DE2500218B1 - Verfahren und Vorrichtung zur simultanen,spezifischen und quantitativen Bestimmung mehrerer Substanzen in einer Probe - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur simultanen spezifischen und quantitativen Bestimmung mehrerer einer Immunreaktion fähiger Substanzen, insbesondere antigenwirksamer Substanzen in einer Probe, bei dem die Probe aus einem antikörperfreien Träger in einen Träger hineinwandert, in den bestimmte weitere Substanzen inkorporiert sind, mit denen die zu bestimmenden Substanzen die Immunreaktion ergeben, und in dem die zu bestimmenden Substanzen Präzipitate bilden, und die Ausbreitung der Probe in Richtung eines über der Probe und dem Träger anliegenden elektrischen Feldes erfolgt. Die Erfindung betrifft ferner eine Vorrichtung zur Durchführung eines derartigen Verfahrens, sowie vorteilhafte Verwendungen dieses Verfahrens.

Ein wichtiges Anwendungsgebiet eines derartigen Verfahrens ist z. B. die quantitative Bestimmung der Plasmaproteine im Blutplasma. Derartige Plasma-

6s proteine sind beispielsweise: Präalbumin, Albumin, a-Lipoprotein, a-I-Antitrypsin, «-I-B-Glykoprotein, Gc-Globulin, Coeruloplasmin, α-2-Makroglobulin, Pseudocholinesterase, Hämopexin, Transferrin, /J-Li-

25 OO 218

3 4

poprotein, Haptoglobin, Orosomukoid, Antitrypsin, Das Verfahren ist jedoch sehr zeitaufwendig und er-

C-reaktives Protein, Fibrinogen, Plasminogen, IgG, laubt nicht die gleichzeitige Bestimmung mehrerer

IgM, IgA, IgD. Die quantitative Bestimmung dieser Antigene.

Proteine erlaubt in vielen Fällen differential-diagno- Eine Beschleunigung des beschriebenen Vorgangs stische Rückschlüsse oder gibt bei bekannter Diagnose 5 erfolgt durch Elektrophorese. Man nützt dabei die Hinweise auf den Verlauf und die Prognose einer Tatsache aus, daß Antigene unter bestimmten Milieu-Krankheit (H. H. Märki, Analytische Methoden bedingungen eine elektrische Ladung besitzen. Legt zur Darstellung der Serumeiweißkörper und ihre man am Träger ein elektrisches Feld an, so legen die Aussagemöglichkeiten für Klinik und Praxis, Deut- dadurch elektrisch geladenen Antigene in kurzer Zeit sches Medizinisches Journal, 1972 [Jg. 23], S. 317ff.; io eine wesentlich größere Wegstrecke im Träger zurück, H. J. Braun, Immunglobuline, Paraproteine und als dies bei der bloßen Diffusion der Fall ist.
Blutfarbstoff bindende Proteine und ihre Bedeutung Im einzelnen finden sich heute in der Praxis folfür die Klinik, Deutsches Medizinisches Journal, 1972 gende Verfahren zur Bestimmung der Konzentration [Jg. 23] S. 227 ff.; C-O. Kind mark + C-B. einzelner Antigene:

La u r ell, »Sequential Changes of the Plasma Pro- 15 a) Bei der sogenannten Acetatfolienelektrophorese tein Pattern in Inoculation Hepatitis, Scand, J. elin, wird eine Probe (im allgemeinen menschliches Serum) Lab. Invest. 29, suppl. 124, 105 bis 115 [1972]; J. S., durch ein entlang einer Folie anliegendes elektrisches Hepatitis: IgA-Mangel erhöht Risiko, SELECTA 41, Feld entsprechend der unterschiedlichen Wanderungs-S. 3574 [1974]; sowie die zur Veröffentlichung ein- geschwindigkeit der einzelnen darin enthaltenen Konigereichte dieser Arbeit beiliegende Untersuchung von 20 ponenten (Antigene) aufgetrennt. Nach der Auf-R. Scherer, A. Moratescu, G.Ruhen- trennung erfolgt die Anfärbung und eine photostroth — Bauer, »Die spezifische Wirkung der metrische Auswertung. Die im klinischen Betrieb Plasma-Proteine bei der Blutkörperchensenkung«). übliche Auftrennung erfolgt jedoch nur in mehrere

Zur quantitativen Bestimmung einzelner mit Anti- Gruppen mit jeweils gleicher elektrophoretischer körpern eine Immunreaktion ergebender Substanzen 25 Wanderungsweite. Es kann also nur eine Differen-(Antigene) bzw. mit Antigenen eine Immunreaktion zierung α-, β-, y-Globuline und Albumin erfolgen, ergebender Substanzen (Antikörper) sind bereits Eine Quantifizierung innerhalb der Gruppen, d. h. mehrere Verfahren bekannt geworden (vgl. zusammen- der in diesen Gruppen enthaltenen einzelnen Antigene fassend W. B e c k e r, B. R a ρ ρ, H. G. S c h w i c k (Proteine), ist mit dieser Methode nicht möglich,
und K. S t ö r i k o, »Methoden zur quantitativen 3° b) Bei der radialen Immundiffusion diffundieren die Bestimmung von Plasmaproteinen durch Immun- in einer Probe enthaltenen Antigene von einem präzipitation«, Zeitschrift für klinische Chemie und zylinderförmigen Startloch aus radial in eine gleichklinische Biochemie, 1968, Heft 3, S. 113 bis 122; mäßig dicke Antikörper enthaltende Schicht aus W. Becker, »Methoden der qualitativen und quan- Agarose-Gel hinein. Dabei bildet sich ein zylindrisches iitativea Immun-Elektrophorese«, Hrsg. Behriag- 35 Präzipitat um das StarÜacL· Bei vorgegebener AnIiwerke AG, Frankfurt, 1972; Prospekt »DAKO-Im- körperkonzentration in der Schicht aus Agarose-Gel munoglobulins« der DAKOPATTS A/S., Dänemark, ist die nach beendeter Diffusion entstehende kreis-1972). Sie basieren auf dem Prinzip der Immundiffu- förmige Grundfläche des Präzipitats ein Maß für die sion und/oder Elektrophorese. Menge des in der Probe enthaltenen Antigens.

