FI56905C - Foerfarande och anordning foer automatisk maetning av agglutinationsprov t ex i spektrofotometer adsoptionsfotometer fluorometer eller nefelometer - Google Patents

Description

- ----- Γβ, KU ULUTUSJULKAISU ,. Λ Λ _ [B] (11) UTLÄGGNINCSSKRIFT 5 6905

Patent aedielat ^ v ^ (51) Kv.ik.*/Int.ci.« G 01 N 35/16 SUOMI—FINLAND (21) Pttcnttlhtkemu· — Pstwittradknlng 78007 0 (22) Htk«mltp*lvi — Antekningtdtf 2d.02.78 (Cl) ' ' ' ' (23) Alkupilvi—Gikl|h«ttda( 28.02.78 (41) Tullut luikituksi — Bllvlt offuntllg 29.08.79

Patentteja rekisterihallitut ............. , .

' (44) Nlhtivikslpanon ja kuuLJulkalaun pvm. —

Patent- oeh registorstyrelsen ' Ansttkan utlafd och utUkriftan publkund 31.12.79 (32)(33)(31) Pyydetty «tuoikeus—Bagtrd prioiitet (71)(72) Osmo Suovaniemi, Armas Lindgrenintie 15 A, 00570 Helsinki 57>

Suomi-Finland(FI) (7^) Ruska & Co.

(5M Menetelmä ja laite agglutinaatiokokeiden tulosten mittaamiseksi automaattisesti esimerkiksi spektrofotometrissä, adsorptiofotometrissä, fluorometrissä tai nefelometrissä - Förfarande och anordning för au-tomatisk mätning av agglutinationsprov t.ex. i spektrofotometer, ad-sorptionsfotometer, fluorometer eller nefelometer Tämän keksinnön kohteena on menetelmä ja laite agglutinaatiokokei-den tulosten mittaamiseksi automaattisesti esimerkiksi spektrofotometrissä, adsorptiofotometrissä, fluorometrissä tai nefelometrissä, jolloin agglutinaatiokokeiden näytteitä inkuboidaan reaktioas-tioissa, kuten kyveteissä tai kyvetistössä näytteiden inaktivoimi-seksi ennen mittausta.

Joidenkin esim. bakteereiden, viruksien, sienien tai niiden vasta-aineiden ja antigeeniosien sekä joidenkin epänormaalien proteiinien osoittamiseen käytetään erilaisia agglutinaatiokokeita. Näistä kokeista mainittakoon HA-koe (hemagglutination test), HAI-koe (hemagglutination inhibition test), IHA-koe (indirect hemagglutination test), kylmä agglutiniini-koe (cold agglutinins test) ja LA-koe (Latex agglutination test).

2 56905

Em. kokeita käytetään serologisessa identifikaatiossa (serologic identification), serotyyppauksessa (serotyping) ja serodiagnostii-kassa (serodiagnesis). Esim. epidemiatutkimuksissa tai -luokitteluissa em. kokeet ovat hyvin käyttökelpoisia.

IHAI-koe soveltuu myös raskauden toteamiseen osoittamalla HCG (human chorionic gonadotropin) -hormonin erittyminen virtsaan.

Edelleen esim. HAI-koetta käytetään veriryhmämäärityksissä.

Riippuen käytetystä kokeesta agglutinaatio voi merkitä joko positiivista tai negatiivista tulosta. Esim. hemagglutinaatio voidaan todeta reaktioastian pohjalla diffuusina peitteenä. Esim. HA-ko-keessa tietyillä viruksilla ja bakteereilla on kyky saostaa punasoluja tietyissä olosuhteissa reaktioastian pohjalle laajalle alueelle. Jos hemagglutinaatiota ei tapahdu, punasolut kerääntyvät reaktioastiassa tavallisesti selvärajaiseksi alueeksi tai napiksi .

