heißt, beim Zusammentreffen der Probe mit dem dritten Reagens reagiert ein Antigen oder ein Antikörper spezifisch mit dem dritten Reagens. Nachdem die in der Probe enthaltenen restlichen biologischen Komponenten, die weder mit dem ersten noch mit dem zweiten noch mit dem dritten Reagens reagieren, den Bereich des dritten Reagens vollständig passiert haben, werden

die drei in der Entwicklungsschicht vorhandenen Reaktionsprodukte, z.B. optisch, ausgemessen, wobei die Konzentrationen der Komponenten in der Probe gleichzeitig oder sukzessive berechnet werden. 5

Die Wanderungsgeschwindigkeit der Probe in der Entwicklungsschicht wird so eingestellt, daß sie einerseits für die Reaktionen der Reagentien mit den in der Probe enthaltenen Untersuchungskomponenten ausreichend ist und andererseits die Reaktionsprodukte von der Entwicklungsschicht zurückgehalten werden. Bei derartigen Immunoassays werden bei der Messung der Reaktionsprodukte in der Probe enthaltene Verunreinigungen durch die Wanderung der Probe von den Detektorsystemen ferngehalten, so daß die Analyse ohne jegliche Beeinträchtigung durch Verunreinigungen durchgeführt werden kann. Dies ermöglicht infolgedessen eine Analyse von hoher Genauigkeit.

Wenn ein Chelatbildner als Markierungsmittel zur Auswertung der Reaktionen verwendet wird und die Bestimmung von Chelaten durchzuführen ist, kann mit dem unbewaffneten Auge erkannt werden, ob Reaktionsprodukte anwesend sind oder nicht. Demgemäß ist das erfindungsgemäße Immunoassayverfahren auch zur Analyse zahlreicher Proben zum Zwecke des Screenens einer Vielzahl von Komponenten geeignet. Wenn Jie Bestimmung der Reaktionsprodukte unter Verwendung optischer oder elektrischer Detektoren erfolgt, ist nicht nur eine qualitative sondern auch eine quantitative Analyse der in der Probe enthaltenen Untersuchungskomponenten möglich. Die optische Auswertung umfaßt zweckmäßigerweise die Bestahlung mit monochromatischem Licht, die Bestimmung des reflektierten Lichts, die Berechnung der Konzentrationen der Untersuchungskomponenten aus der Intensität des reflektierten Lichts, sowie entsprechende Anzeige. In einigen Fällen ist die Bestimmung auch aufgrund einer Auswertung des Durchgangs-

lichtes möglich.

Ein Beispiel für ein elektrisches System, z.B. im Fall eines Analysenverfahrens unter Anwendung einer Kombination von Elektrophorese mit Liposomen, ist ein Verfahren, wobei dem Liposom eine mittels Elektroden erfaßbare Substanz, z.B. Na zusammen mit einem Antigen od.dgl., einverleibt wird. Nach der Reaktion einer Untersuchungskomponente mit dem Liposom wird eine Lösung des Liposoms

JO entnommen, eine Substanz die aus dem Lipsom ausgeflossen ist, mittels eines Sensors der Elektrode bestimmt, und die Untersuchunbgskomponente aus der Signalstärke in der Elektrode quantitativ bestimmt.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

In den Beispielen ist auf die Figuren 1 bis 8 Bezug genommen. Es zeigen:

2Q Fig. 1 in schematischer Darstellung eine Entwicklungsschicht zur Verwendung in dem Analysenverfahren bzw. dem Testset der Erfindung,

Fig. 2 in schematischer Darstellung eine andere Ausfüh-2g rungsform einer erfindungsgemäßen Entwicklungsschicht,

Fig. 3 eine Seitenansicht der Entwicklungsschicht von Fig. 2,

Fig. 4 in Form einer Eichkurve die Abhängigkeit der Absorption von der T4-Konzentration,

Fig. 5 in Form einer Eichkurve die Abhängigkeit der Ab-„c sorption von der T3-Konzentration,

Fig. 6 in schematischer Darstellung eine in Beispiel 3 verwendete Vorrichtung,

Fig. 7 in Form einer Eichkurve die Abhängigkeit der Fluoreszenz von der OC-FP-Konzentration, und

Fig. 8 in Form einer Eichkurve die Abhängigkeit der Fluoreszenz von der CRP-Konzentration.