Bei der Bestimmung der Konzentration von Anti- 4° Bei dieser Methode verwendet man Immundiffugeaen mit Hilfe der lmmMsdiSuuon diffundieren die sionspkiten mil mehreren Siarilöchern, In mehrere in einer Probe enthaltenen Antigene in einen Träger dieser Starlöcher werden zur Erstellung einer Bezugs-(z. B. eine Schicht aus Agarose-Gel) hinein. Im Träger kurve verschiedene Verdünnungen einer Standardsind spezifisch nur gegen ein bestimmtes Antigen ge- lösung mit bekannter Konzentration eines bestimmten richtete Antikörper enthalten. Bei Kontakt von Anti- 45 Antigens, nämlich desjenigen, gegen das im Träger genen und Antikörpern im Träger reagieren beide Antikörper enthalten sind, eingebracht; in die übrigen miteinander und bilden einen Komplex, der sich als Startlöcher werden verschiedene Proben aufgetragen, Präzipitat im Träger niederschlägt. Die Diffusion für die der Gehalt desselben Antigens festgestellt schreitet so lange fort, bis das spezifische in der Probe werden soll. Nach abgeschlossener Diffusion (48 bis enthaltene Antigen durch Präzipitatbildung mit den 50 72 Stunden) werden die entstandenen Areale der spezifisch gegen sie gerichteten Antikörper völlig auf- Präzipitate ausgemessen, aus den Meßwerten für die gebraucht ist. Alle übrigen in der Probe enthaltenen verschiedenen Verdünnungen der Standardlösung eine Antigene können ungehindert weiter in den Träger Bezugskurve erstellt, und an Hand der Bezugskurve Mnein diffundieren; sie bilden kein Präzipitat. Das aus den für die Probe gemessenen Werten die Konzen-Areal im Träger, in dem die Bildung des Präzipitates er- 55 tration desjenigen Antigens in den Proben ermittelt, folgt ist, kann durch Anfärbung verstärkt sichtbar gegen das die im Träger enthaltenen Antikörper gemacht werden; es ist z. B. bei der sogenannten gerichtet sind.

^radialen ImtnundSüstom kreisförmig, d. h., es bildet Nachteilig bei diesem Veriahrea ist zunächst die eine kreisförmige Zone um die Auftragsstelle, an der lange Dauer bis zur endgültigen Ausbildung der die Probe auf den Träger aufgebracht worden ist. Die 60 Präzipitate (etwa 48 bis 72 Stunden). Außerdem kann Größe dieses Areals, in dem sich ein Präzipitat gebildet mit diesem Verfahren lediglich nur jeweils die Konhat, ist ein Maß für die Konzentration desjenigen zentration eines einzigen spezifischen Antigens auf Antigens in der Probe, gegen das der im Träger ent- einmal gemessen werden. Will man die Konzentration haltene Antikörper gerichtet ist. mehrerer spezifischer Antigene bestimmen, so muß der

Mit dieser Methode kann zwar grundsätzlich eine 65 beschriebene Vorgang für jedes zu bestimmende Antiquantitative Bestimmung aller solcher Antigene er- gen wiederholt werden. Diese Methode ist also äußerst folgen, gegen die es spezifische Antikörper gibt bzw. arbeits- und zeitaufwendig,
gegen die man spezifische Antikörper erzeugen kann. c) Bei der sogenannten Raketen-Immun-Eiektro-

25 OO 218

5 6

phorese wird der Nachteil des großen Zeitaufwandes Danach wird erneut, jedoch senkrecht zu der Richtung dadurch vermieden, daß die Immunpräzipitation der Auftrennung in die einzelnen Antigene, also in durch Anlegen eines elektrischen Feldes beschleunigt einer zweiten Richtung (2. Dimension) ein elektrisches wird. In einzelne Löcher einer mit einem Träger aus Feld angelegt. Die zunächst aufgetrennten Antigene Agarose-Gel beschichteten Platte werden — wie bei 5 wandern nun in Richtung dieser 2. Dimension in der radialen Immundiffusion — Verdünnungen eines einen Träger hinein, der gegen die verschiedenen Standardpräparates zur Erstellung einer Bezugskurve Antigene gerichtete Antikörper enthält. Es kommt und mehrere Proben mit unbekanntem Gehalt eines dann in der 2. Dimension zum gleichen Vorgang der bestimmten Antigens eingebracht. Nach Anlegen eines Elektroimmunpräzipitation mit Ausbildung von glokelektrischen Feldes wandert die Probe aus den Start- io kenförmigen Präzipitaten, die sich gegenseitig überlöchern in den Träger hinein, der spezifisch gegen das lappen. Wiederum stellt das Areal der Präzipitation in seiner Konzentration zu messende Antigen gerichtete ein Maß für die Konzentration des betreffenden AntiAntikörper enthält (z. B. bei Auftragen einer Serum- gens (Plasmaprotein) in der aufgetragenen Probe dar. probe Antikörper gegen ein im Serum enthaltenes Es genügt aber nicht wie bei der Raketenelektro-Protein). Es ergeben sich bei Wanderung der Proteine 15 phorese — lediglich die Höhe auszumessen; es muß im elektrischen Feld raketenähnlich ausgebildete Prä- vielmehr die Fläche, und zwar entweder direkt durch zipitate, deren Höhe ein Maß für die Konzentration Planimetrieren oder — nach Übertragung auf Papier derjenigen Antigene in der Probe darstellt, die mit den genormter Stärke — durch Ausschneiden oder Wiegen im Träger enthaltenen Antikörpern eine Immun- ermittelt werden.

reaktion ergeben haben. »0 Der Nachteil dieser Methode ist der außerordentlich

Nachteil dieses Verfahrens ist, daß — ebenso wie hohe Zeitaufwand, den die Auswertung der Präzipitate

bei der radialen Immundiffusion — keine Möglichkeit erfordert. Ein weiterer Nachteil ist darin zu sehen, daß

besteht, die Konzentrationen mehrerer Antigene in es außerordentlich schwierig ist, das entstehende kom-

der Probe gleichzeitig zu bestimmen, da die im Träger plexe Elektrophoresemuster richtig zu deuten, d. h.

enthaltenen Antikörper, die mit den Antigenen zu- »5 die verschiedenen Areale des Präzipitats den richtigen

sammen die Immunreaktion ergeben, notwendiger- Antigenen (Plasmaproteinen) zuzuordnen. Dies ist

weise nur gegen ein Antigen in der Probe gerichtet insbesondere dann sehr schwierig und erfordert eine

sein dürfen. Für die Bestimmung der Konzentration große Erfahrung, wenn das Elektrophoresemuster bei

von beispielsweise zehn verschiedenen Antigenen in Proben von Patientenserum krankheitsbedingt vom

einer Probe (z. B. zehn verschiedene Plasmaproteinen 30 erwarteten Normalfall erheblich abweicht,

in einem Blutplasma eines Patienten) müssen demnach Zusammenfassend ist der Stand der Technik daher

auch jeweils zehn voneinander unterschiedlichen Anti- derart zu beurteilen, daß die Bestimmung mehrerer

körpern versehene Träger der oben beschriebenen Art eine Immunreaktion ergebender Substanzen außer-

mit Proben beschickt und über mehrere Stunden in ordentlich kompliziert, aufwendig und zeitraubend ist.

