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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Beurteilung einer immunologischen Reaktion, d. h. einer Antigen-Antikörper- Reaktion, mit den Merkmalen gemäß dem Oberbegriff des Patentanspruchs 1 sowie ein Reaktionsgefäß zur Durchführung eines derartigen Verfahrens.
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Bisher war es bekannt, die Antigen-Antikörper-Reaktion zu beurteilen oder zu bestimmen durch Einbringen einer Antigen- oder Antikörperprobe und eines Antikörper- oder Antigenreagenses in ein Reaktionsgefäß mit einer geneigten Bodenfläche und durch Nachweis eines durch absinkende Teilchen auf der geneigten Bodenfläche gebildeten Musters. Wenn eine Antigen- Antikörper-Reaktion eintritt, agglutinieren die Teilchen und werden gleichmäßig auf der geneigten Bodenfläche wie Schnee abgeschieden und bilden ein Agglutinationsmuster. Im Gegensatz dazu, werden, wenn keine Antigen-Antikörper-Reaktion eintritt, die Teilchen nicht agglutiniert und rollen über die geneigte Bodenfläche in den tiefsten Teil des Reaktionsgefäßes und bilden ein nicht-Agglutinations-Muster.
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Fig. 1A zeigt eine Konstruktion einer Mikroplatte 1, die bei dem bekannten Verfahren angewandt wird. Die Mikroplatte 1 umfaßt einen transparenten plattenförmigen Träger und eine Anzahl von Reaktionsgefäßen 2, die durch Vertiefungen in einer der Hauptflächen des Trägers in Form einer Matrix gebildet sind. Jedes Reaktionsgefäß 2 besitzt eine konisch geneigte Bodenfläche 2 a, wie aus dem Querschnitt der Fig. 1B hervorgeht. Das Reaktionsgefäß 2 kann eine runde konkaven Bodenfläche 2 b besitzen wie aus Fig. 1C hervorgeht. Nach Einbringen der Probe und eines Reagenses in das Reaktionsgefäß 2, wird dieses eine vorbestimmte Zeit still stehen gelassen. Dann hat sich auf der Bodenfläche des Reaktionsgefäßes 2 das Muster entsprechend agglutinierten oder nicht-agglutinierten Teilchen durch die auf die Bodenfläche absinkenden Teilchen gebildet. Verschiedene Beispiele für derartige Teilchenmuster sind in Fig. 2 angegeben. Wenn die Antigen-Antikörper-Reaktion in dem Reaktionsgefäß 2 stattgefunden hat, sind die Teilchen agglutiniert und gleichmäßig auf der geneigten Bodenfläche abgeschieden. Wenn jedoch keine Antigen-Antikörper-Reaktion eingetreten ist, sind die Teilchen nicht-agglutiniert und rollen entlang der geneigten Bodenfläche in den niedrigsten Bereich, d. h. die Mitte der konisch nach innen geneigten Bodenfläche. Daher ist es durch Beobachtung des Teilchenmusters, das sich auf der Bodenfläche des Reaktionsgefäßes gebildet hat, möglich, zu beurteilen, ob eine Antigen-Antikörper-Reaktion eingetreten ist oder nicht. Bei den bekannten Verfahren, ist es jedoch schwierig Zwischenstufen der Agglutination zwischen einem positiven Agglutinationsmuster und einem nicht-Agglutinationsmuster, die aufgrund einer schwachen Agglutination eingetreten sind, genau nachzuweisen. Daher ist bei dem bekannten Verfahren nur möglich zu beurteilen, ob Agglutination eingetreten ist oder nicht. Bei der Untersuchung auf HB, Syphilis usw. ist es notwendig, eine Information oder Daten über den Grad der Agglutination zu erhalten, d. h. die Agglutinationskraft, außer der Beurteilung ob Agglutination eingetreten ist, oder nicht. Darüber hinaus besitzen einige Blut-Untergruppen Agglutinationskräfte, die sich voneinander nur gering unterscheiden. Daher können bei der Untersuchung von Blut-Untergruppen manchmal Fehlbeurteilungen, d. h. falsche Ergebnisse eintreten. Darüber hinaus konnten im Falle des fotoelektrischen Nachweises von Teilchenmustern solche nur geringfügig unterschiedlichen Teilchenmuster nicht genau beurteilt werden.
