FI76888B - Nya medel och foerpackningar foer immunologiska analyser. - Google Patents

Description

76888

Uusia välineitä ja pakkauksia immunologisia analyysejä varten - Nya medel och förpackningar för immunologiska analyser 5 Tämä keksintö koskee uusia laitteita immunologisia analyysejä varten, niiden valmistusmenetelmää ja käyttöä erityisesti moniparametrisissä vasta-aineanalyyseissä ja sellaisten hybridomien seulonnassa, jotka valmistavat monoklonaalisia vasta-aineita.

10 Kliinisissä diagnooseissa käytetään paljon testejä, jotka perustuvat suorasti tai epäsuorasti potilaan veren seerumin vasta-aineiden mittaukseen. Kyseessä olevasta vasta-aineesta riippuen ovat testit rutiinikäytössä riippuen hyvin tunnetuista periaatteista: pelkkä immuuni-15 sakan muodostus tai se yhdistettynä diffuusioon ja/tai elektroforeesiin, komplementin kiinnitys vasta-aineanti-geenikomplekseilla, erytrosyyttien agglutinaatio vasta-aineilla tai vasta-aineen ja antigeenin välisen sitoutumisen suora mittaus. Kaikkia näitä periaatteita käytetään 20 tavalla tai toisella sellaisissa pakkauksissa, joita on kaupallisesti saatavissa senhetkisten tai jo parantuneiden sairauksien diagnostisointiin. Niinpä spesifisiä testipakkauksia valmistetaan sellaisten vasta-aineiden ilmaisuun tai mittaukseen, jotka aiheutuvat virus-, bakteeri-, 25 sieni- tai loisinfektioista. Jokainen testipakkaus on tehty tilaustyönä juuri jotakin tiettyä vasta-ainetta varten.

Jo olemassaoleviin diagnostisiin pakkauksiin liittyy se vaikeus, että niissä voi esiintyä sairauteen liit-30 tymättömiä vääriä positiivisia vasteita, jotka johtuvat käytettyjen menetelmien suuresta herkkyydestä. Positiiviset tulokset ovat merkitseviä yleensä vain silloin, kun vasta-ainetiitterissä voidaan havaita muutoksia sairauden edetessä. Tämä estää nopeiden johtopäätösten teon. 35 Kyseiselle potilaalle ei koskaan ole käytettävissä vasta-aineen perustasoa ennen tiettyä sairautta, kun käytetään tunnettuja testipakkauksia.

2 76888 Tämä tulisi mahdolliseksi vain siinä tapauksessa, että olisi tarjolla riittävän yksinkertainen järjestelmä, jota lääkäri voisi kuljettaa mukanaan ja suorittaa kokeet yksityisvastaanotollaan tai terveyskes-5 kuksessa osana rutiiniterveystarkastusta, ja joka samalla olisi riittävän monipuolinen minkä tahansa sellaisen vasta-aineen perustason toteamiseksi, jonka tiedetään olevan kliinisesti ajankohtainen, tai joka saattaisi osoittautua kliinisesti mielenkiintoiseksi tulevaisuudes-10 sa. Tällaisella kokeella kerättäsiin tietoja vasta- aineista, jotka eivät ole ilmeisen kliinisesti merkittäviä juuri sillä hetkellä. Koska vasta-aineet ovat erittäin spesifisiä, mutta eivät absoluuttisen spesifisiä, voi esiintyä satunnaisia ristikkäisreaktioita. Tämä 15 saattaa johtua antigeenin satunnaisesta ristikkäinreagoin-tikyvystä tai siitä, että sairaus tuntemattomasta syystä aiheuttaa immuunisysteemin väärän toiminnan ja tarkoituksettoman vasta-aineen muodostumisen. Niinpä esim. reumaattisen kuumeen aiheuttavien bakteerien epäillään 20 reagoivan ristikkäin sydänlihaskudoksen kanssa; tarttuvassa mononukleoosissa käytetään diagnostisessa pakkauksessa heterofiilisiä vasta-aineita, jotka reagoivat ristikkäin ja aiheuttavat muiden lajien, kuten hevosen, erytrosyyttien agglutinoitumisen.

25 Nyt käsillä olevalla keksinnöllä, joka määritellään jäljempänä tarkemmin, vältetään kaikkien olemassaolevien, vasta-aineiden ilmaisuun perustuvien antigeeniana-lyysien haitat. Keksintö edesauttaa mainittujen satunnaisten ristikkäisreaktiokykyisyyksien ja tarkoituk-30 settoman vasta-aineidenmuodostuksen paljastamisessa.

Keksinnön kohteena olevat testipakkaukset ovat erittäin yksinkertaisia ja ohjelmoitavissa niin, että on mahdollista todeta yksityiskohtainen "vasta-aine-profiili", jonka avulla voidaan saada irti maksimaalinen 35 tieto kehon omasta sairaudenvalvontasysteemistä sairauden diagnostisointia varten. Pakkaus sisältää oleelli- 3 76888 sena osana välineen, joka muodostaa tuen antigeeneille ja immunoglobuliineille, ja joka sopii millaisten tahansa vasta-aineiden tai antigeenien, esim. lääkkeiden tai hormonien, immunologiseen analysointiin tai ilmaisuun .

Termillä "vasta-aine" ymmärretään tiettyä ryhmää proteiinimolekyylejä, joille on ominaista se, että ne kuuluvat veren immunoglobuliinijakeeseen tai ovat immuunisysteemistä johdettujen viljeltyjen solujen erittämiä ja reagoivat spesifisesti vastaavan ligandin kanssa, josta tämän hakemuksen tekstissä käytetään termiä "antigeeni".

Ensi sijassa tämä keksintö koskee välinettä immunologisten analyysien suorittamiseksi, joka väline käsittää luonnollisista polymeerisistä hiilihydraateista, niiden synteettisesti modifioiduista, ristikyt-ketyistä tai substituoiduista johdannaisista tai polyamidista tai polysulfonikopolymeeristä muodostuvan huokoisen kiinteän tukiaineen, jolle on tunnusomaista, että siihen on ennalta valitulla tavalla ryhmitelty antigeenejä ja/tai immunoglobuliineja rajoitetuille ad-sorptioalueille, jotka yhdisteet kiinnittyvät tiukasti eivätkä levity huokoisella pinnalla, ja jotka alueet on saatu aikaan saattamalla erä näiden immunoreaktiivisten yhdisteiden liuoksia tai suspensioita suoraan kosketukseen tukiaineen kanssa mekaanisesti siirtämällä.

Mainittujen kiinteiden tukiaineiden alueet, joihin antigeenejä tai immunoglobuliineja on adsorboitunut, säilyvät myös tukiaineen kuivauksen ja varastoinnin jälkeen sellaisessa tilassa, että reaktio analysoitavan nesteen, esim. seerumin, sisältämien vasta-aineiden tai antigeenien kanssa tapahtuu vastaavasti. Näin ollen tämä keksintö kohdistuu erityisesti tähän mainitun vä- 4 76888 lineen kuivattuun muotoon. Ennen haluttujen immunomää-ritysten suorittamista kaikki proteiinien adsorptiopai-kat huokoisen tukiaineen pinnan niillä alueilla, joita antigeenit tai immunoglobuliinit eivät ole peittäneet, sekä myös näiden vyöhykkeiden sisäosat, pitää kuitenkin kyllästää käsittelemällä pinta epäspesifisillä proteiineilla tai tällaisia proteiineja sisältävillä seerumeilla. Myös tämän käsittelyn aikana pysyvät alunperin lisätyt antigeenit tai immunoglobuliinit vahingoittumattomina niin, että antigeeni-vasta-ainereaktio säi-lyy, eikä säilyvyys poistu myöskään kuivauksessa tai varastoinnissa.

Niinpä tämä keksintö koske toissijaisesti edellä määriteltyä välinettä, jossa huokoisessa kiinteässä tukiaineessa olevat ylimääräiset adsorptiokohdat kyllästetään proteiineilla, joilla ei ole spesifistä kykyä reagoida mainittujen immunoreaktiivisten yhdisteiden kanssa. Nämä proteiinit tukkivat adsorptiopinnan kaikki jäljelle jääneet adsorptiokohdat.

Epäspesifisillä proteiineilla tarkoitetaan sellaisia proteiineja, jotka eivät reagoi ristikkäisesti niiden spesifisten vasta-aineiden tai immunoglobuliinien kanssa, joiden oletetaan olevan analysoitavassa seerumissa, ja epäspesifiset proteiinit eroavat myös huokoiseen tukiaineeseen lisätyistä antigeeneistä tai immu-noglobuliineista. Näin valmistettu suorissa immunomää-rityksissä käytettäväksi tarkoitettu laite, joka on varsinkin kuivassa muodossa, ja jota voidaan varastoida ja käyttää pitkän ajan kuluttua valmistuksesa, on erittäin hyödyllinen.

Kolmanneksi tämä keksintö koskee pakkausta immunologista analyysiä varten, joka pakkaus sisältää edellä määritellyn huokoisen kiinteän tukiaineen, laitteet immunologisten reaktioiden suorittamiseksi ja reagenssit 5 76888 indikaattorisysteemiä varten osiin jaettuna tai kuivattuina.

Neljänneksi tämä keksintö koskee menetelmää edellä määritellyn välineen valmistamiseksi, jolle on tunnusomaista, että erät antigeenien ja/tai immunoglobulii-nien liuoksia tai suspensioita saatetaan suoraan kosketukseen huokoisen kiinteän tukiaineen kanssa mekaanisesti siirtämällä ennaltavalitun ryhmittelyn aikaansaamiseksi, ja haluttaessa näin saatu väline käsitellään proteiineilla, joilla ei ole spesifistä kykyä reagoida mainittujen immunoreaktiivisten yhdisteiden kanssa, huokoisessa kiinteässä tukiaineessa olevien ylimääräisten adsorptiokohtien kyllästämiseksi.

Viidenneksi keksintö koskee immunologista analysointimenetelmää, jolle on tunnusomaista, että edellä määriteltyä välinettä, sen jälkeen kun sitä on käsitelty sopivasti ei-spesifisiä proteiineja sisältävällä tukkimisliuoksella kaikkien ylimääräisten sitoutumiskohtien kyllästämiseksi, inkuboidaan detektoitavia im-munoreaktiivisia yhdisteitä sisältävän näytteen kanssa, mahdollisesti tukkimisliuoksen läsnäollessa, ja haluttaessa pestään, sitten inkuboidaan indikaattorivasta-aineen liuoksen kanssa tai minkä tahansa signalointi-systeemin kanssa, joka tunnistaa aluksi näytteen kanssa inkuboitaessa syntyneen immunologisen kompleksin, mahdollisesti tukkimisliuoksen läsnäollessa, ja indikaat-torisysteemi kehitetään ja/tai kvantitioidaan.

Tämä keksintö perustuu siihen havaintoon, että antigeenejä tai immunoglobuliineja voidaan siirtää kiinteään huokoiseen tukimateriaaliin saattamalla niitä sisältävät nesteet suoraan kosketukseen tukimateriaalin kanssa niin, että saadaan aikaan rajoitettuja adsorptioalueita, 6 76888 jotka haluttaessa voivat olla mahdollisimman rajattuja siten, että on käytetty tilavuuden suhteen sopivasti säädettyjä nestemääriä, ja edelleen on havaittu, että näin saadut alueet eivät levity pinnalla, ja että 5 antigeenit tai immunoglobuliinit kiinnittyvät hyvin tiukasti huokoiseen pintaan, jossa ne voidaan säilyttää vahingoittumattomina määrättömän pitkä aika, ja jossa ne soveltuvat reagoimaan biologisten nesteiden sisältämien vasta-aineiden tai antigeenien kanssa vastaa-10 vasti, kun halutaan saada aikaan niiden detektio millä tahansa tunnetulla immunologisella määritysmenetelmällä. Esimerkiksi, jos väline sisältää kiinteään tukeen sidottuja antigeenejä, voidaan sidotut vasta-aineet ilmaista käyttämällä (indikaattori)-vasta-ainetta, kuten 15 radioaktiivisesti merkittyä (indikaattori)-vasta-ainetta tai (indikaattori)-vasta-ainetta, joka on liitetty entsyymiin, joka antaa värireaktion. Termillä "indikaattori" tarkoitetaan molekyyliä, johon on liittynyt ryhmä, joka kehittää havaittavan ja mitattavissa olevan 20 signaalin tietyissä olosuhteissa.

On myös havaittu, että nämä immunologiset määritykset voidaan suorittaa jopa käyttämällä erittäin pieniä antigeeni- tai immunoglobuliinitäpliä ilman, että esiintyy yhteentörmäyksiä eri antigeenien tai immuno-25 globuliinien tai koenesteiden sisältämien vieraiden aineiden välillä. Tämä havainto on erittäin yllättävä, kun verrataan erilaisiin ennestään tunnettuihin ja varsinkin edellä mainittuihin immunologisiin määritysmenetelmiin. Erittäin yllättävää on se, että tämän keksin-30 nön mukaista yksinkertaista laitetta voidaan soveltaa hyvin yleisesti ja sitä voidaan käyttää käytännöllisesti katsoen kaikkien antigeenisten aineiden, esim. proteiinien, nukleiinihappojen, hiilihydraattien, lipidien ja vastaavien aineiden, ja minkä tahansa immunoglobulii-35 nien määritykseen.

Lukuunottamatta jäljempänä mainittua julkaisua Proc.

76888

Natl. Acad. Sei. USA, joka edusti merkittävää edistysaskelta mikrohuokoisten levyjen käytössä vasta-aineiden-sidontamääritysten käytössä elektroferogrammikopioissa, voidaan tätä keksintöä edeltävästä tiedosta mainita 5 esim!. U.S.Ain patenttijulkaisu no. 4 200 690 ja eurooppalainen patenttihakemus no. 27008. U.S.A. patenttijulkaisussa selostetaan mikrohuokoisten nitroselluloosa-tukimateriaalien sidontakapasiteetin kohottamista erilaisilla monimutkaisilla päällystysmenetelmillä ollen samal-10 la tietämättömiä siitä, että nitroselluloosalla on suuri luontainen sidontakapasiteetti pintayksikköä kohti. Lisäksi lukuisissa aikaisemmissa patenteissa, joista on esitetty yhteenveto mainitussa eurooppalaisessa patenttihakemuksessa kuvataan geometrialtaan erilaisten muovipintojen, 15 joissa on poimuja, reikiä, upotteita ym., käyttöä sidonta-kapasiteetin nostamisessa. Reagenssiylimäärien poistamisen tällaisilta pinnoilta ilmoitetaan olevan vaikeata. Nyt käsillä olevan keksinnön oleellinen piirre on mikrohuokoisten levyjen suuri sidontakapasiteetti ja siihen liittyvä 20 helppo ja perusteellinen pesu esim. jakelemalla pesuneste yksinkertaisesti esim. muovisella pesupullolla ja kaatamalla ylimääräinen reagenssi pois.

