DE69632913T2

DE69632913T2 - Borat-Aufbewahrungspuffer und Probenverdünnungsmittel

Info

Publication number: DE69632913T2
Application number: DE69632913T
Authority: DE
Inventors: C. Stephen ALTER; H. Elsie KIM
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1995-09-20
Filing date: 1996-09-16
Publication date: 2005-07-21
Anticipated expiration: 2016-09-17
Also published as: AU7110796A; JPH11511563A; ATE271220T1; ES2227605T3; EP0852007B1; AU711079B2; DE69632913D1; CA2228520A1; US5753094A; EP0852007A1; WO1997011363A1; CA2228520C

Description

Die Proteinanalyse klinischer Proben, wie z. B. Vollblut, Serum, Plasma, Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit und Urin, kann für den Untersuchenden wertvolle Informationen liefern. Beispielsweise können erhöhte oder verminderte Konzentrationen bestimmter Proteinkomponenten des Serums, wie z. B. Albumin, alpha-1-Lipoprotein, alpha-2-Makroglobulin, beta-1-Lipoprotein und Immunglobuline (einschließlich gamma-Globuline) einen zugrundeliegenden Krankheitszustand oder körperlichen Zustand anzeigen.
Ein typisches Beispiel ist Albumin, das Hauptprotein des Serums. Albumin liegt üblicherweise in einer Konzentration zwischen 3,2 und 5,0 g/dl vor. Verminderte Albuminkonzentrationen können eine Nierenerkrankung anzeigen, wohingegen erhöhte Albuminkonzentrationen für eine Dehydratisierung charakteristisch sind. Ein zweites Beispiel ist eine erhöhte Konzentration an alpha-1-Lipoprotein, das einen chronischen Alkoholismus oder einen Hyperöstrogenismus z. B. aufgrund einer Schwangerschaft anzeigen kann. Ein zusätzliches Beispiel sind erhöhte Konzentrationen an beta-1-Lipoprotein, die eine erhöhte Cholesterinkonzentration anzeigen können.
Die Analyse der Menge und der Art der Immunglobuline ist besonders bei der Diagnose "monoklonaler Gammopathien" wichtig. Diese Anomalien sind durch Immunglobuline mit dem gleichen Genotyp gekennzeichnet, die durch einzelne, unregulierte B-Zell-Klone in erhöhten Konzentrationen erzeugt werden. Monoklonale Gammopathien verursachen nicht notwendigerweise klinische Störungen in einem Individuum. Eine solche Situation kann als "benigne monoklonale Gammopathie" oder "monoklonale Gammopathie mit unbestimmter Signifikanz" bezeichnet werden. Viele klinische Störungen hängen jedoch mit einer monoklonalen Gammopathie zusammen. Beispielsweise gibt es einen Zusammenhang zwischen monoklonalem IgM, d. h. einer Zunahme der Erzeugung eines IgM-Genotyps durch unregulierte B-Zell-Klone, mit der Waldenström'schen Makroglobulinämie-Krankheit. Da IgM ein relativ hohes Molekulargewicht aufweist, hängt die erhöhte Erzeugung von IgM mit einer erhöhten Viskosität des Bluts des Patienten zusammen, die als "Hyperviskosität" bezeichnet wird. Mit der Hyperviskosität gehen Symptome wie z. B. Kopfschmerzen, Benommenheit und Schwindel einher.
Ein multiples Myelom ist eine weitere klinische Störung, die mit einer monoklonalen Gammopathie zusammenhängt und die sich als Zunahme der IgG-, IgA-, IgD- oder IgE-Genotypen manifestieren kann. Darüber hinaus können die leichten kappa- oder lambda-Ketten oder die schweren gamma-, alpha, mu- oder delta-Ketten erhöht sein. Ein pathologisches Hauptmerkmal von multiplem Myelom ist eine Knochenzerstörung, d. h. eine Knochendeformität, oder akute, schmerzhafte pathologische Frakturen. Klinisch kann der Patient Knochenschmerzen, Infektionen aufgrund einer verminderten Erzeugung normaler Ig's und Anämie erleiden. 20% der Myelompatienten erzeugen Bence-Jones-Proteine, bei denen es sich um monoklonale leichte Ketten handelt. Aufgrund ihrer relativ geringen Größe werden Bence-Jones-Proteine typischerweise im Harn des Patienten ausgeschieden. Ein multiples Myelom kann auch das Nervengewebe, d. h. das Rückenmark, die Nervenwurzeln und Hirnnerven oder periphere Nerven betreffen.
Serumproteine, einschließlich Immunglobuline, können unter Verwendung elektrophoretischer Verfahren voneinander getrennt werden, typischerweise mit Gelen, die einem elektrischen Feld ausgesetzt werden. In ähnlicher Weise können auch Proteine von klinischen Proben unter Verwendung einer Kapillarzonenelektrophorese ("CZE") analysiert werden. Vgl. Beispielsweise Fu-Tai A. Chen et al., "Capillary Electrophoresis – A New Clinical Tool", Clin. Chem. 77/1, 14–19 (1991); vgl. auch die US-PS 5,120,413 .
Die CZE-Technik ermöglicht schnelle und effiziente Trennungen geladener Substanzen, einschließlich Proteine. Die Trennung der Bestandteile klinischer Proben kann in weniger als 20 min, typischerweise in weniger als 10 min erreicht werden. Im Allgemeinen umfasst die CZE das Einbringen einer flüssigen Probe in ein Kapillarröhrchen, das mit einem Elektrolytlaufpuffer gefüllt ist. Das Kapillarröhrchen hat typischerweise einen Innendurchmesser von etwa 2 bis etwa 2000 μm. Das Anlegen eines elektrischen Felds an das Röhrchen führt sowohl zu einem Ziehen der Probe durch das Röhrchen als auch zu einer Trennung der Probe in ihre Bestandteile. Folglich weist jeder der Probenbestandteile seine eigene individuelle Mobilität auf. Die Probenbestandteile mit größerer Mobilität wandern schneller durch das Kapillarröhrchen als diejenigen mit geringerer Mobilität. Als Folge davon werden die Probenbestandteile während ihrer Wanderung durch das Röhrchen in dem Kapillarröhrchen in diskrete Zonen getrennt. Ein On-Line-Detektor kann zur kontinuierlichen Überwachung der Trennung und zur Bereitstellung von Daten bezüglich der verschiedenen Bestandteile auf der Basis der diskreten Zonen verwendet werden.
Die Zusammensetzung des Laufpuffers ist ein wichtiger Faktor bei CZE-Trennungen. Insbesondere Boratverbindungen haben sich als geeignete Bestandteile von CZE-Laufpuffern erwiesen. Zusätzlich zur Bereitstellung einer niedrigen Leitfähigkeit und eines ausreichenden Puffervermögens über einen pH-Bereich von etwa 8 bis 11 können Borate stabile Komplexe mit Zuckerresten an Glycoproteinen bilden. Als Folge davon wird die elektrophoretische Mo bilität eines Glycoproteins modifiziert und dieses eluiert als Peak später als das unmodifizierte Proteingegenstück. Da die Komplexierung von Zuckerresten stark vom pH-Wert des Puffers und der Boratkonzentration abhängt, können beide Parameter zur Optimierung eines Elektrophoresepuffers eingestellt werden. Im Allgemeinen führt ein höherer pH-Wert und eine höhere Boratkonzentration zu einem höheren Anteil der komplexierten Spezies und zu einer negativeren Nettoladung. Beispiele für Borat-enthaltende Elektrophoresepuffer finden sich in der US-PS 5,120,413 .
Die Spezifität der Bindung, die bei Antikörpern und ihrem bzw. ihren als Rezeptor wirkenden antigenen Bindungspartner(n) vorliegt, wurde auch verbreitet zur Identifizierung klinisch signifikanter Proteine verwendet. Die Immunelektrophorese, die Immunfixierungselektrophorese und die Immunsubtraktionselektrophorese (IFE/s) sind Beispiele für immunologische Verfahren, die im Zusammenhang mit einem elektrophoretischen Trennschritt eingesetzt werden. Insbesondere wurde die IFE/s angepasst, um sowohl die Geschwindigkeit der Kapillarelektrophorese als auch die Spezifität immunologischer Reaktionen zu nutzen, an denen Antigene und Antikörper beteiligt sind, vgl. beispielsweise die US-PS 5,228,960 .