Agglutinaatiokokeiden tulokset on luettu silmämääräisesti. Eri kokeissa perusteet tulosten tulkinnassa vaihtelevat. Kun tulokset luetaan silmämääräisesti, tulee mukaan runsaasti erilaisia virhe-tekijöitä. Eri henkilöt näkevät eri tavalla, silmä väsyy helposti ja tulokset saattavat muuttua, inhimilliset virhetekijät ovat suuret tulosten tulkinnassa ja tulostamisessa jne. Agglutinaatio-kokeisiin voidaan liittää myös tietty väri-indikaattori, jonka tulkinta silmämääräisesti joko negatiivisessa tai positiivisessa j kokeessa on työlästä. Jos kokeisiin liitetään fluoresoiva aine, 1 saavutetaan monia etuja mitattaessa koetulokset fluorometrisesti. Joidenkin koetulosten mittaaminen nefelometrisesti lisää mahdollisuuksia ja etuja. Jo edellä esitetystä on helppo ymmärtää, että tulosten silmämääräinen tulkinta on rajoittavaa ja epäluotettavaa.

Tämäntapaiset kokeet ovat runsaasti käytettyjä eri alueilla. Usein on kyse myös massoittain tehtävistä kokeista, kuten syfilis- ja reumakokeet, veriryhmämääritykset ja raskauden toteaminen. Tällöin kokeiden suorittaminen tulee olla mm. yksinkertaista, automatisoitua, tarkkaa ja luotettavasti toistettavissa olevaa.

3 56905

Toistaiseksi ei ole olemassa mitään yksinkertaista ja luotettavaa automatisoitua tapaa tehdä em. kokeita. On saatavissa hyvin monimutkainen ja kallis laitteisto (Groupamatic, n. 1,5 milj. Smk) esim. veriryhmämäärityksiin. Se, että ei ole kyetty konstruoimaan yksinkertaista, kohtuuhintaista ja automaattista mittalaitetta eri tyyppisiä agglutinaatiokokeita varten, johtuu mm. siitä, että ei ole keksitty automaatioon soveltuvia menetelmiä.

Keksinnölle tunnusomaiset seikat käyvät selville patenttivaatimuksista.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä ja laite tekevät mahdolliseksi mitata mm. spektrofotometrissä, adsorptiofotometrissä, fluoromet-rissä ja nefelometrissä erilaisten agglutinaatiokokeiden tulokset siten, että agglutinaatio muodostuu reaktioastiaan siihen kohtaan, josta mittaussäde kulkee siten, että mittaussäde ei kohtaa ei-agglutinoituneita partikkeleita silloin, kun agglutinaatiota ei ole tapahtunut.

Keksintö käy lähemmin selville seuraavasta selityksestä ja oheisista piirustuksista, joissa kuva 1 esittää sovellutusesimerkkiin liittyen erästä kyvetistöön pipetoitua seerumlaimennusta, kuva 2 esittää kyvetistön 'kallistettua sijoitusasentoa inkuboinnin aikana, kuva 3 esittää kyvetistöä näytteineen ylhäältä katsottuna erään kokeen yhteydessä, kuvat 4 ja 5 esittävät keksinnön mukaisen menetelmän suoritusta kyvettiä kallistamalla pysty- ja vaakamittauksen yhteydessä, kuva 6 esittää erästä keksinnön mukaista laitetta menetelmän suorittamiseksi ja kuviot 7_9 esittävät vaihtoehtoisia suoritusmuotoja kuvion 6 lait-* teelle.

„ 56905

Seuraavassa on kuvattu eräs tämän keksinnön mukaisen menetelmän sovellutusesimerkki .

Waaler-Rose määritys FP-9 analysointilaitteistolla Periaate

Rheumatekijä (RP = rheumatoid factor) on IgM luokkaan kuuluva IgG autovasta-aine. RF reagoi ihmisestä peräisin olevan IgG:n kanssa.

Reagenssit Käyttöreagenssi sisältää: 1. Amboseptori (kanin seerumi) laimennettuna 1:1000 0,9 %

NaCl:lla. Kanin seerumi inaktivoidaan ennen käyttöä inkuboi-malla sitä + 56°C:ssa 30 minuuttia 2. 0,9 % NaCl 3. Ihmisen 0Rh+ -ryhmän punasoluja, jotka on pesty 5-6 kertaa 0,9 % NaCl:11a.

Normaali seerumipooli.

Valmistetaan kaksi perusliuosta:

Liuos A: 13.5 ml 0,9 % NaCl 1,2 ml normaalia seerumipoolia 0,15 ml pestyjä ihmisen 0Rh+ punasoluja (1-2 % suspensio 0,9 % NaCl:s'sa). Sekoitetaan hellävaraisesti.

