DE69218829T2 - Quantitative Bestimmung von Mustern durch kapillare Elektrophorese - Google Patents
Quantitative Bestimmung von Mustern durch kapillare ElektrophoreseInfo
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Description
- Die vorliegende Anmeldung steht zu der Europäischen Patentanmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr. EP-A-0 518 475 (Beckman, Akt.Z. Nr. 128D-116) mit dem Titel "Analysis of Samples Utilizing Capillary Electrophoresis", die gleichzeitig mit dieser Anmeldung von Fu-Tai A. Chen und James C. Sternberg eingereicht wurde, und zu der Anmeldung Nr. EP-A-0 518 476 (Beckman Akt.Z. Nr. 128D-120), mit dem Titel "Identification Of Sample Constituents Utilizing Capillary Electrophoresis" in Beziehung, die gleichzeitig mit dieser Anmeldung von Fu-Tai A. Chen eingereicht wurde.
- Die vorliegende Erfindung bezieht sich allgemein auf die Analyse von Proben, speziell auf die Analyse durch kapillare Zonen-Elektrophorese und insbesondere auf die Quantitätsbestimmung von Proben-Spezies durch kapillare Zonen-Elektrophorese.
- Säugetier-Proteine, die in klinischen Proben (z.B. gesamtes Blut, Serum, Plasma, Cerebrospinal-Flüssigkeit und Urin) vorliegen, sind nützliche Indikatoren eines Krankheitszustandes oder einer körperlichen Verfassung. Die Menge und die Art dieser Proteine in der Probe können eine Fülle von Informationen für das klinische Personal bzw. den Arzt zur Verfügung stellen.
- Beispielsweise schließen die Protein-Bestandteile von Serum Albumin, Alpha-1 Lipoprotein, Alpha-2 Makroglobulin, Beta-1 Lipoprotein und Immunoglobuline (einschließlich Gammaglobuline) ein. Albumin, das Haupt-Protein von Serum liegt gewöhnlich in einer Konzentration zwischen 4,0 und 5,0 g/dL vor. Eine niedrigere Konzentration von Albumin kann ein Anzeichen für eine Nierenerkrankung sein; eine höhere Konzentration von Albumin ist charakteristisch für eine Dehydration. Erhöhte Spiegel von Alpha-1 Lipoprotein können ein Anzeichen für chronischen Alkoholismus oder Hyperestrogenismus, beispielsweise aufgrund einer Schwangerschaft, sein. Erhöhte Spiegel von Beta-1 Lipoprotein können ein Anzeichen für erhöhte Cholesterin-Spiegel sein.
- Säugetier-Proteine sind geladene Proteine, die sowohl kationische als auch anionische Anteile enthalten. Sie eignen sich somit zur Analyse durch kapillare Zonen-Elektrophorese ("CZE"). Die CZE ist eine Technik, die schnelle und wirksame Trennungen geladener Substanzen ermöglicht. Allgemein ausgedrückt, umfaßt die CZE die Einführung einer Probe in ein Kapillar-Röhrchen und das Anlegen eines elektrischen Feldes an das Röhrchen. Das elektrische Feld zieht die Probe durch das Röhrchen und trennt sie in ihre Bestandteile. D.h. jeder der Proben-Bestandteile weist seine eigene elektrophoretische Beweglichkeit auf; diejenigenmit einer größeren Beweglichkeit bewegen sich schneller durch das Kapillar-Röhrchen als diejenigen mit einer niedrigeren Beweglichkeit. Als eine Folge davon werden die Bestandteile der Probe während der Wanderung der Probe durch das Röhrchen in diskrete Zonen in dem Kapillar-Röhrchen aufgespalten. Ein Online-Detektor kann zur kontinuierlichen Überwachung der Trennung verwendet werden und auf Grundlage der diskreten Zonen Daten der verschiedenen Bestandteile bereitstellen. Der Detektor mißt die Lichtabsorption durch jeden Bestandteil bei einer festgelegten Wellenlänge; unterschiedliche Bestandteile absorbieren Licht unterschiedlich und deswegen können die Bestandteile voneinander unterschieden werden.
- Die CZE kann auf Grundlage des Inhalts der Kapillar-Säulen allgemein in zwei Kategorien getrennt werden. Bei der "Gel" CZE ist das Kapillar-Röhrchen mit einem geeigneten Gel gefüllt, beispielsweise Polyacrylamid-Gel. Die Trennung bzw. Separation der Bestandteile in der Probe ist zum Teil durch die Größe und die Ladung der durch die Gel-Matrix wandernden Bestandteile vorherbestimmt. Bei der "Offenes-Röhrchen" CZE ist das Kapillar-Röhrchen mit einer elektrisch-leitenden Pufferlösung gefüllt. Beim Anlegen eines elektrischen Feldes an das Kapillar-Röhrchen wird die negativ geladene Wand des Kapillar-Röhrchens eine Schicht von positiven Ionen aus der Pufferlösung anziehen. Weil diese Ionen durch den Einfluß des elektrischen Potentials auf die Kathode zuströmen, muß die Lösungs-Hauptmenge in diese Richtung fließen, um die elektrische Neutralität aufrechtzuerhalten. Dieser elektroendosmotische Fluß ergibt eine bestimmte Geschwindigkeitskomponente, die sowohl die neutralen Spezies als auch die ionischen Spezies, unabhängig von der Ladung, auf die Kathode zu treibt. Der Puffer bei der offenen CZE ist so beständig gegen Leitung und Diffusion wie die Gele, die bei der Gel-CZE verwendet werden. Dementsprechend können bei der offenen CZE Trennungen erzielt werden, die denen sehr ähnlich sind, die bei der Elektrophorese auf Gel-Grundlage erzielt werden.
- Typischerweise werden die pH-Werte der bei der offenen CZE verwendeten Puffer unter Berücksichtigung der isoelektrischen Punkte (PI) der Bestandteile der Probe gewählt. Beispielsweise ist der pI-Wert von Serum-Albumin 4,6; deshalb sind bei einem pH-Wert von 4,6 die negativ geladenen und die positiv geladenen Anteile von Serum-Albumin gleich und die Gesamtladung ist neutral. Wird der pH-Wert jedoch über dem isoelektrischen Punkt angehoben, so überwiegen die negativ geladenen Anteile und die Netto-Ladung ist negativ. Somit werden durch die geeignete Auswahl des pH-Wertes alle Spezies der Probe negativ geladen sein. Bei Serum-Proben mit größerem pH-Wert als ungefähr 8,00, wird die Mehrheit aller Serum-Protein-Spezies negativ geladen sein. Somit kann die Manipulation der isoelektrischen Punkte der Proben-Spezies verwendet werden, um eine geeignete Ladungsverteilung gegenüber dem Fluß von der artigen Spezies durch ein geladenes Kapillar-Röhrchen sicherzustellen.
