DE1648999B2

DE1648999B2 - Verfahren zur immunochemischen Bestimmung von Antigenen und Antikörpern

Info

Publication number: DE1648999B2
Application number: DE19671648999
Authority: DE
Inventors: Antonius Hermanus WiIhelmus Maria Oss Schuurs (Niederlande)
Original assignee: Organon NV
Current assignee: Organon NV
Priority date: 1966-11-08
Filing date: 1967-11-08
Publication date: 1972-10-12
Also published as: BE706213A; CH512071A; DE1648999C3; FI48510C; CA937498A; GB1210819A; JPS4937241B1; FI48510B; ES346848A1; SE337494B; NL130516C; DE1648999A1; DK127200B; US3565987A

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur immunochemischen Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in einer flüssigen Probe, worin sie in geringer Konzentration enthalten oder von störenden Faktoren begleitet sind, bestehend aus folgenden Einzelstufen: Adsorbieren einer der Komponenten der immunochemischen Reaktion auf einem Träger und Umsetzen dieser Komponente oder beider Komponenten der immunochemischen Reaktion mit der zu untersuchenden Flüssigkeit.

Zum Nachweis oder der Schätzung von Antigenen oder Antikörpern gibt man bekanntlich die für die immunochemische Reaktion notwendigen Komponenten in geeigneten Volumina zusammen, worauf in dem Gemisch die Reaktion verläuft und daraus dann das Resultat abgelesen wird. So wird beispielsweise bei der Bestimmung der ABO-Blutgruppe ein Tropfen einer Suspension von Erythrocyten in einem Reagenzglas oder auf einer Glasplatte mit einem Tropfen des zu untersuchenden Serums gemischt. Nach einer Inkubation von einer Stunde bei Raumtemperatur wird die Reaktion ausgewertet.

Auf gleiche Weise wird der Gehalt an Antikörpern gegen Thyroglobulin im Serum von Patienten, die an der Hashimotoschen Krankheit leiden, mit Erythrocyten bestimmt, welche nach der Methode von S. V. Boyden, beschrieben in J. Exp. Med. 93 (1951), S. 107, mit Tannin behandelt wurden und dann mit Thyroglobulin sensibilisiert worden sind. Ein Tropfen des zu untersuchenden verdünnten Serums wird auf einer Glasplatte vermischt mit einem Tropfen sensibilisierter Erythrocyten. Das Gemisch wird 10 Minuten in Rotation gehalten, worauf das Resultat abgelesen wird.

L. W i d e beschreibt in Acta Endocrin. (1962), Suppl. 70, die Bestimmung von menschlichem chorionischem Gonadotropin (chorionic gonadotropin, HCG) mittels des Te?*es zur Haemafjglutinationsverhinderung. Urin (0,4 ml) wird in einem Röhrchen mit rundem Boden mit einem Tropfen verdünnten Antiserum und einem Tropfen einer Suspension von Erythrocyten vermischt. Das Röhrchen wird eingestellt in ein Gestell mit einem schwenkbaren Spiegel, der den Boden des Röhrchens reflektiert. Während etwa 60 bis 90 Minuten läßt man die Erythrocyten sich absetzen; sie bilden dann ein typisches Sedimentationsmuster am Boden des Röhrchens, das ausgewertet werden kann.

Ein anderes Beispiel ist die Bestimmung des Rheumafaktors nach der Methode von J. M. Singer und C. M. Plotz (Am. J. Med. 21 [1950], S. 888). 0,5 ml einer Suspension von Polystyrol-Latexteilchen (Durchmesser 0,8 μ), sensibilisiert mit menschlichem y-Globulin, wird vermischt mit dem gleichen Volumen an gegebenenfalls verdünntem Testserum. Nach Inkubation bei 56° C und dann bei 4° C wird das Röhrchen mit dem Reaktionjgemisch einige Zeit bei einer gewissen Umdrehungszahl zentrifugiert. Für das Resultat ist die Trübung der überstehenden Flüssigkeit maßgebend.