In den Fig. 1 bis 8 haben die verwendeten Buchstaben und Bezugsziffern folgende Bedeutung:

a ... Anti-IgG, b ... Anti-IgA; c ... Anti-IgM, a.. und a„ ... Mikrokapseln, d, e und f ... Aufgabestellen, g ... Probenaufgabestelle, h ... Entwicklungsschicht, i ... Sieb, 10 ... Entwicklungsschichtmaterial,

11 ... Puffer für Elektroden, 12 ... Gel, 12a Trenn-

GeI, enthaltend ein Liposom mit daran gebundenem Anti-CRP, 12a¹ ... Trenn-Gel, enthaltend ein Liposom mit daran gebundenem Anti-tt^FP, 12b ... Konzentrier-Gel, B und C .. Elektroden.

Beispiel 1

Fig. 1 zeigt eine Entwicklungsschicht zur Verwendung bei der qualitativen Analyse von IgG, IgA und IgM (Immunoglobuline). Als Träger für die Entwicklungsschicht findet ein Cellulosegel (Sepharose-4B) Verwendung. Die Bindung von Antikörpern an das Cellulosegel erfolgt so, daß man mit Cyanbromid aktiviertes Cellulosegel mit einem 0,2 molaren Carbonatpuffer (pH 8,8) wäscht, worauf man einen Antikörper in einer Menge von 10 mg (berechnet auf Trokkensubstanz) pro ml des mit Cyanbromid aktivierten Cellulosegels zusetzt und dann das erhaltene Gemisch über Nacht bei 4 ⁰C schüttelt, um das Antigen an das Cellulosegel zu binden.

Nach Zugabe von Glycin in einer Menge von 0,2 g pro ml der vorgenannten Reaktionslösung, wird das erhaltene Gemisch 8 h bei 4 ⁰C geschüttelt, um eine Reaktion des Glycins mit HN-Gruppen zu bewirken, die nicht an den Antikörper gebunden sind. In gleicher Weise werden Anti-IgG, Anti-IgA und Anti-IgM jeweils an Cellulosegel unter Bildung von Anti-IgG-Cellulosegel, Anti-IgA-Cellulosegel und Anti-IgM-Cellulosegel gebunden.

Die Herstellung der Entwicklungsschicht erfolgt so, daß man in 0,1 molarem Phosphatpuffer (pH 7,4) suspendiertes Cellulosegel auf einer ebenen Glasplatte zu einer gleichmäßigen Schicht von 1 mm Dicke formt. Um die Anti-IgG-, Anti-IgA- und Anti-IgM-gebundenen Cellulosegele auf die gleichmäßige Schicht aufzubringen, wird an drei Stellen der gleichmäßigen Schicht eine dünne Decke entfernt, worauf die Antikörper-gebundenen Cellulosegele an den Stellen a, b und c der Fig. 1 so aufgebracht werden, daß eine glatte Beschichtung entsteht. In einiger Entfernung von diesen Stellen wird eine Vertiefung g als Probenaufgabestelle gebildet. Die Vertiefung g wird etwas konkav und mit etwa 1 mm Tiefe ausgebildet, um die Probenaufgabe zu erleichtern.

Das Entwicklungsschichtmaterial 10 in Fig. 1 enthält das genannte Cellulosegel als Träger. An den Stellen a, b und c befinden sich Anti-IgG, Anti-IgA bzw. Anti-IgM.

Beispiel 2

" Dieses Beispiel betrifft einen Testset für die gleichzeitige quantitative Analyse von drei Hormonen im Serum mittels des Immunoassayverfahrens der Erfindung. Die Entwicklungsschicht ist in Fig. 2 und 3 dargestellt. Als Träger für die Entwicklungsschicht dient Agarosegel. Die Probenaufgabestelle g wird durch Entfernen eines Teils

des Agarosegels gebildet. An den Stellen a. und a„ werden liposomhaltige Reagentien aufgebracht, die spezifisch reaktiv für die in einer Probe enthaltenen Komponenten sind. Die Herstellung einer Liposomenmembran erfolgt nach der Methode von CT. Tain, Samuel W. Chan, et al .,beschrieben in Methods in Enzymology J4_, 152 - 161. Die Bindung jedes Antikörpers an das Liposom erfolgt nach der Methode von Lee et al., beschrieben in Nature, 288, 602 (1985). Ein handelsüblicher Chelatbildner TAMSMB ist in der Membran entsprechend einer üblichen Methode enthalten. Zwischen dem Gel und jedem Reagens, das die Liposomenmembran enthält, wird ein Sieb i aus porösem Material vorgesehen, um eine Bewegung der Liposomenmembran zu vermeiden und um die Wanderung der Komponenten im Reagens zu ermöglichen.