- Typischerweise werden die Ergebnisse von CZE-Analysen über ein Elektropherogramm zur Verfügung gestellt, das die diskreten Zonen der Proben-Bestandteile als Spitzen bzw. Peaks oder Zacken mit unterschiedlicher Höhe und Breite veranschaulicht. Zusätzlich können die Ergebnisse in Ausdrücken von numerischen Daten dargestellt werden, die auf der integrierten Fläche unter jeder Bestandteil-Spitze basieren.
- Für Analysen von klinischen Proben ist es möglich, einen Krankheitszustand oder eine körperliche Verfassung dadurch zu bestimmen, daß die Spitzen, die durch ein Elektropherogramm von der Probe erhalten wurden, mit denen verglichen werden, die durch ein Elektropherogramm von einer bekannten Kontrollprobe erhalten wurden. Wenn eine Proben-Bestandteil- Spitze des Elektropherogramms von einer klinischen Probe breiter oder schmaler oder höher oder nicht so hoch wie die gleiche Proben-Bestandteil-Spitze des Elektropherogramms von der Kontroll-Probe ist, kann dies somit ein Anzeichen für einen Krankheitszustand oder eine körperliche Verfassung sein.
- Ein Problem bei CZE-Analysen von Protein enthaltenden Proben, Peptid enthaltenden Proben und Proben, die natürliche und/ oder synthetische DNA und RNA enthalten, besteht darin, daß es sehr schwierig ist, die Quantität der verschiedenen Proben-Bestandteile exakt zu bestimmen. D.h. obwohl es möglich war, zugehörige bzw. verwandte Spitzen visuell zu vergleichen, um zu bestimmen, ob ein potentieller Krankheitszustand vorliegt, war es bis heute ein Problem, die genauen quantitativen Mengen von dem verschiedenen Bestandteilen einer Probe exakt und lückenlos zu bestimmen.
- Ein anderes Problem im Zusammenhang mit der kapillaren Zonen- Elektrophorese von derartigen Proben besteht darin, daß die Bestandteile auf dem Elektropherogramm bei unterschiedlichen Proben zu unterschiedlichen Wanderungs-Zeiten auftreten können. Anders ausgedrückt, ein Protein und/oder ein Peptid, das in zwei unterschiedlichen Proben enthalten ist, kann an unterschiedlichen Stellen auf jedem der Elektropherogramme für derartige Proben angezeigt werden. Dies ist teilweise durch die Tatsache verursacht, daß die Zeit, die jeder frühere Proben-Bestandteil erfordert, um sich durch das Kapillar- Röhrchen zu bewegen, die Wanderungs-Zeit von nachfolgenden Proben-Bestandteilen beeinflußt.
- Frühere Versuche der Quantitätsbestimmung von Proben-Bestandteilen wurden beschrieben. Cinnamylsäure wurde als interner Standard bzw. als innerer Bezugswert für die Bestimmung der Ferulasäure-Konzentration in Hunde-Plasma nach oraler Verabreichung von γ-Oryzanol getestet. Fujiwara, S. und Harda S. "Determination of Cinnamic Acid and its Analogues by Elektrophoresis in a Fused Silica Capillary Tube", Anal. Chem . 58: 1811-1814 (1986). Phenol wurde als ein innerer Bezugswert für die Bestimmung von chlorierten Phenol-Konzentrationen getestet. Otsuka, K. et al "Quantitation and Reproducibility in Chromatography with Micellar Solutions" J. of Chrom. 396: 350-354 (1987).
- Es wurden normalisierte Werte bezüglich eines inneren Äthyl p-aminobenzoat Standards für jeden Bestandteil in verschiedenen antipyretischen analgetischen Präparaten bestimmt in Fujiwara, S. und Honda S. "Determination of Ingredients of Antipyretic Analgesic Preparation by Micellar Electrokinetic Capillary Chromatography" Anal. Chem. 59: 2773-2776 (1987). Darüber hinaus wurde Butanoat als innere Referenz gewählt, um die Konzentration von aus Joghurt extrahiertem Lactat zu bestimmen, wobei ein Leitfähigkeits-Detektions-System verwendet wurde, Huang X. et al. "Quantative Analysis of Low Molecular Weight Carboxylic Acids by Capillary Zone Electrophoresis/Conductivity Detection" Anal. Chem. 61: 766-770 (1989). Weiterhin ist die Ko-Injektion von einer bekannten Menge einer zu analysierenden Spezies gut dokumentiert.
- Innere Standards, d.h. Standards, die innerhalb des Bestandteil- Erkennungsbereiches erkannt werden, können zu wenigstens zwei Problemen führen. Erstens existiert ein Potential für eine Mit- Wanderung. Der innere Standard kann in oder nahe bei einem Bereich wandern, in dem ein Proben-Bestandteil wandert, was zu fehlerhaften Analysen von diesem Bestandteil führt. Dies ist der Fall, weil der Proben-Bestandteil aufgrund seiner Vermischung mit und der Auswirkung des mit-wandernden Standards als eine Spitze mit größerer Höhe oder Breite erscheinen kann. Zweitens kann die Position der Spitze des inneren Standards im Elektropherogramm in Abhängigkeit von der Menge der analysierten Probe variieren, weil die Menge der analysierten Probe die Flußrate des Standards beeinflußt. Wenn die Position der Spitze des inneren Standards künstlich verändert wird, ist die Quantitätsbestimmung der Bestandteile aufgrund derartiger Veränderungen ungenau, unverständlich oder fehlerhaft.
- Demzufolge besteht eine Notwendigkeit für ein wirksames und zuverlässiges Verfahren zur schnellen Quantitätsbestimmung der Bestandteile von Peptid enthaltenden Proben durch ein Kapillar-Zonen-Elektrophorese-Protokoll.
- Die vorliegende Erfindung, wie sie in Anspruch 1 definiert ist, erfüllt diese Notwendigkeit durch das Hinzufügen von wenigstens einer ionischen Spezies zu der zu analysierenden Probe und durch die Verwendung der bekannten Konzentration von dieser ionischen Spezies als Grundlage für die Bestimmung der Konzentration der Bestandteile der Probe. Mit "ionischer Spezies" ist eine Spezies gemeint, die eine Ladungsdichte zwischen ungefähr 0,02 und ungefähr 0,001 aufweist. Die "Ladungsdichte" ist definiert als die Anzahl der negativen Ladungen einer Spezies dividiert durch das Molekulargewicht von dieser Spezies. Bei der am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung weist die ionische Spezies eine einzige negative Ladung und ein Molekulargewicht zwischen ungefähr 50 und ungefähr 750, bevorzugter zwischen ungefähr 75 und 250 und am meisten bevorzugt zwischen ungefähr 100 und ungefähr 160 auf.
- Die ionische Spezies wird bezüglich der Ladungsdichte der Bestandteile der Probe ausgewählt, die die Kapillar-Säule durchqueren. Der Sinn bzw. Zweck ist, daß die Elektropherogramm-Spitze der ionischen Spezies hinreichend definiert ist und sich nicht mit dem Spitzen von irgendeinem der anderen Proben-Bestandteile überschneidet bzw. überlagert. Bei der am meisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Ladungsdichte der ionischen Spezies größer als die von jedem der Haupt-Bestandteile der Probe. Bei dieser Ausführungsform erscheint die Elektropherogramm-Spitze der ionischen Spezies nach der Elektropherogramm-Spitze des letzten Proben-Haupt-Bestandteils.