Das letzte Beispiel, nämlich der Nachweis von HCG in Urin mittels Latexteilchen, an welche das Hormon adsorbiert wird, ist beschrieben in der niederländischen Patentanmeldung 6 504 823 vom 15. April 1965. Bei diesem Test werden ein Tropfen der zu untersuchenden Flüssigkeit, ein Tropfen verdünntes Antiserum zu HCG und ein Tropfen einer Suspension des sensitivierten Latex auf einer Glasplatte vermischt. Das Resultat kann abgelesen werden, nachdem die Glasplatte einige Minuten gerüttelt wurde.

Diese Methoden liefern brauchbare Resultate, wenn das zu bestimmende Antigen (bzw. die Antikörper) in der Testflüssigkeit in ausreichender Konzentration vorhanden sind und andere Komponenten die Reaktion nicht stören. Trifft eine von diesen Bedingungen nicht zu, so versucht man gewöhnlich, die zu untersuchende Flüssigkeit einer Konzentration oder Fraktionierung zu unterwerfen.

Ein Beispiel hierfür ist die Fraktionierung der Sera von Patienten, die an rheumatoider Arthritis leiden, wobei der Rheumafaktor bestimmt wird. Eine Übersicht über diese Methoden wird gegeben von K. J. Bloch (Bull. Rheum. Dis. 9 [1959], S. 185).

J. M Dominguez und O.H.Pearson haben eine Bestimmung von Wachstumshormon in fraktionierten menschlichen Sera mit Hilfe der Reaktion zur Haemaggluünationsverhinderung beschrieben (siehe J. CHn, Endocr. Metab. 22 [1962], S. 865). Die Autoren stellen fest, daß durch die Fraktionierung die Faktoren, welche die Reaktion stören, von dem zu bestimmenden Hormon abgetrennt werden, wobei das letztere gleichzeitig konzentriert wird.

Andere Beispiele sind die Methoden der Urinkonzentration zur Bestimmung des Luteinisierungshormons (luteinizing hormone) (LH).

Neben biologischen LH-Bestimmungen in Urinextrakten wurden in den vergangenen Jahren die immunochemischen Methoden entwickelt, z. B. durch L.Wide (Acta Endocrin. [1962], Suppl. 70) und durch D. R. Mi shell (Am. J. Obst. Gyn. 95, S. 747 [1966]).

Alle von anderen Gebieten übernommenen Methoden zur Konzentration von LH haben gewisse Nachteile, von denen einer darin besteht, daß während der Behandlung der Testflüssigkeit Hormon verloren gehen kann. Ein weiterer Nachteil all dieser Verfahren besteht darin, daß zusammen mit dem Hormon auch etwa vorhandene störende Substanzen konzentriert werden. Diese Unvollkommenheiten lassen er-

hebhche Zweifel an der Genauigkeit der erhältlichen ren, vor der Bestimmung dieses Musters von den

Ergebnisse zu. Trägerteilchen abgetrennt. Der Vorteil dieser

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, Arbeitsweise geht aus dem folgenden Beispiel

ein Verfahren zu schaffen, mit dem sich Antigene und hervor:

Antikörper in flüssigen Proben auch dann sicher nach- 5 Zur Bestimmung von HCG im Serum einer

weisen lassen, wenn sie nur in geringer Konzentration schwangeren Frau werden 0,025 ml Serum mit

vorhanden sind, und mit dem sich gleichzeitig der 6 ml eines geeigneten Puffers vermischt. Zu dem

Einfluß störender Faktoren ausschalten läßt Gemisch werden 0,2 ml verdünntes Antiserum

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch ge- und 0,3 ml einer Suspension von sensibilisierten löst, daß man bei einem Verfahren der eingangs be- ίο Erythrocyten zugefügt. Nach. Inkubation des Reschriebenen Art den Träger aus dem Reaktions- aktionsgemisches werden die Erythrocyten wiegemisch abtrennt und ihn, gegebenenfalls nach vor- der isoliert und auf die oben beschriebene Weise herigem Auswaschen, in einem geeigneten flüssigen behandelt.
Medium suspendiert, worauf man dfs Sedimentationsmuster des Trägers abliest. i₅ Die Empfindlichkeit des erfindungsgemäßen Ver-