Während der IFE/s wird eine klinische Probe mit einem spezifischen Bindungspartner vorinkubiert, der auf einen Probenbestandteil gerichtet ist. Der spezifische Bindungspartner ist typischerweise ein nicht solubilisiertes Immunglobulin, das im Wesentlichen von der Probe entfernt werden kann. Ein Vergleich von Probenaliquots, die einer Immunsubtraktion unterworfen wurden oder nicht, wird mittels CZE-Analyse durchgeführt. Das Binden des nicht solubilisierten spezifischen Bindungspartners kann zu einer Verminderung der Konzentration eines in erhöhter Konzentration vorliegenden Probenbestandteils führen. Folglich kann mit der Immunsubtraktion die Identität des Probenbestandteils ermittelt werden. Dieses Verfahren ist besonders bei der Identifizierung und Typisierung monoklonaler Gammopathien nützlich.
Klinische Proben werden vor der Analyse mittels Kapillarelektrophorese im Allgemeinen verdünnt. Eine solche Verdünnung erleichtert unter anderem das Erreichen eines gewünschten analytischen Verhältnisses und unterstützt ferner die Nutzung der Empfindlichkeit, die mit der Kapillarelektrophoreseanalyse einhergeht. Eine unverdünnte klinische Probe, insbesondere Serum, kann eine zu große Menge an Proteinkomponenten bereitstellen, was eine Analyse schwierig macht. Wenn klinische Prüfproben direkt mit einer Kapillarelektrophorese analysiert werden, wird das Verdünnungsmittel typischerweise so ausgewählt, dass es mit dem pH-Wert und der Leitfähigkeit des Elektrophoresepuffers verträglich ist. Alternativ ist dann, wenn vor der elektrophoretischen Analyse biochemische Prozesse, wie z. B. enzymatische oder immunologische Reaktionen durchgeführt werden, im Allgemeinen ein schwach gepuffertes Kochsalzlösungsverdünnungsmittel geeignet, das die Reaktionskomponenten nicht in einer schädlichen Weise beeinflusst.
Ein vorhergehendes Screening bezüglich Serumprotein-Anomalien wird häufig durch eine Serumproteinelektrophorese (SPE) durchgeführt. Wenn eine vermutete Anomalie nachgewiesen wird, kann ein zweiter immunologischer oder enzymatischer Test für eine genauere Diagnose durchgeführt werden. Beispielsweise kann nach einer SPE-Analyse eine Immunsubtraktion (IFE/s) durchgeführt werden, wenn eine monoklonale Gammopathie vermutet wird. Darüber hinaus umfasst die IFE/s oder das enzymatische Verfahren typischerweise eine gleichzeitige Trennung des SPE-Typs für Vergleichszwecke.
Da SPE- und IFE/s-Elektropherogramme einem direkten Vergleich unterworfen werden, wäre es vorteilhaft, wenn die Puffer und Verdünnungsmittel, die zur Herstellung von Proben für die CZE-Analyse verwendet werden, im Wesentlichen gleich wären. Der ideale Aufbewahrungspuffer wäre mit den IFE/s-Anforderungen zur Aufbewahrung immunologischer Reagenzien und zur Durchführung von Immunsubtraktionsreaktionen verträglich. Darüber hinaus wäre das ideale Probenverdünnungsmittel mit dem Laufpuffer identisch, der für den CZE-Analyseschritt der SPE und IFE/s verwendet wird. Die Verwendung eines im Wesentlichen identischen Puffers/Verdünnungsmittels für die SPE und IFE/s würde dabei unterstützen, jegliche inkonsistente Ergebnisse auszuschließen, die bei den beiden Verfahren auftreten. Darüber hinaus führt die Verwendung eines einzigen Probenverdünnungsmittels/Aufbewahrungspuffers zu einer bezüglich der Kosten effektiven Vereinfachung der Lagerungs-, Herstellungs-, Verpackungs- und Dokumentationsvorgänge.
Die vorliegende Erfindung stellt zur Lösung der vorstehend genannten Probleme eine Zusammensetzung bereit, die sowohl als Aufbewahrungspuffer als auch als Probenverdünnungsmittel vor der Kapillarelektrophorese einer klinischen Probe verwendet werden kann, wodurch der Bedarf für getrennte Formulierungen wegfällt. Die Zusammensetzung umfasst: (a) Wasser, (b) eine Boratverbindung, die in einer Menge von 5 bis 150 mM vorhanden ist, (c) eine Pufferverbindung mit einem wirksamen pH-Pufferbereich von 6 bis 8 und ein pH-Modifikationsmittel, das in einer Menge vorhanden ist, die ausreichend ist, den pH der Zusammensetzung zwischen 6 und 8 einzustellen, wobei die Boratverbindung als Borsäure in einer Menge von 20 mM bis 150 mM oder als Tetraborat in einer Menge von 10 mM bis 40 mM vorhanden ist.
Der Aufbewahrungspuffer oder das Probenverdünnungsmittel der vorliegenden Erfindung unterscheidet sich wesentlich von Puffern, die im Stand der Technik verwendet werden. Die US-PS 5,120,413 beschreibt einen Kapillarelektrophorese-Laufpuffer, der Borsäure und ein Boratsalz enthält. Die US-PS 5,120,413 beschreibt die Verwendung eines Puffers zur Verdünnung von Serumproben. Eine separate Bor-enthaltende Zusammensetzung wird als Elektrolytpuffer verwendet. James P. Landers et al. (Analytical Biochemistry, Band 205, Nr. 1, 15. August 1992, Seiten 115–124) beschreiben einen Laufpuffer, der zum Aufbewahren und Verdünnen von Proben eingesetzt wird. Der Oberbegriff der beigefügten Ansprüche beruht auf der EP-A-0 494 544, die zahlreiche Puffer beschreibt, die in der Kapillarelektrophorese geeignet sind, einschließlich Elektrophorese-Laufpuffer, die 6 mM Natriumborat enthalten.
Die Pufferverbindung liegt typischerweise in einer Menge von etwa 5 bis 25 mM vor. Bevorzugte Pufferverbindungen können aus der Gruppe bestehend aus Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Natriumacetat und 2-Tris(hydroxymethyl)methylaminoethansulfonsäure (TES) ausgewählt werden. Das pH-Modifikationsmittel ist gewöhnlich Natriumhydroxid, Chlorwasserstoffsäure oder Kaliumphosphat. Die Leitfähigkeit-einstellende Verbindung liegt typischerweise in einer Menge von etwa 1 bis 150 mM vor und kann aus der Gruppe bestehend aus Natriumchlorid, Kaliumchlorid und einem Gemisch aus Natriumchlorid und Kaliumchlorid ausgewählt werden.
Die klinischen Proben, die für die elektrophoretische Analyse vorbereitet werden, können Vollblut, Plasma, Serum, Urin oder Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit sein. Probenbestandteile, die von besonderem Interesse sind, umfassen menschliche Immunglobuline, Transferrin, beta-Lipoprotein und C3-Komplement.
Der bzw. das Aufbewahrungspuffer/Probenverdünnungsmittel kann auch mindestens einen externen Marker umfassen, der entweder eine ionische oder neutral geladene Spezies sein kann, um bei der Identifizierung und/oder Quantifizierung von Peaks von Bestandteilen während der elektrophoretischen Analyse zu unterstützen. Die ionische Spezies kann aus der Gruppe bestehend aus Ameisensäure, Essigsäure, Benzophosphorsäure, Propionsäure, Isopropionsäure, Buttersäure, Isobuttersäure, Benzoesäure, Benzosulfonsäure, o-Chlorbenzoesäure, m-Chlorbenzoesäure, p-Chlorbenzoesäure, Trichlorbenzoesäure, Naphthylsulfonsäure, Benzonaphthalinsäure, Chlorbenzonaphthalinsäure, Chlornaphthylsulfonsäure, Tetraiodbenzonaphthylsulfonsäure und Diiodanthracenylsulfonsäure ausgewählt werden. Neutral geladene Spezies können Benzylalkohol, Mesityloxid, Isopropanol, Methanol, Ethanol, Ethylenglykol, Dimethylformamid (DMF), Formamid, geschützte Peptide oder geschützte Aminosäuren sein.