- Die bekannte Konzentration der ionischen Spezies kann verwendet werden, um die Konzentration von jedem speziellen Proben-Bestandteil zu bestimmen. Die ionische Spezies wird der Probe zugefügt, um eine Mischung zu bilden. Diese Mischung wird anschließend der kapillaren Zonen-Elektrophorese unterworfen und die ionische Spezies und die Bestandteil-Spezies von der Probe werden durch einen Online-Detektor erfaßt bzw. erkannt. Die Quantität jeder speziellen Bestandteil-Spezies kann genau bestimmt werden, basierend auf der Normalisierung der verschiedenen Bestandteil-Spezies bezüglich der der Probe hinzugefügten ionischen Spezies, der integrierten Fläche der Elektropherogramm-Spitze der ionischen Spezies und der integrierten Fläche der Spitzen von jeder der Proben-Bestandteile.
- Diese und andere Vorteile Werden in der folgenden ausführlichen Beschreibung weiter erläutert.
- Dieser Abschnitt der Offenbarung ist auf die Quantitätsbestimmung von klinischen Proben gerichtet, um eine einfache Darstellung zu ermöglichen. Es ist jedoch selbstverständlich, daß die vorliegende Erfindung genauso zur Quantitätsbestimmung von Peptid enthaltenden Proben, Protein enthaltenden Proben, anderen als klinischen Proben und Proben, die natürliche und/oder synthetische DNA oder RNA enthalten anwendbar ist.
- Die Probleme, die sich beim Stand der Technik ergeben, werden bei dem vorliegenden erfindungsgemäßen Verfahren durch das Hinzufügen von wenigstens einer ionischen Spezies zu der zu analysierenden Probe vermieden.
- In der am meisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die ionische Spezies eine Ladungsdichte auf, die größer als die von dem letzten Haupt-Bestandteil der Probe ist, die analysiert wird. Diese wird den Online- Detektor somit nach dem meisten, wenn nicht allen, Proben- Bestandteilen passieren und als Spitze in dem Ergebnis-Elektropherogramm erscheinen. Die Quantität von jedem Proben- Bestandteil wird anschließend auf Grundlage der bekannten Information über die ionische Spezies (die weiter unten noch genauer zu beschrieben ist) und der Größe der Elektropherogramm-Spitze der ionischen Spezies relativ zu der Größe der Elektropherogramm-Spitzen von jedem Proben-Bestandteil bestimmt.
- Das Haupt-Kriterium für die ionische Spezies ist die Position von ihrer Elektropherogramm-Spitze bezüglich der der Proben- Bestandteile. Es ist wesentlich, daß die Elektropherogramm- Spitze für die ionische Spezies hinreichend definiert ist und sich nicht mit dem Spitzen von irgendeiner der interessierenden Bestandteil-Spezies überlagert. Demgemäß ist es möglich, daß die Spitze der ionischen Spezies innerhalb des Bereiches auftritt, in dem Spezies-Spitzen auftreten. Es wird am meisten bevorzugt, daß die ionische Spezies nach dem letzten Haupt- Bestandteil der analysierten Probe erkannt wird. Die ionische Spezies sollte also eine "flexible" Flußrate aufweisen, d.h. die ionische Spezies sollte im Ergebnis in der Lage sein, sich an die Probe anzupassen, indem sie der letzten Proben-Bestandteil- Zone "hinterher eilt", unabhängig von Abweichungen im Proben- Volumen oder dem Bedingungen. Dieses Kriterium für die ionische Spezies ist durch die "Ladungsdichte" des Standards bestimmt.
- Die Ladungsdichte ist ein Maß für die "Geschwindigkeit", mit der sich entweder ein Bestandteil in der Probe, die analysiert wird, oder die ionische Spezies durch das Kapillar-Röhrchen bewegen wird. Ein Bestandteil, der eine höhere Ladungsdichte aufweist, wird langsamer durch das Kapillar-Röhrchen wandern, verglichen mit einem Bestandteil, der eine niedrigere (relative) Ladungsdichte aufweist. Wenn die ionische Spezies dem Online- Detektor nach dem letzten Proben-Bestandteil passieren soll, dann muß die Ladungsdichte der ionischen Spezies größer als die Ladungsdichte des letzten Proben-Bestandteils sein.
- Die "Ladungsdichte" einer Spezies ist definiert als die Anzahl von negativen Ladungen einer Spezies dividiert durch das Molekulargewicht von dieser Spezies. Die Ladungsdichte der ionischen Spezies liegt vorzugsweise zwischen ungefähr 0,02 und ungefähr 0,001, bevorzugter zwischen ungefähr 0,01 und ungefähr 0,004 und am meisten bevorzugt zwischen ungefähr 0,01 und ungefähr 0,006. Bei der am meisten bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung weist die ionische Spezies eine einzige negative Ladung auf, so daß ihr Molekulargewicht vorzugsweise zwischen ungefähr 50 und ungefähr 750, bevorzugter zwischen ungefähr 75 und ungefähr 250 und am meisten bevorzugt zwischen ungefähr 100 und ungefähr 160 liegt. Die ionische Spezies kann jedoch eine Vielzahl negativer Ladungen aufweisen; wenn die Anzahl der negativen Ladungen erhöht wird, muß das Molekulargewicht dieser Spezies ebenfalls steigen, so daß die Ladungsdichte weiterhin innerhalb des gewünschten Bereichs von ungefähr 0,02 bis ungefähr 0,001 liegt.
- Die negative Ladung von der Spezies wird aus einem "negativen Ladungsanteil" der Spezies abgeleitet. Mit "negativem Ladungsanteil" ist entweder wenigstens ein Carbonsäure- Anteil oder wenigstens ein Sulfonsäure-Anteil, oder wenigstens ein Phosphorsäure-Anteil gemeint. Durch die Ionisation oder wenn der pH-Wert größer als der pI-Wert ist, werden diese Anteile negativ geladen. Wie dem Fachmann bekannt ist, hat Phosphorsäure zwischen 1 und 3 negative Ladungen. Unter sauren Bedingungen (d.h. bei einem pH-Wert von ungefähr 4) hat Phosphorsäure eine einzige negative Ladung; unter neutralen Bedingungen (d.h. bei einem pH-Wert von ungefähr 7) hat Phosphorsäure zwei negative Ladungen; und bei basischen Bedingungen (d.h. bei einem pH-Wert von ungefähr 9) hat Phosphorsäure drei negative Ladungen.