Elektrophoresekammern mit Strom beschickt und 35 Die oben unter a, b, c, diskutierten Verfahren erlauben

einzeln ausgewertet werden. Dieser hohe geräte- nicht die gleichzeitige Bestimmung mehrerer Substan-

technische und kostenintensive Aufwand stand bisher zen in einer Probe. Das unter d erörterte Verfahren

einer breiteren Verwendung dieser Methode im erlaubt dies zwar, weist jedoch — wie erwähnt — den

klinischen Bereich entgegen. Nachteil auf, daß die Ausbildung der auszuwertenden

d) Bei der Linien-Immunoelektrophorese (J. Kroll, 40 Areale der Präzipitate sehr lange dauert und daß — ins-Line Immunoelectrophoresis, in M. H. Axelsen besondere bei pathologisch veränderten Patienten- et al., A Manual of Quantitative Immunoelectropho- seren — die Auswertung selbst sowohl eine Reihe resis, Oslo 1973, S. 61 bis 67) liegt ein Gelstreifen, der schwieriger Interpretations- und Identifikationsfragen eine Probe verschiedener Antigene enthält, an mehreren mit sich bringt und durch die notwendige Bestimmung Gelstreifen an, die jeweils polyvalente Antiseren ent- 45 der Areale der Präzipitate durch Ausmessen oder Aushalten. In jedem dieser polyvalentes Antiserum ent- wiegen äußerst umständlich und zeitaufwendig ist. haltenden Gelstreifen bilden sich nach Elektrophorese Diese Nachteile sind auch die Ursache dafür, daß sich durch Immunreaktion der verschiedenen Antigene in Ansätzen vorhandene differential-diagnostische der Probe mit den verschiedenen im polyvalenten Verfahren an Hand der quantitativen Bestimmung Antiserum enthaltenen Antikörpern mehrere Prä- 50 mehrerer definierter Antigene bis jetzt nur in hochzipitatlinien (vergleiche a. a. O., S. 66, Fig. 5.7 und spezialisierten Labors finden und besonders dafür 5. 8). Da die die verschiedenen polyvalenten Antiseren geschulte Fachkräfte erfordern.

enthaltenden Gelstreifen aneinander angrenzen, gehen Aufgabe der Erfindung ist es demgemäß, ein Verdie Präzipitatlinien in einem Streifen in die der be- fahren der eingangs genannten Art zu schaffen, das nachbauen Streifen über und ermöglichen so den 55 sowohl die gleichzeitige Bestimmung mehrerer SubVergleich der Linienspektren der verschiedenen poly- stanzen in einer Probe ermöglicht, bei dem aber die valenten Antiseren. Auswertung erheblich einfacher und schneller von-

e) Ein bekanntes Verfahren der eingangs genannten statten geht, als das bei dem seither bekannten Ver-Art, von dem die Erfindung ausgeht, ist die sogenannte fahren dieser Art, das oben unter d diskutiert worden zweidimensionale Immunelektrophorese nach Clarke 60 ist, der Fall ist.

und Freeman. Sie ermöglicht die simultane spezi- Erfindungsgemäß wird dies dadurch gelöst, daß die

fische und quantitative Bestimmung mehrerer Anti- Probe aus dem antikörperfreien Träger gleichzeitig in

gene, also z. B. mehrerer Plasmaproteine im Blut- mehrere Träger hineinwandert, die jeweils vonein-

plasma. Bei ihr werden die einzelnen Antigene ander verschiedene spezifisch mit den in der Probe zu

(Plasmaproteine) nach dem Auftragen in einem Start- 65 bestimmenden Substanzen Präzipitate bildende weitere

loch zunächst in einer bestimmten Richtung (1. Di- Substanzen enthalten. Eine Vorrichtung zur Dureh-

mension) in einem Agarose-Gel, das keine Anti- führung dieses Verfahrens sieht dabei vor, daß sich

körper enthält, rein elektrophoretisch aufgetrennt. an einen Träger aus antikörperfreiem Material, der

25 OO 218

7 8

eine Ausnehmung zur Aufnahme der Probe aufweist, F i g. 6 eine Darstellung eines ersten die Erfindung

mehrere Träger anschließen, in denen jeweils vonein- erläuternden Versuches (Versuch Nr. 1),
ander verschiedene mit den in der Probe zu bestimmen- F i g. 7 eine schematische Darstellung eines zweiten

den Substanzen Präzipitate bildende weitere Substan- die Erfindung erläuternden Versuches (Versuch Nr. 2), zen enthalten sind. 5 F i g. 8 eine Draufsicht auf ein zweites Ausführungs-

Ais Substanzen, deren Vorhandensein in einer beispiel in benutzem Zustand,

Probe mit einem derartigen Verfahren bzw. derartigen F i g. 9 eine Draufsicht auf eines weiteren Aus-

Vorrichtungen festgestellt werden kann, kommen führungsbeispiels, für das die einzelnen Werte erdabei alle diejenigen in Frage, die, wie z. B. Antigene mittelt wurden (Tabelle zum 1. Ausführungsbeispiel), mit Antikörpern oder Antikörper mit Antigenen, eine io Fig. 10 eine fotografische Abbildung des Aus-Immunreaktion bilden, d. h. Präzipitate bilden, deren führungsbeispiels nach F i g. 9 mit entsprechender Grenzen — gegebenenfalls nach einer Einfärbung — Beschriftung der einzelnen Träger,
feststellbar sind. Man könnte die Substanzen, bei F i g. 11 eine bei der Herstellung der erfindungs-

denen die Erfindung anwendbar ist, daher auch um- gemäßen Vorrichtung verwendete Vorrichtung,
fassend als »antigenwirksam« oder »antikörperwirk- 15 Fig. 12 eine Draufsicht auf die Vorrichtung nach sam« bezeichnen. Im erstgenannten Fall enthalten die F i g. 10.

einzelnen Träger jeweils einzelne der Antikörper, die Bei der Vorrichtung nach den F i g. 1 bis 4 ist auf

gegen ein bestimmtes von mehreren an in der Probe einer Glasplatte 1 ein etwa 1,5 cm breiter Streifen 2 enthaltenen Antigenen gerichtet sind; in letztgenanntem aus antikörperfreiem Agarose-Gel aufgetragen. Zu Fall enthalten die Träger jeweils ein Antigen, gegen ao diesem Zweck wird das Agarose-Gel auf die Glasdas eines der in der Probe enthaltenen Antikörper ge- platte 1 in der Form, die der Streifen 2 hat, gegossen, richtet ist. Ein wichtiges Anwendungsgebiet ist im Danach läßt man den Streifen 2 trocknen. Dieser erstgenannten Fall, wie eingangs bereits erwähnt, die Streifen 2 bildet einen antikörperfreien Träger auf der Feststellung der Konzentrationen einzelner Plasma- Glasplatte 1. In dem Streifen 2 ist eine Ausdehnung proteine im Blutplasma für differential-diagnostische »5 in Form einer Rinne oder eines Grabens 3 eingebracht. Zwecke; als Anwendungsmöglichkeit des letztgenann- Dies geschieht durch Einstanzen, Ausschaben u. dgl. ten Falls sei auf die Diagnostik von Autoimmun- Der Graben 3 dient zur Aufnahme einer Probenerkrankungen hingewiesen. Lösung, also z. B. einer Blutplasma-Probe, sofern