Wenn die Zusammensetzung für die Vorbereitung einer Kapillarelektrophorese-Immunsubtraktion verwendet wird, umfasst sie ferner mindestens einen spezifischen Bindungspartner für einen Probenbestandteil. Vorzugsweise kann der spezifische Bindungspartner im Wesentlichen aus der Zusammensetzung entfernt werden, z. B. durch Binden an nicht solubilisiertes Material. Ein anti-Mensch-Antikörper ist ein besonders geeigneter spezifischer Bindungspartner für diagnostische Zwecke, insbesondere ein anti-Mensch-Immunglobulinantikörper.
Eine bevorzugte Ausführungsform des Aufbewahrungspuffers/Verdünnungsmittels umfasst a) Wasser, b) Natriumtetraborat, das in einer Menge von etwa 10 mM vorhanden ist, c) Natriumphosphat, das in einer Menge von etwa 20 mM vorhanden ist, d) Natriumchlorid, das in einer Menge vorhanden ist, die ausreichend ist, um die Leitfähigkeit der Zusammensetzung auf etwa 7 mMho einzustellen, und e) ein pH-Modifikationsmittel, das in einer Menge vorhanden ist, die ausreichend ist, um den pH-Wert auf etwa 7 einzustellen.
Die Zusammensetzung kann eine Komponente in Testkits sein, die zur Probenvorbereitung vor der Serumproteinelektrophorese (SPE) oder der Kapillarelektrophorese-Immunsubtraktion (IFE/s) verwendet werden. Die SPE-Kits können einen ersten Behälter, der das vorstehend beschriebene Borat-enthaltende Verdünnungsmittel enthält, und einen zweiten Behälter umfassen, der die Probe(n) während der Verdünnung einbehält. Das IFE/s-Kit kann einen ersten Behälter, der ein Verdünnungsmittel ohne spezifischen Bindungspartner umfasst, und einen zweiten Behälter umfassen, der einen) Aufbewahrungspuffer/Verdünnungsmittel aufweist, der bzw. das einen spezifischen Bindungspartner umfasst.
Darüber hinaus kann die Zusammensetzung in Verfahren zur Herstellung von Proben vor der SPE und der IFE/s verwendet werden. Diese Verfahren können das Messen eines Aliquots einer klinischen Probe und das Verdünnen der Probe mit 1 bis 100 Teilen des Aufbewahrungspuffers/Verdünnungsmittels umfassen.
Diese und andere Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden mittels der nachstehenden Beschreibung, den beigefügten Ansprüchen und den beigefügten Zeichnungen näher erläutert, wobei
1A ein Elektropherogramm einer normalen Kontrollserumprobe ist, die in 150 mM Boratpuffer (37,5 mM Natriumtetraborat), pH 10,0, verdünnt worden ist, Benzylalkohol- und Trichlorbenzoesäuremarkern aufweist und mittels CZE in ihre Bestandteile getrennt worden ist;
1B ein Elektropherogramm einer normalen Kontrollserumprobe ist, die in 150 mM Boratpuffer (Borsäure), pH 7,0, verdünnt worden ist, Benzylalkohol- und Trichlorbenzoesäuremarkern aufweist und mittels CZE in ihre Bestandteile getrennt worden ist;
1C ein Elektropherogramm einer normalen Kontrollserumprobe ist, die in 20 mM Kaliumphosphat, 75 mM Natriumchloridpuffer, pH 7,0, verdünnt worden ist, Benzylalkohol- und Trichlorbenzoesäuremarkern aufweist und mittels CZE in ihre Bestandteile getrennt worden ist;
1D ein Elektropherogramm einer normalen Kontrollserumprobe ist, die in 20 mM Kaliumphosphat, 75 mM Natriumchloridpuffer, pH 10,0, verdünnt worden ist, Benzylalkohol- und Trichlorbenzoesäuremarkern aufweist und mittels CZE in ihre Bestandteile getrennt worden ist;
2A ein erstes Elektropherogramm einer normalen Kontrollserumprobe ist, die in 10 mM TES, 70 mM NaCl, pH 7,0, verdünnt worden ist, Benzylalkohol- und Trichlorbenzoesäuremarkern aufweist und mittels CZE in ihre Bestandteile getrennt worden ist;
2B ein zweites Elektropherogramm der gleichen normalen Serumkontrollprobe wie in der 2A ist, die unter identischen Bedingungen mittels CZE in ihre Bestandteile getrennt worden ist;
3 ein Elektropherogramm der gleichen normalen Serumkontrollprobe wie in den 2A und 2B ist, die in 10 mM TES, 10 mM Natriumtetraborat und 55,5 mM NaCl, pH 7,0, verdünnt und mittels CZE in ihre Bestandteile getrennt worden ist;
4A ein Elektropherogramm einer normalen Kontrollserumprobe ist, die in 20 mM Natriumphosphat, 10 mM Natriumtetraborat, 0,1% Natriumazid und 29,6% mM NaCl, pH 7,0, verdünnt und mittels CZE in ihre Bestandteile getrennt worden ist; und
4B ein zweites Elektropherogramm der gleichen normalen Serumkontrollprobe wie in der 4A ist, die unter identischen Bedingungen mittels CZE in ihre Bestandteile getrennt worden ist.
Die vorliegende Erfindung ist eine Zusammensetzung, die sich sowohl als Aufbewahrungspuffer als auch als Verdünnungsmittel für Proben und biochemische Reagenzien vor der CZE-Analyse eignet. Die Zusammensetzung umfasst Wasser, eine Boratverbindung, eine Pufferverbindung und ein pH-Modifikationsmittel, um einen physiologischen pH-Wert aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus ist eine Leitfähigkeit-einstellende Verbindung vorhanden, so dass die Leitfähigkeit der Lösung etwa den gleichen Wert hat, wie ein in Frage kommender Kapillarelektrophorese-Laufpuffer. Behälter mit Aufbewahrungspuffer/Probenverdünnungsmittel können zu einem Kit zur Durchführung einer Serumproteinelektrophorese (SPE) oder einer Immunsubtraktionsanalyse (IFE/s-Analyse) zusammengebaut werden. Darüber hinaus kann der bzw. das Aufbewahrungspuffer/Probenverdünnungsmittel in Verfahren zur Herstellung von Proben für die CZE-Analyse wie z. B. bei quantitativen Verdünnungen und enzymatischen oder immunologischen Reaktionen verwendet werden.
A. Boratverbindung
Die Zugabe einer Boratverbindung zu klinischen Proben vor der Kapillarelektrophorese führt zu einer überraschenden Verbesserung der Auflösung und Reproduzierbarkeit bei anschließenden elektrophoretischen Analysen. Die Anmelder vermuten, dass die Komplexierung von Borat mit Zuckerresten eine Rolle bei dieser unerwarteten Verbesserung spielen könnte, da viele der in klinischen Proben gefundenen Proteine Glycoproteine sind. Dies ist besonders vorteilhaft, da eine Borat-enthaltende Zusammensetzung als Aufbewahrungspuffer für biochemische Reagenzien und als Verdünnungsmittel für klinische Proben verwendet werden kann. Die daraus resultierende Verbesserung bei der elektrophoretischen Auflösung ermöglicht einen zuverlässigen Vergleich zwischen klinischen Proben vor und nach einer biochemischen Reaktion, die eine Komponente der Probe betrifft.