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Bei einem bekannten Verfahren zum Nachweis der Agglutinationskraft wird eine Probe auf das 2-, 4-, 8fache usw. nacheinander mit Hilfe eines Mikrotiters verdünnt, um eine Vielzahl verdünnter Proben mit unterschiedlichen Konzentrationen zu erhalten. Dann werden die unterschiedlich verdünnten Proben in benachbarte Reaktionsgefäße 2-1, 2-2, 2-3 . . . in der Mikroplatte 1 wie in Fig. 3 angegeben, eingebracht. Das heißt sieben verdünnte Proben einer ersten Ausgangsprobe werden in sieben benachbarte Reaktionsgefäße einer ersten Reihe A eingebracht und sieben verdünnte Proben einer zweiten Ausgangsprobe werden in sieben Reaktionsgefäße einer zweiten Reihe B eingebracht usw. Gleichzeitig werden in sieben Reaktionsgefäße einer Reihe D sieben verdünnte Proben einer Standardausgangsprobe, deren Agglutinationskraft bekannt ist, eingebracht. Nach einer vorbestimmten Zeit werden die Teilchenmuster auf den Bodenflächen der Reaktionsgefäße 2-1, 2-2 . . . 2-7 mit den Standardteilchenmustern, die sich auf der Bodenfläche der Reaktionsgefäße der Reihe D gebildet haben, verglichen. Auf diese Weise, können Werte oder Indices für die Agglutinationskraft unbekannter Proben bestimmt werden. Bei diesem Verfahren kann, selbst wenn die Agglutinationskraft verhältnismäßig gering ist, die Bestimmung genau durchgeführt werden. Das bekannte Verfahren kann, da es erforderlich ist, die unterschiedlich verdünnten Proben in die Reaktionsgefäße einzubringen, nicht wirksam durchgeführt werden. Insbesondere wird, wenn die Konzentration der verdünnten Probe nicht genau stimmt, die Genauigkeit der Beurteilung stark angegriffen und die Zuverlässigkiet nimmt ab. Darüber hinaus erfordert das Verfahren unweigerlich große Mengen an Probe und Reagens und damit werden die Kosten für die Durchführung eines solchen Verfahrens deutlich erhöht.
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Es ist daher Aufgabe der Erfindung, ein neues und geeignetes Verfahren zum Nachweis der Antigen-Antikörper-Reaktion zu entwickeln, durch das die verschiedenen Nachteile der bekannten Verfahren vermieden werden können und mit dessen Hilfe Zwischenmuster (zwischen Agglutination und nicht-Agglutination) genau abgeschätzt werden können und durch das schwache Agglutinationen zuverlässig nachgewiesen werden können.
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Diese Aufgabe wird gelöst durch das im Hauptanspruch angegebene Verfahren und die in den Unteransprüchen angegebenen Reaktionsgefäße. Bei den Zeichnungen zeigen
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Fig. 1A, 1B und 1C die Konstruktion eines Reaktionsgefäßes wie es bei einem bekannten Verfahren angewandt wird,
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Fig. 2 verschiedene Teilchenmuster, die in Reaktionsgefäßen bei dem bekannten Verfahren gebildet werden,
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Fig. 3 eine Draufsicht auf Teilchenmuster, die auf der Bodenfläche von Reaktionsgefäßen einer Mikroplatte bei einem anderen bekannten Verfahren entstehen,
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Fig. 4 einen Querschnitt, der eine Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes illustriert,
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Fig. 5A bis 5D Draufsichten auf Teilchenmuster, die bei dem erfindungsgemäßen Verfahren gebildet werden,
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Fig. 6 einen Querschnitt durch eine andere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes,
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Fig. 7A bis 7E Draufsichten auf Teilchenmuster, die in dem Reaktionsgefäß der Fig. 6 entstanden sind,
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Fig. 8 einen Querschnitt durch eine weitere Ausführungsform eines erfindungsgemäßen Reaktionsgefäßes,
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Fig. 9 eine schematische Ansicht einer Ausführungsform einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens und
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Fig. 10A bis 10F das Reaktionsgefäß und Kurven bzw. wellenförmige Signale zur Erläuterung der Arbeitsweise der Vorrichtung der Fig. 9.