- Wie bereits erwähnt, wird der pH-Wert der bei der offenen CZE verwendeten Puffer bezüglich der isoelektrischen Punkte von dem Bestandteilen der Probe gewählt. Die Aufgabe besteht darin, dem pH-Wert zu bestimmen, bei dem alle Bestandteile negativ geladen sein werden. Für Serum ist dies ein pH-Wert, der größer als ungefähr 8,00 ist. Die ionische Spezies ist also vorzugsweise stabil in wäßrigen Lösungen, die einen pH-Wert von wenigstens ungefähr 8,00 aufweisen. Es ist weiterhin erwünscht, daß die ionische Spezies Absorptionseigenschaften aufweist, die denen von Peptidverbindungen ähnlich sind, so daß die ionische Spezies zusammen mit dem Proben-Bestandteilen durch den Online- Detektor erfaßt wird. Dies ist der Fall, weil die Bestandteile von klinischen Proben Protein-Spezies aufweisen, und Protein-Spezies Peptidverbindungen einschließen. Die ionische Spezies weist also vorzugsweise ein Absorptionsvermögen bei weniger als ungefähr 300 nm, bevorzugter weniger als ungefähr 250 nm und am meisten bevorzugt zwischen ungefähr 220 nm und ungefähr 200 nm auf.
- Der spezielle strukturelle Aufbau der ionischen Spezies an sich ist nicht wichtig. Somit können zyklische, geradkettige oder verzweigte ionische Spezies, die dem erforderlichen negativen Ladungsanteil aufweisen, verwendet werden, vorausgesetzt, daß sie eine Ladungsdichte zwischen ungefähr 0,02 und ungefähr 0,001 aufweisen.
- Beispiele für die ionischen Spezies schließen Ameisensäure (1 negative Ladung; Molekulargewicht von 48; Ladungsdichte von 0,02), Essigsäure (1; 60; 0,017), Benzo-Phosphor-Säure (2; 158; 0,013), Propionsäure (1; 74; 0,014), Isopropionsäure (1; 74; 0,014), Buttersäure (1; 88; 0,011), Iso-Buttersäure (1;88;0,011), Benzoesäure (1; 122; 0,008), Benzo-Sulfonsäure (1; 148; 0,007), Ortho-Chloro-Benzoesäure, Meta-Chloro-Benzoesäure und Para-Chloro-Benzoesäure (1; 157; 0,006), Naphthyl- Sulfonsäure (1;208;0,005), Benzo-Naphtholsäure (1; 224;0,004), Chloro-Benzo-Naphtholsäure (1; 258; 0,004), Chloro-Naphthyl- Sulfonsäure (1; 242; 0,004), Tetra-Iodo-Benzo-Naphthyl-Sulfonsäure (1; 716; 0,001) und Di-Iodo-Anthracenyl-Sulfonsäure (1; 776; 0,001) ein. Die Verwendung von Benzoesäure für die ionische Spezies wird am meisten bevorzugt.
- Für die Wirksamkeit und die Geschwindigkeit der Analysen ist es wünschenswert, eine ionische Spezies zu verwenden, die innerhalb eines relativ kurzen Abschnittes nach der Erfassung des letzten Proben-Bestandteils erfaßt wird. "Relativ kurz" ist definiert als weniger als ungefähr zwei Minuten; längere Zeiten können jedoch ebenso verwendet werden.
- Wie erwähnt wird die ionische Spezies derart ausgewählt, daß ihre relative Ladungsdichte eine einheitliche und hinreichend bzw. gut definierte Elektropherogramm-Spitze erzeugen wird. Bei der am meisten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Ladungsdichte der ionischen Spezies größer als die der Haupt-Bestandteile der Probe. Deshalb wird die ionische Spezies nach dem letzten Haupt-Bestandteil der Probe erfaßt, die analysiert wird. Demzufolge müssen die Ladungsdichtern der Proben-Bestandteile bestimmt werden oder, entsprechend der am meisten bevorzugte Ausführungsform der Erfindung, die Ladungsdichte des letzten Haupt-Bestandteils muß bestimmt werden.
- Klinische Proben schließen Peptid- und Protein-Spezies ein. Peptide und Proteine bestehen aus einem Sortiment von 20 Aminosäuren. Jede Aminosäure weist eine Seitenkette auf. Ein Verfahren zur Kategorisierung vorn Aminosäuren basiert darauf, ob diese Seitenkettern sauer, basisch, ungeladen-polar oder nicht-polar sind. Lysin, Arginin und Histidin haben basische Seitenketten; Aspargin-, Glutamin-, Serin-, Threonin- und Tyrosin haben ungeladen-polare Seitenketten; Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan und Cynstein haben nicht-polare Seitenketten; und Asparginsäure und Glutaminsäure haben saure Seitenketten. Von dem 20 Aminosäuren werden nur Asparginsäure und Glutaminsäure aufgrund ihrer sauren Seitenketten eine negative Netto-Ladung bei der Ionisation aufrechterhalten.
- Obwohl die Ladungsdichte definiert ist als die Anzahl von negativen Ladungen einer Spezies dividiert durch das Molekular- Gewicht von dieser Spezies, kann die Ladungsdichte von Peptiden und Proteinen demgemäß ebenfalls durch die Division der Anzahl der Asparginsäure- und Glutaminsäure-Aminosäuren, die in dieser Spezies enthalten sind, durch das Molekulargewicht von dieser Spezies bestimmt werden.
- Die Menge der ionischen Spezies, die der Probe hinzugefügt wird, basiert auf einer Kombination der gewünschten integrierten Fläche für die ionische Spezies; der Verdünnung der Probe; der Protein-Konzentration vorn einer normalen Kontrollprobe; und einem Absorptions-Wert, der von festgelegten Volumen- Beträgen der ionischen Spezies und der Probe abgeleitet wird.
- Die integrierte Fläche der Elektropherogramm-Spitze der ionischen Spezies sollte weniger als ungefähr 50 % der gesamten integrierten Fläche der Proben-Bestandteil-Spitzen und der Spitze der ionische Spezies betragen. Dies ist der Fall, weil die integrierte Fläche von der ionischen Spezies nicht so groß sein sollte, das sie die integrierten Flächen der Proben-Bestandteile verringert; eine integrierte Fläche der Spitze der ionischen Spezies von mehr als 50 % würde eine derartige Verrirngerungs-Auswirkung auf die anderen Elektropherogramm-Spitzen verursachen. Vorzugsweise sollte die integrierte Fläche zwischen ungefähr 5 % und ungefähr 40 % der gesamten integrierten Fläche, und am meisten bevorzugt ungefähr 30 % der gesamten integrierten Fläche betragen.
- Bei der CZE-Analyse wird die Probe, die analysiert wird, normalerweise verdünnt. Beispielsweise werden Serum, Plasma und gesamtes Blut vor der Einführung in das Kapillar-Röhrchen verdünnt, um diese Proben beim Strömen durch das Kapillar- Röhrchen zu unterstützen; Urin und Cerebrospinal-Flüssigkeit können verdünnt werden, eine Verdünnung ist jedoch nicht erforderlich. Die Verdünnung ist typischerweise von ungefähr 1 Teil Probe zu ungefähr 20 Teilen Verdünnungsmittel (1 : 20 = 0,05) bis zu ungefähr 1 : 100 (0,01). Dort wo eine Verdünnung erwünscht ist, beträgt das Verdünnungsverhältnis vorzugsweise 1 : 50 (0,02). Verdünnungsmittel, die verwendet werden können und die bei der vorliegende Erfindung angewendet werden können, sind hinreichend bekannt und verschiedenartig und werden hier nicht beschrieben. Ein Beispiel für ein derartiges Verdünnungsmittel ist das ICSTM-Verdünnungsmittel (Beckman Instruments, Inc.). Das Verdünnungsmittel sollte vorzugsweise einen neutralen pH- Wert aufweisen (d.h. ungefähr 7).