Mainitussa eurooppalaisessa patenttihakemuksessa no. 27008 kuvataan menetelmää, jolla voidaan suorittaa useita 25 vasta-aine-antigeenireaktioita käyttämällä päällystettyjä muoviputkia ja upotteita, jotka ovat kosketuksessa samaan nestemäiseen näytteeseen. Vaikka keksinnön väitetään soveltuvan useisiin samanaikaisiin määrityksiin ja julkaisussa selostetaan laajasti tällaisten useiden 30 määritysmahdollisuuksien etuja ja tarvetta, kuitenkin selostetaan esimerkkeinä vain kahta samanaikaista määritystä, ja käytännössä useampia kuin kaksi tuskin voidaan suorittaakaan. Tuon keksinnön avain on siinä, että putki ja upoke erotetaan toisistaan fyysisesti reaktion 35 jälkeen ja sitoutunut radioaktiivisuus lasketaan erikseen. On selvää, että tuon keksinnön mukaisesti suoritettujen määritysten määrää voitaisiin lisätä käyttämällä multip- 8 76888 peli-isotooppitekniikkaa yhdistettynä radioimmuunimää-ritykseen, mutta käytännössä määrää ei voida lisätä rutiinikäytössä, sillä tarvittaisiin useampia kuin kaksi isotooppia ja radioaktiivisten määritysten suorittaminen 5 on monimutkaista. Näin ollen neljä samanaikaista määritystä olisi suurin mahdollinen määrä. Annetut esimerkit koskevat myös pelkästään käyttöä radioimmuunimää-rityksissä. Sitävastoin nyt käsillä olevassa keksinnössä käytetään hyväksi tukiaineen suurta kapasiteettia pinta-10 yksikköä kohti yhdistettynä mikrohuokosten suureen sisäiseen erotuskykyyn, joihin nojautuen voidaan päästä rajoittamattomaan määrään samanaikaisia määrityksiä. Edelleen eurooppalaisen patenttihakemuksen no. 27008 esimerkit rajoittuvat tiettyjen tukeen sidottujen vasta-15 aineiden käyttöön ja tarkoitus on määrittää vastaavat antigeenit. Nyt käsillä olevassa keksinnössä sen sijaan on mahdollista käyttää systeemissä oleellisesti ottaen rajoittamatonta määrää erilaisia antigeenejä vastaavien vasta-aineiden mittaamiseen, ja tukea on mahdollista käyt-20 tää myös vasta-aineiden kiinnittämiseen, jotka sitten sitovat vastaavia spesifisiä antigeenejä, ja spesifisiä reagenssejä, kuten komplementtikomponentteja, käyttämällä voidaan identifioida antigeeni-vasta-ainekompleksit.

Artikkelissa "Electrophoretic transfer of proteins 25 from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets:

Procedure and some applications", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 76, No. 9, ss. 4350-4354, September 1979, on selostettu menetelmää, jossa proteiinit siirretään elektro-foreettisesti geelistä mikrohuokoiselle levylle, ja jossa 30 nämä proteiinit ilmaistaan immunomääritysmenetelmillä vasta-aineita käyttämällä. Kun proteiinit siirretään elektroforeettisesti, saadaan nitroselluloosalevylle aikaan tarkka kopio geelin sisältämästä alkuperäisestä asetelmasta. Tällaisten siirrettyjen elektroferogrammien 35 vasta-aineiden määritys suoritetaan sen jälkeen, kun nitroselluloosan jäljelle jäänyt adsorptiokapasiteetti 9 76888 on kyllästetty inkuboimalla epäspesifisten proteiinien kanssa; piirre jota on sovellettu myös tässä keksinnössä. Edellä kuvatut määritykset elektroforeettisesti siirretyillä proteiineilla tekee mahdolliseksi se, että 5 mitään vaihtoa ei tapahdu elektroforeettisesti imettyjen spesifisten proteiinien ja tuen jäännöskapasiteetin täyttämiseen käytettyjen epäspesifisten proteiinien välillä. Tämän keksinnön mukaisten uusien välineiden kehittäminen ja käyttö vasta-aineidenmääritykseen perus-10 tuu merkittävältä osin siihen havaintoon, että tällainen sidottujen antigeenien säilyminen vahingoittumattomina, vaikka niihin kohdistuisi mitä tahansa häiriötä jäännösadsorptiokohtien tukkimiseen käytettyjen epäspesifisten proteiinien (tausta-adsorptio) taholta, se-15 kä vasta-ainemääritysten pitkät inkubointiajät ovat mahdollisia, vaikka antigeenit ja/tai immunoglobuliinit siirretään suoraan, so. ilman mitään sähkökenttiä. On myös yllättävää, ettei myöhemmissäkään antiseerumien ja indikaattorivasta-aineen kanssa tapahtuvissa inkuboin-20 neissa esiinny häiritseviä sivureaktioita, esim. vaihtoa epäspesifisten proteiinien kanssa. Sitäkään ei voitu ennalta aavistaa, että aikaisempi elektroforeettinen menetelmä saatettiin toteuttaa ja saada toimimaan kvantitatiivisella pohjalla käyttämällä vain yksinkertaista 25 antigeenin lisäystä. Koska uudella menetelmällä on suuri erotuskyky käytettäessä tukia, joissa on suuri lukumäärä antigeenien mikrotäpliä, se on ohjelmoitavissa lähes äärettömästi ja samalla erittäin yksinkertainen käyttää. Haluttaessa immunoglobuliinit voidaan asentaa huokoisel-30 le tuelle yhdessä antigeenien kanssa, jos tarkoitus on tehdä tämän keksinnön mukainen immunologinen vasta-aineiden analyysi kvantitatiivisella pohjalla; tunnetut määrät immunoglobuliineja lisätään kiinteään tukeen antigeenien kanssa; nämä immunoglobuliinit reagoivat indikaatto-35 ri-vasta-aineen kanssa niin, että saadaan havaittava reaktio, jota voidaan käyttää perustana verrattaessa 10 76888 antigeeneihin sidottujen immunoglobuliinien vastaavaan reaktioon. Tämän keksinön mukainen immunologinen analyysimenetelmä voidaan näin ollen kalibroida käyttämällä sopivaa sisäistä standardia, joka perustuu esim. tunnettuihin määriin ihmisen immunoglobuliineja. Koska menetelmällä voidaan määrittää samanaikaisesti suuri määrä vasta-aineita, satunnaisesti esiintyvät vasta-aineet, jotka joko reagoivat ristikkäisesti jonkun toisen antigeenin kanssa tai, joiden ei ennestään tiedetä esiintyvän kyseisen sairauden yhteydessä, saadaan helposti todetuiksi. Lisäksi yhteen universaalikokeeseen voidaan sisällyttää kaikki tunnetut diagnostiset kokeet, jotka riippuvat yksittäisten vasta-aineiden määrityksestä.

Termi, "ennalta valitulla tavalla", jota käytetään tämän keksinnön mukaisiin välineisiin muodostetun ryhmityksen yhteydessä, tarkoittaa sitä, että adsorboituneiden antigeeni- tai immunoglo-buliinialueiden geometria on saatettu yhdenmukaiseksi suoritettavaksi tarkoitetun immuunimäärityksen kanssa.

Huokoinen tuki on sellaista materiaalia, jonka pinta on riittävän huokoinen päästääkseen immunoglobuliinit sisään, ja jonka pinnan affiniteetti riittää sitomaan antigeenit. Mikrohuokoiset rakenteet asetetaan yleensä etusijalle, mutta hydratoituneessa muodossa olevia geelimäisiä rakenteita voidaan myös käyttää. Kemialliselta luonteeltaan ne ovat luonnollisia polymeerisiä hiilihydraatteja ja niiden synteettisesti modifioituja, ristikytkettyjä tai substituoituja johdannaisia, kuten a) agaria, agaroosia; ris-tikytkettyä algiinihappoa? substituoituja ja ristikytkettyjä guar-kumeja, ristikytkettyjä dekstraanipolymeerejä ja tärkkelyksiä, b) regeneroitua selluloosaa? selluloosaestereitä, varsinkin typpihapon ja karboksyylihappojen kanssa muodostuneita? sekaselluloosa-estereitä, selluloosaeettereitä, varsinkin alempien alifaattisten alkoholien kanssa muodostuneita? polyamideita tai polysulfoniko-polymeerejä.

Kaikkia näitä materiaaleja voidaan käyttää sellaisinaan sopivaan muotoon saatettuina, kuten filmeinä, levyinä, sylintereinä jne, tai niitä voidaan käyttää päällysteinä tai sidottuina tai laminoitui-na sopiviin inertteihin kantaja-aineisiin, kuten paperiin, lasiin, muovikalvoihin, metallitolioihin, kudonnaisiin. Väline on mielellään levyinä, joiden paksuus on alueella noin 0,01-0,5 mm, mielellään noin 0,1 mm. Huokoskoko voi vaihdella laajalla alueella, mielellään välillä noin 0,025-15y, erityisesti välillä noin 0,15-15y.

11 76888 Näiden tukimateriaalien pinnat voidaan aktivoida sellaisilla kemiallisilla menetelmillä, jotka aiheuttavat antigeenien ja/tai immunoglobuliinien kovalenttisen sitoutumisen tukeen. Antigeenin tai vasta-aineen irre-5 versiibeli sitoutuminen saavutetaan kuitenkin yleensä vain vähän ymmärrettyjen hydrofobisten voimien aiheuttamalla adsorptiolla huokoiseen materiaaliin. Mielellään käytetään mikrohuokoista selluloosaesteriä, kuten selluloosan esteriä alifaattisen karboksyylihapon, kuten 10 1-7 hiiliatomia sisältävän alkaanikarboksyylihapon kanssa, esim. etikkahapon, propionihapon tai minkä tahansa voihapon tai valeriaanahapon kanssa. Nitrosel-luloosalevyt ovat myös käyttökelpoisia, jolloin tarkoitetaan mitä tahansa typpihapon selluloosaesteriä, joka 15 haluttaessa voi olla minkä tahansa mainitun karboksyyli-happoselluloosaesterin seos. Niinpä voidaan käyttää puhtaita selluloosaestereitä, jotka muodostuvat selluloosan esteristä, jossa on noin 3 typpihapon ryhmää per 6 hiiliatomia. Erinomainen nitroselluloosaan perustuva 20 materiaali, joka sopii tämän keksinnön mukaisten laitteiden valmistukseen, on markkinoilla kauppanimellä "Millipore®" (Millipore, Bedford, Mass, USA), ja sen huokoskoko on 0,45 μ.

Antigeenit tai immunoglobuliinit lisätään kuvattuun 25 kiinteään tukeen suoralla kontaktilla, jolla tarkoitetaan mitä tahansa mekaanista siirtämistä, joka voi olla joko manuaalinen, esim. kapillaariputkien tai pipettien tai ruiskujen avulla nestemäisten tai kaasumaisten ponneaineiden, kuten suihkeiden tai sopivasti suunnattujen 30 ilma- tai kaasuvirtojen avulla, tai painomallin avulla, tai lisäyslaitteella, jossa määrät on saatu pieniksi tavallisilla mikroelektroniikan keinoilla, litografi-silla tai vastaavilla menetelmillä tai "charged drop"-työnnöllä, jota käytetään suurinopeuksisessa elektroni-35 sessa painatuksessa. Näyte voidaan lisätä niin, että saadaan aikaan mikä tahansa haluttu geometria, kun 76888 12 adsorptioalueet ovat esim. pisteiden, täplien tai viivojen tai missä tahansa sopivassa muodossa. Ryh-mitelmä voi sisältää suuren määrän antigeenejä tai vain muutamia tai vain jopa yhden. Mielellään lisätään 5 antigeenipitoisia nesteitä tai seerumeja pieninä tilavuuksina, esim. alle 1 yl. varsinkin alle 0,1 yl.

Tällä tavalla huokoiseen pintaan saadaan mikropisteitä. Mikropisteet, joiden halkaisija on esim. alle 2 mm, varsinkin alle 0,5 mm, ovat sopivimpia suurelle anti-10 geeni- ja/tai immunoglobuliinimäärälle , esim. kaksidi- mensionaalisena alueena tai ryhmitelmänä; viivat, joiden leveys on esim. noin 2 mm tai vähemmän, esim. 1 mm, voivat olla sopivimpia rajoitetulle määrälle antigeenejä tai vasta-aineita, jolloin tulokset voidaan helposti 15 havaita silmin tai jollakin mekaanisella skannerilla. Tällainen yhdensuuntaisten viivojen ryhmitelmä voidaan sitten leikata useiksi liuskoiksi tavalla, joka tekee mahdolliseksi testisysteemin massatuotannon.

Tyypillinen tämän keksinnön mukainen koeväline seeru-20 mien sisältämien vasta-aineiden analysointia varten voi olla esim. liitteenä olevan kuvan muotoinen, jossa pisteet on esitetty kehitettyinä erilaisiin analysoitaviin seerumeihin upottamisen jälkeen ja tehty näkyviksi reaktiolla indikaattorivasta-aineiden kanssa, jotka on lii-25 tetty entsyymeihin, jotka antavat värireaktion reagoidessaan substraatin kanssa. Standardit 1-3 ovat normaalia ihmisen seerumia sopivasti laimennettuna. Tämäntyyppiset välineet sopivat sellaisiin tarkoituksiin, joissa halutaan suorittaa "moniparametrisiä" vasta-aineanalyy-30 sejä. Sellaiset pakkaukset, joissa on vain yksi antigeeni sijoitettuna kiinteään, huokoiseen tukimateriaaliin, ovat erittäin tärkeitä monoklonaalisia vasta-aineita valmistavien hybridomien seulonnassa.

Uusi pakkausjärjestelmä voidaan ohjelmoida rajoituk-35 setta, koska yhteen ainoaan koesuoritukseen voidaan si-* 76888 säilyttää mikä tahansa haluttu määrä antigeenejä tai antigeenien ja immunoglobuliinien yhdistelmiä ja analysoida ne sitten yhdellä ainoalla toimenpiteellä. Keksintöä voidaan käyttää esim. sellaisten vasta-aineväkevyyk-5 sien seuraamiseen, jotka ovat normaalisti endeemisiä, mutta voivat vaihdella patologisen tilanteen mukaan, tai haluttaessa ilmaista ja kvantifioida sellaisia vasta-aineita, joita löytyy ainoastaan patologisissa tilanteissa. Jos huokoisena tukimateriaalina käytetään nitrosel-10 luloosaa, mielellään levyjen muodossa, on yllättävää, kuinka suuri erotuskyky systeemillä on. Kun näyte lisätään mikrokapillaarilla, piste säilyy erittäin pienenä, millimetrien murto-osien suuruusluokassa, eikä se myöskään leviä myöhemmissä käsittelyissä ja reaktioissa. Tällai-15 siä mikropisteitä sisältäviä antigeenilevyjä voidaan käyttää ihmisen seerumien sisältämien erittäin moninaisten vasta-ainelaatujen ilmaisuun ja kvantifiointiin.