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Fig. 4 ist ein Querschnitt, der eine Ausführungsform eines Reaktionsgefäßes, das bei dem erfindungsgemäßen Beurteilungsverfahren angewandt wird, zeigt. Bei dieser Ausführungsform ist eine Vielzahl von Reaktionsgefäßen 11 in einer Mikroplatte 10 vorgesehen und jedes Reaktionsgefäß besitzt eine Bodenfläche, bestehend aus drei geneigten Bereichen 12 A, 12 B und 12 C, deren Neigungswinkel R 1, R 2 und R 3 bezogen auf die Horizontale stufenweise größer werden, d. h. R 1 < R 2 < R 3. In diesen geneigten Bereichen der Bodenfläche 12 A , 12 B und 12 C ist eine Anzahl feiner Stufen oder Rillen vorgesehen, wie aus dem am rechten unteren Ende der Fig. 4 angegebenen vergrößerten Teil hervorgeht. Diese Stufen tragen mit dazu bei, eine stabile Unterlage für auf die Bodenfläche absinkende Teilchen zu bilden.
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Fig. 5A bis 5D sind Draufsichten auf Agglutinations- und nicht- Agglutinationsmuster, die auf der Bodenfläche des Reaktionsgefäßes 11, wie in Fig. 4 angegeben, entstanden sind. Die Fig. 5A bis 5C zeigen Agglutinationsmuster bei unterschiedlichen Agglutinationskräften. Das in Fig. 5A angegebene Agglutinationsmuster zeigt die stärkste Agglutinationskraft, bei der die Teilchen gleichmäßig bis auf dem äußersten Bereich 12 C der Bodenfläche mit dem größten Neigungswinkel R 3 abgeschieden sind. Bei dem in Fig. 5B gezeigten mittleren Agglutinationsmuster sind die Teilchen nicht auf dem Bereich 12 C abgeschieden sondern gleichmäßig auf den restlichen Bereichen 12 A und 12 B mit Neigungswinkel R 1 und R 2, die kleiner sind als R 3. Fig. 5C zeigt das sehr schwache Agglutinationsmuster, bei dem Teilchen gleichmäßig nur auf dem innersten Bereich 12 A der Bodenfläche abgeschieden sind, der den kleinsten Neigungswinkel R 1 besitzt. Fig. 5D zeigt das nicht-Agglutinationsmuster und nahezu alle Teilchen haben sich in dem niedrigsten Zentrum der Bodenfläche angesammelt und es hat sich kein gleichmäßig abgeschiedenes Teilchenmuster auf irgendeinem der Bereiche 12 A, 12 B und 12 C der Bodenfläche gebildet. Daher ist es erfindungsgemäß möglich, durch Nachweis, auf welchen Bereichen der Bodenfläche gleichmäßig abgeschiedene Teilchenmuster entstanden sind, die Agglutination quantitativ zu untersuchen und den Grad der Agglutinationskraft zu beurteilen.
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Fig. 6 ist ein Querschnitt, der eine andere Ausführungsform eines Reaktionsgefäßes zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens zeigt. Bei dieser Ausführungsform sind in einer Mikroplatte 20 eine Anzahl von Reaktionsgefäßen 21 gebildet, von denen jedes vier geneigte Bereiche 22 A bis 22 D der Bodenfläche und zwei ringförmige Vertiefungen bzw. Rillen 23 A und 23 B aufweist. Die Bodenbereiche 22 A und 22 C sind mit den Winkeln R 1 bzw. R 3 nach innen und die Bodenbereiche 22 B und 22 D mit den Winkeln R 2 bzw. R 4 nach außen geneigt. Die Rille 23 A liegt zwischen den Bodenbereichen 22 A und 22 B und die Rille 23 B zwischen den Bodenbereichen 22 C und 22 D. Die Neigungswinkel R 1 bis R 4 nehmen in dieser Reihenfolge stufenweise zu, d. h. R 1 < R 2 < R 3 < R 4. Es ist zu bemerken, daß die Bodenflächenbereiche 22 A bis 22 D feine Stufen oder Rillen aufweisen, so daß sie eine stabile Auflage für die Teilchen bilden.