Liuos B: 9.5 ml 0,9 % NaCl 0,5 ml 1:1000 laimennettua amboseptoria Käyttöliuos 10 ml:aan liuosta B lisätään 10 ml liuosta A. Annetaan seistä 10-15 minuuttia huoneenlämmössä, jolloin amboseptori tarttuu punasolujen pintaan. Liuos on sen jälkeen käyttövalmis. Suoritus 1. Potilasnäytteet inaktivoidaan inkuboimalla niitä +56°C:ssa 30 minuuttia.

2. Kustakin näytteestä tehdään yhdeksän laimennusta koeputkistoon. Laimentimena käytetään 0,9 % NaCl:a, 3. 0,2 ml kutakin seerumilaimennusta pipetoidaan kyvetistöön kuvion 1 esityksen mukaisesti.

5 56905 4. Lisätään 0,2 ml käyttöliuosta.

5. Kyvetistöjä inkuboidaan +4°C:ssa vähintään 4 tuntia kyvetistö-jen ollessa n. 45° kulmassa (kuva 2). Inkubointia voidaan jatkaa yli yön.

6. Tulokset luetaan FP-9 fotometrissä. Kyvetistöstä mitataan ab-sorbanssit tislattua vettä vastaan aallonpituudella 600 nm.

Agglutinoituneet punasolut peittävät kyvetin pohjan ja antavat absorbanssin, jonka suuruus riippuu solukerroksen paksuudesta. Jos reumatekijä puuttuu seerumista agglutinaatiota ei tapahdu, ja punasolut putoavat vapaasti asettuen vinosta inkubointiasen-nosta johtuen kapeana rintamana kyvetin pohjan toiselle reunalle .

Esimerkki: Kuvassa 3 esitetty kyvetistö antoi mitattaessa seuraa- vat absorbanssit.

ABS.

1. 0.571 2. 0.603 3. 0.623 4. 0.603 5. 0.465 6. 0.222 7. 0.141 8. 0.059 9. 0.048

Kyvetti 7 On viimeinen, missä absorbanssi on yli perustason (kyve-tit 8 ja 9). Kyvetissä 7 on laimennus 1:2048. Täten tässä tapauksessa RF tiitteri on 2000.

FP-9 analysointisysteemillä saadut tulokset Waaler-Rose määrityksestä korreloivat hyvin Mikrotiter-välineistöllä saatujen tulosten kanssa, kun käytetään samoja reagensseja ja inkubointiolosuhteita.

Tulosten tulkinta

Titrauksen loppupiste on laimennuksen käänteisarvo viimeisessä kyvetissä, joka antaa perustasoa (kirkas liuos) korkeamman absorbanssin (agglutinaatio).

6 56905

Em. sovellutusesimerkissä agglutinaatio on mitattu käyttämällä FP-9 — R

-systeemin (The Finnpipette Analyzer System) pystymittausperiaa-tetta. Agglutinaatio on muodostunut, kun reaktion on annettu tapahtua kallistetussa kyvetistöblokissa ennen mittausta sen kyvetin pohjiin, joiden kautta mittaussäteet kulkevat. Tässä tapauksessa kyvetistöblokkia on sopivimpaa kallistaa 15---60°.

Jos mittaussäde kulkee kyvetin pituusakselia kohtisuoraan, ts. mitataan vaakasuoralla mittaussäteellä, kyvettejä tulee kallistaa enemmän kuin edellisessä tapauksessa. Tällöin kyvetin seinämään eli siihen kohtaan, jonka kautta mittaussäde kulkee, syntyy agglutinaatio. Sopivin kallistuskulma on alle 90°. Agglutinaatioreak-tion jälkeen kyvetti tai kyvetit käännetään pystyasentoon, jolloin niissä reaktioissa, joissa ei ole tapahtunut agglutinaatiota, punasolut tai jotkut muut agglutinoitavat partikkelit kulkeutuvat kyvetin pohjalle täydellisemmin. Tällöin optinen ikkuna, jonka kautta mittaussäde kulkee, jää vapaaksi ei-agglutinoituneista partikkeleista.