Kun valitut antigeenit ja/tai mahdolliset immuno-globuliinit on ensin sijoitettu kiinteään, huokoiseen 20 tukimateriaaliin mainitulla tavalla, pitää huokoisen materiaalin ylimääräiset sidoskohdat tukkia, ennenkuin välinettä voidaan käyttää immuunimäärityksiin. Tämä suoritetaan inkuboimalla mainittua antigeeni- tai immu-noglobuliiniryhmityksen sisältävää tukea epäspesifisten 25 proteiinien tai tällaisten proteiinien seoksen tai koko-seerumin tai minkä tahansa näiden aineosien yh distelmän kanssa niin, että mukana saattaa olla myös seuraavien immuunimääritysten aineosa. Näiden jäljellä-olevien adsorptiokohtien tukkiminen voidaan suorittaa myös 30 vaiheittain. Niinpä kiinnittyneet antigeenit tai vasta-aineet sisältävä tuki voidaan ensivaiheessa inkuboida naudan seerumialbumiinin kanssa. Tällaiset on edullis-tan laimentaa fysiologisella suolaliuoksella ja koostetta inkuboidaan niiden kanssa mielellään hieman korotetus- 14 76888 sa lämpötilassa, esim. välillä 30 - 50 °C:ssa, mielellään 40 °C:ssa, ja sitten pestään fysiologisella suolaliuoksella. Tämän esikäsittelyn jälkeen saattaa vielä olla jäljellä proteiinien sidoskohtia, jotka pitää myös tukkia, 5 ennenkuin immuunimäärityksiä voidaan suorittaa. Jos on olemassa tausta-adsorptiota, joka johtuu jäljellä olevista sidoskohdista tai epäspesifisten proteiinien vaihdosta, se voidaan estää suorittamalla inkubointi ensimmäisen antiseerumin kanssa ja indikaattorivasta-aineen 10 kanssa siten, että samaa epäspesifistä proteiinia ja lisäksi kantaja-aineena käytettyä muusta kuin testattavan vasta-aineen antaneesta lajista peräisin olevaa kokonaista seerumia on läsnä. Nämä proteiiniseokset tukkivat jäljellä olevat sidoskohdat jatkuvalla läsnäolollaan, mutta 15 tämän lisäksi niillä on taipumus myös kilpailun kautta ehkäistä vaihtoa, joka tapahtuu vasta-aineiden ja aikaisemmin epäspesifisiin kohtiin sitoutuneiden proteiinien välillä, sekä mitä tahansa epäspesifistä vuorovaikutusta, joka tapahtuu immunoglobuliinien kanssa. Näin käytetyn 20 kantaja-aineseerumin ei pitäisi olla peräisin sellaisesta lajista, jonka immunoglobuliinit reagoivat ristikkäin indikaattorivasta-aineen kanssa.

Kun halutaan suorittaa vasta-aineet ilmaiseva immuno-määritys,edellä kuvattua välinettä esimerkiksi inkuboi-25 daan analysoitavan antiseerumin kanssa, joka on laimennettu oletetun vasta-aineväkevyyden mukaan, tavallisesti suhteessa 1 : 100-1 : 10 000 tukkimis-liuokseen, huoneenlämpötilassa esimerkiksi 2 tunnin ja yön yli seisottamisen välillä oleva aika ja sen jälkeen 30 ylimääräiset sitoutumattomat vasta-aineet poistetaan pesemällä perusteellisesti fysiologisella suolaliuoksella. Indikaattorivasta-aine on radioaktiivisesti leimattu, fluo-roiva tai lUminoiva tai se on konjugoitunut fluoroivan aineen kanssa tai entsyymin kanssa, joka antaa värireak-35 tion reagoidessaan substraattinsa kanssa. Indikaattori- vasta-aineesta tehdään tavallisesti 1000-kertainen laimennus edellämainittuun tukkimisliuosseokseen ja inkuboi- 76888 daan esim. kaksi tuntia ja pestään jälleen fysiologisella suolaliuoksella.

Nämä toimenpiteet suoritetaan sinänsä tunnetuilla menetelmillä käyttämällä tunnettuja indikaattoreita, 125 5 mm. stafylokokkiproteiini A:ta. Niinpä esim. I-leinattua immunoglobuliinia voidaan käyttää autoradio-grafiässä, fluoreseiiniin liitettyä immunoglobuliinia fluorometrisessä menetelmässä tai piparjuuriperoksi-daasiin liitettyä immunoglobuliinia entsymaattisessa 10 immuunimenetelmässä siten, että o-dianisidia käytetään vetyperoksidin läsnäollessa substraattina peroksidaasin aiheuttamalle värireaktiolle piparjuuriperoksidaasimene-telmässä, ja tällöin värillinen reaktiotuote on liukenematon ja pysyy immobilisoituneena muodostumiskohdassa.

15 Tämän keksinnön mukaisilla uusilla pakkauksilla voidaan analysoida kaikenlaisia potilaalta saatuja vasta-aineita sisältäviä nesteitä, kuten seerumia, plasmaa, selkäydinnestettä, imunestettä, maitoa, sylkeä, virtsaa, ulosteita , kolostrumia jne.

20 Kuten edellä mainittiin, huokoisella tukimateriaa lilla olevat antigeenit voidaan ilmaista sopivan indikaat-torivasta-aineen avulla tai komplementtisysteemin komponentin avulla tai kytketyllä entsyymisysteemillä, joka on herkkä antigeeni-vasta-ainereaktiolle. Tämä indi-25 kaattorivasta-aine voi myös olla mikä tahansa vasta-aine, joka reagoi spesifisesti ihmisen tai eläinten immunoglobu-liinien kanssa, tai kyseessä voivat olla luokkaspesifi-set vasta-aineet, jotka reagoivat vain yhden halutun vasta-aineluokan, kuten IgG, IgM, IgA, IgD tai IgE, 30 kanssa tai minkä tahansa tällaisten spesifisten immu-noglobuliinien halutun yhdistelmän kanssa. IgM-vasta-aineet ovat erityisen tärkeitä, koska ne ovat ominaisia äskeisille tai tällä hetkellä ajankohtaisille infektioille, ja IgE-luokka liittyy allergiaan.

35 Indikaattorivasta-aineisiin liittyneinä mahdollisesti käytetyt entsyymit voivat olla sellaisia, että ne voi- 76888 16 daan paikallistaa tai kvantifioida niiden muodostaman radioaktiivisen, luminoivan tai fluoroivan tuotteen avulla tai sellaisen tuotteen avulla, jonka karakteristinen adsorbanssi- tai heijastusspektri on näkyvä tai nä-5 kyvän alueen ulkopuolella, ainoan vaatimuksen ollessa se, että ilmaisureagenssi tai reaktiotuote pysyy paikallaan siinä kohdassa, jossa antigeeni-vasta-ainekomp-leksi sijaitsee. Jos sidotun antigeeni-vasta-ainekomplek-sin ilmaisuun käytetään komplementtia, se voi joko itse 10 olla merkitty millä tahansa edellämainitulla tavalla tai se voidaan vuorostaan ilmaista spesifisellä antikomple-menttivasta-aineella, joka on merkitty millä tahansa edellä olevista tavoista.

Tämän keksinnön mukaiset välineet voivat olla kiintei-15 den, huokoisten tukimateriaalien muodossa, esim. nitrosel-luloosalevyinä, sellaisina kuin ne ovat välittömästi antigeenien lisäyksen jälkeen. Tällaiset välineet voidaan kuivata ja niitä voidaan varastoida määrättömän pitkä aika ympäristön lämpötilassa edellyttäen, että väline 20 pidetään kosteudelta suojattuna. Kuitenkin keksinnön mukaiset välineet voivat edullisesti olla siinä muodossa, johon ne saadaan tukkimalla jäännösadsorptiokohdat joko yhdessä tai useammassa vaiheessa. Myös tässä tapauksessa kuivattua tukea voidaan säilyttää mainitussa lämpö-25 tilassa määrättömän pitkään, kun väline pidetään kosteudelta suojattuna, ja tämä muoto onkin tärkeä kaupalliselta kannalta.

Menetelmässä, jossa tämän keksinnön mukaisia välineitä käytetään immunologisten analyysien suorittamiseen, 30 tukimateriaali, joka sisältää antigeenit ja/tai immuno-globuliinit, ja joka on käsitelty epäspesifisillä proteiineilla (toinen väline), upotetaan analysoitavaan nesteeseen, joka voi olla esim. seerumi tai plasma, joka on saatu eläin- tai ihmispotilaalta tai rutiiniter-35 veystarkastuksessa olevalta henkilöltä, ja tämän jälkeen tuki kastetaan laimennettuun liuokseen tai suspensioon, joka sisältää indikaattorivasta-ainetta, joka koh- 76888 distuu analysoitavan nesteen sisältämiä eläinlajin immunoglobuliineja vastaan, ja tällöin voivat olla ky-sessä esim. ihmiseen kohdistuvat anti-immunoglobuliinit, kuten entsyymiin kytketty vasta-aine, jonka entsyymireak-5 tion tuote on liukenematon. Viimeinen vaihe on sidotun toisen vasta-aineen visualisointi, jolloin edullinen reaktio on 4-kloori-1-naftolin hapettuminen liukenemattomaksi värilliseksi tuotteeksi. Viimeiset vaiheet ovat niin yksinkertaisia ja nopeita (koko toimitus voidaan suo-10 rittaa kolmessa tunnissa tai lyhemmässä ajassa), että menetelmää voidaan käyttää lääkärin yksityisvastaanotolla.

Antigeenien lisäyksen jälkeen on joissakin tapauksessa järkevää tai välttämätöntä kuivata huokoinen tuki perusteellisesti. Tuki on edullista kuivata ilman avul-15 la, minimikuivausajän ollessa 1 tunti ympäristön lämpötilassa. Kuumennus on tarpeen nukleiinihappojen ollessa kyseessä ja kuumennus voidaan suorittaa muille antigeeneille ilman haittavaikutuksia. Näin ollen tämän keksinnön erään näkökohdan mukaisesti voidaan valmistaa 20 koepakkauksia siten, että antigeenit lisätään suoraan ja suoritetaan kuumennus ennen jatkokäsittelyä varsinkin siinä tapauksessa, että ohjelmaan on sisällytetty nukleii-nihappoantigeenejä. Kuumennus on edullista suorittaa lämpötila-alueella noin 60 - 120 °C, mielellään noin 25 80 °C:ssa, kuuroennusajan ollessa noin 5 minuutin ja 12 tunnin välillä, esim. 1 tunti. Alaan perehtyneet tietävät, että denaturoituneet nukleiinihapot kiinnittyvät nitroselluloosaan tällaisissa olosuhteissa. Ei osattu odottaa, että luonnollinen DNA myös sitoutuisi 30 kuvatuissa olosuhteissa, eikä sitäkään osattu odottaa, että mitkään nukleiinihapot säilyisivät sidottuina ja hajoamattomina vasta-ainemäärityksen olosuhteissa.

Perustoimenpiteet, joilla immunomääritykset suoritetaan tämän keksinnön mukaisilla uusilla pakkauksilla, 35 ovat seuraavat: Väline on konstruoitu lisäämällä anti geeni kiinteään tukeen edelläkuvatulla tavalla. On olemassa periaatteessa kaksi muunnosta, nimittäin "yhden pisteen menetelmä", jota käytetään, kun vain yksi anti- 76888 18 geeni on lisätty ja näytteet seulotaan vastaavan vasta-aineen läsnäolon suhteen, ja "monen pisteen menetelmä", kun on lisätty useampia antigeenejä yhden tai useampien vasta-aineiden toteamiseksi. "Usean pisteen menetelmäs-5 sä" antigeenit voivat olla ryhmiteltyjä huokoiselle tukimateriaalille, esim. nitroselluloosalevylle, yksidi-mensionaalisesti tai kaksidimensionaalisesti, kuten jo edellä on mainittu. Jos lopullinen ryhmitys on yksi-dimensionaalinen, näytteet lisätään yhdensuuntaisina 10 viivasarjoina ja sisäinen standardi, joka on esimerkiksi sarja väkevyydeltään tunnettuja kokonaisia immunoglobulii-neja, lisätään samalla tavalla.

Tuen jäljelle jäänyt sidoskapasiteetti tukitaan liottamalla tukimateriaalia, esim. levyä, esim. 2 tuntia 15 40 °C:ssa seoksessa, jossa on puskuroitua suolaliuosta sekä "tukkimisliuosta" (esim. 10 % hevosenseerumia) ja sen jälkeen kuivataan. Kokeiden tekoon tarkoitettua tukimateriaalia voidaan varastoida ja kuljettaa tässä kuivassa muodossa tai siten, että ensin on suoritettu 20 leikkaus yksittäisiksi koeliuoskoiksi esim. kohtisuoraan antigeeniviivoja vasten. Liuskat voivat olla niin ohuita, kuin käytännössä on mahdollista, mutta niiden leveys ei saisi olla yli 3 mm. Varsinaista koetta varten voidaan kaikkia reagensseja helposti säilyttää lyofili-25 soidussa muodossa sopivina määrinä niin, että ne ovat rekonstruoitavissa koetta varten. Tutkittava seerumi laimennetaan sopivasti suolaliuokseen, joka sisältää tukkimisliuosta. Laimennussuhteet 1 : 100, 1 : 1000 ja 1 : 10 000 kattavat useimmat tarpeet. Liuska upo-30 tetaan yhteen näistä laimennetuista liuoksista, joka on kertakäyttöisessä upokkeessa, kuten sellaiseen, jota käytetään automatisoiduissa mikrotiträöksen la±-mennuslaitteissa, esim. säiliö, josta lisätään useita identtisiä näytteitä samanaikaisesti mikrotitrausle-35 vyjen koloihin. Yksittäiset kolot ovat tavallisesti 10 cm pitkiä, 4 mm leveitä ja 1 cm syviä. Liuskoja inkuboidaan näissä laimennetuissa liuoksissa esim. aika, joka on 2 tunnin ja yön yli seisottamisen välillä, 19 76888 huoneenlämpötilassa samalla varovaisesti sekoittaen.

Sitten ylimääräinen seerumi pestään pois puskuroidulla suolaliuoksella käyttämällä esim. kolmea perusteellista pesua. Pesujen ajoitus ei ole kriittinen. Sit-5 ten lisätään indikaattorivasta-ainenäytteet. Tämä on tavallisesti vuohelta saatua ihmisen anti-IgG:tä (raskas + kevyt ketju), johon on liitetty peroksidaasi, laimennettuna suhteessa 1 : 1000 ja käsittelyä jatketaan korkeintaan 2 tuntia. Laimennus tehdään tavallisesti 10 samaan tukkimisliuokseen. Sitten indikaattorivasta- aine pestään pois perusteellisesti, esim. 3 kertaa 10 minuutin ajan. Sitten indikaattorivasta-aine visualisoidaan sopivalla menetelmällä, kuten fluoresenssilla, autoradiografialla tai käyttämällä liitetylle entsyy-15 mille sopivaa substraattia. Peroksidaasin tapauksessa substraatti saattaisi olla O-dianisidiini tai kloori-naftoli vetyperoksidin läsnäollessa. Värireaktion annetaan kehittyä esim. 0,5-2 tuntia. Sitten luetaan yksittäiset vasta-ainetiitterit valitsemalla alkuperäisen 20 seerumin paras laimennus ja vertaamalla värin intensiteettiä vertailusarjän intensiteetteihin. Värin intensiteetti voidaan lukea myös suoraan jollakin densito-metrisellä laitteella, joko upottamalla liuska väliaineeseen, jolla on sopiva taitekerroin, niin, että se 25 tulee läpinäkyväksi, ja lukemalla transmissio, tai käyttämällä laitetta, joka on suunniteltu heijastuneen intensiteetin mittaukseen. Viimeksimainittuun tarkoitukseen sopivat sellaiset laitteet, joita käytetään ohutkerroskromatogrammien väri-intensiteetin mittaukseen, 30 ja samoilla laitteilla voidaan myös mitata fluoresenssin intensiteettiä. Jos indikaattorivasta-aineessa on fluoroiva merkki tai entsyymillä fluoroiva substraatti, se voidaan myös kvantifoida tällaisella laitteella.