Die Boratverbindung ist typischerweise Borsäure oder Natriumtetraborat, die bzw. das in der Zusammensetzung in einer minimalen Konzentration von 20 mM bzw. 5 mM vorliegt. Bei niedrigeren Boratkonzentrationen wird keine Verbesserung der elektrophoretischen Auflösung festgestellt. Entsprechend wird bei Borsäure- oder Natriumtetraboratkonzentrationen von mehr als etwa 160 mM bzw. 40 mM keine weitere Verbesserung der elektrophoretischen Auflösung festgestellt. Vorzugsweise liegt die Borsäure in einer Menge zwischen etwa 30 bis 80 mM oder das Natriumtetraborat in einer Menge zwischen etwa 10 und 20 mM vor. Die am meisten bevorzugte Borsäurekonzentration ist etwa 40 mM und die am meisten bevorzugte Konzentration von Natriumtetraborat ist 10 mM. Diese Konzentrationen ergeben die am besten reproduzierbaren Serumproteinmuster während der Kapillarelektrophorese, insbesondere in der beta-Region.
B. Pufferverbindung
Gemäß der Verwendung der Zusammensetzung als Aufbewahrungspuffer für biochemische Reagenzien enthält die Lösung eine Pufferverbindung mit einem effektiven Pufferbereich von etwa 6 bis 8. Dieser pH-Bereich inaktiviert die biologische Aktivität spezifischer Bindungspartner, wie z. B. Antikörper und Antigene oder Enzyme und Substrate nicht. Darüber hinaus nutzen Testreagenzien häufig organische Bindungen zwischen einem Biomolekül und einem Festphasenmaterial, z. B. bei einem Antikörper, der mittels einer CNBr-aktivierten Bindung an Agarose gebunden ist. Diese Bindungen sind bei einem pH-Wert von etwa 7 weniger hydrolyseempfindlich.
Geeignete Pufferverbindungen umfassen Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Natriumacetat und 2-[Tris(hydroxymethyl)methyl]aminoethansulfonsäure (TES). Eine bevorzugte Pufferverbindung ist TES, die innerhalb des gewünschten pH-Bereichs ein geeignetes Puffervermögen aufweist. Die am meisten bevorzugte Pufferverbindung ist jedoch Natriumphosphat, das mit Phosphat-gepufferten Standard-Kochsalzlösungsformulierungen verträglich ist. Die Pufferverbindung liegt typischerweise in einer Menge von etwa 5 mM bis 25 mM vor. Die am meisten bevorzugte TES-Konzentration ist etwa 10 mM und die am meisten bevorzugte Natriumphosphatkonzentration ist etwa 20 mM. Der Zusammensetzung wird eine ausreichende Menge eines pH-Modifikationsmittels, wie z. B. Natriumhydroxid, Chlorwasserstoffsäure oder Kaliumphosphat zugesetzt, um den pH-Wert auf etwa 6 bis 8, vorzugsweise auf 6,5 bis 7,5 und insbesondere auf etwa pH 7 zu bringen.
C. Leitfähigkeit-einstellende Verbindung
Für die beste Auflösung der Probenbestandteile sollte die Leitfähigkeit der Zusammensetzung etwa der Leitfähigkeit des in Frage kommenden Kapillarelektrophorese-Laufpuffers entsprechen. Dadurch können potenzielle Probleme mit Peakasymmetrien oder Peakverbreiterungen vermindert werden. Diese Peakanomalien können sich entwickeln, wenn an der Grenzfläche zwischen der Probe und den Trennkammern der Kapillare ein Leitfähigkeitsgradient vorliegt.
Ein typischer Elektrophorese-Laufpuffer ist 150 mM Borat, pH 10, der eine Leitfähigkeit von etwa 7 mMho aufweist. Die Leitfähigkeit wird in der vorliegenden Erfindung auf einen Wert zwischen etwa 5 und 8 mMho, insbesondere etwa auf einen Wert von 7 mMho eingestellt. Dies kann durch Zusetzen von Natriumchlorid, Kaliumchlorid oder eines Gemischs aus Natriumchlorid und Kaliumchlorid in einer Menge bis zu etwa 150 mM erreicht werden. Ein bevorzugter Konzentrationsbereich für die Leitfähigkeit-einstellende Verbindung liegt zwischen etwa 30 und 120 mM und die am meisten bevorzugte Konzentration ist etwa 75 mM.
D. Klinische Proben und Probenbestandteile
Die klinischen Proben, die zur Analyse mittels SPE oder IFE/s vorbereitet werden, können Vollblut, Plasma, Serum, Urin oder Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit sein. Die Probenbestandteile, die getrennt werden sollen, umfassen typischerweise Serumproteine, wie z. B. Albumin, Transferrin, beta-Lipoprotein und Transferrin. Immunglobuline sind Probenbestandteile von besonderem Interesse für die Diagnose monoklonaler Gammopathien. Die Immunglobuline umfassen die gamma-, mu-, alpha-, delta- und epsilon-Klassen schwerer Ketten sowie leichte kappa- und lambda-Ketten. Wie es nachstehend detaillierter beschrieben wird, können die Probenbestandteile während der IFE/s spezifische Bindungsstellen für spezifische Bindungspartner bereitstellen, z. B. Antigene für anti-Mensch-Immunglobulinantikörper.
E. Externe Marker
Aus Gründen der Zweckmäßigkeit kann das Probenverdünnungsmittel externe Marker umfassen, die während der CZE-Analyse von den Probenbestandteilen getrennt werden können. Die externen Marker können eine ionische Spezies und/oder eine neutral geladene Spezies umfassen, die bei der Identifizierung und/oder der Quantifizierung von Probenbestandteilen unterstützt bzw. unterstützen. Eine neutral geladene Spezies weist eine Nettoladung von Null auf und wird während der CZE eine höhere relative Mobilität aufweisen als eine negativ geladene Spezies. Folglich wird die neutral geladene Spezies während der CZE vor allen anderen Elektropherogrammpeaks erscheinen. Mit "ionischer Spezies" ist eine negativ geladene Spezies gemeint, die eine Ladungsdichte aufweist, die größer ist als die Ladungsdichte jedes einzelnen Hauptbestandteils der Probe. Folglich wird die ionische Spezies während der CZE nach allen Peaks der Hauptbestandteile nachgewiesen. Verfahren zur Verwendung externer Marker zur Identifizierung und Quantifizierung von Probenbestandteilen sind in den US-PSen 5,139,630 bzw. 5,228,960 beschrieben. Die ionische Spezies kann aus der Gruppe bestehend aus Ameisensäure, Essigsäure, Benzophosphorsäure, Propionsäure, Isopropionsäure, Buttersäure, Isobuttersäure, Benzoesäure, Benzosulfonsäure, o-Chlorbenzoesäure, m-Chlorbenzoesäure, p-Chlorbenzoesäure, Naphthylsulfonsäure, Benzonaphthalinsäure, Chlorbenzonaphthalinsäure, Chlornaphthylsulfonsäure, Tetraiodbenzonaphthylsulfonsäure und Diiodanthracenylsulfonsäure ausgewählt werden. Darüber hinaus kann die neutral geladene Spezies aus der Gruppe bestehend aus Mesityloxid, Isopropanol, Methanol, Ethanol, Ethylenglykol, Dimethylformamid (DMF), Formamid, geschützten Peptiden und geschützten Aminosäuren ausgewählt werden. Die am meisten bevorzugte ionische Spezies ist 2,4,6-Trichlorbenzoesäure und die am meisten bevorzugte neutrale Spezies ist Benzylalkohol. Die Marker liegen in dem Probenverdünnungsmittel vorzugsweise in einer Menge vor, die um etwa das zweifache (2X) konzentriert ist, d. h. in einer Menge, die eine gewünschte Endkonzentration ergibt, wenn sie 1 : 2 verdünnt wird. Für Benzylalkohol ist eine 2X-Konzentration etwa 0,8 g/l, während für 2,4,6-Trichlorbenzoesäure eine 2X-Konzentration etwa 0,2 g/l ist.