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Die Fig. 7A bis 7E zeigen agglutinierte und nicht-agglutinierte Teilchenmuster, die auf dem Boden der Oberfläche des Reaktionsgefäßes 21 wie in Fig. 6 gezeigt, entstanden sind. Die Fig. 7A bis 7D zeigen Agglutinationsmuster mit unterschiedlichen Agglutinationskräften, die bei den aufeinanderfolgenden Figuren abnehmen. Fig. 7E zeigt das nicht-Agglutinationsmuster, bei dem nahezu alle Teilchen über die geneigten Bodenflächenbereiche 22 A bis 22 D in die Rillen 23 A und 23 B rollen, so daß kein gleichmäßig abgeschiedenes Teilchenmuster auf einem der Bodenbereiche 22 A bis 22 D entsteht. Bei dieser Ausführungsform fallen, selbst wenn Agglutinationsmuster entstehen, einige Teilchen in die Rillen 23 A und 23 B, so daß die Rillen deutlich sichtbar werden. Daher kann das Teilchenmuster mit dem bloßen Auge positiv beurteilt werden. Besonders im Falle des fotoelektrischen Nachweises des Teilchenmusters können die Muster auf den Bodenflächenbereichen 22 A bis 22 D leicht und genau voneinander unterschieden werden und daher kann die Beurteilung genau durchgeführt werden.
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Fig. 8 ist ein Querschnitt der eine weitere Ausführungsform eines Reaktiongefäßes zur Anwendung bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zeigt. Bei der in Fig. 6 angegebenen Ausführungsform ist in jedem Reatkionsgefäß eine Mehrzahl von Bodenbereichen angeordnet, deren Neigungswinkel sich voneinander stufenweise unterscheiden. Bei dieser Ausführungsform (der Fig. 8) sind diese Bodenbereiche in unterschiedlichen Reaktionsgefäßen vorgesehen. Das heißt in einer Mikroplatte 31 sind mehrere Reaktionsgefäße 32 A, 32 B, 32 C und 32 D mit unterschiedlich geneigten Bodenflächen 33 A, 33 B, 33 C bzw. 33 D vorgesehen, wobei der Neigungswinkel R 1, R 2, R 3 und R 4 dieser Bodenflächen, bezogen auf die Horizontale, nach und nach stufenweise zunehmen. In diese Reaktionsgefäße 32 A bis 32 D werden bestimmte Mengen von Probe und Reagens gegeben. Es ist zu bemerken, daß die in diese Reaktionsgefäße gegebenen Proben die gleiche Konzentration aufweisen. Daher kann das Einbringen der Probe sehr einfach durchgeführt werden und es entsteht kein Meßfehler aufgrund möglicher Änderungen in der Konzentration, verglichen mit dem bekannten Verfahren, wie es in Bezug auf Fig. 3 beschrieben worden ist.
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Fig. 9 ist ein schematisches Diagramm einer Ausführungsform einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Beurteilungsverfahrens, bei dem das in Fig. 6 gezeigte Reaktionsgefäß angewandt wird. Die Mikroplatte 20 mit einer Anzahl von Reaktionsgefäßen 21 wird nach und nach durch eine fotoelektrische Nachweisstelle transportiert, mit Hilfe eines geeigneten Transportmechanismus wie einer Transportrolle oder einem Transportband. In der fotoelektrischen Nachweisstellung ist eine Lichtquelle 42 und ein fotoelektrischer Detektor 43 über bzw. unter der Mikroplatte 20 vorgesehen. Mit Hilfe der Lichtquelle 42 und des fotoelektrischen Detektors 43 wird das auf der Bodenfläche des Reaktionsgefäßes 21 gebildete Teilchenmuster fotoelektrisch nachgewiesen. Ein Austrittssignal aus dem Detektor 43 wird durch einen Verstärker 44 verstärkt und dann einem Proben- und Aufnahmekreis 45 zugeführt, indem aus dem Eintrittsnachweissignal dem Muster entsprechende Signale abgeleitet werden, die die auf den jeweiligen geneigten Bodenbereichen 22 A bis 22 D gebildeten Teilchenmuster darstellen, mit Hilfe von Signalen entsprechend den Rillen 23 A und 23 B. Dann werden die so gewonnenen Signale des Musters nacheinander zu einem Gleichheitsprüfer 46 geleitet und mit einem Grenzwert verglichen, der durch eine Vergleichs-Gleichstrom-Spannungsquelle 46 A gegeben ist. Der Gleichheitsprüfer 46 erzeugt Austrittssignale, die Agglutination oder nicht-Agglutination anzeigen. Diese Signale können logische "1" oder "0" Signale sein.