Kun tiitteri määritetään käyttämällä kalibrointi-35 sarjaa sisäisen standardin, esim. ihmisen normaalin seerumin tai ihmisen puhtaan immunoglobuliinin,kanssa, yksikkö on kokonaisimmunoglobuliinin jae, joka on spesi- 76888 20 fisen vasta-aineluokan muodossa, tai tuon vasta-aineen yksinkertainen väkevyys massayksikköinä alkuperäisen seerumin tilavuusyksikköä kohti. Näin ollen tämä yksikkö on laajakäyttöinen verrattaessa eri yksilöiden seeru-5 meja tai plasmoja ja jopa suoritettaessa vertailuja eri määritysmenetelmien kanssa.

Seuraavassa kuvataan tarkemmin edullista tapaa suorittaa immuunimäärityksiä tämän keksinnön mukaisesti, kuitenkaan haluamatta rajoittaa keksintöä.

10 A) Yhden pisteen menetelmä (1) Levyn valmistus. Nitroselluloosalevylle piirretään ruudukko, jonka sivut ovat alle 4 mm, tai käytetään nitroselluloosalevyä, johon on painettu valmiiksi 3x3 15 mm ruudukko (Millipore Corporation). Levyä pestään 5 minuuttia tislatulla vedellä ja jätetään huoneenlämpötilaan kuivumaan. Seuraavia toimenpiteitä varten levyä pitäisi käsitellä tylpillä pinseteillä. Pesu ei aina ole tarpeen.

20 (2) Pisteiden teko. Kun suodatinlevy on kuiva, jo kaiseen ruutuun sijoitetaan pieni pisara antigeeniliuosta. Väkevyys vaihtelee antigeenistä antigeeniin. Antigeeni-komplekseille on 0,1 - 1,0 mg/ml sopiva, vähemmän monimutkaisten seosten ollessa kyseessä voidaan väkevyyttä 25 pienentää vastaavasti. On usein edullista kuivata suodatinlevy perusteellisesti tässä vaiheessa, koska kuivaus voi stabiloida sitoutumista. Nukleiinihappojen sitoutuminen vaatii 2 tuntia 80 °C:ssa. Levyjä, joihin on sijoitettu antigeenipisteitä, voidaan varastoida ympäris-30 tön lämpötilassa määrättömän pitkään ilman minkäänlaista aktiivisuudenmenetystä. Pisteiden pitäisi olla mahdollisimman pieniä. Pisteiden tekoon on edullista käyttää 20 yl:n mikropipetointilaitetta tai vaihtoehtoisesti 5 yl:n Drummond-mikroannostelijaa, jolla saadaan 0,5 yl:n 35 pisteitä, tai Hamilton-ruiskua, jolla saadaan 0,1 μ1:η pisteitä.Jos antigeeniliuos on hyvin laimeata, 21 76888 on mahdollista lisätä useita annoksia samaan kohtaan pitäen samalla huolta siitä, että suoritetaan kuivaus jokaisen lisäyksen välissä. Sitten suodatinlevy pestään TBS:ssä (tämä voi olla liuos, jonka pitoisuus on 0,15 -5 0,2 M NaCl, 0,01 - 0,05 M Tris-HCl, ph 7,4 - 7,8). Yksit täiset neliöt voidaan leikata nitroselluloosan ollessa vielä märkää tai kuivassa tilassa. Se voidaan leikata pienellä leikkausveitsellä tai saksilla yhdessä mukana olevan tukipaperin kanssa (tämä suojaa lohkeamiselta leik- 10 kaamisen aikana). Neliöt sijoitetaan etupuoli ylöspäin 96 kolon mikrotitrausalustan koloihin (Costar Inc. Cambridge, Mass.) .

(3) Tukkiminen. Jokaiseen kokoon lisätään 150 yl tukkimisliuosta, joka voi olla naudan seerumialbumiinia, 15 kokonaista seerumia tai mitä tahansa yhdistelmää. (Naudan seerumialbumiini voi olla 3-prosenttista, kanin, hevosen tai vuohen kokoseeruni voi olla 1 - 10-pro-senttista.) Joskus on tarpeen dekomplementoida seerumi kuumentamalla tukkimissysteemiä 30 minuuttia 56 °C:ssa.

20 Tukkimiskäsittely kestää 15 minuuttia - 2 tuntia lämpötilassa, joka on huoneenlämpötilan ja 40 °C välillä.

Näin valmistettuja suodatinlevyjä voidaan myös varastoida määrättömän pitkään ilman aktiivisuuden menetystä.

(4) Ensimmäinen inkubointi. Tukkimisliuos pois- 25 tetaan pipetin avulla, esim. käyttämällä imulinjaan kytkettyä Pasteur-pipettiä, ja lisätään tutkittava vasta-aineliuos (primäärinen vasta-aine). 150 yl koloa kohti riittää helposti, mutta puoletkin tästä määrästä käy. Inkubointiaika vaihtelee vasta-aineesta vasta-aineeseen.

30 Useimpiin tarkoituksiin riittää 2-4 tuntia, mutta yön yli tapahtuva inkubointi lisää herkkyyttä kymmenkertaisesti. Vasta-aineiden laimennukset pitäisi tehdä tukkimisliuoksiin.

(5) Pesu. Tutkittava vasta-aineliuos poistetaan 35 koloista, esim. kaatamalla, ja tukea pestään vähintään 4 kertaa mielellään TBS-liuoksella, ja pesun kestoaika 76888 voi olla mitä tahansa muutaman minuutin ja useiden tuntien väliltä.

(6) Sekundäärinen inkubointi. Tukea inkuboidaan esim. 2 tuntia 100 - 150 ylrssa "primäärisen lajin" anti-5 immunoglobuliinia, joka on liitetty piparjuuriperoksidaa-siin, ravistelemalla hitaasti huoneenlämpötilassa, jolloin "primäärisellä lajilla" tarkoitetaan tutkittavaa vasta-ainetta. Jos esim. primäärinen vasta-aine on muodostunut hiiressä, käytetään joko peroksidaasiin liittynyttä 10 vuohen anti-hiiri-IgG:tä, esim. Nordic Laboratories, Tillburg, Netherlands, tai kanin anti-hiiri-IgG:tä, DAKO, Kööpenhamina, Tanska. Jos halutaan analysoida kanin tai ihmisen seerumeja, voidaan käyttää vastaavia sopivia sekundäärisiä (indikaattori) vasta-aineita, joita 15 on saatavissa esim. mainituista firmoista. Tiettyjen vasta-aineluokkien ilmaisuun voidaan käyttää luokkaspesi-fisiä sekundäärisiä vasta-aineita, kuten sellaisia, jotka ovat spesifisiä IgG:n, IgA:n, IgM:n, IgD:n tai IgE:n suhteen, ja joita on saatavissa edellä mainitusta fir-20 masta Nordic Laboratories. Vasta-aineliuoksen väkevyys vaihtelee vasta-aineen mukaan (tehty mielellään tukki-misliuokseen, vaikka muitakin laimentimia voidaan käyttää) , mutta tukkimisliuokseen tehty vasta-aineen laimennus suhteessa 1 : 1000 on edullinen.

25 (7) Toinen vasta-aine poistetaan suorittamalla pesu kohdassa (5) kuvatulla tavalla.

(8) Kehitys. Peroksidaasin kromogeenisenä substraattina voidaan käyttää 4-kloori-1-naftolia (Merck), o-dianisidia tai 3,3-diaminobentsidiiniä. On edullista 30 käyttää 4-kloori-1-naftolia metanoliin tehtynä varasto-liuoksena (3 mg/ml), jota voidaan säilyttää korkeintaan viikko jäähdytettynä pimeässä. Juuri ennen käyttöä se pitäisi laimentaa 5-30 tilavuudella TBS:ää ja tehdä 0,01 - 0,03-prosenttiseksi vetyperoksidiin (taval-35 lisesti saatavissa 30 % vesiliuoksena). Keloa kohti tarvitaan noin 100 - 150yl kehitysliuosta. Positiiviset 23 76888 värireaktiot alkavat kehittyä 2 minuutissa ja 2 tunnin kuluttua ei ole enää havaittavissa värinmuodostusta. Kun reaktio on tapahtunut täydellisesti, tuki pestään tislatulla vedellä tai johtovedellä.

5 (9) Varastointi. Nitroselluloosalevyt voidaan kiin nittää valokuvauksessa käytetyllä kautsuliimalla niiden ollessa vielä kosteita. Kuivina niitä pitäisi säilyttää pimeässä.

10 B) Usean pisteen menetelmä

Noudatetaan samoja vaiheita seuraavin muunnoksin: Antigeenit lisätään ruudukon yhdensuuntaisiin riveihin ja tukkiminen suoritetaan koko levylle ennen leikkausta. Levy pestään nopeasti, kuivataan ja varastoidaan sellai-15 senaan. Ennen käyttöä levy kostutetaan TBSillä ja sopiva määrä liuskoja leikataan irti kohtisuoraan antigee-nirivejä vasten, niin, että saadaan liuskoja, jotka sisältävät yhden pisteen kutakin antigeeniä. Liuskat sijoitetaan 1 - 1,5 ml:aan muovialustalla olevia laimen-20 nettuja seerumeja, valmistaja Dynatech (Alexandria, Virginia), "Disposable Reservoir Inserts". Näillä on samat dimensiot kuin mikrotitrauslevyillä ja multipipetointivälineillä ( esim. Finpipette Multichannel Pipette). Alustoilla voidaan laimentaa 8 tai 12 näytettä 25 samanaikaisesti. 8 kanavan upokkeessa voidaan käyttää korkeintaan 32 erilaista antigeeniä 10 cm:n nitrosellu-loosaliuskalla. Pesua varten neste kaadetaan ensin pois alustalta ja jäännös heitetään pois. Pesuneste lisätään altaisiin pesupulloista. Sekundääristä vasta- 30 ainetta varten käytetään 1 - 1,5 ml liuosta.

C) Kvantifiointi Tämä suoritetaan sisäisellä standardilla käyttämällä joko sarjaa puhdasta immunoglobuliinia tai koko-35 seerumia, joka sisältää tunnetun määrän kokonaista immunoglobuliinia. Värin voimakkuutta verrataan standar- 76888 24 dien värinvoimakkuuksiin joko silmällä tai käyttämällä skannauslaitetta. Reflektanssi mitataan ohut-kerroskromatografisella skannerilla ja saadaan tulokseksi määrä kolmen kymmenyksen dynaamisella alueella.

5 Alkuperäisen seerumin vasta-aineväkevyys lasketaan standardikäyrästä, jossa on esitetty reflektanssi immuno-globuliinimäärän suhteen.

Tämän keksinnön mukaisen vasta-aineiden määritysmenetelmän toistettavuus värireaktion suhteen on erittäin 10 hyvä, kun käytetään edellämainittuja indikaattorivasta-aineita, ja kun olosuhteet on muuten standardisoitu.

Tämä värireaktio on kvantitatiivinen vasta-ainetiitterin mitta, kun seerumista tai plasmasta tehdään sopiva laimennus. Lisäksi analyysi voidaan tehdä kvantitatiivisek-15 si käyttämällä sisäisenä standardina ihmisen immunoglo-buliinia laimennettuna sarjana esim. siten, että mikro-huokoiseen tukeen lisätään standardisoidut määrät ihmisen puhdasta IgG:tä, ennenkuin epäspesifiset kohdat tukitaan edelläkuvatulla tavalla. Tämä antaa standardivärisarjän 20 kokeen jälkeen ja kompensoituu automaattisesti niiden vaihteluiden suhteen, jotka johtuvat tuntemattomasta seerumista tai plasmasta. Yksi vaihteluiden syy on se, että yksittäiset seerumit antavat erilaisia taustareaktioita sitoutuessaan joko epäspesifisten sidoskohtien tukkimiseen 25 käytettyihin proteiineihin tai niihin mikrohuokoisen levyn epäspesifisiin kohtiin, jotka ovat välttäneet tuk-kimisvaiheen. Tämä tausta vaihtelee yksittäisten seerumien kohdalla tuntemattomista syistä, ja tällä seikalla saattaisi jo sinänsä olla diagnostista arvoa. Kuiten-30 kin pisteiden muotoon lisätyt antigeenit antavat mahdollisuuden visuaalisesti hyvin herkästi todeta vasta-aineen läsnäolon tai poissaolon.

Tällaiset pienet erot on hyvin vaikea havaita visuaalisesti, kun on kyseessä tavalliset entsyymeihin 35 kytketyt vasta-ainemääritykset, jotka riippuvat mikrotit-rauslevyjen käytöstä, sillä tällöin voidaan esim. joutua vertaamaan toisiinsa eri koloissa olevia hyvin saman- 76888 laisia näytteitä. On aivan odottamatonta, että antigeenin ollessa fyysisesti rinnakkain oman taustansa kanssa mikrohuokoisella levyllä voidaan havaita merkittäviä eroja, jotka muuten olisi mahdotonta määrittää 5 silmällä tai spektrofotometrisesti.

Edellämainittu kvantitatiivinen värireaktio ja sisäisten standardien käyttö tekee mahdolliseksi yksittäisten vasta-aineiden tiitterien kvantitatiivisen määrityksen. Tämä voidaan tehdä millä tahansa sellaisella 10 tavallisella sensitometrillä, jota käytetään elektro-ferogrammien tai kromatogrammien analysoinnissa.

Optinen tiheys voidaan määrittää tekemällä mikrohuokoi-nen levy läpinäkyväksi upottamalla se sellaiseen liuot-timeen, jolla on sopiva taitekerroin, ja joka ei liuota 15 värillistä reaktiotuotetta eikä mikrohuokoista levyä. Radioaktiivisuuden skintillaatiolaskennasta tiedetään hyvin, että tolueeni tekee nitroselluloosan radioaktiiviseksi tällä tavalla. Käytännössä tolueeni, ksyleeni tai glyseroli-vesiseos tekevät tuen läpinäky-20 väksi, mutta eivät liuota o-dianisidin hapettumistuotetta. Lisäksi vasta-ainetiitterille saadaan kvantitatiivinen vaste käyttämällä vasta-ainetta tuhatkertaisesti alemmalla väkevyysalueella, kuin antigeenin kyllästäminen vaatisi. Tästä syystä ei tarvita yksityiskohtaista laimennussarjaa, 25 ja tämä seikka tekeekin keksinnön erityisesti rutiini-käyttöön soveltuvaksi.