Beispiel 3

An der Probenaufgabestelle g des Testsets gemäß Beispiel 1 werden 5 μΐ einer IgG, IgA und IgM enthaltenden Probe aufgegeben und mittels eines 0,1 molaren Phosphatpuffers als Entwicklerlösung entwickelt. Nachdem die Probe am oberen Ende der Entwicklungsschicht angekommen ist, werden Eosin-markiertes Anti-IgG an der Stelle d, Eosinmarkiertes Anti-lgA an der Stelle e und Eosin-markiertes Anti-IgM an d~r Stelle f aufgegeben. Die Entwicklung der Eosin-markierten Antikörper erfolgt in einer Richtung senkrecht zur Richtung der Entwicklung der Probe. Als Entwicklerlösung dient eine 0,1 molare Phosphatpufferlösung (pH 7,4). Als Ergebnis läßt sich mit dem unbewaffneten Auge feststellen, daß IgG, IgA und IgM, d.h. Komponenten in der Probe, die in der Entwicklungsschicht gehalten werden, durch Eosin markiert worden sind. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Anwesenheit von IgG, IgA und IgM, die der Probe zugesetzt worden waren, ist in Übereinstimmung mit der durch

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1 das Eosin verursachten Färbung, die mit dem unbewaffneten Auge beobachtet werden kann.

Bei Verwendung von Urin als Probe findet man, daß drei 5 Proteine gleichzeitig qualitativ analysiert werden können.

Tabelle 1. Ergebnis der qualitativen Analyse von IgG, IgA und IgM

Probe NrT"***-^^^	IgG	(D	(II)	IgA	(II)	IgIA	(II)
1	-	-	(I)		(D	-
2			-	-	-	-
3	-	-	-		-	-
4	-	-	₊	-	-
5	₊	₊	-		•7"
6	-	-		-5-	-	-
7	+		+	-
8	♦		-	+		+

(I): Zugabe + , keine Zugabe 30 (II): Meßergebnisse gemäß Erfindung.

Beispiel 4

Dieses Beispiel wird unter Verwendung des Testsets von Beispiel 2 durchgeführt. Unter Verwendung einer Phosphatpufferlösung (pH 6,0) als Elektrophoresepuffer werden 5 μΐ einer Probe an der Probenaufgabestelle g aufgebracht und der Elektrophoresewanderung durch Anlegen eines elektrischen Feldes zwischen den Elektroden B und C unterworfen. An der Stelle a.. der Entwicklungsschicht 10 befinden sich Liposomen mit daran gebundenem Antithyroxin (T4), und an der Stelle a„ befinden sich Liposomen mit daran gebundenem Antitrijodthyronin (T3). Beim Passieren der Probe der Stellen a* und a_? reagiert jede Komponente der Probe spezifisch mit jedem Antikörper auf der Liposonenmembran, die auf der anderen Seite des in Fig. gezeigten Siebes i enthalten ist, wodurch die Untersuchungskomponenten auf den Liposomenmembranen festgehalten werden. Die elektrophoretische Wanderung erfolgt von der Anode B zur Kathode C, worauf 10 μΐ eines Reagens, hergestellt durch Zugabe eines Komplements und eines Metalls zu Phosphatpuffer, jeweils bei a.. und a„ zur Reaktion mit der Liposomenmembran eingespritzt werden. Die an ein Antigen in der Probe gebundene Liposomenmembran wird unter der lytischen Aktivität des Komplements aufgebrochen bzw. lysiert, wodurch es zu einem Austritt des von den Liposomenmembranen eingeschlossenen Chelatbildners TAMSMB kommt. Der Chelatbildner TAMSMB reagiert mit dem Metall unter Bildung eines Chelats unter Farbentwicklung . 20 min nach dem Einspritzen des Komplements und des Metalls werden T3 und T4 in der Probe aus der Absorption bei einer Wellenlänge von 585 nm quantitativ bestimmt.