Mit der Erfindung werden die eingangs dargestellten Blutplasma untersucht werden soll.
Nachteile des Standes der Technik auf überraschend 30 Senkrecht an den Streifen 2 schließen sich mehrere einfache Weise beseitigt. Es ist lediglich das Einbringen Streifen 12, 13, ..., 19 an. Jeder dieser Streifen der Probe in die dafür vorgesehene Ausdehnung not- besteht ebenfalls aus Agarose-Gel, enthält jedoch ganz wendig, um nach einem Ablauf von etwa 8 Stunden bestimmte (und voneinander unterschiedliche) d. h. die Konzentration mehrerer — bei entsprechender spezifische Antikörper. Die Antikörper jedes einzelnen Größe der die Träger tragenden Platte bis zu 20 oder 35 Streifens 12, 13, ..., 19 sind jeweils gegen ein bemehr — Substanzen angeben zu können. stimmtes derjenigen Antigene gerichtet, die in der in

Im Falle der Untersuchung von Blutplasma von die Ausnehmung 3 einzubringenden Probe enthalten Patienten ist es dann möglich, ohne großen Aufwand sein können und die durch die Untersuchung festsofort von einer Platte, auf der die Träger angeordnet gestellt werden sollen. Im Fall der Untersuchung von sind, her Abweichungen der Konzentration von einem 40 Blutplasma sind also in jedem der Streifen 12, 13, ..., bestimmten Soll-Wert bei einer beliebig großen Zahl 19 Antikörper gegen jeweils einen und nur ein einziges von diagnostisch bedeutsamen Plasmaproteinen zu Plasmaprotein vorgesehen,
erkennen. Daraus folgt, daß in jedem der Streifen 12, 13, ...,

Die Erfindung schafft damit im labortechnischen 19 jeweils nur eines der in der Probe enthaltenen Bereich die Voraussetzung dafür, daß durch ent- 45 Plasmaproteine zusammen mit dem spezifisch dagegen sprechende Reihenversuche z. B. für bestimmte patho- gerichteten Antikörper durch Immunreaktion ein logische Prozesse typische Abweichungen der Konzen- Präzipitat bilden kann. Im Fall der Untersuchung von tration mehrerer Plasmaproteine überhaupt erst fest- Blutplasma bedeutet das, daß in jedem Streifen ein gestellt werden können und daß, sofern diese Er- anderes Plasmaprotein aus der in die Ausnehmung 3 kenntnisse bereits vorliegen bzw. noch erarbeitet 50 eingebrachten Probe durch Immunreaktion mit dem werden, die sich daraus ergebenden Diagnosemöglich- jeweils in diesem Streifen enthaltenen monospezikeiten auch Eingang in die nichtklinische ärztliche fischen Antikörpern ein Präzipitat bildet.
Praxis finden können. Füllt man nun in die Ausnehmung 3 eine Probe,

Ausführungsbeispiele der Erfindung und ihrer z. B. Blutplasma, ein, das mehrere Antigene (oder vorteilhaften Weiterbildungen werden im folgenden 55 allgemein: mehrere antigenwirksame Substanzen) entunter Bezugnahme auf die Zeichnungen beschrieben. hält, und legt ein elektrisches Feld an, wie dies in Es stellt dar F i g. 1 durch die Minuszeichen auf der Unterseite

F i g. 1 eine schematische Darstellung eines Aus- des Streifens 2 und die Pluszeichen an den oberen führungsbeispiels in Draufsicht in unbenutztem Zu- Enden der Streifen 12, 13, ..., 19 angedeutet ist, so stand, 60 wandern die einzelnen Komponenten der Probe, d. h.

F i g. 2 einen Schnitt entlang der Linie II-II in die einzelnen Antigene, zunächst in dem antikörper-F i g. 1, freien Agarose-Gel des Streifens 2 nach oben und von

F i g. 3 einen Schnitt entlang der Linie HI-III in dessen Oberkante 2' in die Streifen 12, 13, ..., 19 F i g. 1, hinein. Da diese Streifen jeweils, wie erwähnt, mono-

F i g. 4 einen Schnitt entlang der Linie IV-IV in 65 spezifische Antikörper gegen verschiedene Antigene F i g. 1, der Probe enthalten, findet nun in ihnen jeweils eine

F i g. 5 eine schematische Darstellung des Aus- Immunreaktion statt. Die dabei präzipitierten Komführungsbeispiels nach F i g. 1 in Draufsicht, plexe werden jeweils von den noch vorhandenen

9 10

überschüssigen Antigenen wieder aufgelöst. Erst Komponente der Probe abhängt. Es soll also nach-

dann, wenn kein Antigen-Überschuß mehr besteht, gewiesen werden, daß α desto größer ist, je weniger

d. h. wenn der gesamte Vorrat des einen in der Probe Antikörper in dem Streifen 12, 13, ..., 19 vorhanden

enthaltenen Antigens, gegen das die in einem der sind und umgekehrt.

Streifen enthaltenen Antikörper gerichtet sind, durch S Der Versuch ist in F i g. 6 dargestellt. Die etwa

Immunreaktion aufgebraucht ist, bleiben die sich 10 mm breiten und etwa 72 mm langen Streifen 21,

bildenden Präzipitate beständig und ihre Grenzen 22, ..., 25 enthielten jeweils Antikörper gegen ein be-

damit — gegebenenfalls nach Einfärbung — erkenn- stimmtes Plasmaprotein, nämlich gegen a₂-Makro-

bar. Es entsteht dabei ein Bild, wie es in Fig. 5 globulin, jedoch in unterschiedlichen Konzentrationen,

schematisch dargestellt ist. io Die Streifen 21, 22, 23, 24, 25 enthielten 160, 120, 80,

In F i g. 5 sind die Präzipitate mit 12', 13', .... 19' 60 bzw. 40 μΐ Antiserum gegen a₂-Makroglobulin. In

bezeichnet und schraffiert eingezeichnet. Die Präzipi- die Ausnehmung 103 im Streifen 102 wurden etwa

tatgrenzen sind mit 12", 13", ..., 19" bezeichnet. Sie 200 μΐ einer Mischung von 300 μΐ Blutplasma eines

sind deutlich wahrnehmbar. gesunden Blutspenders und 0,7 ml Agarose eingefüllt.