Joidenkin sairauksien kohdalla, varsinkin kroonisissa infektioissa, tiedetään, että tietyn luokan vasta-aineiden heterogeenisen populaation väkevyys kasvaa, mutta 30 reaktiivisuus on tuntematon. Tätä kutsutaan polyklonaali-seksi gammopatiaksi. Tällaisen sairauden diagnostisointia helpottaa, jos tällaisen potilaan suuren määrän satunnaisesti valittuja antigeenejä sisältävä seerumi tai plasma voidaan tutkia.

35 Esimerkiksi tarttuvaa mononukleoosia sairastavan po tilaan seerumi osoittaa odottamatta suuria vasta-ainetiit-tereitä 10 antigeeniä vastaan, kun antigeenejä on kaikki- 76888 26 aan 17, vertailuantigeenien vastaiset tiitterit mukaanluettuina (esimerkki 3). Erityisen korkea on vasta-aine-tiitteri tuhkarokkovirusta vastaan, joka ei ole antigee-nisesti sukua, ja jolla ei ole aikaisemmin kuvattu ole-5 van mitään yhteyttä tarttuvan mononukleoosin syiden kanssa, joka johtuu täysin eri viruksen aiheuttamasta tartunnasta. Tämä tiitteri on jopa suurempi kuin siinä seerumissa, jota on kaupallisesti saatavissa tuhkarokon positiiviseksi kontrolliksi ihmisen seerumia varten. Tämä 10 odottamattoman korkean tuhkarokkoviruksen vastaisen tiit-terin havainto on hyödyllinen tarttuvan mononukleoosin diagnostisoinnissa. Edelleen yksityiskohtainen vasta-aineprofiili on tärkeä uusi väline haluttaessa diagnostisoida sairauksia, joihin liittyy polyklonaalinen 15 gammopatia.

Edellä kuvatut tämän keksinnön mukaiset välineet eivät rajoitu vain vasta-aineanalyyseissä käytettäviksi; ne sopivat mihin tahansa luonteeltaan biokemiallisiin tai immunologisiin analyyseihin, joissa on kyseessä 20 luonnossa esiintyvät eläimistä tai kasveista peräisin olevat makromolekyyliset orgaaniset aineet, kuten luonnossa esiintyvät tai keinotekoisesti tuotetut proteiinit, luonnossa esiintyvät proteiinikonjugaatit, kuten glykoproteiinit, lipoproteiinit tai proteiini-25 nukleiinihappokompleksit, kunhan ne vain voidaan lisätä huokoisille tukimateriaaleille mainitulla tavalla. Immu-noglobuliinit sitoutuvat myös mainittuihin tukimateri-aaleihin, ja juuri tästä syystä edelläkuvatussa kokeessa pitää eliminoida epäspesifinen taustasitoutuminen ennen 30 immunologisen määrityksen suorittamista. Ribonukleiini-happoja ja deoksiribonukleiinihappoja voidaan myös käyttää tämän keksinnön mukaisiin uusiin pakkauksiin liittyvissä määrityksissä, jolloin viimeksimainitut ovat erittäin tärkeitä kuuluessaan autoimmuunisairauksien tutki-35 musohjelmaan.

Tämän keksinnön mukaiset välineet ovat myös sopivia reumaattisen tekijän ja kiertävien immuunikompleksien ilmaisemiseen. Tällaisia immunoglobuliineja tai 27 76888 immunoglobuliinikomplekseja tavataan usein sellaisten potilaiden seerumeissa, joilla on kroonisia tulehdustiloja, ja varsinkin sidekudossairauksien yhteydessä. Reumaattisen tekijän ollessa kyseessä eläinlajin, esim.

5 kanin IgG:tä lisätään huokoiseen tukimateriaaliin, esim. selluloosaan, suoritetaan inkubointi edellä kuvatun tukkimisliuoksen kanssa ja sitten inkuboidaan tutkittavan seerumi, esim. ihmisen seerumin kanssa. Reumaattinen tekijä sitoutuu pakkauksen IgG:iin ja näin muodos-10 tunut kompleksi ja sidottu reumaattinen tekijä voidaan tunnistaa indikaattorivasta-aineella, joka kohdistuu analysoitavaa seerumilajia vastaan ja on esim. anti-ihmisvasta-aine, esim. kanin anti-ihmisvasta-aine. Indi-kaattorivasta-aine on, kuten tavallista, liitetty ent-15 syymiin, joka muodostaa värillisen reaktiotuotteen sopivan substraatin kanssa. Jos järjestely suoritetaan sellaisen reumaattisen tekijän ilmaisemiseksi, joka ei ole lajispesifinen, kuten ihmisen reumaattinen antikanitekijä, olisi odotettavissa, että toisen lajin, kuten hevosen, 20 suuri IgG-ylimäärä, joka on tukkimisliuoksessa, tunkisi kilpailussa tehokkaasti ulos lajiin kuulumattoman spesifisen vasta-aineluokan. Näin ei yllättävää kyllä tapahdu.

Kun kyseessä ovat immuunikompleksimääritykset, proteiini Clg säilyttää kykynsä sitoa antigeeni-vasta-aine-25 komplekseja myöskin nitroselluloosalle varastoituna. Tämä on hyvin yllättävää, kun ajatellaan proteiinin tunnettua epästabiilisuutta. Se pysyy stabiilina ympäristön lämpötilassa tuella kuivana.

Se antigeenien ryhmä, jota voidaan käyttää tämän kek-30 sinnön mukaisissa uusissa pakkauksissa, jotka on tarkoitettu esim. immunologisiin määrityksiin, on hyvin laaja ja sisältää esim. ihmisen koepalamateriaalin, nisäkkään kudoksen tai solut, kehon nesteet, mykoplasman, metazoaloiset, sienet, bakteerit, protozoan, virukset 35 ja mistä tahansa näistä johdetut preparaatit. Esimerkeissä mainittujen antigeenien ulkopuolelta voidaan mainita seuraavat, jotka sopivat käytettäviksi tämän keksinnön mukaisesti: virukset ja niistä valmistetut antigee- 76888 28 nit, kuten influenssakannat, A, A^, B, C mukaan luettuina, parainfluenssakannat 1, 2 tai 3, lymfosyyt-tinen koriomeningitisvirus, mumps, Q-kuume Rickettsia, vesikauhu, respiratorinen synkytiaalivirus, Rotavirus, 5 vihurirokkovirus, adenovirus, Eppstein Barr-virus, bru-kella, hepatitis B, Cocksackie B1-B6, A9, polio T, 2 tai 3, reo, echo 1-33, sieniperäiset antigeenit, kuten Histoplasmosa capsulatum, Coecidioides immitis,

Blastomyces dermatitidis, Aspergillus fumigatus, flavus 10 tai carnea, loisperäiset antigeenit, kuten Entemeba histolytica, Trypanosoma cruzi, Echinococcus granulosis, Schistosoma mansoni, bakteeriperäiset antigeenit, kuten Spirochete reiter, Treponema pallidum, Escherichia coli, Leptospira, Listeria, Salmonella, Shigella, stafylokokit, 15 spreptokokit, Legionella pneumophilia, autoantigeenit, kuten ydin-RNP, komplementtijakeet, ihmisen seerumin proteiinit, reumaattinen tekijä, insuliini, insuliini-reseptori, kilpirauhasta stimuloivan hormonin reseptori, asetyylikoliinireseptori ja muut hormonit ja reseptorit, 20 kaikki allergeenit, kuten heinäkasviperäiset, esim. Dactylis glomerata, Festuca elatior, Lolium perenne,

Phleum pratense, Poa pratensis, Agristis stolonifera,

Secale cereale, yrttiperäiset, kuten Artemis vulgaris, Chrysanthemum leucanthemum, Chenopodium album, Taraxum 25 vulgare, Solidago virgaurea, Ambrosia trifidia, puuperäiset, kuten Olea europea, Juglans californica, Ulmus americana, Colylus avellana, Platanus acerifolia, sienet, kuten Penicillium notatum, Cladosporium herbarum, Aspergillus fumigatus, eläinten epiteeli, kuten kissat, hevoset, 30 nautaeläimet, koirat tai marsut, ruoka-aineet, kuten maito, vehnä, mantelit, ravut, katkaravut, punkeista, pölystä, hyönteisistä, kuten mehiläisistä tai ampiaisista, ja lääkeaineista, kuten penisilliini G:stä, penisilliini V:stä, synakteenistä, steroideista jne. peräi-35 sin olevat.

29 76888

Immunologiset menetelmät ovat myös erittäin tärkeitä tiettyjen lääkkeiden ilmaisussa ja seurannassa. Tällaiset kokeet perustuvat monoklonaalisten vasta-aineiden käyttöön esim. sairauden hoidon aikana niin, että 5 huokoiseen tukeen lisätään spesifisiä vasta-aineita ja spesifiset antigeenit tunnistetaan ja kvantifioidaan käyttämällä edellä selostettua immuunimääritysmenetelmää käänteisesti. Sitten komplementtiproteiinien kykyä sitoutua spesifisesti antigeeni-vasta-ainekomplekseihin 10 voidaan käyttää suoraan tai epäsuorasti, jotta saataisiin visualisoiduiksi ja kvantifioiduiksi spesifiset antigeenit, kuten lääkkeet tai muut farmakologiset reagens-sit tai hormonit tai mitkä tahansa tällaisten antigeenien yhdistelmät, käyttämällä tämän keksinnön mukaista pakkaus-15 ta. Näin ollen tämä keksintö sisältää myös immunologisen menetelmän, jolla voidaan analysoida millaisia antigeenejä tahansa, kuten lääkkeitä ja hormoneja, siten, että vastaavia monoklonaalisia tai spesifisiä vasta-aineita lisätään kiinteään tukimateriaaliin keksinnön mukaisesti 20 ja antigeeni-vasta-ainekompleksit ilmaistaan esim. komplementilla, kuten komplementti Clqrlla, tai entsyymireak-tioilla, jotka liittyvät vasta-aineen ja antigeenin väliseen vuorovaikutukseen. Biologisten nesteiden sisältämien spesifisten lääkkeiden ja hormonien seuraamista diag-25 nostisissa tarkoituksissa on viime vuosina helpotettu, kun on voitu käyttää ns. "homogeenisiä vasta-aineidenmää-rityssysteemejä", joita on saatavissa tavaramerkillä EMIT (Syvä Corporation, California). Näissä määrityksissä ei tarvita sitä perusteellista pesua, joka liittyy 30 muihin immuunimäärityssysteemeihin, ja ne ovat näin ollen sekä helpompia käyttää että nopeampia. Homogeeninen vasta-aineidenmääritys riippuu kyseisen lääkkeen tai hormonin vastaisen spesifisen vasta-aineen käytöstä, adduktista, joka muodostuu lääkkeen tai horraonimole-35 kyylin välille, ja signalointimolekyylistä. Signalointi-molekyyliaddukti on addukti, johon liittyy mitattavissa oleva 76888 30 signaali sen sitoutuessa spesifiseen vasta-aineeseen.

Kun viimeksimainittu sitoutuminen estyy kyseisen lääkkeen tai hormonin läsnäolon vuoksi, syntyy positiivinen signaali, joka on suhteessa biologisen nesteen 5 sisältämän hormonin tai lääkkeen väkevyyteen. Signa-lointimolekyyli voi olla indikaattorientsyymi itse tai substraatti, indikaattorientsyymin kofaktori tai prosteettinen ryhmä tai sarja kytkettyjä entsyymejä, joka johtaa mitattavissa olevaan signaaliin.

10 Äskettäin ilmestyneessä julkaisussa D.L. Morris, P. B. Ellis, R. J. Carrico, F. M. Yeager, H. R.

Schroeder, J. P. Albarella, R. C. Bogulaski, W.E.

Hornby ja R. Dawson, "Flavin Adenine Dinucleotide as a Label in Homogenous Colorimetric Immuno-assays", 15 Analytical Chemistry, vol. 53, ss. 658-665 (1981) kuvataan menetelmää, jossa analyytin molekyyli kytketään kovalenttisesti flaviiniadeniinidinukleotidiin, joka on glukoosioksidaasientsyymin prosteettinen ryhmä. Analyytin ja flaviiniadeniininukleotidin addukti, joka on 20 sitoutunut spesifiseen vasta-aineeseen, ei kykene aktivoimaan glukoosioksidaasia. Jos analyytin läsnäolo estää adduktin sitoutumisen spesifiseen vasta-aineeseen, glukoosi-oksidaasi aktivoituu ja aktivoituminen on suhteessa tuntemattoman lääkkeen tai hormonin määrään. Akti-25 voutunut glukoosioksidaasi tuottaa vetyperoksidia reaktiotuotteena ja vetyperoksidi on peroksidaasin substraatti, jota voidaan käyttää yhdessä kromogeenisen substraatin kanssa niin, että aiheutuu värireaktio.

Homogeenisiä vasta-aineidenmäärityssysteemejä voi-30 daan helposti soveltaa käytettäviksi tämän keksinnön mukaiseen menetelmään liittyvässä kiinteässä tukimateriaalissa. Spesifinen vasta-aine ja signalointisysteemin makromolekulaariset komponentit, esim. glukoosioksidaasi ja piparjuuriperoksidaasi, voidaan lisätä suoraan kiinteäl-35 le tukimateriaalille mihin tahansa haluttuun geometriseen muotoon, mielellään samaan paikkaan. Tällöin fyysi- 31 76888 sestä yhteensattuvuudesta on etua toisiinsa kytkettyjen ent-symaattisten reaktioiden kannalta. Tämän keksinnön mukaisten menetelmien mukaan voidaan samaan tukeen sijoittaa useita vasta-aineita ja signalointisysteemin indikaattorientsyymejä helpottamaan useiden antigeenien samanaikaista määrittämistä. Tämä mahdollisuus on hyvin hyödyllinen esim. lääkkeiden väärinkäytön mittaukseen tarkoitetuissa pakkauksissa ja spesifisten bakteeriperäisten antigeenien identifiointipakkauk-sissa.

Tämä keksintö, sikäli kun se liittyy esim. uusien välineiden valmistukseen, joita käytetään immunologiassa, ja tällaisten välineiden käyttöön immuunimääritykeissä kuvatulla tavalla, kattaa myös tällaisten prosessien yksittäiset vaiheet .

Lisäksi keksintö koskee kiinteiden tukien muodossa olevien kuvattujen välineiden lisäksi myös tarjottimia ja muita laitteita, joita tarvitaan kiinteiden tukien käsittelyssä määrityksiä varten, sekä osiin jaettuna tai kuivassa muodossa olevia valmiita reagensseja, kuten tiettyjä määriä kanta-jaseerumia, indikaattorivasta-aineita, peroksidaasin substraatteja jne. Tällaiset pakkaukset on saatettu esim. sellaiseen muotoon, että ne sisältävät tämän keksinnön mukaiset välineet, jotka ovat esim. nitroselluloosalevyjen tai liuskojen muodossa, ja mitkä tahansa edellämainitut apuvälineet. Erityisesti tarjottimet voivat olla useita koloja sisältäviä muovitarjottimia, ja kuivatut reagenssit voivat sisältää indikaattorivasta-aineiden, suolojen, puskurin, kantajasee-rumin tai -proteiinien muodostaman lyofilisoidun seoksen, indikaattorientsyymien värireagenssit punnittuina määrinä kromogeenista substraattia, esim. 4-kloori-l-naftolia, suoloja, puskuria ja mukana voi olla ampulleja, jotka sisältävät mitatut määrät nestemäisiä substraatteja, esim. vetype-roksia.