Die Eichkurven der Fig. 4 und 5 wurden mit fünf verschiedenen Konzentrationen, jeweils T3 und T4 erhalten. Aus den Eichkurven werden T3 und T4 in der Probe bestimmt.

Bei der experimentellen Bestimmung der zugegebenen und wiedergewonnenen Mengen zeigt sich, daß die gemessenen Werte in Übereinstimmung mit den zugesetzten Mengen stehen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Diese Ergebnisse zeigen, daß die gleichzeitige Bestimmung von T3 und T4 im Serum möglich ist.

Tabelle

^•v Kompo- ^v·. nente Probe\ Nr. "\	zugesetzte Menge	^T4 (yg/cU)	Meßwert	^T3 Abs	^T3 ng/dil	^T4 Abs	^T4 (ug/dH)
1	^T3 (ng/dit)	2,5	0,175	50,2	0,225	2,2
2	46,5	6,8	0_;368	181,4	0,550	⁵,⁹
3	172,6	13,6	0,619	275,7	1_;625	14,5
4	269,7	5,6	0,298	148,9	0_;488
5	141,7	0_;0	0_;150	4_;8	0_;135	0,5
0,0

Beispiel

In diesem Beispiel werden in einer Probe enthaltenes cc-Fetoprotein (Ot-FP) und C-reaktives Protein (CRP) quantitativ mittels Scheibenelektrophorese bestimmt. Die Herstellung des Liposome erfolgt in gleicher Weise wie in Beispiel 2 beschrieben. Anti-0C-FP und Anti-CRP werden an die Oberfläche des Liposoms nach einem herkömmlichen Verfahren gebunden.

Als Entwicklerschicht dient Polyacrylamidgel.Zur Herstellung des Gels werden als Monomere Acrylamid und N, N¹-Methylbisacrylamid (Bis) und als Polymerisationskatalysa-

toren N,N,N¹,N¹-Tetramethylethylendiamin (TEMED) und Ammoniumpersulfat oder Riboflavin verwendet. Eine Rezeptur für ein 7%iges Gel (pH 9,5) ist in Tabelle 3 angegeben.

Tabelle 3. Verfahren zur Herstellung von Reagentien zur Herstellung eines Gels für die Scheibenelektrophorese.

Lösung	Zusammensetzung
10 Lösung A (pH 8,9)	In HCl 24 ml Tris 18,1 g TEMED 0,12 ml aufgefüllt mit Wasser auf 50 ml
Lösung B 15	1n HCl 48 ml Tris 5,98 g TEMED 0,46 ml aufgefüllt mit Was ser auf 100 ml
Lösung C 20	Acrylamid 28,0 g Bis 0,735 g aufgefüllt mit Was ser auf 50 ml
Lösung D	Acrylamid 20,0 g Bis 5,0 g aufgefüllt mit Was ser auf 100 ml
Lösung E 25	Riboflavin (4,0 mg) aufgefüllt mit Was ser auf 100 ml
Lösung F	Saccharose 40,0 g aufgefüllt mit Was ser auf 100 ml
Lösung a für Trenn-Gel	Lösung A und Lösung C werden in gleichen Mengen vermischt
Lösung b für Trenn-Gel	Ammoniumsulfat (0,14 g) wird mit Wasser auf 100 ml aufgefüllt
Lösung für Kon- zentrier-Gel	Lösungen B, D, E und F sowie Wasser werden im Verhältnis 1:1:1:4:1 vermischt
_o Puffer für Elek- ⁸⁵ troden	Unverdünnte Lösung: Tris (6,0 g) und Glycin (28,8 g) werden mit Wasser auf 1 1 aufgefüllt (pH 8,3). Die unverdünn te Lösung wird vor Verwendung 10-fach verdünnt.