Die Lage der Präzipitatgrenzen 12", 13", .... 19" 15 Die Vermischung der Plasmaprobe mit Agarose vor

entlang der Richtung, in der die Antigene von der dem Auftragen in die Ausnehmung 103 ist notwendig,

Ausnehmung 3 her in die Streifen 12, 13, ..., 19 um durch Auffüllen der Ausnehmung 103 mit der

hineingewandert sind, die gleich der Richtung des elektrisch leitenden Agarose auch nach Einwanderung

angelegten elektrischen Feldes ist, ist ein Maß für die der Probe in die Streifen 21 bis 25 bzw. in die Streifen 12,

Konzentration der jeweiligen Antigene in der Blut- ao 13, ..., 19 nach F i g. 5 eine durchgehende gleich-

plasma-Probe. Im einzelnen: Die Lage der Präzipitat- mäßige elektrische Leitfähigkeit im Agarose-Gel zu

grenze 12" ist ein Maß dafür, in welcher Konzen- gewährleisten,

tration dasjenige Antigen in der Blutplasma-Probe Es ergaben sich folgende Abstände α der Präzipitats-

enthalten ist, das mit den im Streifen 12 enthaltenen grenzen 21", 22" 25" von der Oberkante 102'

Antikörpern eine Immunreaktion ergibt; die Lage der as des Streifens 102.
Präzipitatgrenze 13" ist ein Maß dafür, in welcher
Konzentration dasjenige Antigen in der Blutplasma-Probe enthalten ist, das mit den im Streifen 13 enthaltenen Antikörpern eine Immunreaktion ergibt, usw. Tabelle zu Versuch Nr. 1

Die Platte 1 nach F i g. 5 weist ferner eine Skala 4 30 auf, die es ermöglicht, die Lage der Präzipitatgrenzen bzw. ihren Abstände von der Oberkante2' des Streifens 2 bzw. vom unteren Ende der Streifen 12, 13, ..., 19 abzulesen.

Für den Fall der Untersuchung menschlichen Blut- 35
plasmas ist es möglich, den Gehalt der einzelnen Antikörper in den Streifen 12, 13, ..., 19 so aufeinander
abzustimmen, daß z. B. bei der Untersuchung von
Blutplasma eines gesunden Menschen alle Präzipitatgrenzen auf der gleichen Höhe z. B. auf der Marke 4' 40
liegen. Bei der Untersuchung von Blutplasma eines
Kranken unter gleichen Bedingungen würden dann
Abweichungen der Konzentration bestimmter Plasmaproteine von einem Normalwert dadurch höchst einfach zu erkennen sein, daß die Präzipitatgrenzen bei 45 Aus diesem Versuch geht also deutlich hervor, daß den Streifen, die Antikörper gegen die betreffenden der Abstand α der Präzipitatgrenzen 21", ..., 25" Plasmaproteine enthalten, über oder unter der Marke 4' eine Funktion des Antikörpergehaltes in den Streifen liegen. Typische Muster der Abweichung von den 21, 22 25 ist, d. h., je geringer der Antikörper-Normalwerten könnten dann bestimmten Kranheits- gehalt in den Streifen ist, um so größer ist der Abbildern zugeordnet werden, was einen erheblichen 50 stand α der Präzipitatgrenze von den unteren Enden Fortschritt und eine erhebliche Erleichterung in der der Streifen 21, 22, .... 25, die an der Oberkante 102' medizinischen Diagnostik darstellt. des Streifens 102 anliegen. Umgekehrt ergibt sich

Die oben gemachte Angabe, daß die Entfernung α auch, daß der Abstand α um so kleiner ist, je größer

der Präzipitatgrenzen 12", 13", ..., 19" von der der Antikörpergehalt in den Streifen ist.
Oberkante 2' des Streifens 2 bzw. den unteren Enden 55

der Streifen 12,13 19 von der Konzentration der

Antigene, die mit den in den Streifen enthaltenen Versuch Nr. 2
Antikörper eine Immunreaktion bilden, abhängt, soll

im folgenden durch zwei Versuche nachgewiesen Dieser Versuch soll nachweisen, daß die Entfer-

werden. 60 nung α der Präzipitatgrenzen von den unteren Enden

der Streifen bzw. der Oberkante 2' des Streifens 2 in

Versuch Nr. 1 F i g. 5 von der Menge der aufgetragenen Probe bzw.

bei konstantem Probenvolumen von der Konzen-

Der Versuch soll nachweisen, daß die Entfernung α tration abhängt, mit der diejenige Komponente in

der Präzipitatgrenzen von der Oberkante 2' des Strei- 65 der Probe enthalten ist, die mit den Antikörpern in

fens 2 von der in den Streifen 12, 13, ..., 19 einge- dem Streifen durch Immunreaktion reagiert,

setzten Konzentration der monospezifischen Anti- Der Versuch ist in F i g. 7 dargestellt. Die Streifen

körper gegen jeweils eine spezifische antigenwirksame 41,42,43 und 44 enthalten Antikörper gegen α,-Makro-

Streifen	Antiserum	Abstand an der
Bezugszeichen	im Streifen	Präzipita tsgrenze
Nr.		(Mittelwert)
	μΐ	mm
21	160	7
22	120	9,5
23	80	13
24	60	17,5
25	40	24

25 OO

globulin in jeweils gleicher Konzentration, d. h., jeder dieser Streifen enthielt 60 μΐ Antiserum gegen «₂-Makroglobulin. Um in jedem Streifen eine Immunreaktion mit a₂-Makroglobulin verschiedener Konzentration zu erzielen, wurden vier voneinander getrennte Ausnehmungen 203', 203", 203'", 203"" in dem Streifen 203 angebracht. In diese Ausnehmungen wurde Serum eines gesunden Blutspenders in verschiedenen Verdünnungen mit Agarose eingefüllt. Die verschiedenen Konzentrationen, mit denen das jeweils gleiche Volumen der Probe in den Ausnehmungen 203', 203", 203'", 204"" enthalten war, ergeben sich aus nachfolgender Tabelle zu Versuch Nr. 2. Ansonsten entsprachen die Versuchsbedingungen denjenigen beim Versuch Nr. 1. Es ergaben sich folgende Abstände a der Präzipitatgrenzen 41", 42", 43", 44" von der Oberkante 202' des Streifens 202.

Tabelle zu Versuch Nr. 2

Streifen Bezugs zeichen Nr.	Ausnehmung	Serum pro 100 μΐ Probe	Abstand α der Präzipitat- grenze (Mittelwert) 25
		μΐ	mm
41	203'	26	11
42	203"	36	14 30
43	203'"	46	17
44	2C3""	56	20

35

Der Versuch zeigt, daß bei konstanter Antikörperkonzentration in den Streifen 41, 42, 43, 44 der Abstand α der Präzipitatgrenzen eine Funktion der aufgetragenen Probenmenge bzw. bei konstanter Probenmenge der Konzentration der die Immunreaktion ergebenden Komponente in der Probe ist.