Siihen kohtaan kyvettiä, jossa mitataan syntynyt agglutinaatio, voidaan liittää myös spesifisiä antigeenejä tai antibodeja agglu-tinaatiokompleksille, jolloin agglutinaatiokompleksi kiinnittyy näiden antigeenien tai antibodien välityksellä lujemmin kyvetin seinämään tai pohjaan. Tällöin on tarvittaessa helppo pestä pois kyvetistä vapaat punasolut tai muut partikkelit siten, että agglu-tinoitunut kompleksi ei lähde pesussa irti.

Edelleen agglutinaatiokompleksiin voidaan liittää jokin väri- tai fluoresoiva aine tai jokin muu mitattavissa oleva aine, jolloin voidaan lisätä mittaustekniikan erottelukykyä.

Kyvetti voidaan rakentaa myös niin, että sen pohja on sopivasti tietyssä kulmassa. Tällöin kyvetti voidaan säilyttää pystyasennossa, koska pohjassa on haluttu kallistuskulma.

Mittalaite voidaan rakentaa myös siten, että mittaussäteelle on rajain siinä kohdassa, johon agglutinoitumattomat partikkelit kasautuvat .

7 S6905

Seuraavissa kuvissa 4-9 on esitetty keksinnön mukaisesta menetelmästä joitakin sovellutusesimerkkejä reaktioastioista, joissa agglutinaatioreaktiot voidaan mitata. Mitta-astiat ovat erillisiä kyvettejä tai ne voidaan asettaa matriisiin, jossa on useampia ky-vettejä. Tällaiset matriisit voidaan myös valmistaa ruiskupuris-tamalla muovista kuten FP-9 -systeemin kyvetistöblokki.

Kuvassa 4 kyvetti 1 on tietyssä kulmassa (sopivimmin 15-60° pysty-tasoon nähden) reaktion ajan. Tapauksessa A (fig. 4) ei ole tapahtunut agglutinaatiota, joten punasolut tai muut partikkelit vajoavat kyvetin pohjan 2 ja seinämän 3 muodostamaan kulmaan.

Tapauksessa B sitä vastoin on muodostunut agglutinaatio ja agglu-tinoituneet partikkelit ovat muodostaneet tasaisen ja samean maton koko kyvetin 5 pohjaan 6.

Kun kyvetit 1 ja 5 ovat pystyasennossa (fig. 1, C ja D) ja mitataan pystymittausperiaatteella, jossa mittaussäteet 7 ja 8 kulkevat pystysuunnassa ja kyvetin 1 vast. 5 pituusakselin suuntaisina, mittaussäde 8 tavoittaa vain kyvetin 5 pohjassa olevan agglu-tinaation 6. Kyvetin 1 pohjan 2 ja seinämän 3 muodostamassa kulmauksessa 4 olevia ei-agglutinoituneita partikkeleita mittaussäde 7 ei tavoita, jolloin mittaussäteen 7 intensiteetti pysyy saman suuruisena vertailuarvoon verrattuna. Tämä mittaustapa mahdollistaa myös agglutinaation eri asteiden toteamisen, kuten em. Waaler-Rose -agglutinaatiokokeessa mittaustulokset osoittavat.

Kuvassa 5 ovat samat vaiheet kuin kuvassa 4 esitettynä toisentyyppisessä kyvetissä, jossa mittaus suoritetaan vaakamittausperiaat-teella vaiheessa C ja D.

Reaktiovaiheissa A ja B kyvetit 9 ja 10 ovat kallistetut (alle 90°). Vaiheessa A ei ole syntynyt agglutinaatiota, joten partikkelit ovat vajonneet kyvetin pohjan 11 ja seinämän 12 väliseen kulmaan 13. Tapauksessa B on muodostunut agglutinaatio kyvetin 10 seinämään 14.

Mitattaessa vaakamittausperiaatteella, jossa mittaussäteet 15 ja 16 kulkevat kohtisuoraan kyvetin 9 vast. 10 pituusakseliin nähden, 8 56905 mittaussäde 15 ei kohtaa ei-agglutinoituneita partikkeleita kyve-tin 9 kulmassa 13 (fig. 2, C). Sitä vastoin agglutinaatio, joka on tarttunut kyvetin seinämään 14 osuu mittaussäteen 16 kohdalle ja aiheuttaa muutoksen mittaustulokseen (fig. 2, D). Jos reaktio-seos poistetaan kyvetistä, kyvetin seinämään kiinnittynyt agglutinaatio voidaan myös värjätä sopivalla väriliuoksella, joka voi myös parantaa agglutinaation pysyvyyttä seinämässä. Käyttämällä agglutinaation värjäystä testi herkistyy ja erottelukyky paranee, koska mittaus voidaan suorittaa esim. fotometrissä väriainetta absorboivalla aallonpituudella.