Keksintö koskee erityisesti pakkausta, jossa reagenssit 32 768 8 8 indikaattorisysteemiä varten ovat (a) radioaktiivisesti leimattu vasta-aine, fluoresoivaan indikaattoriin konjugoitunut vasta-aine tai vasta-aine, joka on konjugoitunut entsyymiin, joka kykenee saamaan aikaan vä-rireaktion sopivan substraatin kanssa, tai (b) vasta-aine ja radioaktiivisesti leimattu tai fluoresoivaan indikaattoriin tai entsyymiin konjugoitunut komplement-tiproteiini, tai (c) vasta-aine, komplementtiproteiini ja komplementtispesi-finen vasta-aine, joka on radioaktiivisesti leimattu tai konjugoitunut fluoresoivaan indikaattoriin tai entsyymiin.

Indikaattorisysteemin valinta riippuu siitä suoritetaan-ko detektointi ja kvantifiointi radioaktiivisuuslaskennalla, autoradiografiällä, fluorimetrisesti, densitometrisesti vai visuaalisesti.

Edelleen keksintö koskee erityisesti pakkausta, jossa laitteet immunologisten reaktioiden suorittamiseksi tarkoittaa monikoloista muovitarjotinta ja että indikaattorisysteemin reagenssit tarkoittavat lyofilisoitua seosta, jossa on entsyymikonjugoitua vasta-ainetta, suoloja, puskureita ja kantajaseerumia tai kantajaproteiinia, lyofilisoitua seosta, jossa on ennaltamäärätyt määrät entsyymin kromogeenista substraattia, suoloja ja puskureita, ja ampulleja, jotka sisältävät ennaltamäärätyt tilavuudet nestemäistä entsyymi-substraattia.

Edelleen keksintö koskee erityisesti pakkausta, jossa huokoinen kiinteä tukiaine sisältää ryhmiteltynä yhtä tai useampaa spesifistä vasta-ainetta ja reagenssit indikaattorisysteemiä varten sisältävät substraatin, kofaktorin tai prosteettisen ryhmän indikaattorientsyymille tai kytketylle entsyymisarjalle, joka signaloi antigeeni-vasta-ainereak-tiota, tai signaalisysteemi on kovalenttinen entsyymi-anti-geeniaddukti.

Kiinteä tukiaine sisältää edullisesti ryhmiteltynä ih- 33 76888 misestä tai eläimistä peräisin olevia immunoglobuliineja tai niiden fragmentteja, jotka on tarkoitettu reumafaktorin de-tektointiin ja kvantifiointiin, tai ryhmiteltynä komplement-tiproteiinia, joka on tarkoitettu kiertävinä immuunikomplekseina tunnettujen antigeeni-vasta-ainekompleksien detektioon.

Keksintö koskee edelleen kaikkien yllä määriteltyjen pakkausten ja laitteiden käyttöä spesifisten antigeenien ja/ tai spesifisten vasta-aineiden detektioon tai kvantifioin-tiin immunomääritysmenetelmillä, kun halutaan diagnosoida, seurata tai ennustaa ihmisten tai eläinten sairauksia, tai mainittuja antigeenejä ja vasta-aineita koskevassa tutkimus-ja kehitystyössä.

Keksintöä valaistaan seuraavilla esimerkeillä.

Kaikki lämpötilat ovat Celsius-asteita.

Esimerkki 1: Pisteen koon vaihtelu

Ihmisen kokonaista seerumia lisätään suoraan Milli-porelevylle (huokoskoko 0,45 ym) ja sen sisältämä IgG värjätään vuohen anti-ihmis-IgG:llä, johon on liitetty peroksidaasi. Lisättyä tilavuutta vaihdellaan pienimmän käyttökelpoisen mikropistekoon löytämiseksi.

Normaali ihmisen seerumi laimennetaan tilavuussuhteessa 1 : 1000 TBS:llä (0,15 M NaCl, 0,02 M Tris-HCl, pH 7,4), joka sisältää 2 % naudan seerumialbumiinia. Tätä liuosta lisätään pisteiksi suoraan mikroruiskulla (mielellään Hamilton-mikroruisku), jolla on 0,1 yl:n asteikko, Milli-porekaistalle ( 3 mm x 100 mm). Sitten levy kuivataan, ja sen jälkeen liotetaan TBSrssä, joka sisältää 10 % (tilav/tilav) hevosen seerumia, 40°C:ssa 2 tuntia niin, että Milliporelevyn epäspesifiset proteiinien sidoskoh-dat saadaan tukituiksi. Levy pestään TBS:llä ja sen jälkeen sitä liotetaan 1 ml:ssa vuohen anti-ihmis-IgG:tä, joka on liitetty peroksidaasiin (Nordic Laboratories,

Tilburg, Netherlands), ja joka on liuotettu tislattuun veteen valmistajan ohjeiden mukaan ja laimennettu 1 : 1000 TBS:ään, jossa on 10 % hevosen seerumia. Käsittelyt suoritetaan kolossa, joka sijaitsee kertakäyttöisessä, 76888 34 8 allasta sisältävässä upokesäiliössä (Dynatech Laboratories, Alexandria, Virginia, USA). Inkubointi vasta-aineen kanssa, johon on liitetty peroksidaasi, suoritetaan huoneenlämpötilassa 2 tunnissa varovaisesti 5 sekoittaen. Ylimääräinen vasta-aine poistetaan pesemällä perusteellisesti TBStllä. Lopuksi valmistetaan peroksidaasin substraattiliuos, jossa on 5 ml TBS, 1 μΐ vetyperoksidin 30 % vesiliuosta ja 10 μΐ o-dianisidia (1 % paino/tilav metanolissa), ja 1 ml tätä liuosta li-10 sätään altaaseen. Sitten reaktion annetaan tapahtua 2 tuntia pimeässä. Ylimääräiset reagenssit pestään pois tislatulla vedellä, liuska kuivataan ilmalla huoneenlämpötilassa ja pisteiden koko mitataan Vernier-mittaharpilla. Näin saadaan seuraavat tulokset: 15

Seerumin tilavuus Pisteen halkaisija 0,8 μΐ 1,5 mm 0,6 μΐ 1,3 mm 20 0,4 μΐ 1,0 mm 0,2 μΐ 0,6 mm 0,1 μΐ 0,3 mm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Mikropisteen halkaisija on lineaarinen lisätyn 2 tilavuuden suhteen, kun tämä on alueella 0 - 0,2 μΐ.

3

Tilavuuksien ollessa suurempia lineaarisuus häviää 4 johtuen luultavasti adsorptiosta lisäyskohdassa. Jos 5 taas käytetään ruudukolla varustettuja Millipore-levyjä, 6 on muste riittävän hydrofobista niin, ettei neste le 7 viä painettujen neliöiden ulkopuolelle. Mikropiste- 8 svsteemin sisäinen erotuskyky on selvästi alempi kuin 9 pienin tilavuus, joka voidaan lisätä tavallisilla 10 pipetointilaitteilla, nimittäin << 0,3 mm. 100 mm:n 11 pituinen standardiliuska, joka sopii hyvin "upoke-altaaseen", jota tässä käytetään, voisi sisältää 76888 300 yksittäistä antigeeniä, jotka on sijoitettu yksi- dimensionaaliseksi pisteryhmäksi. Jos käytetään kaksi- 2 dimensionaalista pisteryhmittelyä, 10 an alueelle voidaan sijoittaa jopa 10 ^ yksittäistä koetta.

5 Esimerkki 2: Influenssavirusvasta-aineiden epidemio loginen seulonta

Flow Laboratories (Rockville, Maryland, USA) on toimittanut sarjan standardi-influenssaviruksia, joita käytetään standardihemagglutinaatiokokeissa. Virusperäi-10 set antigeenisuspensiot lisätään pisteiksi Millipore- levyn (huokoskoko 0,45 μη) merkittyihin neliöihin (3 mm x 3 mm), jota saadaan valmiiksi painettuna tuottajalta. Lisätyt näytteet ovat 0,5 μ 1 laimentamatonta materiaalia. Influenssarokotteella (Sandoz "Sandovac") tehdään myös 15 piste.

Näytepisteet ryhmitellään suoriksi jonoiksi niin, että jokainen suora linja sisältää vain yhden ja saman kannan pisteitä siten, että käsittelyn jälkeen levyt voidaan leikata liuskoiksi, joista jokainen sisältää aina 20 yhden pisteen koko antigeenisarjasta.

Sitten levyn sisältämät epäspesifiset sidoskohdat tukitaan esimerkin 1 mukaisesti hevosen seerumilla ja kuivataan.

Koevälinettä voidaan kuivana säilyttää määrättömän 25 pitkä aika ympäristön lämpötilassa aktiivisuuden häviämättä.

Seerumia otetaan henkilöltä, joka on immunisoitu edellämainitulla rokotteella noin kuusi viikkoa aikaisemmin. Tästä seerumista tehdään laimennukset TBSrään 30 (10 % hevosen seerumia) lähtien 100-kertaisesta laimen nuksesta ja edeten sitten 5-kertaisin askelin.

Koevälineestä leikataan liuskasarja edelläkuvatulla tavalla.

Liuskoja liotetaan yön yli laimennetuissa seeru-35 meissä ympäristön lämpötilassa varovaisesti sekoittaen 76888 36 ja sen jälkeen pestään perusteellisesti TBS:llä. Sitten sitoutunut vasta-aine värjätään vuohen anti-ihmis-IgG:llä, johon on liitetty peroksidaasi, täsmälleen samoin kuin esimerkissä 1. Vasta-ainetiitteri määritetään päätepiste-5 menetelmällä suurimpana laimennuksena, jolla väri vielä näkyy, ja tiitteri ilmaistaan tämän laimennuste-kijän käänteisarvona. Näin saadaan seuraavat tulokset.

Kokeessa käytetty antigeeni__Vasta-ainetiitteri 10 Sandovac-rokote (seos) A/Brazil/11/78 A/Bankok/1/79 ’ 625,000 A/Singapore/222/79 ,, 15 Flow-hemagglutinaatiokokeen antigeenit A/PR-8/34 2,500 A-l/FM-1/47 12,500 A-2/Hong Kong/68 <100 A-2/England/42/72 < 100 20 A-2/Japan/170/62 < ioo B/Lee/40 500 B/Mass/3/66 500

Negatiivinen virusvertailukoe < 100 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 2

Tulokset osoittavat, että seerumilla on erittäin 3 korkea vasta-ainetiitteri sen antigeenin suhteen, jolla 4 yksilö on rokotettu, ja vaihtelevat, mutta suuruudeltaan 5 merkittävät tiitterit joitakin historiallisia influenssa- 6 kantoja vastaan, ja seerumilla ei ole mitään havaittavisa 7 olevaa tiitteriä vertailuantigeenivalmisteen suhteen, 8 joka ei sisällä virusta. Näin ollen kaikki influenssa- 9 kannat voidaan helposti titrata yksilön seerumin suhteen 10 yhdellä ainoalla toimenpiteellä. Menetelmä on myös 11 hyvin herkkä; päätepiste on noin 10^-kertaisessa laimennuksessa suuren tiitterin vasta-aineilla. Lisäksi menetelmässä tarvitaan hyvin vähän seerumia: 10 μ 1 per 37 76888 1 ml väliainetta alhaisimpaan laimennukseen. Menetelmän edut ovat huomattavat verrattuna tavanomaisiin hem-agglutinaation inhiboitumiskokeisiin tai komplementti-fiksaatiokokeisiin, joissa jokaista antigeeniä varten 5 tarvitaan erilliset määritystoimenpiteet. Tulokset voidaan myös taltioida liuskoille pysyvästi ja varastoida määrättömän pitkä aika.

Esimerkki 3: Kymmenestä olemassaolevasta diagnos- 10 tisesta kokeesta konstruoitu väline Väline konstruoidaan tekemällä pisteitä markkinoilla olevista antigeeneistä esimerkin 2 mukaisesti. Käytetään seuraavia antigeenejä ja laimennustekijöitä niin, että saadaan maksimaalinen vaste. Kaikki anti-15 geenit laimennetaan TBS:ään.

Antigeeni Käytetty lai mennus

Behring

Toxoplasma fluoroivasta vasta-ainekoe-2o pakkauksesta laimentamaton

Tuhkarokon hemagglutinaation inhibiitiokoe 1/25

Papukaijakuumeen komplementti- fiksaatiokoe laimentamaton

Herpes Simplex tyyppi 1, komplementti-25 fiksaatiokoe 1/25

Mycoplasma pneumoniae, komplementti-fiksaatiokoe 1/5

Punkin kantaman encephalitis-viruksen komplementtifiksaatiokoe laimentamaton

Varicella Zoster-virus, komplementti-30 fiksaatiokoe 1/5

Flow

Adenovirus, tyyppi 4 virus, komplementti-fiksaatiokoe 1/5

Cytomegalovirus <Ad 169)-virus, komplementtif iksaatiokoe 1/5

Sandoz

Sandoz-influenssarokote laimentamaton 35 38 76 8 8 8 Nämä esimerkit on valittu sillä perusteella, että diagnostiseen pakkaukseen kuuluu osana positiivinen ihmisen seerumivertailunäyte. Kuitenkin, kuten jo ensimmäisestä esimerkistä ilmenee, antigeenien luku-5 määrä koetta varten voi haluttaessa olla paljon suurempi .

Näytteistä ja negatiivisista vertailuantigeeneistä, mikäli ne ovat saatavissa, tehdään pisteet Millipore-levylle, jolle on painettu ruudukko, kuten esimerkissä 10 2, ja epäspesifiset kohdat tukitaan hevosen seerumilla, kuivataan ja varastoidaan kuten aikaisemmissa esimerkeissä. Levystä leikataan liuskat esimerkin 2 mukaisesti ja tehdään kokeet positiivisilla seerumeilla ja kontrol-liseerumeilla, jotka sisältävät edellä olevassa taulukos-15 sa lueteltuihin pakkauksiin. Seerumit laimennetaan kaikki suhteessa 1 : 100 TBS:ään (10% hevosen seerumia) ja relevantit koeliuskat käsitellään samoin kuin esimerkissä 2. Tässä sarjassa tulos merkitään positiiviseksi tai negatiiviseksi jokaiselle antigeenille jokaista see-20 rumia vasten. Tuloksista on esitetty yhteenveto seu-raavassa taulukossa.