Die Abtrennung des Trägers von den übrigen Be- fahrens kann erhöht werden, wenn man in das Verstandteilen des Reaktionsgemisches hat gegenüber fahren vor der Zugabe der sensibilisierten Trägerteildem bisherigen Verfahren, bei dem das Resultat vom chen eine Inkubation der Testflüssigkeit und der Anti-Träger abgelesen werden mußte, solange dieser noch serumlösimg einschaltet. Ein Bebrüten über Nacht bei in Kontakt mit den anderen Verbindungen der Test- 20 Kühlschranktemperatur (oder von zwei Stunden bei flüssigkeit stand, folgende Vorteile: Raumtemperatur) ist ausreichend. Durch diese sogenannte Vorinkubation kann die Empfindlichkeit des Verfahrens mindestens auf das Doppelte erhöht

1. Die Erfordernisse beim Ablesen der Versuchs- werden.

ergebnisse bringen eine gewisse Begrenzung des ag Nach der immunochemischen Reaktion kann der Maximalvolumens für das Reaktionsgemisch mit Träger auf übliche Weise, beispielsweise durch Filtrasich. So ist beispielsweise bei der Schätzung von tion, von dem Reaktionsgemisch abgetrennt werden, HCG mittels der von Wide (s. oben) beschrie- jedoch wird er vorzugsweise abzentrifugiert, da hierbenen Reaktion zur Haemagglutinationsverhin- durch eine rasche und völlige Trennung zu erreichen derung das Volumen der Reaktionsflüssigkeit 30 ist. Er wird dann zweckmäßigerweise ausgewaschen begrenzt durch den Absetzprozeß der Erythrocy- und in einem kleinen Volumen Flüssigkeit resuspenten, der innerhalb einer vernünftigen Zeit beendet diert. Man läßt ihn dann in einem Röhrchen mit runsein muß. Beim Glasplattentest darf das VoIu- dem Boden sich absetzen, worauf man aus dem Sedimen des Reaktionsgemisches nur ein paar Trop- mentationsmuster das Resultat der Reaktion ablesen fen betragen, die auf der Giasplatte gehalten 35 kann.

werden können. Als Träger bei Anwendung des erfindungsgemäßen

Dagegen steht bei dem erfindungsgemäßen Ver- Verfahrens können alle Arten von bekannten Trägern

fahren für die Reaktion zwischen den verschie- dienen, jedoch sind Erythrocyten und Latexteilchen

denen Komponenten ein wesentlich größeres besonders gut geeignet.

Volumen als das zum Ablesen des Resultates 40 Das Verfahren eignet sich zum Nachweis von Antinotwendige zur Verfügung. So werden beispiels- körpern gegen verschiedene Antigene, ζ. B. von Antiweise bei der Bestimmung des LH, das im Urin körpern gegen pathogene Bakterien, wie sie im Urin meist in geringen Konzentrationen auftritt, 6 ml in geringen Konzentrationen zu finden sind. Es ist Urin vermischt mit 0,2 ml verdünntem Antiserum nunmehr auch möglich, Antigene und Antikörper zu HCG, das immunochemisch eine »Überkreuz- 45 nachzuweisen, die im Serum in so niedrigen Konzen-Reaktion« mit dem LH eingeht, und 0,2 ml an trationen vorkommen, daß sie sich bisher der Bestimmit HCG sensibilisierten Erythrocyten. Die Re- mung in verdünnten Sera entzogen haben, wobei jeaktion zwischen Antigen und Antikörper verläuft doch die Verdünnung notwendig ist, um eine Störung während einer dem Vermischen der Reagenzien bei der Agglulinierung zu verhindern,
folgenden Inkubation. Die Erythrocyten werden 5° Die folgenden Beispiele dienen der Erläuterung des dann, vorzugsweise durch Zentrifugieren, von erfindungsgemäßen Verfahrens,
dem übrigen Teil des Reaktionsgemisches abgetrennt, gegebenenfalls in 0,5 ml eines geeigneten Puffers suspendiert und in ein Röhrchen mit Beispiel 1
einem vollkommen regelmäßigen runden Boden 55 Bestimmung von
überführt. Man läßt nun die Suspension ein bis menschlichem chorionischem Gonadotropin
zwei Stunden stehen, worauf man das Sedimen- (chorionic gonadotropin) (HCG)
tationsmuster ablesen kann (s. L. Wide, Acta