Zur Herstellung eines Gels wird ein Glasrohr (Innendurchmesser 8 mm, Außendurchmesser 10 mm, Länge 50 mm) vertikal auf einem Stativ montiert. Eine Lösung für Konzentrier-Gel wird durch Vermischen gemäß Tabelle 3 hergestellt, und die Lösungen a und b werden erhalten durch Vermischen gemäß Tabelle 3 unmittelbar nach Entgasung. Nachdem man das Glasrohr bis zu einer Höhe von 10 mm vom Boden mit der Lösung für das Konzentrier-Gel beschickt hat, wird auf den oberen Teil der Lösung vorsichtig Wasser aufgegeben. Die Durchführung der Gelierung erfolgt mittels Photopolymerisation durch Bestrahlung mit Licht aus einer fluoreszierenden Lampe. Die Bestrahlungsdauer beträgt etwa 20 min. Hierauf wird eine Lösung für Trenn-Gel hergestellt durch Vermischen gemäß Tabelle 3, bereitet und nachdem man eine Lösung von Liposomen mit daran gebundenem Anti-<x-FP entgast hat, wird diese Lösung mit der gleichen Menge der Lösung für das Trenn-Gel vermischt. Das den oberen Teil des Gels im Glasrohr bedeckende Wasser wird entfernt, und die das Liposom enthaltende Lösung für das Trenn-Gel wird auf den Rückstand bis zu einer Dicke von 5 mm aufgegeben. Nachdem man auf den oberen Teil dieser Lösung vorsichtig Wasser aufgegeben hat, läßt man das Glasrohr etwa 30 min stehen. Nachdem man 15 mm der gleichen Lösung, wie vorstehend für das Konzentrier-Gel beschrieben, auf das Wasser aufgebracht hat, wird abermals Wasser aufgegeben, worauf die Lösung der Photopolymerisation unterworfen wird. Hierauf wird eine Lösung aus Liposomen mit daran gebundenem Anti-CRP mit der gleichen Menge einer Lösung für Trenn-Gel (ein Gemisch aus Lösung a und b) vermischt. Das erhaltene Gemisch wird auf das Wasser im Glasrohr aufgegeben und der Polymerisation unterworfen. Die gleiche Lösung, wie vorstehend für das Konzentrier-Gel beschrieben, wird auf das erhaltene Gel bis zu einer Dicke von 10 mm aufgebracht und der Photopolymerisation unterworfen.

Unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Gels wird eine Vorrichtung gemäß Fig. 6 aufgebaut. Als Puffer für die Elektroden dient die in Tabelle 3 beschriebene Lösung. Nachdem man eine Probe mit einer gleichen Menge einer 20%igen Saccharoselösung versetzt hat, werden 5 μΐ des erhaltenen Gemisches auf das obere Ende der Scheibe für die Elektrophorese aufgegeben. Nach Beendigung der Elektrophorese werden die jeweils liposomhaltigen Trenn-Gele ausgeschnitten und mit Komplementlösung versetzt, worauf die Antigen/Antikörper-Reaktion gemessen wird.

Wenn die Liposomen zuvor Carboxylfluorescein enthielten, können 0t-FP und CRP quantitativ aus der Fluoreszenz bestimmt werden. Wenn die Liposomen einen Chelatbildner, z.B. TAMSMB enthielten, können die genannten Bestandtei-Ie aus der Lichtabsorption quantitativ bestimmt werden, sofern zusätzlich z.u dem Komplement Kupfer ionen (Cu ) zugesetzt worden sind.

Es werden Proben mit «t-FP-Konzentrationen von 5 ug/1, 10 ug/1, 20 ug/1 und 40 ug/1, sowie Proben mit CRP-Konzentrationen von 5 mg/1, 10 mg/1, 20 mg/1 und 40 mg/1 verwendet. Sämtliche Proben werden dann der Elektrophorese unterworfen, worauf das Trenn-Gel ausgeschnitten wird. Die Eichkurven werden aus der Fluoreszenz (Carboxyfluorescein) bestimmt. Sie sind in den Fig. 7 und 8 dargestellt .

Die Beispiele zeigen, daß erfindungsgemäß ein Immunoassayverfahren und ein Testset zu seiner Durchführung zur Verfügung gestellt werden, mit denen die gleichzeitige Analyse verschiedener biologischer Komponenten, und zwar sowohl qualitativ als auch quantitativ, möglich ist. Hierzu ist eine geringe Menge einer einzigen Untersuchungsprobe ausreichend. Das erfindungsgemäße Immunoassayverfahren zeichnet sich insbesondere dadurch aus, daß keine Verunreinigungen zur Zeit der Analyse anwesend

sind, da die Untersuchungskomponenten von den anderen Komponenten in der Entwicklerschicht durch Verwendung des erfindungsgemäßen Testsets abgetrennt werden können. Darüber hinaus ist die gleichzeitige Analyse einer Vielzahl von Untersuchungskomponenten durch Veränderung der Art und Anzahl der auf der Entwicklerschicht als Träger enthaltenen Reagentien möglich.