- Die Protein-Konzentration von einer Kontrollprobe ist derart gewählt, daß sie eine Protein-Konzentration aufweist, die gleich der ist, die normalerweise bei einer typischen normalen menschlichen Probe vorliegt. Die Protein-Konzentration einer Serum-Probe einer gesunden Person beträgt beispielsweise ungefähr 60 mg/ml. Ähnliche Konzentrations-Werte für Urin bzw. Cerebrospinal-Flüssigkeit ("CSF") liegen ungefähr bei 10 µg/ml bzw. zwischen ungefähr 150 und 400 µg/ml. Wenn die Serum- Protein-Konzentration eines Patienten über oder unter diesen Normalwerten liegt, kann also ein klinisches Problem vorliegen. Für die Gleichheit der Konzentrations-Angaben: Die Protein- Konzentration, die bei menschlichem Serum vorliegt, beträgt ungefähr 60.000 µg/ml.
- Ein weiterer Faktor, der zur Bestimmung der zur Probe hinzugefügten Menge der ionischen Spezies erforderlich ist, basiert auf dem Absorptionsgrad vorn definierten Mengen der ionischen Spezies und der Probe bei dem festgelegtern Wellenlängen, die durch dem Online-Detektor erfaßt werden. Wenn eine definierte Menge der ionischen Spezies und der Probe mit Licht einer festgelegten Wellenlänge bestrahlt werden, kann für jede ein numerisch definierter Absorptions-Wert bestimmt werden. Diese zwei Werte werden verwendet, um ein Verhältnis der Absorption für die ionische Spezies allein und die Probe allein zu erhalten. Diese Werte werden getrennt bestimmt, um die Absorptionseigenschaften jeweils ohne durch dem anderen Bestandteil verursachte Interferenzen zu bestimmen.
- Um die Menge der ionischen Spezies zu bestimmen, die der Probe hinzuzufügen ist ("I.S"), werden die oben genannten Faktoren mathematisch durch Multiplikation der normalen Protein-Konzentration der speziellen Probe, die analysiert wird, mit dem Verdünnungs-Faktor manipuliert (für CSF kann ein mittlerer Wert von 275 µg/ml für die Protein-Konzentration verwendet werden); dieser Wert wird anschließend mit der gewünschten integrierten Fläche der ionischen Spezies multipliziert; schließlich wird das Ergebnis multipliziert mit: dem Quotient aus dem Absorptions- Wert einer definierten Menge der ionischen Spezies, der bei einer festgelegten Wellenlänge gemessen wird, dividiert durch den Absorptions-Wert der gleichen definierten Menge der Probe, der bei ungefähr derselben Wellenlänge gemessen wird.
- Das Vorstehende kann formelmäßig wie folgt ausgedrückt werden:
- I.S. = (S * D * P.W.) * X/Y (1)
- Innerhalb der gesamten Beschreibung bedeutet das Zeichen " *" ein mathematisches Multiplikationszeichen. In dieser Gleichung ist "S" der Prozentsatz der gewünschten integrierten Fläche der ionischen Spezies-Spitze, wie oben definiert; "D" ist der Verdünnungs-Faktor der Probe, wie oben definiert (für Proben, die nicht verdünnt sind, wie zum Beispiel für Urin oder Cerebrospinal-Flüssigkeit, kann dieser Wert 1,0 sein); "P.W." ist die normale Protein-Konzentration; "X" ist der Absorptionsgrad von (am meisten bevorzugt) 100 µg/ml der ionischen Spezies bei einer festgelegten Wellenlänge; und "Y" ist der Absorptiornsgrad von 100 µg/ml der Probe bei einer festgelegten Wellenlänge. X und Y werden typischerweise in Nanometern angegeben. Hinsichtlich der Absorptions-Werte sowie der Menge der ionischen Spezies und der Probe die gemessen werden, ist die spezielle Menge an sich nicht wichtig; was wichtig ist, ist daß die Mengen die sowohl für die Probe als auch für die ionische Spezies verwendet werden, ungefähr gleich sind.
- Um die Konzentration der Bestandteile der Probe zu bestimmen, wird die integrierte Fläche der Spitze von jedem Proben- Bestandteil und der ionischen Spezies bestimmt, und der relative Prozentsatz von jeder Spitze bezüglich der gesamten integrierten Flächen von allen derartigen Spitzen wird ermittelt. Jeder Spitzen-Prozentsatz wird dann bezüglich der ionischen Spezies normalisiert. Der Ausdruck "normalisiert" bedeutet hier, daß die verschiedenen Kriterien, die die ionische Spezies an sich und die ionische Spezies wie sie durch die CZE-Analyse gemessen wurden betreffen, derart manipuliert werden, daß die Konzentration von jeder Bestandteil-Spezies aus der ionischen Spezies erhalten werden kann.
- Demgemäß wird zur Bestimmung der Konzentration einer speziellen Spezies ("P.S.") der Wert der integrierten Fläche von dieser Spezies durch die Summe der integrierten Flächen von allen Bestandteilen und der ionischen Spezies dividiert, und dieser Wert wird dividiert durch: dem Wert der integrierten Fläche von der ionischen Spezies, dividiert durch die Summe der integrierten Flächen von allen Bestandteil-Spezies und der ionischen Spezies. Dieser Wert wird multipliziert mit: dem Kehrwert des Verdünnungs-Faktors; dem Absorptions-Wert von einer definierten Menge der Probe, gemessen bei einer festgelegten Wellenlänge, der durch den Absorptions-Wert von ungefähr der gleichen festgelegten Menge von der ionischen Spezies, gemessen bei ungefähr der gleichen festgelegten Wellenlänge dividiert ist (d.h. Y/X, dem Kehrwert von der Manipulation dieser Faktoren, wie sie in Abschnitt C "Bestimmung der Konzentration der ionischen Spezies" beschrieben ist); und der Konzentration der ionischen Spezies in der Probe.
- Das Vorstehende kann formelmäßig wie folgt ausgedrückt werden: P.S. = [SC%/S%] * ([1/D] * [Y/X] * [I.S.]) (2)
- wobei SC% die prozentuale integrierte Fläche von wenigstens einer Bestandteil-Spezies darstellt; S% stellt die prozentuale integrierte Fläche der ionischen Spezies dar; D stellt dem verdünnungs-Faktor dar; Y/X stellt den Kehrwert von dem Absorptions-Manipulations-Faktor dar, wie er vorher im Abschnitt C "Bestimmung der Konzentration der ionischen Spezies" definiert wurde; und [I.S.] ist die Konzentration von der ionischen Spezies in der analysierten Probe.