Zusammen zeigen beide Versuche, daß die Entfernung α die Funktion von zwei Parametern ist, nämlich erstens der Antikörperkonzentration in den Streifen 12, 13, ..., 19 und der Antigenkonzentration in der Probe. Das bedeutet aber auch, daß bei bekannter Antikörperkonzentration in den Streifen 12, 13, ..., 19 der Abstand α ein Maß für die Konzentration derjenigen antigenwirksamen Substanz in der Probe ist, die mit den Antikörpern eine Immunreaktion ergeben hat.

Um die Wanderung der in die Ausnehmung 3 eingebrachten Probe in die antikörperhaltigen Streifen 12, 13, ..., 19 zu bewirken, wird für die Dauer von mindestens 8 Stunden (beispielsweise über Nacht) an die Streifen ein elektrisches Feld angelegt. Nach dieser Zeit haben bei entsprechend elektrischer Spannung in der Regel alle Antigene mit ihren entsprechenden Antikörpern vollständig reagiert. Da die Präzipitate nach abgeschlossener vollständiger Reaktion in Agarose-Gel unbeweglich sind, ändert sich auch nach verändertem Anlegen der Spannung (z. B. 24 Stunden) an der Lage der Präzipitationslinien nichts.

Apparativ kann das Anlegen der Spannung mit jedem herkömmlichen Elektrophorese-Apparat erfolgen, also im Prinzip durch zwei Elektroden, die an den in F i g. 1 mit einem Pluszeichen bzw. einem Minuszeichen bezeichneten Stellen unter Verwendung von Pufferlösungen angelegt werden. Das elektrische Feld beträgt etwa 8 V/cm.

Bei der Präzipitatbildung in den einzelnen Streifen handelt es sich um eine Immunreaktion, die unter dem Einfluß eines elektrischen Feldes abläuft, also um eine Elektro-Immun-Präzipitation. Durch die verwendete Pufferlösung (Barbituratpuffer pH 8,6, 0,2 M) wird sichergestellt, daß innerhalb des Agarose-GeIs ein konstanter Pufferwert von pH = 8,6 herrscht. Bei diesem pH-Wert besitzen die Antikörpsrmoleküle in den Streifen keine positive oder negative Überschußladung und wandern demzufolge auch nicht unter dem Einfluß des angelegten elektrischen Feldes, wie es die Einzelkomponenten der aufgetragenen Lösung tun. Sie bilden vielmehr eine stationäre Phase, in die die mobilen Antigenmoleküle der Probe hineinwandern.

Bei einem pH-Wert von 8,6 gibt es aber auch im Blutplasma einzelne Proteine, die nicht wie die meisten übrigen eine negative Überschußladung besitzen und daher unter dem Einfluß des angelegten elektrischen Feldes in die Streifen hineinwandern, sondern elektrisch neutral oder sogar positiv geladen sind. In diese Gruppe fallen die Immunglobuline Ig G, Ig M, Ig A, Ig D, sowie das C-reaktive Protein und Fibrinogen. Die Ladung dieser Plasmaproteine (ebenso wie die aller anderen antigenwirksamen Substanzen ohne oder mit verkehrter Ladung) kann man aber chemisch derart verändern, daß sie — bei gegebenem pH = 8,6 — ebenfalls unter dem Einfluß des elektrischen Feldes in die Streifen hineinwandern. Dies geschieht durch eine Vorbehandlung der Probe mit Formaldehyd. An Stelle von Formaldehyd kann die Vorbehandlung auch mit /9-Propiolacton oder mit Kaliumcyanat (KCNO) erfolgen.

Man kann ferner der Probe, die in die Ausnehmung 3 eingebracht wird, eine definierte Menge einer weiteren probenfremden antigenwirksamen Substanz beifügen, also z. B. einer Blutplasma-Probe eine bestimmte Menge des im Blutplasma nicht enthaltenen Ovalbumins, das als interner Standard dient, und ferner allen Streifen 12, 13, ..., 19 ebenfalls eine definierte Menge von Antikörpern gegen diese Substanz, also z. B. Antikörper gegen Ovalbumin, beigeben. Es ergibt sich dann in jedem der Streifen 12, 13, ..., 19 ein zweites Präzipitat, dessen Präzipitatsgrenze als Referenz, d. h. als Bezugsgröße dienen kann, da es unter den gleichen Bedingungen wie die Präzipitatgrenzen der Substanzen in der Probe zustande kommt, aber sowohl die Menge der in den Streifen enthaltenen Antikörper als auch die Konzentration in der Probe bekannt sind. Kennt man für diesen internen Standard aber die Konzentration in der aufgetragenen Probe, dann spielt die eingefüllte Menge der Probe für die Quantifizierung keine Rolle mehr und scheidet als Fehlerquelle aus. An Stelle des Abstandes α wie im Ausführungsbeispiel nach F i g. 5 ist dann ein Abstand b der beiden jeweils in einem Streifen enthaltenen Präzipitatgrenzen voneinander ein Maß für die Konzentration derjenigen antigenwirksamen Substanz in einer Probe, gegen die die Antikörper in dem betreffenden Streifen gerichtet sind.

Ein derartiges Ausführungsbeispiel ist in F i g. 8 dargestellt. Es sind dort jeweils zweite Präzipitatgrenzen 12a, 13a, ..., 19a ersichtlich, die sich für den internen Standard ergeben und die auf jeweils gleicher Höhe liegen, also von der Oberkante 2' des Streifens 2 gleichen Abstand haben. Maß für die

Konzentration der antigenwirksamen Substanzen in der Probe, gegen die jeweils die in einem der Streifen 12, 13, ..., 19 enthaltenen Antikörper gerichtet sind, sind jetzt die Abständet zwischen den Präzipitatgrenzen 12" und 12a bzw. 13" und 12, 13o, usw. Im folgenden werden die Ergebnisse von zwei Bestimmungen einzelner Blutplasmaproteine im Blutplasma angegeben:

1. Ausführungsbeispiel

Verwendet wurde eine Platte 1, auf der — wie in F i g. 1 — acht Streifen angeordnet waren. 0,25 ml eines Serums von einem gesunden Blutspender wurden mit 1 ml einer Mischung von 0,4 M Formaldehyd in 0,015 M Barbitalpuffer gut gemischt und bei Zimmertemperatur 30 min stehen gelassen. Danach wurde diese Mischung mit 1,250 ml Agarose gemischt. Von dieser Mischung wurden 0,75 ml in die Ausnehmung 3 eingefüllt. In den acht Streifen 12, 13, ..., 19 waren monospezifische Antiseren gegen bestimmte in der Blutplasma-Probe enthaltene und zu bestimmende Antigene enthalten (vgl. die Tabelle zum ersten Ausführungsbeispiel). Die Breite der Streifen betrug etwa 10 mm, ihre Länge etwa 74 mm. Es ergaben sich bei den in der folgenden Tabelle angegebenen Mengen von Antiseren in den Streifen folgende Abstände a der Präzipitatlinien von der Oberkante 2' des Streifer s 2.