Kuvassa 6 esitetyt kyvetit 17 ja 18 ovat rakennetut siten, että kyvetin pohja on tietyssä kulmassa (sopivimmin 15-60°) kyvetin seinämään nähden. Tällöin, kun kyvetti 17 on pystyasennossa, ei-agglutinoituneet partikkelit sedimentoituvat kyvetin 17 seinän 21 ja pohjan 19 muodostamaan kulmaan 22 (fig. 6, A). Kyvetissä 18 agglutinoituneet partikkelit ovat keräytyneet pohjan 20 pintaan (fig. 6, B).

Kun kyvetit 17 ja 18 mitataan pystysuorilla mittaussäteillä 23 ja 2b (fig. 6, C ja D), mittaussäde 2b kohtaa vain agglutinoituneet partikkelit kyvetin 18 pohjalla 20. Sen sijaan mittaussäde 23 kyvetissä 17 (fig. 6, C) ei kohtaa kulmassa 22 olevia ei-agglutinoituneita partikkeleita. Kyvettien pohjat voivat olla esim. tasomaisia, tasokuperia, kuperankuperia, kuperankoveria tai koveran-kuperia. Tällaiset kyvetit voivat olla esim. yksittäisiä, asetettavissa tiettyyn matriisiin tai ruiskupuristettu muovista monta kyvettiä sisältäväksi matriisiksi.

Kuvassa 7 on esitetty kyvetit 25 ja 26, joissa voi olla esim. ν'-tai U-muotoiset pohjat. Kyvetin 25 V-pohjan 27 kärkiosaan 28 sedimentoituvat ei-agglutinoituneet partikkelit (fig. 7, A). Agglutinoituneet partikkelit asettuvat kyvetin 26 V-pohjan seinään 29 (fig. 7, B).

Kun kyvetti 25» jossa ei-agglutinoituneet partikkelit ovat pohjan kärjessä 28, mitataan pystymittausperiaatteella, jossa mittaussä-teet kulkevat kyvetin pituusakselin ympärillä sopivan suuruisena sylinterinä 30 (fig. 7, C), nämä mittaussäteet 30 eivät kohtaa kyvetin kärjessä 28 olevia partikkeleita.

9 66905

Sen sijaan mitattaessa kuvion 7, D tapauksessa kyvettiä 26, joutuvat sen pohjassa 29 olevat agglutinoituneet partikkelit mittaussä-teiden 37 tielle.

Mittaussäteen johtimessa 31 on sydänosa 32, joka ei johda mittaus-säteitä. Mittaussäde kulkee mittaussäteen johtimen loppupäässä sylinterimäisenä osana 33· Tällaisena mittaussäteen johtimena voi toimia esim. muovi-, lasi- tai kvartsikuitu. Tämän johtimen alkupää 3^ on yhtenä kimppuna ja se voi jakautua jakautumiskohdassa 35 useammaksi erilliseksi mittaussäteen johtimeksi 36. Mittaussäteen johtimen loDouosassa on mittaussädettä läpäisemätön svdänosa 32. Kävtettäessä tällaista loDDUDäästään sylinterimäiseksi muutettua mittaussäteen johdinta, ei tarvita mittaussäteen edessä rajainta. Sylinterimäiseksi jakautuva mittaussäteen johdin auttaa mittaussäteen yhdensuuntaistamista ilman monimutkaisia linssijärjestelmiä mittaussäteen johtimen ja kyvetin pohjan välillä.

Kuvassa 8 on esitetty kyvetit 38 ja 39, joiden pohja voi olla erimuotoinen, esim. kuperankovera ja kuperankupera. Tällöin pohjan linssivaikutusta voidaan käyttää sopivimmin mittaussäteen johtamiseen kyvetin pohjan kautta.