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Claims

PATENT- UND RECHTSANWÄLTE BARDEHLE · PAGENBERG --DOST · AhTENBURS-; FROHWITTER A^PAfSTlSlE(S :—..."_.;-- OCI Ο RECHTSANWÄLTE *" " PÄfEN*TA^WALTt" EUROPEAN PATENT1 ÄTT JOCHEN PAGENBERG or jur ll μ harvard·· HEINZ BARDEHLE dipl-ing BERNHARD FROHWITTER dipl-ing ·· WOLFGANG A. DOST dr.. dipl.-chem GÜNTER FRHR. v. GRAVENREUTH dipl-ing (fhi- UDO W. ALTENBURG dipl-phys JÜRGEN KROHER or jur ll μ queensuniv BERNHARD H. GEISSLER dipl-phys DR JUR MCUGWU) RECHTSANWALT·. US ATTORNEY AT LAW POSTFACH 860620 8000 MÜNCHEN 86 TELEFON (089)98 03 61 TELEX 522 791 padd TELEFAX (089)9897 63 HYPOBANK MUC 6860130600 (BLZ 70020001) PGA MUC 387 37-808(BLZ 70010080) BÜRO GALILEIPLATZ 1. 80O0 MÜNCHEN 80 datum 30. Mai 1986 A 7068 D/ka Patentansprüche

1. Immunoassayverfahren zur gleichzeitigen Analyse mindestens zweier Bestandteile einer Probe, dadurch kennzeichnet , daß man

eine Probe an einer Probenaufgabestelle eines Entwicklerschichtmaterials aufgibt, das eine Entwicklerschicht aus einem Material, das die Entwicklung der Probe ermöglicht, und mindestens zwei Reagentien an verschiedenen Stellen der En+wicklerschicht als Träger enthält, die individuell ein Antigen oder einen Antikörper, unterschiedlich von denjenigen der anderen Reagentien, enthalten, wobei die Probenaufgabestelle an einer Stelle entfernt von denjenigen Stellen, wo sich die Reagentien befinden oder an der gleichen Stelle wie eine dieser Stellen vorgesehen ist,

die Probe einer Wanderung zu den Stellen, wo sich die Reagentien befinden, unterwirft,

eine Immunoreaktion des Antigens oder des Antikörpers in der Probe mit den Reagentien durchführt und

diejenigen Substanzen für die Auswertung heranzieht, die im Zuge der Immunoreaktion eine physikalische Änderung erfahren haben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagentien in Mikrokapseln enthalten sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Mikrokapseln einer Lyse durch Antigen/Antikörper-Reaktion oder Komplementaktivität unterwirft.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als in den Mikrokapseln enthaltenes Reagens eine Substanz verwendet, die eine Farbreaktion verursacht.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man die zur Farbreaktion befähigte Substanz aus der Gruppe Chelatbildner, Enzyme, Coenzyme und fluoreszierende Stoffe auswählt.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die Auswertung der Reaktionsprodukte mittels optischer oder elektrischer Verfahren durchführt.

7. Testset zur Durchführung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 6, gekennzeichnet durch ein Entwicklerschichtmaterial mit einer Entwicklerschicht zur Entwicklung einer Probe; mindestens zwei Reagentien, die sich an geeigneten Stellen der Entwicklerschicht als Träger befinden und individuell ein Antigen oder einen Antikörper, unterschiedlich von denjenigen der anderen Reagentien, enthalten; und eine konkave Probenaufgabensteile, die auf dem Entwicklerschichtmaterial an der gleichen Stelle wie eine der Stellen wo sich die Reagentien befinden, oder an einer Stelle entfernt von all diesen Stellen, vorgesehen ist.

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8. Testset nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Entwicklerschicht aus einem Material, ausgewählt aus der Gruppe Polymere, Polysaccharide, Proteine, Metallhydroxide, Zeolithe, poröse Glasperlen und poröse Kunst-

5 stoffilme, besteht.

9. Testset nach Anspruch 7 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Reagentien in Mikrokapseln eingeschlossen sind.

10 10. Testset nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokapseln aus Liposommembranen aufgebaut sind.