- Die folgenden Beispiele, die auf bevorzugte Ausführungsformen der hier beschriebenen Erfindung gerichtet sind, beabsichtigen weder eine Einschränkung der Beschreibung oder der folgenden Ansprüche, noch sollten sie so aufgefaßt werden.
- Die kapillare Elektrophorese von klinischen Proben und Kontrollproben wurden mit einem Hochleistungs-Kapillar-Elektrophorese-System der Beckman Instruments, Inc. (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, Ca., USA, Modell Nr. 357575) durchgeführt. Die Datenanalyse wurde mit der System Gold Software (Beckman Instruments, Inc.) durchgeführt. Das vorher erwähnte Kapillar-Elektrophorese-System enthält eingebaute 214, 254, 280 und 415 nm Schmalband-Filter zur Online-Detektion. Die Elektrophorese wurde in einem Quarzglas-Rohr mit 75 µM Innendurchmesser und 25 cm Länge (Polymicro Technologies, Inc., Phoenix, AZ, USA, Produkt Nr. TSP075375) durchgeführt. Das Detektions-Fenster war ungefähr 6,5 cm vom Säulenauslaß entfernt angeordnet.
- Die klinischen Proben und Kontrollen wurden auf der Einlaßschale des oben beschriebenen Kapillar-Elektrophorese-Systems angeordnet. Die klinischen Proben und die Kontrollproben wurden automatisch durch das elektrokinetische Verfahren für 3 bis 10 Sekunden bei 1 kV in das Kapillar-Röhrchen injiziert. Die Analyse wurde in weniger als 10 Minuten unter Verwendüng eines Säulern-Spannungs-Gradient von 200 Volt/cm durchgeführt. Das Kapillar-Röhrchen wurde zwischen jedem Durchlauf gewaschen und rekonditioniert (18 Sekunden in NaOH, 12 Sekunden 0,1 % Triton-X 100 in destilliertem H&sub2;O).
- Der Elektrophorese-Puffer wurde gemäß der Beschreibung der gleichzeitig eingereichten Anmeldung hergestellt, auf die oben Bezug genommen wurde, indem 9,95 g Borsäure (MW 61,83) und 4,86 g Natrium-Hydroxid (MW 40,00) in 1 Liter destilliertem H&sub2;O gelöst wurden. Die endgültige Konzentration der Borsäure betrug 80 mM/L und der endgültige pH-Wert wurde durch tropfenweises Hinzufügen von 1 N NaOH auf 10,25 +/-0,1 eingestellt.
- Alle Chemikalien waren wenigstens von der ACS-Güteklasse. Benzoesäure (Aldrich Chemical, Milwaukee, Wis., USA, Part No. 24,238-1) wurde dem ICS -Verdünnungsmittel (Beckman Instruments, Inc., Part No. 449690) derart hinzugefügt, daß die endgültige Benzoesäure-Konzentration 0,10 mg/ml betrug. Ein Beispiel dafür, wie die Benzoe-Säure-Konzentration ermittelt wurde, wird in Beispiel II erläutert. Der verwendete Protein- Standard war I.D. - Zone -Normal-Protein-Elektrophoresis- Control (Becknan Instruments, Inc., Part No. 667600). Es wurde ein 1 : 50 Protein-Kontrollproben: verdünnter Markierer Verhältnis verwendet.
- Die Serum-Proben von Patienten wurden vom Brea Community Hospital, Brea, CA. erhalten. Es wurde ein 1 : 50 Serum- Probe : verdünnter innerer Markierer Verhältnis verwendet.
- Für die CZE-Analyse der Protein-Kontrollproben-Vergleiche wurde ein Synchron CX 4 Clinical Analyzer (Beckman Instruments, Inc.) verwendet, um die Protein- und Albumin- Gesamtkonzentrationen zu bestimmen. Die Hersteller-Anweisungen wurden für die Analysen der Protein-Kontrollproben befolgt.
- Die Ladungsdichte für die Protein-Spezies kann zum Zweck der Bestimmung der Ladungsdichte der ionischen Spezies einfach und wirksam berechnet werden, indem entweder die Anzahl der Asparginsäureund der Glutaminsäure-Aminosäurern in dem Protein bestimmt wird, wie oben beschrieben, durch konventionelle Sequenzierungs-Verfahren, wie beispielsweise dem Sanger-Coulson- oder Maxam-Gilbert-Verfahrern, oder durch Protein-Sequenzierungs- Geräte, wie beispielsweise dem PI 2020 und PI 2090E - Protein-Sequenzierer (Porton Instruments, Inc., Tarzana, CA.).
- Dem oben beschriebernden Verfahren folgend, ist beispielsweise der letzte durch die CZE-Analyse zu erfassende Haupt-Bestandteil des menschlichen Serums Albumin (Pre-Albumin ist der absolut letzte Bestandteil von Serum). Serum-Albumin (menschliches) hat ein Molekulargewicht ("MW") von ungefähr 86.000. Jede Aminosäure hat näherungsweise ein Molekulargewicht von ungefähr 100. Somit ergibt sich für menschliches Serum-Albumin ("HSA") [86.000 MW/(100 MW/a.a)] = 860 Aminosäuren
- Somit liegen in HSA ungefähr 860 Aminosäuren vor. Weil zwanzig Aminosäuren in HSA vorliegen, sollten somit theoretisch unfähr 5 % der HSA-Aminosäuren Asparginsäure und ungefähr 5 % Glutaminsäure sein; d.h. 10 % der ungefähr 860 HSA-Aminosäuren sollten eine negative Netto-Ladung bei der Ionisation aufweisen. Für Berechnungszwecke wird es jedoch als sinnvoll angesehen, diese theoretische Näherung auf 20 % zu verdoppeln, um eine theoretisch maximale negative Ladung abzuschätzen. Die Verdoppelung des Beitrags der negativen Anteile zu dem Bestandteil wird bei der Menge der verwendeten ionischen Spezies keine negativen Auswirkungen verursachen. Um die Näherung für die Ladungsdichte von HSA zu bestimmen, ergibt sich für die Berechnung deshalb:
- 20 % x 860 a.a. = 172 Karbonsäure-Anteile [172/86.000 MW] = [1/500] = 0,002 = ungefähre Ladungsdichte von HSA
- Damit sich die ionische Spezies langsamer als der letzte Probenbestandteil, in diesem Fall HSA, bewegt, muß die Ladungsdichte der ionischen Spezies deshalb größer als 0,002 sein.
- Die vorstehende Methode kann einfach für beliebige Aminosäure enthaltende Bestandteile verwendet werden. D.h. das Molekulargewicht von dem bzw. dem Bestandteil(en) kann verwendet werden, um eine genaue Abschätzung ihrer Ladungsdichte derart zu erhalten, daß die Elektropherogramm-Spitze der ionischen Spezies als einheitliche und definierte Spitze relativ zu der bzw. dem Spitze(n) von dem bzw. dem Bestandteil(en) angeordnet werden kann. Durch die Division des Molekulargewichts des Aminosäure enthaltenden Bestandteils durch 100 (dem ungefähren Molekulargewicht einer Aminosäure); der Multiplikation dieses Wertes mit 20 % (der theoretisch maximalen Anzahl von Asparginsäure- und Glutaminsäure-Aminosäuren in einer Protein-Spezies); und der Division dieses Wertes durch das Molekulargewicht des Bestandteils, wird ein Ladungsdichte-Wert für diesen Bestandteil zur Verfügung gestellt, der zum Zweck der Bestimmung der Ladungsdichte der ionischen Spezies verwendet werden kann.