Tabelle zum 1. Ausführungsbeispiel Tabelle zum 2. Ausführungsbeispiel

Streifen
Bezugszeichen

Nr.

Menge und Art des im Streifen Abstand a enthaltenen Antiserums (Mittelwert)

μΐ mm

21	50 Anti-Fibrinogen	33
22	50 Anti-Plasminogen	13
10 23	75 Anti-Orosomukoid	30
24	100 Anti-Antichymotrypsin	9
25	150 Anti-a-I-Antitrypsin	26
26	50 Anti-Coeruloplasmin	18
»5 27	50 Anti-a-2-Makroglobulin	17
28	100 Anti-Haptoglobin	28
29	75 Anti-Hämopexin	12
30	100 Anti-Transferrin	24
ao 31	100 Anti-a-Lipoprotein	47
32	100 Anti-j?-Lipoprotein	13
33	50 Anti-Ä-C/ftA-Globulin	15
34	100 Anti-IgA	17
25 35	30AnIi-IgM	19
36	100 Anti-IgG	28

Streifen	Menge und Art des im Streifen	Abstand α
Bezugs	enthaltenen Antiserums	(Mittelwert)
zeichen Nr.
	μΐ	mm
1	100 Anti-IgG	23
2	100 Anti-IgM	2
3	100 Anti-IgA	16,5
4	50 Anti-Lipoprotein	11
5	50 Anti-«2-Makroglobulin	11
6	100 Anti-Haptoglobin	21,5
7	50 Anti-Coeruloplasmin	4,5
8	150 Anti-Saures α-1-Glyko-	9
	protein

2. Ausfuhrungsbeispiel

0,250 ml frisches Blutplasma eines gesunden Spenders wurden mit 1,0 ml Formaldehydlösung (0,4 M Formaldehyd in 0,015 M Barbitalpuffer) gut gemischt und bei Raumtemperatur 30 min inkubiert. Im Anschluß daran wurden 4 ml Agarose dazugegeben und insgesamt 5 ml dieser Mischung in die Ausnehmung 3 einer mit 16 Streifen 21, 22, ..., 36 versehenen Platte nach Fig. 9 gegeben. Die Streifen 21, 22, ...,36 enthielten die in der nachfolgenden Tabelle zum 2. Ausführungsbeispiel angegebenen Mengen an monospezifischen Antikörpern gegen die angegebenen Plasmaproteine. Es wurde eine Spannung von 8 V/cm angelegt und danach die Entfernung α der Präzipitatgrenzen 21", 22", ..., 36" gemessen. Es ergaben sich folgende Abstände (Mittelwert):

F i g. 10 zeigt die fotografische Darstellung einer

solchen Platte nach Durchführung des Versuchs, wobei die fotografierte Platte entsprechend der Art des Antiserums beschriftet ist. Die Präzipitatgrenzen sind — nach Einfärbung des Präzipitats — deutlich erkennbar in den einzelnen Streifen ausgebildet.

Es zeigt sich, daß für jedes der in diesem 2. Ausführungsbeispiel untersuchten 16 Plasmaproteine ein sichtbares und damit meßbares Präzipitat in den jeweiligen Streifen gebildet wird. Die ausgewählten Plasmaproteine, die damit simultan, spezifisch und aus einer Probe bestimmt wurden, stellen die nach den bisherigen Erkenntnissen für die Diagnostik wertvollsten Plasmaproteine dar: Fibrinogen und Plasminogen sind entscheidend für die Diagnose von Blutgerinnungsstörungen; Orosomukoid, Antichymotrypsin, Antitrypsin und Coeruloplasmin sind bei akuten und chronischen Entzündungen sowie bei Karzinomen in typischer Weise erhöht; «,-Makroglobulin ist wichtig bei der Diagnose gewisser Nierenerkankungen; Haptoglobin, Hämopexin und Transferrin ermöglichen, wenn sie zusammen bestimmt werden, eine Differentialdiagnose der anämischen Erkrankungen; <x- und vor allem /Mjpoprotein ist wichtig bei der Erkennung von Fettstoffwechselstörungen, die einen Risikofaktor für das Entstehen von Arteriosklerose darstellen; /J₁C/ ßiA-Globulin weist auf Störungen im Komplementsystem hin; IgA, IgM und IgG sind bei Infekten, allergischen Erkrankungen, Lebererkrankungen, Entzündungen und bösartigen Gewebswucherungen in einem jeweils typischen Muster erhöht oder erniedrigt.

Zusammenfassend zeigt dies die Breite der differentialdiagnostischen Nutzungsmöglichkeiten, die sich aus der Erfindung ergeben.

Die die Ausführungsbeispiele darstellenden Platten mit den als Träger für die Antiseien aufgebrachten Streifen können wie folgt hergestellt werden: Wie oben bereits erwähnt, wird auf einer Glasplatte der Streifen 2 aus antikörperfreiem Agarose-Gel aufgetragen. Dann werden in der gewünschten Anzahl, also ent-

sprechend der Anzahl der zu bestimmenden antigenwirksamen Substanzen, die Streifen 12, 13, ..., 19 aufgetragen. Auch dies geschieht dadurch, daß die Streifen aus flüssigem etwa 5O⁰C warmem Agarose-GeI, die die vorgesehene Menge Antikörper enthalten, aufgegossen werden und durch Stehenlassen bei Raumtemperatur abkühlen und erstarren. Die Dosierung der Antikörper in dem Agarose-Gel, aus dem die einzelnen Streifen 12, 13, ..., 19 hergestellt werden, erfolgt auf Grund entsprechender Versuche derart, daß z. B. bei der Untersuchung von Blutplasma die Normalwerte der Konzentration der jeweiligen Plasmaproteine alle eine etwa gleich hohe Präzipitatausbreitung (Abstand α der Präzipitatgrenze von dem unteren Ende der Streifen) aufweisen und Abweichungen von der Norm also bereits durch eine Abweichung von dieser durch alle Streifen gleichmäßigen durchgehenden Normallinie des Abstandes auffallen.

Der besondere Vorteil dieser gleichzeitigen quantitativen Bestimmung mehrerer antigenwirksamer Substanzen in einer Probe, z. B. von Plasmaproteinen im Blutplasma, ist darin zu sehen, daß auf einer Platte in den entsprechenden Streifen gerade Antikörper gegen solche Plasmaproteine eingebracht werden können, bei denen Abweichungen für ein bestimmtes Krankheitsbild (Herzinfarkt, Pneumonie, Entzündung, Tumore usw.) typisch sind, wodurch ein wichtiges Hilfsmittel für die Differentialdiagnose geschaffen ist.