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Die genaue Konstruktion und Arbeitsweise des Proben- und Haltestromkreises 45 und des Gleichheitsprüfers 46 wird auch in bezug auf Fig. 10A bis 10F erläutert. Fig. 10A zeigt einen Querschnitt einer linken Hälfte des Reaktionsgefäßes 21 und Fig. 10B eine Wellenform des Nachweissignals, das aus dem Verstärker 44 kommt. Wie in Fig. 10A angegeben, sind die Muster von gleichmäßig abgeschiedenen Teilchen nur auf den Bodenbereichen 22 A und 22 B entstanden. Das heißt dieses Muster entspricht dem in Fig. 7C angegebenen Zwischen-Muster. Der Proben- und Haltestromkreis umfaßt einen Kantendetektor 45 A zum Nachweis der steilen Kanten (Stufen) des in Fig. 10B gezeigten Nachweissignals zur Bildung eines in Fig. 10C angegebenen Kantensignals. Das so nachgewiesene Kantensignal wird in einen Probenpulsgenerator 45 B geleitet, um den in Fig. 10D angegebenen Probenpuls zu erzeugen. Der Probenpuls besitzt eine solche zeitliche Anordnung, daß das Nachweissignal zu geeigneten Zeiten aufgenommen werden kann. Der Probenpuls wird auf einen Probenstromkreis 45 C geführt, um das Eintrittssignal aufzunehmen unter Bildung eines Probensignals, das dann in dem Haltestromkreis 45 D gespeichert wird. Fig. 10E zeigt ein Austrittssignal des Haltestromkreises 45 D, das die Mustersignale bildet. Dann ist es durch Vergleich dieser Mustersignale mit dem Grenzwert V TH in dem Gleichheitsprüfer 46 möglich, die Agglutination logisch ("1") und die nicht-Agglutination logisch ("0") wie in Fig. 10F angegeben genau nachzuweisen.
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Das Signal, das Agglutination und nicht-Agglutination anzeigt, wird in einen Beurteilungs- bzw. Auswertungsstromkreis 47 geleitet. In diesem Stromkreis 47 ist ein Paar von Speichern 47 A und 47 B vorgesehen, in denen jeweils die Mustersignale für die Bodenbereiche 23 A und 23 D gespeichert werden können. Zunächst werden Standardteilchenmuster gebildet unter Verwendung verschiedener Standardproben mit bekannten Agglutinationskräften. Dann werden die Mustersignale von den Bodenflächenbereichen 23 A bis 23 Dabgeleitet und in dem Speicher 47 A gespeichert. Dann wird eine zu untersuchende Probe zusammen mit einem Reagens in das Reaktionsgefäß eingebracht und auf den Bereichen 22 A bis 22 D gebildete Teilchenmuster nachgewiesen und in dem Speicher 47 B gespeichert. In dem Beurteilungsstromkreis 47 wird die Agglutinationskraft der Probe abgeleitet durch Vergleich der in den Speichern 47 A und 47 B gespeicherten Mustersignale. Die so abgeleitete Agglutinationskraft wird in eine Anzeigevorrichtung 48 eingegeben.
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Das erfindungsgemäße Verfahren ist nicht auf die hier gezeigten Ausführungsformen beschränkt. Zum Beispiel kann es mit Hilfe einer anderen Vorrichtung als der in Fig. 9 angegebenen durchgeführt werden. Außerdem können die auf den geneigten Bodenbereichen entstandenen Muster mit dem bloßen Auge beurteilt werden. Bei den oben angegebenen Ausführungsformen sind die Reaktionsgefäße in Mikroplatten angeordnet. Sie können jedoch auch die Form einzelner Behälter aufweisen.
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Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Probe mit einer vorgegebenen konstanten Konzentration und Reagens in das Reaktionsgefäß mit einer Vielzahl von geneigten Bodenbereichen gegeben, deren Neigungswinkel voneinander verschieden sind und die auf diesen Bodenbereichen entstandenen Teilchenmuster getrennt untersucht, wobei kein Meßfehler auftritt aufgrund einer möglichen Variation der Konzentration der Probe und daher eine genaue Beurteilung möglich ist. Da ferner die Neigungswinkel der Bodenbereiche nach und nach stufenweise zunehmen, können Zwischenmuster klar voneinander unterschieden werden und die Bestimmung kann so genau durchgeführt werden. Daher kann die Agglutinationskraft genau nachgewiesen werden und die schwache Agglutination auch klar beurteilt werden. Darüber hinaus können bei der Untersuchung von Proben mit Hilfe von Reaktionsgefäßen mit geneigten Bodenflächenbereichen wie in Fig. 4 und 6 angegeben, die Mengen an Probe und Reagens und damit die Kosten verringert werden.