- Benzoesäure, die einen Kohlenstoff-Anteil und ein Molekulargewicht von 122 aufweist, hat eine Ladungsdichte von 1/122 (0,008)., die größer ist als die Ladungsdichte von HSA (0,002).
- Wie bereits dargestellt, kann die Menge der der Probe hinzuzugefügtern ionischen Spezies wie folgt bestimmt werden:
- (S * D * P.W.) * X/Y
- Die Definitionen für jeden Faktor in dieser Gleichung sind oben vollständig beschrieben. Eine am meisten bevorzugte ionische Spezies ist Benzoesäure. Wie bereits erwähnt, beträgt der am meisten bevorzugte Wert für S 30 %. Für die Analyse von Serum beträgt ein am meisten bevorzugter Verdünnungsfaktor 1:50 (0,02). Die Protein-Konzentration von menschlichem Serum beträgt ungefähr 60 mg/ml. Die Absorptions-Werte für die definierten Mengen von Benzoesäure und der Probe (100 µl), die bei einer festgelegten Wellenlänge von 214 nm gemessen wurden, waren 0,4471 (X) bzw. 1,66 (Y); der Wert beträgt deshalb 0,2693 (0,4471/1,66). Demzufolge wird die Konzentration (und somit die Menge) von Benzoesäure in der Probe wie folgt abgeleitet:
- (0,30 * 0,02 * 60) * 0,2693 = 0,097mg/ml
- Für die folgenden Beispiele wurde dieser Wert aufgerundet, so daß die Konzentration von Benzoesäure in dem Standard 0,10 mg/ml betrug.
- Wie erwähnt, wird die integrierte Fläche von jeder Bestandteil-Spezies bezüglich verschiedener ermittelbarer Informationen über die ionische Spezies normalisiert. Während die Information, die die integrierten Flächen betrifft, aus der CZE-Analyse der Probe bestimmt werden muß, können die verbleibenden Faktoren auf Grundlage der in Beispiel II genannten Daten bestimmt werden. Gleichung 2, ohne deren Anteil der integrierten Fläche, ergibt folgendes: [1/D] * [Y/X] * [I.S.]
- Die Lösung von diesem Teil der Gleichung wird als der "ionische Spezies Normalisierungs-Wert" bezeichnet.
- Für die in dem folgenden Beispielen (Serum) verwendeten klinischen Proben kann der ionische Spezies Normalisierungs- Wert, unter Verwendung der Werte, wie sie in Beispiel II definiert und abgeleitet sind, wie folgt bestimmt werden: [1/0,02] * 3,713 * 0,10 mg/ml = 18,57 mg/ml
- Die vorher erwähnten Protein-Kontrollproben wurden unter Verwendung des erwähnten Beckman-Hochleistungs-Kapillar-Zonen- Elektrophorese-Systems mit Detektion bei 214 nm und einem angelegten Potential von 5kV durchgeführt. Die analytischen Ergebnisse wurden nach weniger als 10 Minuten erhalten. Die Werte der integrierten Fläche (die automatisch durch die System Gold Software ermittelt werden) sind nachfolgend in Tabelle 1 dargestellt; die Proben-Bestandteil-Konzentrations- Werte, wie hergeleitet, sind nachfolgend in Tabelle 2 dargestellt.
- Die Protein-Kontrollprobe von Beispiel IV wurde auf dem vorher erwähnten Beckman Synchron CX 4 klinischen Analysator für Protein und Albumin Gesamtkonzentrationen analysiert. Die Konzentrations-Werte sind nachfolgend in Tabelle 2 dargestellt.
- Es wurden neun Patienten-Serum-Proben (1-9) gemäß dem in Beispiel IV beschriebenen Verfahren analysiert. Die Werte der integrierten Flächen sind nachfolgend in Tabelle 1 dargestellt; die Proben-Bestandteil-Konzentrations-Werte, die gemäß der vorliegenden Erfindung ermittelt wurden, sind nachfolgend in Tabelle 2 dargestellt.
- Die Patienten-Serum-Proben von Beispiel VI wurden zur Bestimmung der Protein- und Albumin-Gesamtkonzentrationen gemäß dem in Beispiel V beschriebenen Verfahren analysiert. Die Konzentrations-Werte, wie sie von dem analytischen Gerät erhalten wurden, sind nachfolgend in Tabelle 2 dargestellt. Tabelle 1 Werte der integrierten Fläche (%)
- A = Gammaglobulin
- B = Beta 1 Lipoprotein
- C = Alpha 1 Lipoprotein
- D = Alpha 2 Makroglobulin
- E = Albumin
- F = Benzoesäure
- Die Werte für SC% und S% erhält man wie oben beschrieben aus Tabelle 1, und der ionische Spezies-Normalisierungs-Wert ist wie vorher berechnet (18,57 mg/ml). Demgemäß lassen sich die Probenbestandteil-Konzentrationen einfach berechnen, und diese sind in Tabelle 2 dargestellt. 26/1 Bestandteil-Konzentrationen (mg/ml)
- A = Gammaglobulin
- B = Beta 1 Lipoprotein
- C = Alpha 1 Lipoprotein
- D = Alpha 2 Makroglobulin
- E = Albumin (CZE)
- F = Albumin (SYNCHRON CX 4)
- G = Protein gesamt (CZE) (Summe von A bis E)
- H = Protein gesamt (SYNCHRON CX 4)
- Die Regressions-Analysen für die Vergleiche zwischen dem CZE- Analysen für Albumin und gesamtes Protein und die Synchron CX 4 ("CX4") Analysen für Albumin und gesamtes Protein sind wie folgt:
- YCZE = (1,0463 * XCX4) - 2,141
- R = 0,9603
- YCZE = (1,0864 * XCX4) - 4,138
- R = 0,8467
- Wie die oberen Ergebnisse zeigen, kann die Konzentration von klinischen Proben-Bestandteilen durch die CZE mit einer ionischen Spezies, wie sie hier beschrieben wurde, genau und schnell bestimmt werden. Weil jeder der Proben-Bestandteile definiert ist, ergibt sich weiterhin eine definitivere Analyse. D.h. für Patient #2 zeigt allein die Gesamt-Protein-Konzentration an, daß bezüglich der Protein-Kontrollprobe das Gesamt-Protein akzeptabel ist. Eine Überprüfung der Gammaglobulin-Konzentration zeigt jedoch an, daß der Wert bezüglich der Kontrollprobe erhöht ist, was möglicherweise ein Anzeichen fur einen potentiellen Krankheitszustand oder eine körperliche Verfassung ist. Demgemäß zeigen die vorstehenden Daten dem Nutzen und die Vorteile, die sich durch die CZE- Analyse von klinischen Proben unter Verwendung von wenigstens einer ionischen Spezies zur Bestimmung der Proben-Bestandteil- Konzentration ergeben.