Die F i g. 11 und 12 zeigen eine relativ einfache Vorrichtung zur Herstellung der Streifen 12,13, ..., 19 auf einer Platte 11. Diese Vorrichtung besteht aus senkrecht verlaufenden Plättchen 50, die durch zwei Stege 51 zusammengehalten werden. Die Vorrichtung wird mit den Enden der Plättchen 50 an die Kante 2' des Streifens 2 angesetzt. Die Zwischenräume zwischen den Plättchen 50 werden dann jeweils mit verschiedene monospezifische Antikörper enthaltender Agarose ausgegossen, so daß sich die Streifen 12, 13, ..., 19 bilden. Besondere Mittel zum Anlegen des elektrischen Feldes sind nicht erforderlich, da — wie bereits erwähnt — alle seither bekannten Elektrophorese-Apparate oder auch einfache aus Elektroden zusammengebaute Anordnungen dafür verwendet werden können.

Die Anordnung der Streifen muß nicht notwendigerweise parallel und ihre Form nicht notwendigerweise rechteckig sein. Auch sternförmige Anordnungen mehrerer Streifen sind verwendbar; sie können dann auch gegebenenfalls segmentförmig ausgebildet sein, sofern die sich daraus ergebende stärkere Nichtlineari- tät des Abstandes α der Präzipitatgrenzen vom Streifenanfang bei speziellen Untersuchungszwecken hingenommen werden kann.

Eine weitere Variation der Erfindung ist — wie eingangs bereits erwähnt — darin zu sehen, daß es möglich ist, in die Streifen 12, 13, ..., 19 nach F i g. 5 statt der beschriebenen Antikörper Antigene zu inkorporieren und entsprechend die Einzelkomponenten von Proben zu untersuchen, die nicht Antigene sondern Antikörper enthalten. Als Anwendungsmöglichkeit sei auf die Diagnostik von Autoimmunerkrankungen und allergischen Erkrankungen verwiesen. In die Streifen werden Gewebeextrakte der verschiedenen Körpergewebe, wie Herz, Niere, Muskel, Schilddrüse, Nukleinsäuren inkorporiert. Als Probe, die in die Ausnehmung 3 eingebracht wird, wird Patientenserum eingegeben. Enthält das Patientenserum Autoantikörper gegen ein bestimmtes Gewebe, so binden sich in demjenigen Streifen, der den betreffenden Gewebeextrakt erhält, Präzipitate; alle anderen Streifen, die mit Gewebeextrakten gefüllt sind, gegen die das Patientenserum keine Autoantikörper enthält, werden von der Probe ohne Präzipitat durchwandert.

Hierzu 6 Blatt Zeichnungen 609511/439

Claims (18)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur simultanen spezifischen und quantitativen Bestimmung mehrerer einer Immunreaktion fähiger Substanzen, insbesondere antigenwirksamer Substanzen in einer Probe, bei dem die Probe aus einem antikörperfreien Träger in einen Träger hineinwandert, in den bestimmte weitere Substanzen inkorporiert sind, mit denen die zu bestimmenden Substanzen die Imunreaktion ergeben, und in dem die zu bestimmenden Substanzen Präzipitate bilden, und die Ausbreitung der Probe in Richtung eines über der Probe und dem Träger anliegenden elektrischen Feldes erfolgt, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe aus dem antikörperfreien Träger (2) gleichzeitig in mehrere Träger (12, 13, ..., 19) hineinwandert, die jeweils voneinander verschiedene spezifisch mit den in der Probe zu bestimmenden Substanzen Präzipitate bildende weitere Substanzen enthalten.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß in an sich bekannter Weise die chemische Ladung der Moleküle der Probe derart beeinflußt wird, daß sie negativ geladen sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß eine Vorbehandlung der Probe mit Formaldehyd, /3-Propiolacton oder Kaliumcyanat erfolgt.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Vorbehandlung für die Dauer von etwa 30 Minuten bei Raumtemperatur erfolgt.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß über die Träger (12, 13, ..., 19) ein elektrisches Feld mit einer Feldstärke von etwa 8 V/cm für die Dauer von 8 bis 10 Stunden anliegt.

6. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß der zu untersuchenden Probe als interner Standard in bekannter Konzentration zusätzlich eine weitere eine Immunreaktion ergebende Substanz, die nicht zu den aus der Probe zu bestimmenden Substanzen gehört, zugefügt wird, und daß in den Träger (12, 13, ..., 19) neben den mit den zu bestimmenden Substanzen eine Immunreaktion ergebenden weiteren Substanzen entsprechend zusätzlich eine weitere Substanz enthalten ist, die mit der in der Probe als interner Standard eingebrachten Substanz eine Immunreaktion bildet.

7. Verfahren nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der in den Trägern (12, 13, ..., 19) enthaltenen weiteren Substanzen derart bestimmt ist, daß sich für einen bestimmten Gehalt von zu untersuchenden Substanzen in der Probe gleiche Abstände (β) der Präzipitatgrenzen (12", 13", ..., 19") von der Kante (2') des antikörperfreien Trägers (2) ergeben.

8. Verwendung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder einem der folgenden zur Bestimmung von Antigenen.

9. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Bestimmung der Plasmaproteine im Blutplasma.

10. Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Bestimmung von Autoimmunreaktionen durch Inkorporation von Gewebeextrakten in die Träger (12, 13 19) und

Einsetzung von Serum als Probe.

11. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 1 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß sich an einen Träger (2) aus antikröperfreiem Material, der eine Ausnehmung (3) zur Aufnahme der Probe aufweist, mehrere Träger (12,13, ..., 19) anschließen, in denen jeweils voneinander verschiedene mit den in der Probe zu bestimmenden Substanzen Präzipitate bildende weitere Substanzen enthalten sind.

12. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß in den Trägern (12, 13, ..., 19) Antikörper gegen Plasmaproteine des Blutplasmas enthalten sind.

13. Vorrichtung nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß in den Trägern (12, 13, ..., 19) Extrakte verschiedener Gewebe enthalten sind.

14. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß die Träger (12, 13, ..., 19) als parallel zueinander angeordnete Streifen ausgebildet sind, die mit ihren Enden jeweils an die Kante (2') des substanzfreien Trägers (2) anstoßen.

15. Vorrichtung nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß die Träger (12, 13, ..., 19) auf einer Platte (1) angeordnet sind.

16. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß die Träger (2; 12, 13, ..., 19) aus Agarose-Gel gebildet sind.

17. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß auf einer die Träger (12,13,..., 19) tragenden Platte (1) eine Skala (4) zur Ablesung der Präzipitatgrenzen (α) angebracht ist.

18. Vorrichtung nach Anspruch 11 oder einem der folgenden, dadurch gekennzeichnet, daß in den Trägern (12,13, .... 19) als interner Standard eine weitere Substanz enthalten ist, die mit einer der Probe zuzugebenden probenfremden Substanz eine Immunreaktion ergibt.