Endocrin. [1962], Suppl. 70). Während mit der Es wird ein Phosphatpuffer mit einem pH-Wert ursprünglichen Methode etwa hundert Einheiten 60 von 7 und folgender Zusammensetzung hergestellt:

HCG je Liter bestimmt werden können, lassen Je Liter: sich mit dem erfindungsgemäßen Verfahren zehn

Einheiten (oder sogar weniger) an HCG je Liter 2 g Äthylendiamintetraacetat (EDTA)

bestimmen.

₆₅ 2 g Na₂HPO₄

2. Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden 0 72 e KH PO
die Verunreinigungen der Testflüssigkeit, die »624
unter Umständen das Sedimentationsmuster stö- 1,125 g NaCl

5 ^v 6

Nach Zugabe von 0,1 °/o (Gewicht/Volumen) Rin- lumen) Erythrocyten, "snsibilisiert mit HCG, werden

derserumalbumin zu dem Puffer werden damit eine einer Inkubation von 30 Minuten bei 37⁰C unter-

Reihe von HCG-Verdünnungen bereitet Zu 6 ml worfen. Das Gemisch wird dann zentrifugiert und die

jeder HCG-Lösung werden 0,2 ml Antiserum für Erythrocyten einmal mit O,9°/oiger Kochsalzlösung ge-

HCG hinzugefügt, die auf die gewünschte Stärke ver- 5 waschen und dann wieder in Phosphatpuffer suspen-

dünnt sind mit einem Zitratpuffer vom pH 6,5, der im diert. Die Suspension wird in eine Ampulle mit run-

Liter 9 g NaCl, 40 g Natriutrizitrat-2H,O und 0,1% dem Boden überführt. Nach zwei Stunden Stehen

Rinderserumalbumin enthält; außerdem gibt man läßt sich das Sedimentationsmuster feststellen.

0,2 ml einer l,75°/oigen (Volumen/Volumen) Suspen- Die LH-Konzentration des Urins wird ausgedrückt

sion von Erythrocyten, sensibilisiert mit HCG im io in internationalen Einheiten (I. U.) LH im Liter. Das

Phosphatpuffer, zu. Nachdem das Gemisch 30 Minu- LH kann bestimmt werden in Konzentrationen von

ten bei 37° C einer Inkubation unterworfen wurde, 251. U. LH je Liter oder höher. Durch dieses Verfah-

wird es 10 Minuten mit etwa 2000 Umdr./Min. zen- ren kann der Anstieg in der LH-Sekretion, der etwa

trifugiert. Die Erythrocyten werden mit 0,9°/oiger gleichzeitig mit der Ovulation stattfindet, bestimmt

Kochsalzlösung gewaschen, worauf sie in Phosphat- 15 werden, ohne daß der Urin konzentriert werden muß. puffer aufgenommen und zu einem Gesamtvolumen
von 0,5 ml resuspendiert werden. Die Suspension wird

in eine Ampulle mit rundem Boden überführt. Nach B eispiel 4

2 Stunden kann man das Sedimentationsmuster fest- Bestimmung von Luteinisierungshormon (LH)

stellen. Durch diese Methode können noch 10 inter- *o ^ ^. _{γοη sterilen p}£_ienten , nationale Einheiten HCG je Liter bestimmt werden.

Die Empfindlichkeit der im Beispiel 3 beschriebenen Bestimmung kann erhöht werden durch Inku- j

Beispiel 2 bation der Testflüssigkeit mit Antiserumlösung vor

Bestimmung von menschlichem Wachstumshormon ^a5 Zugabe der Suspension von sensibilisierten Erythro-

CHCT-TI cyten. Diese sogenannte Vorinkubation kann über

*■ ^; Nacht zwischen 0 und 10° C stattfinden. Das Ver-

Von der Aufbereitung des Wachstumshormons fahren wird dann gemäß Beispiel 3 weitergeführt. Das

wird eine Reihe von Verdünnungen bereitet, die in LH kann in Konzentrationen von 101. U. je Liter

dem phosphatpufferhaltigen Rinderserumalbumin ge-- 3° oder höher bestimmt werden, wobei man das zweite

maß Beispiel 1 untersucht werden. (2nd) IRP-HMG (s. Beispiel 3) als Standard nimmt.