F. Spezifische Bindungspartner
Ein spezifischer Bindungspartner für einen interessierenden Probenbestandteil kann in vorteilhafter Weise in die Aufbewahrungspuffer eingebracht werden. Beispiele für spezifische Bindungspartner umfassen einen Antikörper, der an ein Antigen oder ein Enzym bindet, das an ein Substrat bindet. Der spezifische Bindungspartner kann löslich oder unlöslich sein. Bezüglich des Antikörperbeispiels ist der spezifische Bindungspartner vorzugsweise unlöslich und wird eine Tendenz dahingehend zeigen, sich am Boden eines Reaktionsbehälters abzusetzen. Unlösliche spezifische Bindungspartner können durch Koppeln der spezifischen Bindungspartner an einen festen Träger gebildet werden. Die Auswahl eines festen Trägers liegt im Ermessen des Untersuchenden. Ein bevorzugter fester Träger ist jedoch Cyanogenbromid-aktivierte Sepharose^TM (Pharmacia). Anti-Mensch-Immunglobulin (mit schwerer oder leichter Kette) -Antikörper sind käuflich, z. B. von DAKO Co. Diese Antikörper können direkt an den vorstehend genannten festen Träger gekoppelt werden. Bezüglich der IgG-Probenbestandteile ist ein alternativer unlöslicher spezifischer Bindungspartner Agarosegekoppeltes Protein G (Isolab). Es ist dem Fachmann bekannt, dass das Protein G ein Zelloberllächenprotein ist, das aus Streptokokken der Gruppe G isoliert worden ist und das spezifisch an IgG aus einer Anzahl von Säugern, einschließlich Menschen, bindet. Anti-Mensch-IgG-Antikörper können jedoch mit einer im Wesentlichen äquivalenten Effizienz verwendet werden.
G. SPE-Kit
Es kann ein Serumproteinelektrophorese-Kit (SPE-Kit) hergestellt werden, das einen oder mehrere Behälter umfasst, der bzw. die mit einer bevorzugten Version des Probenverdünnungsmittels gefüllt ist bzw. sind. Beispielsweise kann ein erster Behälter mit einem Probenverdünnungsmittel, das keine externen Marker enthält, und ein zweiter Behälter mit einer Probe gefüllt werden, die externe Marker enthält. Darüber hinaus kann der Kit mindestens einen Probenaufnahmebehälter enthalten, der zur Durchführung von Verdünnungen verwendet werden kann. Der Probenaufnahmebehälter kann mehrere Kammern zur Durchführung von Mehrfachverdünnungen der gleichen Probe oder von verschiedenen Proben aufweisen.
H. IFE/s-Kit
Entsprechend kann ein Immunsubtraktionskit (IFE/s-Kit) hergestellt werden, der einen oder mehrere Behälter umfasst, der bzw. die mit dem Probenverdünnungsmittel gefüllt ist bzw. sind. Darüber hinaus kann ein weiterer Behälter mindestens einen spezifischen Bindungspartner in dem Aufbewahrungspuffer umfassen. Ein bevorzugter IFE/s-Kit weist einen ersten Behälter, der mit dem Probenverdünnungsmittel gefüllt ist, und einen zweiten Behälter auf, der mehrere Kammern aufweist, die verschiedene spezifische Bindungspartner enthalten. Beispielsweise weist ein ganz besonders bevorzugter IFE/s-Kit einen zweiten Behälter mit anti-κ-, anti-γ-, anti-IgG-, anti-IgA- und anti-IgM-Immunglobulinen in getrennten Kammern auf.
I. Herstellung
Zur Herstellung von Probenverdünnungsmitteln durch Kombinieren verschiedener Vorratslösungen kann eine Standardrezeptur verwendet werden. Die Vorratslösungen können umfassen: 100 mM NaCl; 100 mM NaCl plus 2-fach konzentrierte Marker, d. h. 0,2 g/Liter 2,4,6-Trichlorbenzoesäure (TCBA) und 0,8 g/Liter Benzylalkohol; und 100 mM-Lösungen jeder Pufferverbindung, die auf den gewünschten pH-Wert eingestellt sind. Verdünnungen mit 10 mM Pufferverbindung plus 70 mM NaCl können durch Kombinieren von 1 Teil der konzentrierten Pufferverbindung, 5 Teilen 100 mM NaCl plus Marker, 2 Teilen 100 mM NaCl allein und 2 Teilen entionisiertem H₂O hergestellt werden. Leitfähigkeitsmessungen können z. B. mit dem Leitfähigkeitsmessgerät YSI Modell 35 durchgeführt werden. Diese Standardrezeptur erzeugt Verdünnungsmittel mit einer Leitfähigkeit von etwa 5,6 mMho. Im Vergleich dazu beträgt die Leitfähigkeit des Laufpuffers etwa 7,0 mMho.
Zur Herstellung von Verdünnungsmitteln mit einer Leitfähigkeit, die der Leitfähigkeit des Laufpuffers entspricht, können Lösungen, die Natriumphosphat, Kaliumphosphat, Natriumacetat oder "gute Puffer" wie z. B. TES und verschiedene Konzentrationen an Natriumtetraborat oder Borsäure enthalten, mit unterschiedlichen Mengen an zusätzlichem NaCl ergänzt werden. Beispielsweise ergeben 10 mM NaCl eine gemessene Leitfähigkeit von etwa 0,9 mMho. Diese Verdünnungsmittel können durch Lösen von abgemessenen Mengen eines Puffersalzes und Natriumtetraborat oder Borsäure in 90 ml entionisiertem Wasser, Einstellen auf den gewünschten pH-Wert mit 1,0 M NaOH oder HCl und Einstellen des Volumens auf 100 ml hergestellt werden. Die Leitfähigkeit der Lösung wird dann gemessen und in die Gleichung [7 mMho – (Leitfähigkeit der Lösung)]/9 = Xeingesetzt, wobei X die NaCl-Menge in Millimol ist, die erforderlich ist, um die Leitfähigkeit auf die Leitfähigkeit des Laufpuffers anzuheben. Die erforderliche Menge an kristallinem NaCl wird zugesetzt und die Leitfähigkeit wird erneut gemessen. 7,0 mMho ± 0,7 wird als akzeptabel angesehen. Natriumchlorid wird nicht zugesetzt, wenn die Boratkonzentration und folglich die Leitfähigkeit größer ist als diejenige des 150 mM-Borat-Laufpuffers.
J. Anwendung
Die Zusammensetzung kann als Probenverdünnungsmittel für die SPE verwendet werden. Ein Aliquot einer klinischen Probe wird abhängig von der Probe mit 1 bis 100 Teilen des Aufbewahrungspuffers/Verdünnungsmittels gemischt. Beispielsweise beträgt die Proteinkonzentration einer Serumprobe bei einem gesunden Individuum etwa 60 mg/ml. Entsprechende Konzentrationswerte für Urin und Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit (CSF) betragen etwa 10 μg/ml bzw. liegen zwischen etwa 150 und 400 μg/ml. Bezüglich des Serums beträgt die Verdünnung typischerweise 1 Teil der Probe auf etwa 9 Teile des Verdünnungsmittels (1 : 10 = 0,1) bis zu etwa 1 : 100 (0,01). Eine Serumverdünnung von 1 : 20 ist am meisten bevorzugt. Urin- und CSF-Proben können einen Konzentrierungsvorgang und/oder eine Dialyse gegen das Probenverdünnungsmittel erfordern, um Proteinkonzentrationen zu erhalten, die etwa denjenigen der Serumproben entsprechen.
Die Zusammensetzung kann auch als Probenverdünnungsmittel und/oder Aufbewahrungspuffer in einem IFE/s-Verfahren verwendet werden, wie es in der US-PS 5,228,960 beschrieben ist, die in diese Beschreibung unter Bezugnahme einbezogen wird. Typischerweise wird eine Serumprobe 1 : 2, 1 : 7 oder 1 : 15 vorverdünnt. Ein Teil des vorverdünnten Serums wird dann mit 5 bis 100 Teilen einer Feststoffsuspension kombiniert, die im Allgemeinen als "Gelaufschlämmung" bezeichnet wird. Die Feststoffsuspension umfasst typischerweise einen unlöslichen spezifischen Bindungspartner, z. B. einen an Agarose gebundenen Antikörper, der in einem Aufbewahrungspuffer/Probenverdünnungsmittel suspendiert ist. Die Verdünnungen können so eingestellt werden, dass sie in dem Gemisch ein gewünschtes Verhältnis von Probenbestandteil zu spezifischem Bindungspartner ergeben. Das Gemisch wird inkubiert, bis sich der nicht solubilisierte spezifische Bindungspartner auf dem Boden des Reaktionsbehälters abgesetzt hat. Der "immunsubtrahierte" Überstand wird dann einer CZE-Analyse unterworfen.