Kyvetin 38 pohja 40 on kuperankovera. Kun agglutinaatiota ei tapahdu, ei-agglutinoituneet partikkelit painuvat pystyasennossa olevan kyvetin 38 pohjan 40 ja seinämän kulmaukseen 4l, jolloin mitattaessa kyvetti 38 pystysuunnassa (fig. 8, C) mittaussäde 42 ei kohtaa ei-agglutinoituneita partikkeleita kulmauksessa 41. Ky-vetissä 39 agglutinoituneet partikkelit ovat asettuneet tasaiseksi massaksi kyvetin pohjaan 43 ja kun suoritetaan mittaus, mit-taussäteet 44 kohtaavat kyvetin 39 pohjassa 43 olevan agglutinaa-tion (fig. 8, D).

Kuvassa 9 kohdassa A kyvetin 45 pohjan 46 jatkeena on esim. sylin-terimäinen rengastila 47. Tällöin kyvetin 45 ollessa sopivassa kallistuskulmassa, ei-agglutinoituneet partikkelit kulkeutuvat sy-linterimäiseen rengastilaan 47. Kun kyvetti 45 mitataan (fig. 9,C) mittaussäteet 48 kulkevat kyvetin 45 pohjan 46 kautta kohtaamatta kyvetin sylinterimäisessä rengastilassa 47 olevia partikkeleita.

Kun sylinterimäinen rengastila 47 on tarpeeksi syvä, siihen kulkeutuneet partikkelit eivät helposti kulkeudu takaisin kyvetin pohjaan 46.

Claims (6)

1. Menetelmä agglutinaatiokokeiden tulosten mittaamiseksi automaattisesti esimerkiksi spektrofotometrissä, adsorptiofotometris-sä, fluorometrissä tai nefelometrissä, jolloin agglutinaatiokokeiden näytteitä inkuboidaan reaktioastioissa, kuten kyveteissä tai kyvetistössä näytteiden inaktivoimiseksi ennen mittausta, tunnettu siitä, että näytteiden inkuboinnin aikana reaktioastiat sovitetaan sellaiseen asentoon, esimerkiksi reaktioastioita (1, 5, 9, 10) riittävästi kallistamalla, tai käytetään sellaisia reaktio-astioita (17, 18, 25, 26, 38, 39, 45, 50), joiden pohjaosa on tarkoitusta varten muotoiltu siten, että silloin, kun agglutinaatiota ei ole tapahtunut, agglutinoitumattomat partikkelit kerääntyvät tai kasaantuvat reaktioastioissa niiden alimpana sijaitsevaan osaan tai soppeen mittaussäteen kulkutien ulkopuolelle, mutta että silloin, kun agglutinaatio tapahtuu, se muodostuu reaktioastioissa siihen kohtaan, josta mittaussäde kulkee.

2. Laite patenttivaatimuksen 1 mukaisen menetelmän suorittamiseksi, jolloin laitteen muodostaa reaktioastia tai reaktioastiaryhmä agglutinaatiokokeiden näytteiden inkuboimista varten ennen näytteiden mittausta, tunnettu siitä, että reaktioastian tai reaktioastiaryhmän kunkin reaktioastian pohjarakenteessa on soppi, joka on alempana kuin reaktioastian pohjaosan mittaussäteen kulkukohta eli mittausikkuna.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen laite, tunnettu siitä, että reaktioastian (17, 18) pohja (19, 20) on viistossa asennossa reaktioastian pituusakseliin nähden, viistouden ollessa sopi vimmin noin 45°.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen laite, tunnettu siitä, että reaktioastian (25, 26) pohja (27, 29) on alaspäin suuntautuvan kartion muotoinen, siten, että mainittu soppi muodostuu n 56905 kartion kärkeen (28) ja mittaussäteen (30, 31) mittausikkuna ren-gasalueena ko. sopen ympärille.

5. Patenttivaatimuksen 2 mukainen laite, tunnettu siitä, että reaktioastian (38, 39) pohja (40, 43) on kuperankovera tai kuperankupera mittaussäteen mittauskohdan muodostuessa pohjan (40, 43) keskialueelle.

6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen laite, tunnettu siitä, että reaktioastian (45, 50) pohjan (46, 49) reunaosa (47) on alempana kuin pohjan keskikohta, johon muodostuu mittaussäteen (48, 51) mittausikkuna, jolloin mittausikkunan ympärille sitä alemmaksi muodostuu rengastilan muotoinen soppi.