Zu 6 ml der jeweiligen Verdünnung werden 0,2 ml Diese Methode mit. ihrer hohen Empfindlichkeit kann Antiserum gegen HGH in Zitratpuffer (entsprechend benutzt werden zur Diagnose, wenn es um die EntBeispiel 1) und 0,2 ml einer Suspension von Erythro- scheidung geht, ob ein Fall von Sterilität seinen Grund cyten, sensibilisiert mit HGH (1,75% Volumen/Vo- 35 in der Hypophyse oder im Ovarium hat.
lumen) in Phosphatpuffer, hinzugefügt. Das Gemisch
wird einer 30 Minuten langen Inkubation bei 37° C

unterworfen, worauf die Erythrocyten abgetrennt,mit Beispiel 5

physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und wie- Bestimmung von menschlichem Serumalbumin (HSA)

der in Phosphatpuffer aufgenommen und suspendiert 40

werden, so daß man ein Gesamtvolumen von 0,5 ml Gemäß Beispiel 1 wird eine Reihe von Verdünnun-

enthält. Die Suspension wird dann in eine Ampulle gen der zu untersuchenden HSA-Aufbereitung in dem

mit rundem Boden überführt und nach zwei Stunden Phosphatpuffer mit 0,1% Rinderserumalbumin her-

Stehen kann das Sedimentationsmuster abgelesen gestellt. Zu 4 ml jeder HSA-Verdünnung werden

werden. 45 0,2 ml eines sorgfältig verdünnten Kaninchen-Anti-

Die Aktivität der untersuchten Zubereitung von HSA-Serums zugefügt. Man läßt das HSA und das

Wachstumshormon betrug 1,5 U je mg. Es hatte den Antiserum während einer Inkubationszeit von 20 Slun-

Anschein, daß sich HGH noch in einer Konzentration den bei 5° C miteinander reagieren. Zu dem Reak-

von 15 m. U. oder 10 μg je Liter nachweisen und be- tionsgemisch fügt man 0,2 ml einer Suspension von

stimmen läßt. 50 Schafsblut-Erythrocyten zu, die gemäß L. W i d e,

Acta Endocrin, Supplement 70 (1962) mit Formalin

Beispiel 3 und Tannin behandelt und mit HSA sensibilisiert

Bestimmung von Luteinisierungshormon (LH) ^w°^rd£\^{n S}™\^N^ ^Z"^{gabe di{}f^r _r Erythrocytm er-

im Urin einer Frau mit normalem Menstruations- *?& ^dle Weiterbehandlung nach Beispiel 1. Ehe bei

zvklus ⁵⁵ diesem Ansatz erreichbare Empfindlichkeit betragt

^ 2,5 μg je Liter. Durch Erhöhung des Volumens der

Von dem zu untersuchenden Urin wurden folgende Testfiüssigkeit von z. B. 4 ml auf 8 ml kann man die

Verdünnungen hergestellt: unverdünnt, 1:2, 1:4, Empfindlichkeit entsprechend steigern.
1: 8 und 1:16. Die Verdünnungen wurden mit einem

Phosphatpuffer gemäß Beispiel 1 mit 0,1% Rinder- öo

serumalbumin bereitet. Außerdem wurde eine Stan- Beispiel 6

dardserie der »Second International Reference Pre- Bestimmung von menschlichem chorionischem

?o ^r^\°™ τ» ^nschhches Menopausalgonadotropin (chorionic) Gonadotropin (HCG) in Serum

(2nd IRP-HMG) im gleichen Puffer in den Konzen- ^v ' ν \ >

trationen 0, 12, 18, 25 und 35 internationale Einhei- 65 Zu dem Serum einer gesunden Frau werden 0,1, 2,

ten je Liter hergestellt. 6 ml Testflüssigkeit mit 0,2 ml 3 und 6 I. U. HCG je ml hinzugegeben und das Geeiner Verdünnung von Antiserum gegen HCG und misch auf das 240fache mit dem Phosphatpuffer aus 0.2 ml einer Suspension von 1,75% (Volumen/Vo- Beispiel 1 verdünnt. Dann werden zu 6 ml des ver-

dünnten Serums 0,2 ml einer Lösung von Antiserum in Zitratpuller (s. Beispiel 1) und 0,3 ml einer Suspension von 3,5¹Vo (Volumen/Volumen) Erythrocyten zugesetzt.