39 76888 tn

•H

-P

•H

3 rt ή 5 •Η ·3 <0 3 3 &

•P rP .H <U

p -H -H ϋ CD rö <0 3

> 4J 4-1 (UP

-P pp CO ω

,. -h -Φ o«)X on)4J

5 ε·Η·ρ>>εα> Ρέω

3 W W 3 H Ή (0 O

POO - *· 3 04 >4->N

<U 00<0(000^!g(0 in O G

CD OOgg^XdiP E 3H Λ (S

tn h h ίο ω Λ M ·η m m p « ϋ h -ΗΛ!γ^(0<000·Η (d -p &> Ή -p 33rHrHPP(0öl>-l>(UG<U β 33ααί03^ί<υθ4θε·ΡΟ

ro 0000Αί>:3α0 30Λί·Ρ <u 3 3 ΧΧΛΛ OjP O <U -P 3 P O OOOOSSrOWiP'diPSrO

10 Koeantigeenit_

Toxoplasma - -Θ----------

Tuhkarokko +- + -(+)- + --- + --

Papukaijakuume + - - - - -(+)------ 15 Papukaijakuume, vertailu

Herpes simplex + + - + + - +(+)+ + + + +

Herpes simplex, vertailu -------------

Mycoplasma +----- + +(+) + + --

Mycoplasma, vertailu ------------- 20 Adenovirus - + - + + - + + +(+)+ + +

Cytomegalovirus + + -- + - + + + -(+)+ -

Cytomegalovirus, vertailu -------------

Punkin kantama encephalitis -(+)-

Punkin kantama encephalitis, 25 vertailu - ------------

Varicella zoster ++-++-+++++ +(+)

Varicella zoster, vertailu ; --------------

Influenssa +++++-+++++++

Influenssa, vertailu j+--- + -- -- - + -- 76888 40

Piste on positiivinen joka kerta, kun kyseessä on koeantigeenin ja vastaavan koeantiseerumin yhdistelmä, kuten rengastuksilla on korostettu.

Negatiiviset vertailuseerumit ovat kaikki nega-5 tiivisia niiden antigeenien suhteen, joita varten ne on tarkoitettu pakkauksissa, mutta ne voivat olla positiivisia useiden muiden antigeenien suhteen. Negatiiviset vertailuantigeenit ovat myös negatiivisia niiden seerumien kanssa, joille ne on tarkoitettu, vaikka 10 muissa seerumeissa voi mahdollisesti olla vasta-aineita, jotka kohdistuvat näitä valmisteita vastaan. Näin ollen tämän keksinnön mukaisella menetelmällä on sama spesifisyys kuin pakkauksilla, joista väline konstruoitiin.

15 Monet näistä vasta-aineista kohdistuvat endeemisiin viruksiin, kuten Herpes simplex. Varicella zoster tai adenovirus. Näin ollen ei ole yllättävää, että tällaisia endeemisiä vasta-aineita löytyy monista seerumeista, joita ei ole erityisesti tarkoitettu olemaan 20 positiivisia näiden antigeenien suhteen. Käytännössä tällaisen vasta-aineen poissaolo on merkki kyseisen henkilön immuuniseen puolustusjärjestelmään liittyvästä puutteellisuudesta ja ilmentää suurta herkkyyttä kyseiselle infektioille. Kuten monissa käytännön serolo-25 gisissa menetelmissä, itse asiassa vain muuttuva tiit- teri todistaa diagnoosissa todellista infektiota. Mono-nukleoosiseerumi sisältää suuren määrän vasta-aineita, jotka kohdistuvat sellaisiin antigeeneihin, jotka ovat ilmeisen riippumattomia toisistaan. Vasta-ainetiitteri 30 tuhkarokkoviruksen suhteen on erityisen korkea. Laajan, näennäisesti irrelevantin vasta-ainespektrin ilmeneminen, joka kohdistuu myös joihinkin negatiivisiin vertailu-antigeenivalmisteisiin, on merkkinä polyklonaalisesta gammopatiasta ja diagnostisoitavissa tarttuvaksi 35 mononukleoosiksi.

Tarttuvan mononukleoosiseerumin lisäksi myös useat 76888 muut seerumit osoittavat vasta-aineita, jotka kohdistuvat influenssan vertailuantigeeniin. Tämä on otettu mukaan valaisemaan pahinta epäpuhdasta antigeenitapausta. Ihmisellä rokotteena käytettävä influenssa-antigeeni on 5 erittäin puhdas virusvalmiste, mutta vertailuantigeeni on paljon vähemmän puhdas valmiste, joka sisältää vielä munan proteiineja epäpuhtauksina. Joka tapauksessa vasta-ainetiitterit tämän vertailunäytteen suhteen ovat aina alempia kuin tiitterit virusantigeenin suhteen. 10 Tällaisten vasta-aineisiin kohdistuvien epäpuhtauksien läsnäolo ilmentää sitä, että potilas, jolta seerumi on otettu, oli allerginen niille epäpuhtauksille, joita tavallisesti käytetyt rokotevalmisteet sisältävät. Vaihtoehtoisesti se voisi merkitä, että henkilö oli allergi-15 nen kananmunalle. Rutiinikäytössä tällaisten vasta-aineiden seuraaminen on hyödyllistä, kun halutaan tietoja rokotteisiin, ympäristötekijöihin ja ruoka-aineisiin liittyvistä allergioista.

Allergiat liittyvät tavallisesti kiertävien vasta-20 aineiden läsnäoloon, jotka ovat IgE-tyyppiä. Kuten on mainittu, määritys indikaattorivasta-aineiden avulla, kun käytetään vuohen anti-ihmis-IgG:tä, joka on liitetty peroksidaasiin, ilmaisee myös IgM- ja IgE-vasta-aineet, koska käytetty vuohen vasta-aine reagoi sekä H- että 25 L-ketjun kanssa. Spesifisempiä kokeita voidaan konstruoida käyttämällä vasta-aineita, jotka ovat spesifisiä esim. IgG:n tai IgM:n tai IgE:n suhteen.

Esimerkki 4: Vasta-aineiden analysointi sellaisten 30 potilaiden seerumeista, joilla on autoimmuunisai rauksia tai muita sairauksia Tämä väline on konstruoitu käyttämällä samoja antigeenejä kuin esimerkissä 3 ja lisäksi vielä sellaisia antigeenejä, jotka ovat tunnusomaisia autoimmuunisai-35 raukeille. Käytetään puhtaita ja denaturoituja nukleiinihappoja, kuten jäljempänä on selostettu, ja subsellulaa- 76888 42 risia jakeita, jotka on johdettu Hela-soluista, joita voidaan käyttää tyypillisinä epädifferentiaalisina ihmisen solulinjoina, joita voidaan helposti viljellä· suuria määriä. Aktiinia ja myosiinia käytetään myös 5 antigeeneinä (kani, Sigma).

Lohen sperman DNA (Serva, Heidelberg) denaturoidaan kuumentamalla 100 °C:ssa 2 minuuttia 1 M glyoksaalin läsnäollessa ja sen jälkeen jäähdytetään nopeasti.

Escherichia colin ribosomaalinen RNA valmistetaan 10 suuresta ribosomaalisesta alayksiköstä tunnetuilla menetelmillä (Gordon & RamjouS, Analytical Biochemistry 83, 763-766 (1977)).

Hela-soluja viljellään ja niistä valmistetaan sub-sellulaariset jakeet (tumat, mitokondriot, tumajyväset, 15 polysomit ja sytosolijakeet) tunnettuja menetelmiä noudattamalla (Penman, S., J, Mol. Biol. 1_7, 117-125 (1966)).

Kaikkien antigeenien liuoksista, joiden väkevyys on 1 - 10 mg/ml, otetaan 0,5 yl erät, joilla tehdään 20 pisteet Millipore-levyille esimerkissä 3 kuvatulla tavalla kahdessa vaiheessa seuraavasti: 1) Nukleiinihapot kiinnitetään tekemällä pisteet suoraan ja kuumentamalla levyä 2 tuntia 80 °C:ssa, sillä jo ennestään tiedetään, että tämä menettely ai-25 heuttaa RNA:n ja denaturoituneen DNA:n irreversiibelin kiinnittymisen nitroselluloosaan (P.S. Thomas, Proc.

Nat. Acad. Sei. US 7T_, 5201-5205 (1980)). Ennestään ei kuitenkaan tiedetty, että myös luonnollinen DNA voidaan sitoa tällä tavalla.

30 2) Näin käsitellylle Millipore-levylle tehdään pisteet kaikista muista mainituista proteiineista, soluista tai subsellulaarisista jakeista.

Välineet valmistetaan edellisten esimerkkien mukaisesti ja leikataan liuskat, joilla testataan autoimmuu-35 nisairauksia sairastavien potilaiden seerumit ja vertai-lupotilaiden seerumit. Seerumit testataan laimennuksina 43 76888 1:100, 1: 1000 ja 1 : 10 000, jotka on tehty TBSrään (10 % hevosen seerumia) ja käsitellään edellä olevien esimerkkien mukaisesti. Lisäksi välineet sisältävät 0,5 μ1:η pisteet normaalia ihmisen seerumia kokeen 5 sisäisenä IgG-standardina. Nämä ovat laimennuksina 1 : 1000,1 : 2000, 1: 4000 ja 1 : 8000, jotka on tehty TBSrään, 1 mg/ml naudan seerumialbumiinia.

Sairaudet diagnostisoidaan American Rheumatological Associationin kriteerien mukaan. Saadut tulokset on 10 esitetty yhteenvetona seuraavassa taulukossa.

44 76888 3| 2 I C <2 £ ° " o all * c_>| <r

I I C/ -CJ- Ο Ό CM CM

(/) I I ,τΛ r-i CM to —I *~t to Z m I ^ ^ —I v a

E-* —· I o o O O

y ^ 0000-. ^ ~ £ £ >q ^ ^ ^ 2 (n ^ “ 10 O Ό rj, CM m o to I <-*

O I

cn| \s ς> ·“· <n in r-<

(Λ I

” ^ ·—' CVI ^-( u~i _, 2

0° I

^ I *nJ· Ό» 10)0 ^ O ^ 2 c - o

I H V H

vr . .

—* I V ΰ· ^ ·-* --1 .-1 to ·—* I --1 ·—1 O cm (m

O I

^ Ci -rt rt CM CM I—I

I .-1 .—I

^r-il -ci*^ ς> u"> ^ «—t cm

I <N

I Γ-l ΙΛ σ> I Si ζ} ^J. H H r-'3 I tr» to *n 00 I cm' cm" <✓ Γ/ ’-‘rt—‘cm

I r-l r-l V V H

N “1 tr» ίο V v ¢0^ ^ H (S| Ifl 10 I «Π rt ω I CM o ci C ^ a I ·~* tr» 1/1 ^ I cn to to ^ ^ tn ζΗ cm a ^ ^

j IN I tO

al^ M v O · a to O O

3 1 CM .-1 r-l

E tr» I

jjj'-'l ^ ö H ° 1/1 N O

3

r“H

*H

§ 3 , O +J ! Λ Ί C4-> -M-H (U 30-5 Ego 33 η -H 3 m ω -P s-5^ g p .h 3 w ω h p I—I ό :3 ή ·ρ -rl g ,5 ·η 3 w 3 -—I g g dB Q G 5 H E C (3 P -rj r-t-HÖIrHdd

03 8 o >-.QQ-n^G(rtga,>aJ oaJaJ

-ri ^ Jj jj, | j| υ ^3 45 7 6 8 8 8 Tämän taulukon vasta-ainetiitterit ovat normaalien yksilöiden seerumeista tai sellaisten yksilöiden seerumeista, joilla on mainittuja sairauksia. Seerumit on merkitty numeroilla 1- 20. Tiitterit on ilmoitettu 5 tietyn vasta-aineen mukaan kokonaisen immunoglobulii- -5 nin jakeena x 10 . Jos merkittävää vasta-ainetta ei havaita, ei ole tehty merkintää. Jos merkittävä vasta-aine havaitaan, mutta se on standardin alueen ulkopuolella, tulokset on annettu <1 tai >500.

10 SLE = systeeminen lupus erythematosus, RA = nivel reuma, MCTD = sekasidekudossairaus, MS = multippeliskleroosi, ICD = immuunikompleksisairaus, AE = ang ioneuroott inen ödeema.

Autoimmuuniseerumeista löytyy huomattava määrä 15 autovasta-aineita: yhdessä tapauksessa on läsnä spesifisiä vasta-aineita, jotka kohdistuvat luonnolliseen DNA:hän, mutta eivät reagoi denaturoidun DNA:n kanssa, ja lisäksi esiintyy reaktioita kokonaisten solujen, organellien jne, suhteen, joka osoittaa, että koe on sensitiivinen 20 paljon suuremman antigeenispektrin kuin pelkästään proteiinien suhteen. Kun on tutkittu 200 yksilön SLE-see-rumit, on havaittu, että antiluonnollisen DNA:n ja antidenaturoidun DNA:n tiitterit vaihtelevat suuresti yksilöiden välillä ja riippumatta toisistaan. Tämä 25 osoittaa, että määritys on spesifinen. Joissakin tapauksissa on mahdollista, että autoimmuuneja vasta-aineita ei enää ole läsnä, koska seerumit on otettu potilailta, jotka ovat jo hoidossa. Kuten edellä on selostettu, muuten voi influenssaviruksen vertailukokeissa olla 30 läsnä vasta-aineita, jotka kohdistuvat kananmunan proteiineihin.

Tällä määritysmenetelmällä on seuraavat edut verrattuna aikaisempiin autoimmuunisairauksien diagnosti-sointimenetelmiin. Kaikki kiinnostavat vasta-aineet 35 voidaan mitata yhdellä toimenpiteellä eikä siis erillisesti. Spesifiset vasta-aineet, jotka kohdistuvat 76888 46 subsellulaarisiin osiin, määritetään yleensä fluore-senssimikroskooppisesti. Tämä on vaivalloista, subjektiivista ja aikaavievää, kun taas nyt käsillä oleva menetelmä on yksinkertainen ja se voidaan kvantifioida 5 automaattisesti. Kanin aktiini ja myosiini sisältyvät mukaan, koska niitä on saatavissa kaupallisesti. On selvää, että menetelmällä voidaan ilmaista vasta-aineita, jotka kohdistuvat näihin proteiineihin. Kuitenkin ne voidaan autoimmuunisairauksen diagnostisoinnissa korva-10 ta vastaavilla ihmisen proteiineilla tai ihmisen kollageenilla. Edelleen voidaan käyttää monia erilaisia differentioituneita solutyyppejä, jotka valmistavat spesialisoituneita proteiineja, samoin kuin voidaan käyttää epädifferentioituneita Hela-soluja. Tällä pakkauk-15 sella on lisäksi etuna se, että sitä voidaan käyttää potilaiden seerumien seuraamiseen sinä aikana, kun autoimmuunisairautta hoidetaan immunosuppressiivisilla aineilla. Näin voidaan seurata patologisten vasta-aineiden häviämistä ja säädellä hoitoa niin, ettei vähennetä 20 endeemisiä hyvänlaatuisia vasta-aineita eikä kokonaan vaaranneta potilaan immuunijärjestelmää.