K. Vorteile der Erfindung
Die vorstehend beschriebenen Versionen der vorliegenden Erfindung haben viele Vorteile. Bezüglich der Zusammensetzung umfassen diese Vorteile die bequeme Tatsache, dass zum Aufbewahren von Reagenzien, zur Durchführung biochemischer Reaktionen und zur Verdünnung von Proben vor der CZE-Analyse eine einzige Formulierung verwendet werden kann. Darüber hinaus hat das Einbeziehen von Boratverbindungen in die Formulierung den überraschenden Effekt einer Verbesserung der Auflösung von Serumproteinen durch die CZE-Analyse. Die Reproduzierbarkeit der verbesserten Trennung ermöglicht einen zuverlässigen Vergleich von Elektropherogrammen verwandter CZE-Analysen, wie z. B. SPE und IFE/s. Darüber hinaus führt die Verwendung eines gemeinsamen Puffers für diese verwandten Verfahren zu einer Wirtschaftlichkeit beim Herstellungsmaßstab von Reagenzien sowie bei zweckmäßigen Verpackungsalternativen, wie z. B. den SPE- und IFE/s-Kits.
Beispiele
Die folgenden Experimente wurden durchgeführt, um einen gemeinsamen Puffer zum Aufbewahren von Reagenzien und zum Verdünnen von Proben während SPE- und IFE/s-Verfahren zu finden. Die Kapillarelektrophoresetrennschritte während der SPE und IFE/s zeigten geringfügige Unterschiede bei der Wanderung und der Auflösung mancher Serumproteine, was einen Vergleich zwischen Verfahren schwierig macht. Der Grund für die Unterschiede lag darin, dass die Proben in verschiedene Umgebungen eingebracht worden sind. Für die SPE wurde die Probe in pH 10,0-Boratpuffer verdünnt und dann injiziert. Für die IFE/s wurde die Probe in einem Boratpuffer (pH 10,0 oder 10,2) oder einem Phosphatpuffer (pH 7,0) vorverdünnt und dann im Festphasenaufbewahrungspuffer (phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,0) weiter verdünnt. Obwohl der gleiche Laufpuffer verwendet worden ist, erzeugte das Injizieren der Probe in Puffern, die sich bezüglich der chemischen Zusammensetzung und des pH-Werts unterschieden, verschiedene Elektropherogramme. Zusätzliche Erwägungen, wie z. B. die optimale Gerätegestaltung und die Reagenzverpackung führten zu einem weiteren Impuls zum Auffinden eines gemeinsamen Puffers.
Materialien
Natriumchlorid, Natriumtetraborat (Decahydrat) und einbasiges Natriumphosphat waren Produkte von Mallinckrodt Specialty Chemicals, Paris, KY. Natriumazid war ein Produkt von BDH Laboratory Supply, Poole, England. Benzylalkohol wurde von Sigma Chemical Company und 2,4,6-Trichlorbenzoesäure von Aldrich Chemical Company erworben, beide St. Louis, MO. TES (Natriumsalz), d. h. 2-{[Tris-(hydroxymethyl)methyl]-amino}ethansulfonsäure wurde von Calbiochem, San Diego, CA, erworben.
"ICS-Verdünnungsmittel" ist ein Produkt von Beckman Instruments, Brea, CA, und besteht aus 20 mM Natriumphosphat, 75 mM Natriumchlorid, 2 mM Kaliumchlorid und 0,1% (w/v) Natriumazid, pH 7,0. Es wurde in dieser Studie als "generische" phosphatgepufferte Kochsalzlösung verwendet.
"ICS-Puffer" ist ICS-Verdünnungsmittel, das mit 4% Polyethylenglykol (PEG) ergänzt worden ist.
"ID ZONE" ist ein Serumkontrollprodukt von Beckman Instruments und enthält Polyethylenglykol als Konservierungsmittel. Dieses Material wurde für diese Studien als Serumprobe verwendet.
Die Reagenzien für die Kapillarelektrophorese umfassten: Einen Laufpuffer, der 37,5 mM Natriumtetraborat, pH 10,0, umfasste und auch als 150 mM Borat bezeichnet wird; eine Spüllösung aus 0,1 N NaOH, die zum Reinigen von Kapillaren zwischen Durchläufen verwendet wurde, und einen Festphasenaufbewahrungspuffer, der aus 20 mM Natriumphosphat, 75 mM Natriumchlorid und 0,1% (w/v) Natriumazid, pH 7,0, bestand.
In dieser Studie wurden verschiedene Formulierungen im Hinblick auf das "Probenverdünnungsmittel" getestet. Das Probenverdünnungsmittel kann das Vehikel sein, mit dem zwei externe Marker der Probe zugesetzt werden. Benzylalkohol (0,4 ml pro Liter) und 2,4,6-Trichlorbenzoesäure (0,1 g pro Liter) wurden bestimmten Testverdünnungsmitteln als externe Marker zugesetzt.
Experimentelle Verfahren
Tests wurden auf einem Prototypengerät durchgeführt, das als "CALCITE" (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA) bezeichnet wird. Dieses Gerät weist sechs parallele unbehandelte Quarzglaskapillaren auf, die jeweils Abmessungen von 25 μm × 27 cm aufweisen, wobei die Trennlänge 18 oder 20 cm beträgt. Die Außenflächen der Kapillaren waren mit Polyimid beschichtet, um die Kapillaren vor einem Bruch zu bewahren (Polymicro Technologies, Inc., Phoenix, AZ). Ein Optikmodul, das eine UV-Lichtquelle (Deuteriumlampe) und einen 214 nm-Filter sowie einen Detektor umfasste, wurde mit einer Öffnung ausgerichtet, die sich 6,5 cm entfernt von einem Kapillarröhrchenauslass befand. In jeder der Kapillaren wurde die gleiche Probe mit dem gleichen Verdünnungsmittel laufen gelassen, so dass eine Kapillaren-Kreuzvariation untersucht und aus der Analyse ausgeschlossen werden konnte.
Um Standard-SPE-Bedingungen nachzuahmen, wurde 1 Teil ID ZONE-Probe plus 9 Teile Verdünnungsmittel, d. h., eine 1 : 10-Verdünnung, mit einer Sekunde Vakuum injiziert. Die Elektrophorese wurde 5 min bei 9000 Volt durchgeführt.
Zur Simulation von Standard-IFE/s-Bedingungen wurde ein Teil ID ZONE-Probe mit einem Teil Verdünnungsmittel verdünnt. Die vorverdünnte Probe wurde dann mit 160 μl Aufbewahrungspuffer weiter verdünnt. Die vollständig verdünnte Probe wurde mit einer Sekunde Vakuum injiziert und 6 min einer Elektrophorese bei 7600 Volt unterworfen.
Die resultierenden Elektropherogramme wurden unter Verwendung des AUTO-CAP-Softwaretools, Version 2.04 (Beckman Instruments, Inc., Fullerton, CA) unnormalisiert bewertet und bezüglich der Reproduzierbarkeit und der Auflösung der verschiedenen Peaks und Schultern visuell verglichen.
Beispiel 1: Pufferverbindungen und pH-Wert
sEin Experiment wurde durchgeführt, um zu ermitteln, ob die Unterschiede bei der Peakmorphologie, die während der SPE bzw. IFE/s-Trennschritte beobachtet wurden, durch verschiedene Pufferverbindungen (Borgt gegen Phosphat) oder durch Unterschiede beim pH-Wert verursacht wurden. Die nachstehenden Pufferlösungen wurden hergestellt.

1) 150 mM Borgt, pH 7,0 (Borsäure)
2) 150 mM Borgt, pH 10,0 (37,5 mM Natriumtetraborat)
3) 20 mM zweibasiges Kaliumphosphat, pH 7,0, 75 mM Natriumchlorid
4) 20 mM zweibasiges Kaliumphosphat, pH 10,0, 75 mM Natriumchlorid

Um die Bedingungen für die IFE/s-Elektrophorese nachzuahmen, wurde ein Teil einer Serumprobe (10 μl) mit einem Teil des Probenverdünnungsmittels (10 μl) vorverdünnt. Dann wurden die vorstehend angegebenen Puffer verwendet, um 160 μl des Aufbewahrungspuffers zu ersetzen und die Probe weiter zu verdünnen. Die Elektrophorese wurde unter Verwendung von 150 mM Borgt, pH 10,0, als Laufpuffer 6 min bei 7,6 kV durchgeführt.