Nach einer Inkubationszeit von 30 Minuten bei 37° C wird das Gemisch zentrifugiert, worauf die Erythrocyten mit Phosphatpuffer gewaschen und schließlich in dem Puffer auf ein Volumen von 1,5 ml suspendiert werden. 0,5 ml der Suspension werden in eine Ampulle mit rundem Boden überführt. Nach zwei Stunden wird der Erfolg der Reaktion abgelesen. Auf diese Weise lassen sich 3 I. U. HCG je ml Serum nachweisen.

Beispiel 7
Verwendung eines Spezialversuchsröhrchens

Die in den Beispielen 1 bis 4 beschriebenen Nachweise werden durchgeführt in einem Röhrchen aus Glas oder Kunststoff mit vollkommen regelmäßig rundem, transparentem Boden, einem Innendurchmesser von 11 mm und einer Länge von 10 bis 11 cm; das Röhrchen muß stark genug sein, um die beim Zentrifugieren auftretenden Kräfte auszuhalten und so geformt sein, daß es leicht mit einer abnehmbaren Kappe verschlossen werden kann, so daß die gewaschenen und wieder suspendierten Erythrocyten nicht in ein anderes Gefäß überführt werden müssen.

Beispiel 8

Bestimmung von menschlichem chorionischem Gonadotropin (HCG)

mit Hilfe einer Agglutionierungs-Verhinderungsreaktion unter Verwendung von Latex

»Bacto-Latex« (Difco Laboratories, Detroit, Michigan) wird, wie in Beispiel 1 der niederländischen Patentanmeldung 6 504 823 vom 15. April 1965 beschrieben, mit HCG sensibilisiert. 2 ml des Phosphatpuffers nach Beispiel 1 mit einem Gehalt an 0,1 °/o Rinderserumalbumin, worin das HCG in Konzentrationen zwischen 20 und 200 I. U. je Liter gelöst wurde, werden vermischt mit 0,03 ml (einem Tropfen) einer Antiserumlösung in Zitratpuffer (s. Beispiel 1) und 0,03 ml (einem Tropfen) einer Latexsuspension. Das Reaktionsgemisch wird einer Inkubation von 30 Minuten bei 37° C unterworfen. Der Latex wird durch Zentrifugieren vom übrigen Reaktionsgemisch

ao abgetrennt und so viel davon in dem Phosphatpuffer mit 0,1 °/o Rinderserum suspendiert, daß das Endvolumen 0,1 ml beträgt, Die Suspension wird auf einer Glasplatte zu einer Kreisfläche von etwa 3 cm Durchmesser ausgebreitet. Die Platte wird unter

as leichtem Neigen von einer Seite zur anderen langsam in Rotation versetzt. Nach 3 Minuten stellt es sich heraus, ob ein Agglutinieren eingetreten ist oder nicht. Auf diese Weise lassen sich noch Mengen von 50 internationalen Einheiten im Liter bestimmen.

209542/348

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur immunochemischen Bestimmung von Antigenen oder Antikörpern in einer flüssigen Probe, worin sie in geringer Konzentration enthalten oder von störenden Faktoren begleitet sind, bestehend aus folgenden Einzelstufen: Adsorbieren einer der Komponenten der immunochemischen Reaktion auf einem Träger und Umsetzen dieser Komponente oder beider Komponenten der immunochemischen Reaktion mit der zu untersuchenden Flüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man den Träger aus dem Reaktionsgemisch abtrennt und ihn, gegebenenfalls nach vorherigem Auswaschen, in einem geeigneten flüssigen Medium suspendiert, worauf man das Sedimentationsmuster des Trägers abliest.