- Obwohl der Standard und die Methoden sehr ausführlich und bezüglich bevorzugter Ausführungsformen beschrieben wurden, soll dies nicht als Einschränkung der Offenbarung oder der folgenden Ansprüche aufgefaßt werden. Die Erfindung ist nicht auf das spezielle Beckman Hochleistungs-Kapillar-Elektrophorese- System beschränkt, das beschrieben wurde. Es ist beabsichtigt, daß Modifikationen und Änderungen die im Wirkungskreis des Fachmanns liegen, in dem Schutz der folgenden Ansprüche fallen.
Claims (21)
1. Verfahren zur Quantitätsbestimmung einer
Peptid-enthaltenden Bestandteil-Spezies in einer Probe durch kapillare
Zonen-Elektrophorese mit dem folgenden Schritten:
a) Hinzufügen von wenigstens einer durch eine
anorganische Säure gebildeten ionischen Spezies zu der
Probe, um eine Mischung zu bilden, in der die ionische
Spezies und die Peptid enthaltende Bestandteil-Spezies
negativ geladen sind, wobei die ionische Spezies eine
Ladungsdichte aufweist, die größer ist als die
Ladungsdichten von jeder der Peptid enthaltenden Bestandteil-
Spezies in der Probe,
b) Anwendung der kapillaren Zonen-Elektrophorese auf
die Mischung,
c) Erfassung der ionischen Spezies und der
Peptidenthaltenden Bestandteil-Spezies in der Mischung, und
d) Normalisierung von wenigstens einer
Peptidenthaltenden Spezies bezüglich der erfaßten ionischen
Spezies, wobei der normalisierte Wert nach Schritt d)
die quantifizierte Menge der Peptid-enthaltenden
Bestandteil-Spezies in der Probe ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Ladungsdichte
der ionischen Spezies von 0,02 bis 0,001 reicht.
3. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Ladungsdichte
der ionischen Spezies von 0,01 bis 0,004 reicht.
4. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Ladungsdichte
der ionischen Spezies von 0,01 bis 0,006 reicht.
5. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die ionische Spezies
wenigstens eine negative Ladung aufweist und ein
Molekulargewicht von wenigstens ungefähr 50 hat.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die
ionische Spezies in einem wäßrigen Medium mit einem größeren
pH-Wert als ungefähr 8,00 lösbar ist.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem die
ionische Spezies ein Absorptionsvermögern bei weniger als
ungefähr 300 nm aufweist.
8. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Konzentration der
der Probe hinzugefügten ionischen Spezies bestimmt wird
durch die Multiplikation eines Verdünnungsfaktors der
Probe mit der Protein-Konzentration einer normalen
Kontrollprobe, um einen ersten Wert zu erhalten; Multiplikation
des Prozentsatzes einer gewünschten integrierten Fläche
bezüglich der ionischen Spezies mit dem ersten Wert, um
einen zweiten Wert zu erhalten; und Multiplikation des
zweiten Wertes mit einem dritten Wert, wobei der dritte
Wert durch Dividieren eines Absorptions-Wertes von
einer festgelegten Menge der ionischen Spezies, gemessen
bei einer festgelegten Wellenlänge, durch einen Absorptions-
Wert von ungefähr der gleichen festgelegten Menge der Probe,
gemessen bei ungefähr der gleichen fest-gelegten
Wellenlänge, ermittelt wird.
9. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der prozentuale Anteil
der gewünschten integrierten Fläche ein kleiner Wert als
als ungefähr 0,50 ist.
10. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der prozentuale Anteil
der gewünschten integrierten Fläche ein Wert von 0,05 bis
0,40 ist.
11. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der prozentuale Anteil
der gewünschten integrierten Fläche ungefähr 0,30 ist.
12. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Verdünnungs-Faktor
ein Wert von 0,05 bis 0,01 ist.
13. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem der Verdünnungs-Faktor
ungefähr 0,02 ist.
14. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die
Protein-Konzentration von 10 µg/ml bis 60.000 µg/ml reicht.
15. Verfahren nach Anspruch 8, bei dem die
Protein-Konzentration ungefähr 60 mg/ml beträgt.
16. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Normalisierung, von
wenigstens einer Peptid enthaltenden Bestandteil-Spezies
bestimmt wird durch die Division eines integrierten
Flächen-Wertes vorn wenigstens einer Peptid enthaltenden
Bestandteil-Spezies durch die Summe der Beträge der
integrierten Flächen der Analyse, um einen ersten Wert zu
erhalten; Division des ersten Wertes durch einen zweiten
Wert, um einen dritten Wert zu erhalten, wobei der zweite
Wert erhalten wird durch Dividieren des Wertes der
integrierten Fläche der ionischen Spezies durch die Summe
der Beträge der integrierten Flächen von der Analyse;
Multiplikation des dritten Wertes mit einem vierten Wert,
wobei der vierte Wert erhalten wird durch Dividieren
des Verdünnungs-Faktors der Probe durch dem numerischen Wert
1,0, um einen fünften Wert zu erhalten; Multiplikation
des fünften Wertes mit einem sechsten Wert, wobei der
sechste Wert erhalten wird durch Dividieren eines
Absorptions-Wertes einer festgelegten Menge der Probe,
gemessen bei einer festgelegten Wellenlänge, durch einen
Absorptions-Wert von ungefähr der gleichen festgelegten
Menge der ionischen Spezies, gemessen bei ungefähr der
gleichen festgelegten Wellenlänge; und Multiplikation
des sechsten Wertes mit der Konzentration der
ionischen Spezies in der Probe.
17. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei
dem die ionische Spezies ausgewählt ist aus: Ameisensäure,
Essigsäure, Benzo-Phosphor-Säure, Propionsäure,
Isopropionsäure, Buttersäure, Iso-Butter-Säure, Benzoesäure, Benzo-
Sulfon-Säure, Ortho-Chloro-Benzoesäure, Meta-Chloro-
Benzoesäure, Para-Chloro-Benzoesäure, Naphthyl-Sulfonsäure,
Benzo-Naphthol-Säure, Chloro-Benzo-Naphthol-Säure,
Chloro-Naphthyl-Sulfon-Säure, Tetra-Iodo-Benzo-Naphthyl-
Sulfon-Säure, und Di-Iodo-Anthracentyl-Sulfon-Säure.
18. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, bei dem die
ionische Spezies Benzoesäure ist.
19. Verfahren nach Anspruch 18, bei dem die Konzentration der
Benzoe-Säure in der Probe ungefähr 0,10 mg/ml beträgt.
20. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, bei dem die
Probe eine klinische Probe ist.
21. Verfahren nach Anspruch 20, bei dem die klinische Probe
ausgewählt ist aus: gesamtes Blut, Serum, Plasma,
Cerebrospinal-Flüssigkeit und Urin.
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