Wenn anstelle des Aufbewahrungspuffers 150 mM Borat verwendet wurde, wurden die Serumproteine in der beta-Region in einen schneller wandernden kleineren Peak und einen größeren langsamer wandernden Peak aufgetrennt (vgl. die 1A und 1B). Wenn darüber hinaus anstelle des Aufbewahrungspuffers ein Boratpuffer, pH 7, verwendet wurde, wurde die Auflösung der Serumproteine in der beta-Region bezogen auf das gegenwärtige SPE-Verdünnungsmittel, 150 mM Borat, pH 10 (1A), in unerwarteter Weise verbessert (vgl. die 1B). Die beiden Peaks in der beta-Region, die wahrscheinlich Komplement und Transferrin entsprechen, waren viel schärfer und gut getrennt. Im Vergleich dazu ergab ein Phosphatpuffer, entweder bei pH 7 oder 10 (1C und 1D) nur einen einzigen scharfen Peak in der beta-Region, der nicht in zwei Peaks für Komplement und Transferrin aufgelöst war. Dieses Experiment legt nahe, dass die Gegenwart von Borat in der Probe die Auflösung von Serumproteinen, insbesondere in der beta-Zone, verbessert.
Beispiel 2: Boratdosisreaktion
Diese Studie wurde mit TES-Puffer durchgeführt, um jegliche mögliche Wechselwirkung zwischen Phosphat und Borat zu vermeiden, welche die Ergebnisse beeinflussen könnte. Puffer wurden mit 10 mM TES plus der gewünschten Menge an Natriumtetraborat hergestellt, mit 6 N HCl auf pH 7,0 eingestellt und dann wurde NaCl zugesetzt, so dass eine Endleitfähigkeit erreicht wurde, die der Leitfähigkeit des Laufpuffers entsprach. Folglich nimmt mit steigender Boratkonzentration die Natriumchloridkonzentration ab. Für die höchste Boratkonzentration (40 mM Tetraborat) war die Leitfähigkeit geringfügig höher als die Leitfähigkeit des Laufpuffers ohne Zugabe von NaCl. ID ZONE wurde unter SPE-Bedingungen laufen gelassen.
Die 2A und 2B sind repräsentative Elektropherogramme, welche die aufgespaltenen und variablen beta-Regionen zeigen, die erzeugt werden; wenn TES-Puffer ohne Borat verwendet wird. Wenn der Puffer etwa 5 bis 20 mM Tetraborat enthält, vgl. z. B. die 3, erscheinen innerhalb der beta-Region zwei gut definierte Peaks. Darüber hinaus blieb die Morphologie der Peaks im Wesentlichen gleich, wenn die experimentellen Bedingungen wiederholt wurden. Bei über 20 mM Tetraborat ändert sich die Morphologie des Scans nicht stark, sondern sie scheint bei wiederholten Proben weniger reproduzierbar zu werden (nicht gezeigt). Folglich wurden die am besten reproduzierbaren Elektropherogramme der Serumproteine in der beta-Region innerhalb eines Tetraborat-Konzentrationsbereichs von etwa 5 bis etwa 20 mM erhalten.
Beispiel 3: 5 mM im Vergleich zu 10 mM Tetraborat
Probenverdünnungsmittel mit 10 mM TES als Puffersalz plus 5 oder 10 mM Borat, pH 7,0, wurden verwendet, um ID ZONE-Proben zu verdünnen. Dreißig Wiederholungen jedes Testverdünnungsmittels wurden unter SPE-Bedingungen laufen gelassen. Die Verwendung von 5 mM Tetraborat im Verdünnungsmittel ermöglichte immer noch eine signifikante Variabilität in der beta-Region (hier nicht gezeigt), und zwar vorwiegend bezüglich der Form und der Anzahl der Schultern des Hauptpeaks. Die Verwendung von 10 mM Tetraborat in dem Verdünnungsmittel ergab jedoch einen sehr gut reproduzierbaren Scan mit zwei Peaks in der beta-Region, wie es in der 3 gezeigt ist.
Beispiel 4: Ersetzen von TES durch Phosphat
Ein Probenverdünnungsmittel wurde mit 20 mM einbasigem Natriumphosphat, 10 mM Natriumtetraborat, 0,1% Natriumazid und 29,6 mM NaCl, pH 7,0, hergestellt. Die Leitfähigkeit des Verdünnungsmittels entsprach der Leitfähigkeit des Laufpuffers, d. h. etwa 7,0 mMho. Dieses Verdünnungsmittel ergab ein Elektropherogramm mit zwei gut aufgelösten Peaks in der beta-Region, das dem von 3 sehr ähnlich war. Wenn die elektrophoretische Trennung unter identischen Bedingungen wiederholt wurde, wurde im Wesentlichen das gleiche Profil erzeugt (vgl. die 4A und 4B). Daher liefert eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,0, der 10 mM Tetraborat zugesetzt worden sind, ein akzeptables und reproduzierbares Elektropherogramm.
Beispiel 5: Borsäure- und Phosphatpuffer
Die Verwendung von Borsäure in dem Probenverdünnungs/Aufbewahrungspuffer wurde ebenfalls getestet. Darüber hinaus wurden zunehmende Konzentrationen von einbasigem und/oder zweibasigem Kaliumphosphat einbezogen, um den pH-Wert auf 7,0 einzustellen und das Puffervermögen zu verbessern. Die Beibehaltung eines neutralen pH-Werts kann erforderlich sein, wenn ein Reagenz, wie z. B. ein an einen festen Träger gebundener Antikörper, gelagert wird.
Es wurden die nachstehenden Puffer hergestellt:

1) 143,4 mM Borat (Borsäure) 4,4 mM zweibasiges Kaliumphosphat
2) 150 mM Borat (Borsäure) 7,5 mM zweibasiges Kaliumphosphat 2 mM einbasiges Kaliumphosphat
3) 150 mM Borat (Borsäure) 10 mM zweibasiges Kaliumphosphat 2 mM einbasiges Kaliumphosphat
4) 150 mM Borat (Borsäure) 12,5 mM zweibasiges Kaliumphosphat 3 mM einbasiges Kaliumphosphat
5) 150 mM Borat (Borsäure) 15 mM zweibasiges Kaliumphosphat 5 mM einbasiges Kaliumphosphat

Wenn einer dieser Borsäure/Phosphat-Puffer wie im Beispiel 1 als Probenverdünnungs/Aufbewahrungspuffer eingesetzt wurde, zeigten die resultierenden Elektropherogramme zwei gut aufgelöste Peaks in der beta-Zone (nicht gezeigt). Folglich handelt es sich bei Borsäure um eine geeignete Boratquelle für den bzw. das Aufbewahrungspuffer/Probenverdünnungsmittel. Darüber hinaus verursachten die erhöhten Phosphatkonzentrationen keine signifikanten Änderungen der verbesserten Peakmorphologie, die in Gegenwart von Borat erhalten wird.
Das Puffervermögen wurde mit dem Puffervermögen von ICS-Puffer durch Untersuchen der pH-Änderungen während der Zugabe kleiner Mengen (jeweils 20 μl) 5 N NaOH (Tabelle 1) und 6 N HCl (Tabelle 2) verglichen. Als allgemeine Regel wurde das Puffervermögen bei etwa pH 7 durch Erhöhen der Phosphatkonzentrationen verbessert.
Tabelle 1: pH-Wert von Testpuffern nach der Zugabe von 5 N NaOH
Tabelle 2: pH-Wert von Testpuffern nach der Zugabe von 6 N HCl
Beispiel 6: Pufferzusätze
Die Effekte zusätzlicher Komponenten in dem Puffer aus 150 mM Borat (Borsäure), 15 mM zweibasigem Kaliumphosphat, 5 mM einbasigem Kaliumphosphat, pH 7,0, wurden untersucht. Die getesteten Komponenten und deren Konzentrationen sind nachstehend angegeben:

1) 0,40 mM und 75 mM Natriumchlorid;
2) 0,1% w/v Natriumazid; und
3) 4% Polyethylenglykol.

Das elektrophoretische Profil, das nach der Verwendung von Puffern mit den vorstehend angegebenen Komponenten als Probenverdünnungsmittel erhalten worden ist, zeigte keine signifikanten Unterschiede bei der Peakmorphologie bezüglich Elektropherogrammen, die unter Verwendung von Boratpuffern erhalten wurden, die keine zusätzlichen Komponenten enthielten.
Obwohl die vorliegende Erfindung ziemlich detailliert bezüglich bestimmter bevorzugter Versionen beschrieben worden ist, sind auch andere Versionen möglich. Beispielsweise können in dem Verdünnungsmittel/Aufbewahrungspuffer andere Pufferverbindungen mit einem effektiven Puffervermögen innerhalb eines Bereichs von etwa pH 6 bis 8 verwendet werden. Daher sollte der Schutzbereich der beigefügten Ansprüche nicht auf die vorliegende Beschreibung der bevorzugten Versionen beschränkt werden.

Claims

Zusammensetzung, welche als ein Aufbewahrungspuffer oder Probenverdünnungsmittel vor einer Kapillarelektrophorese einer klinischen Probe, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Vollblut, Plasma, Serum, Harn und Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit, verwendbar ist, umfassend: a) Wasser, b) eine Boratverbindung, welche in einer Menge von 5 bis 150 mM vorhanden ist, c) eine Pufferverbindung mit einem wirksamen pH-Pufferbereich von 6 bis 8 und ein pH-Modifikationsmittel, welches in einer Menge vorhanden ist, die ausreichend ist, den pH der Zusammensetzung zwischen 6 und 8 einzustellen, und welche dadurch gekennzeichnet ist, daß die Boratverbindung als Borsäure in einer Menge von 20 mM bis 150 mM oder als Tetraborat in einer Menge von 10 mM bis 40 mM vorhanden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche weiter eine Leitfähigkeiteinstellende Verbindung umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei Borsäure in einer Menge von 40 mM vorhanden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Pufferverbindung in einer Menge von 5 bis 25 mM vorhanden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Pufferverbindung aus der Gruppe, bestehend aus Natriumphosphat, Kaliumphosphat und 2-Tris(hydroxymethyl)methylamino-ethansulfonsäure (TES), ausgewählt ist.
Verbindung nach Anspruch 5, wobei die Pufferverbindung Natriumphosphat ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei die Pufferverbindung TES ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das Natriumphosphat in einer Menge von 20 mM vorhanden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, wobei TES in einer Menge von 10 mM vorhanden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die Leitfähigkeit-einstellende Verbindung aus der Gruppe, bestehend aus Natriumchlorid, Kaliumchlorid und einem Gemisch von Natriumchlorid und Kaliumchlorid, ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei die Leitfähigkeit-einstellende Verbindung in einer Menge von 1 bis 150 mM vorhanden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei die Leitfähigkeit-einstellende Verbindung in einer Menge von 30 bis 120 mM vorhanden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, wobei die Leitfähigkeit-einstellende Verbindung in einer Menge von 75 mM vorhanden ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, welche weiter umfaßt: (e) mindestens einen externen Marker, welcher aus der Gruppe, bestehend aus einer Ionenart und einer neutralen Ladungsart, ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei die Ionenart aus der Gruppe, bestehend aus Ameisensäure, Essigsäure, Benzophosphorsäure, Propionsäure, Isopropionsäure, Buttersäure, Isobuttersäure, Benzoesäure, Benzosulfonsäure, Orthochlorbenzoesäure, Metachlorbenzoesäure, Parachlorben zoesäure, Naphthylsulfonsäure, Benzonaphthalinsäure, Chlorbenzonaphthalinsäure, Chlornaphthylsulfonsäure, Tetraiodbenzonaphthylsulfonsäure und Diiodanthracenylsulfonsäure, ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei die neutrale Ladungsart aus der Gruppe, bestehend aus Mesityloxid, Isopropanol, Methanol, Ethanol, Ethylenglykol, Dimethylformamid (DMF), Formamid, geschützten Peptiden und geschützten Aminosäuren, ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei der mindestens eine externe Marker Benzylalkohol und 2,4,6-Trichlorbenzoesäure umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei das pH-Modifikationsmittel aus der Gruppe, bestehend aus Natriumhydroxid, Salzsäure und Kaliumphosphat, ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung zur Verwendung in der Immunsubtraktionsanalyse eines Probenbestandteils mittels Kapillarelektrophorese angepaßt ist, wobei die Zusammensetzung weiter umfaßt: mindestens einen spezifischen Bindungspartner für den Probenbestandteil.
Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei der spezifische Bindungspartner geeignet ist, im wesentlichen aus der Zusammensetzung entfernt zu werden.
Zusammensetzung nach Anspruch 20, wobei der spezifische Bindungspartner eine Substanz umfaßt, welche geeignet ist, an ein ungelöstes Material zu binden.
Zusammensetzung nach Anspruch 19, wobei der spezifische Bindungspartner einen anti-Mensch-Antikörper umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 22, wobei der spezifische Bindungspartner einen anti-Mensch-Immunglobulinantikörper umfaßt.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die Boratverbindung Natriumtetraborat ist, welches in einer Menge von 10 mM vorhanden ist, wobei die Pufferverbindung Natriumphosphat ist, welches in einer Menge von 20 mM vorhanden ist, wobei die Leitfähigkeit-einstellende Verbindung Natriumchlorid ist, welches in einer Menge vorhanden ist, die ausreichend ist, die Leitfähigkeit der Zusammensetzung auf 7 mMho einzustellen, und wobei das pH-Modifikationsmittel in einer Menge vorhanden ist, die ausreichend ist, den pH auf 7 einzustellen.
Testkit zur Herstellung von Proben für die Serumprotein-Kapillarelektrophorese, umfassend: (a) einen ersten Behälter, welcher die Zusammensetzung nach Anspruch 1 als Probenverdünnungsmittel und Aufbewahrungspuffer enthält, und (b) einen zweiten Behälter zum Einbehalten mindestens einer Probe, wobei das Probenverdünnungsmittel und der Aufbewahrungspuffer mit der Probe gemischt werden können, um die Probe vor dem Laden in ein Kapillarelektrophoresegerät zu verdünnen und aufzubewahren.
Testkit nach Anspruch 25, welcher weiter mindestens einen externen Marker, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Ionenart und einer neutralen Ladungsart, umfaßt.
Testkit nach Anspruch 25, wobei der Kit zur Herstellung von Proben für die kapillarelektrophoretische Immunsubtraktion ist, wobei der erste Behälter weiter mindestens einen externen Marker, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer Ionenart und einer neutralen Ladungsart, umfaßt, und wobei der zweite Behälter weiter mindestens einen spezifischen Bindungspartner für einen Probenbestandteil umfaßt.
Testkit nach Anspruch 27, wobei der zweite Behälter eine Vielzahl von Kammern umfaßt, wobei jede Kammer weiter einen unterschiedlichen spezifischen Bindungspartner umfaßt.
Verfahren zur Herstellung einer Probe für die Kapillarelektrophorese, welches die Schritte umfaßt: a) das Messen eines Aliquots einer klinischen Probe, wobei die Probe aus der Gruppe, bestehend aus Vollblut, Plasma, Serum, Harn und Gehirn- und Rückenmarksflüssigkeit, ausgewählt ist, und b) das Verdünnen der Probe mit 1 bis 100 Teilen der Zusammensetzung von Anspruch 1 vor dem Laden in ein Kapillarelektrophoresegerät.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei das Verfahren zur Herstellung einer Probe für die kapillarelektrophoretische Immunsubtraktion ist, und wobei das Probenverdünnungsmittel und der Aufbewahrungspuffer weiter mindestens einen spezifischen Bindungspartner für den Probenbestandteil umfassen.