Esimerkki 5: Moniparametrisen vasta-aineanalyysin herkkyysrajat 25 Ihmisen puhtaasta IgG:stä valmistetaan standardilaimen- nussarja, josta tehdään pisteet Milliporelevyille esimerkin 1 mukaisesti. Sitten levyt käsitellään tarkalleen samoin kuin esimerkissä 2 käyttäen laimennussuhdetta 1 : 100 samasta seerumista, jota käytettiin 30 esimerkissä 2.

Pisteiden reflektanssit määritetään käyttämällä ohutkerroskromatogrammiskanneria (valmistaja "Camag", Muttenz, Sveitsi). Saadut tulokset on esitetty seu-raavassa taulukossa.

76888 47

IqG-määrä (nq) pisteessä Reflektanssi (mielivalt. yksikköinä) 50 54 23,3 49 5 10,8 41,8 5 37 2,33 22 1,08 14 0,5 10 10 0,23 7

Tuloksista voidaan havaita, että reflektanssiarvot antavat kvantitatiivisen tuloksen vasta-ainemäärästä 15 yli kolmen kymmenyksen dynaamisella alueella ja alle 0,5 ng sidottua vasta-ainetta voidaan havaita.

Esimerkki 6: Erilaisten peroksidaasisubstraattien vertailu 20 Esimerkin 5 mukainen vasta-aineanalyysi toistetaan kahtena: Toisessa noudatetaan tarkalleen esimerkin 5 mukaista menetelmää ja toisessa suoritetaan seuraava muunnos: O-dianisidin tilalla käytetään seosta, jossa on 5 ml TBS, 10 ui (30 % paino/paino vedessä) ja 0,3 ml 25 4-kloori-l-naftolia, 0,3 % paino/tilav. (Merck) metanolis-sa. Värjäyksen herkkyys on identtinen, mutta o-diani-sidi antaa hieman korkeamman taustan kuin 4-kloori-l-naf toli. Diaminobentsidiiniä voidaan myös käyttää.

4-kloori-l-naftoli asetetaan etusijalle kaupallisessa 30 käytössä, koska tiedetään, ettei se ole karsinogeeninen.

Esimerkki 7: Monoklonaalisten vasta-aineiden seulonta neuronaalisia kalvojakeita vasten Hybridomasolusarjoja valmistettaessa pitää seuloa 35 suuri lukumäärä klooneja, jotka tuottavat mielenkiinnon kohteena olevaa spesifistä vasta-ainetta. Jos jokainen klooni halutaan seuloa useiden erilaisten vasta-aineiden suhteen, voidaan noudattaa edellisten esi- 76888 48 merkkien mukaisia menetelmiä pienin muunnoksin. Jos halutaan seuloa vasta-aineet yhden ainoan antigeenin suhteen, voidaan menetellä seuraavasti: Millipore-levyyn merkitään ruudut (4 mm tai alle) tai käytetään sa-5 manlaisia valmiita Millipore-levyjä kuin edellisissä esimerkeissä, joissa on painettu ruudukko. Joskus on edullista pestä Millipore-levy ensin tislatulla vedellä.Rotan aivojen synaptosomaalista plasmakalvoa (Jones, D.H.,

Matus, A.I., Biochem.Biophys.Acta 356, 276-287 (1974)) 10 käytetään antigeeninä väkevyytenä, joka on alueella 0,1 - 1 mg/ml proteiinia. Tätä antigeenivalmistetta lisätään 0,5 Hl:n tilavuuksina pisteiksi Millipore-levylle esim. esimerkissä 2 kuvatulla tavalla. Tarvittaessa paikallista väkevyyttä voidaan kohottaa lisää-15 mällä valmistetta pisteeseen useita kertoja ja kuivaamalla eri lisäysten välillä. Sitten levy pestään TBS:llä ja haluttaessa tukkimisliuoksella (hevosen seerumi), kuten edellisissä esimerkeissä, kuivataan ja varastoidaan. Yksittäiset neliöt leikataan irti ja sijoitetaan Costar-20 tarjottimen koloihin (Cambridge Mass, USA). Jokaiseen koloon lisätään 150 μΐ liuosta, jossa on 3 % naudan seerumialbumiinia ja 1 % normaalia vuohen seerumia TBSsssä, ja inkuboidaan 15 minuuttia ympäristön lämpötilassa ravistellen. Vaihtoehtoisesti, jos Millipore-25 levy on käsitelty tukkimisliuoksella, kolot voidaan päällystää erikseen. Päällystettyjä tarjottimia ja suodattimia voidaan myös varastoida kuivina sellaisenaan.

Hiiret immunisoidaan rotan aivojen synaptosomaalisel-30 la kalvovalmisteella, pernat poistetaan, hybridisoi- daan myelomasolujen kanssa ja jaetaan 200 koloon, joissa on selektiivistä elatusainetta, joissa kasvatetaan hyb-ridomia tunnetuilla menetelmillä (G. Köhler, C.

Milstein, Nature 256, 495-497 (1975)).

35 10 vuorokauden kuluttua otetaan koloista neste- näytteet tai niistä tehdään laimennukset tukkimisliuok- 76888 49 seen ja sijoitetaan Costar-levyn koloihin, joissa on neliöt (75 - 150μ1 per kolo), ja vasta-aineiden sitou-tumisreaktion annetaan jatkua aika, joka on kahden tunnin ja yön yli seisottamisen välillä, riippuen vasta-5 aineen aktiivisuudesta. Sitten inkubointineste poistetaan ja ylimääräinen vasta-aine pestään pois pesemällä perusteellisesti TBS:llä. Sitten sitoutunut immunoglo-buliini värjätään spesifisesti vuohen antihiiri-IgG:llä, joka on liitetty peroksidaasiin, käyttämällä samaa melo nettelyä kuin edellisissä esimerkeissä. Kaikkiaan 480 kolosta löytyi 170 positiivista.

Tätä menetelmää voidaan käyttää sellaisten pakkausten valmistukseen, joilla seulotaan hybridomia minkä tahansa halutun antigeenin tai antigeeniseoksen suhteen. 15 Menetelmä on edullinen siksi, että antigeenin käsittely ja varastointi on helpompaa, jos se immobilisoidaan levyihin tai neliöihin eikä tavallisiin muoviastioihin, tarvitaan vähemmän antigeeniä kuin siinä tapauksessa, että Costar-astian koko kolo on päällystetty 20 antigeenillä, ja vasta-aineiden sitoutuminen antigeeniin on suoraan verrattavissa Millipore-levyn taustavärjäy-tymiseen, joten saavutetaan erittäin herkkä erottuminen ja vältetään väärät positiiviset tulokset, jotka aiheutuvat taustareaktioista.

25

Esimerkki 8: Monoklonaalisen vasta-aineen tunnista ma rotan aivojen kudosjakautuma (MXT-23)

Monoklonaalinen vasta-aine saadaan esimerkin 7 mukaisesti. Tätä monoklonaalista vasta-ainetta käytetään 30 määritettäessä MIT-23-antigeeni erilaisista epäpuh taista rotan kudosten homogenaateista. Joka kerta homogenaattia lisätään pisteeksi 1,0 mg/ml. Kudokset ovat: maksa, pikkuaivot, etuaivot, munuaiset, kateen-korva, juovikas lihas ja sydänlihas. Antigeeni MIT-23 35 on läsnä sekä pikkuaivoissa että etuaivoissa, mutta ei missään muissa tutkituissa kudoksissa. Kokeet, joissa 76888 50 pisteen antigeeniväkevyyttä vähennetään progressiivisesti, osoittavat, että MIT-23 voidaan havaita etuai-vohomogenaatista väkevyytenä 50y g/ml, mutta ei väkevyytenä 10y g/ml, mikä ilmeisesti merkitsee sitä, että 5 kudosnäytteiden negatiivisessa sarjassa löytyy etu- aivoista alle 5 % MIT.

Esimerkki 9: Reumaattisen tekijän ja kiertävän immuunikompleksin määrittäminen sellaisten ihmis-10 ten tai hiirten seerumeista, joilla on autoimmuuni sairaus

Reumaattinen tekijä määritellään sellaiseksi seerumissa esiintyväksi immunoglobuliiniksi, joka sitoutuu IgG:hen, muiden lajien IgG:t mukaanlukien. Kiertävä 15 immuunikompleksi on endogeeninen antigeeni-vasta-aine- kompleksi, jonka on havaittu kiertävän eräissä häiriötiloissa. Nämä kummatkin mitataan usein osana sidekudossairauksien diagnoosia. Kanin IgG:tä (Nordic) käytetään reumaattisen tekijän kokeessa ja ihmisen Clq:ta 20 käytetään immuunikompleksin kokeessa. Clq-komplementti-jae tunnistaa spesifisesti antigeeni-vasta-ainekomplek-se ja.

Kanin IgG ja Clq liuotetaan TBS:ään pitoisuuteen I mg/ml ja 0,5 yl:n pisteet lisätään nitroselluloosaan.

25 Sitten levyt tukitaan liuoksella, jossa on 10 % hevosen seerumia, samoin kuin edellisissä esimerkeissä. Ihmisen autoimmuuniseerumi (SLE, n:o 7 esimerkistä 4, MCTD, n:o II esimerkistä 4 ja normaali vertailunäyte) ja hiiren seerumi synnynnäiseltä MRL, jolla on luontainen taipumus 30 autoimmuunisairauteen, ja vertailunäyte ei-autoimmuunil-ta BALB/C-kannalta laimennetaan kaikki suhteessa 1 : 100, 1 : 1000 ja 1 : 10 000 liuokseen, jossa on 10 % hevosen seerumia TBS:ssä, ja levyjä inkuboidaan näissä laimennuksissa ympäristön lämpötilassa yön yli. Sitten 35 näytteet pestään TBSrllä ja ihmisen seerumit inku- 76888 51 boidaan kanin anti-ihmisimmunoglobuliinien kanssa, joi» hin on liitetty peroksidaasi, ja hiiren seerumit inku-boidaan antihiiri-immunoglubuliinien kanssa, joista on tehty 1 : 1000 laimennukset liuokseen, jossa on tO % 5 hevosen seerumia TBS:ssä. Kaksi viimeksimainittua saadaan DAKOtlta (Kööpenhamina, Tanska). Inkubointiai-ka on 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Sitten ylimääräinen vasta-aine pestään pois TBSrllä ja sitoutunut vasta-aine ilmaistaan kloorinaftolireaktiolla kuten esimer-10 kissä 5. Värin annetaan kehittyä 2 tuntia ja tulokset tulkitaan.

Kumpikin ihmisen autoimmuuniseerumi osoittaa sisältävänsä huomattavasti reumaattista tekijää aina laimennukseen 1 : 1000 asti ja vertailuseerumeissa ei havaita 15 mitään merkkejä tästä tekijästä missään laimennuksessa.

Hiiren autoimmuuniseerumi osoittaa positiivista reaktioita aina laimennukseen 1 : 10 000 asti ja hiiren vertailu-seerumi osoittaa havaittavaa positiivista reaktiota 100-kertaisen laimennuksen raja-arvoon asti. Näin ollen 20 mittauksella havaitaan antikani-IgG-vasta-aineiden korkean tiitterin läsnäolo sekä ihmisen että hiiren patologisissa seerumeissa. Immuunikomplekseja havaitaan myös patologisissa seerumeissa tiittereinä, joiden suuruus on noin 10 kertaa se, mikä on vertailuseerumeissa.

25 Kiertäviä immuunikomplekseja, joilla on korkea tiitteri, löytyy autoimmuuneista hiiren seerumeista ja ihmisen MCTD- ja SLE-seerumista. Näitä tuloksia tukevat ne määritykset, jotka tehtiin 200 ihmisen SLE-seerumille ja 20 MRL-hiiren seerumeille, kun näytteet otettiin 30 koko elinaikana.

Tässä esimerkissä kuvatut olosuhteet tarjoavat toimivan systeemin reumaattisten tekijöiden ja immuuni-kompleksien havaitsemiseen sekä kliinisessä diagnostisoinnissa että eläinmallisysteemeissä.

52 76888

Esimerkki 10: Erilaisten mikrohuokoisten materiaalien käyttäytyminen tukina, joihin näytteet on sidottu pistemäiseen muotoon immuunimäärityksiä varten 5 Käytetään lukuisia erilaisia tukimateriaaleja, joi hin lisätään 0,5 μΐ antigeeninäytteitä kuten edellisissä esimerkeissä.

Tuet: (1). New England Nuclear Cor., Boston, Mass. USA

"Gene Screen" (mikrohuokoinen polyamidi) (2) . Gelman (Gelman Sciences Inc., Ann-Arbor,

Michigan, USA) Teflon HT450 (0,45 μ), aromaattinen polysulfonisekapolymeeri käytettäväksi korkeassa lämpötilassa, (3) . Gelman Metricel GN6 "sekaselluloosaesteri" (0,45 μ), (4) . Gelman Metricel GN6 selluloosatriasetaatti (0,45 μ), (5) . Schleicher & Schuell (Schleicher & Schuell

GmbH, Dassel W. Germany) nitroselluloosa, (0,15 μ) BA 80/1, ,n (6). Schleicher & Schuell nitroselluloosa (0,45 μ) BA 85/1 (7) . Schleicher & Schuell nitroselluloosa (0,8 μ) AE 91/1 (8) . Schleicher & Schuell nitroselluloosa (12 μ) AE 100 ,,. (9) . Schleicher & Schuell selluloosa-asetaatti (0,45 μ) OE 67 (10) . Schleicher & Schuell rekonstituoitu sellu loosa (0,45 μ) RC 57 (11) . FMC (Rockland, Maine, USA) agaroosi "Sea plague" (12) . Difco Noble agar (Difco Laboratory Inc.,

Detroit, Michigan, USA).

Kaksi viimeksimainittua on sijoitettu valmistajan ohjeiden mukaan jäykälle muovituelle (FMC Corporation, 53 7 6 8 8 8 2 "Gel Bond") niin, että saadaan 0,5 mg/cm kerros. Viimeksimainittu tehdään lisäämällä 1 ml sulaa agaria tai agaroosia 5 cm ympyrän pintaan ja kuivaamalla infra-punalampun alla. Kun agar kostutetaan uudelleen, siihen 5 kehittyy huokoinen rakenne.

Seuraavia antigeenejä lisätään 0,5 pi määrät kuten edellisissä esimerkeissä, kuivataan ilmalla ja suoritetaan samat toimenpiteet kuin käytettäessä ihmisen SLE-seerumia (numero 7 esimerkistä 4).

10 (A) . Luonnollinen DNA (0,4 mg/ml) (B) . Denaturoitu DNA (0,4 mg/ml) (C) . Influenssavirusseos (Undiluted Sandovac vaccine) (D) . Ihmisen IgG, 1 ug/ml liuoksessa, jossa on 1 mg/ml naudan seerumialbumiinia (E) . Ihmisen IgG, 10 pg/ml liuoksessa, jossa on 1 mg/ml naudan seerumialbumiinia (F) . Ihmisen IgG,100 yg/ml liuoksessa, jossa on 1 mg/ml naudan seerumialbumiinia (G) . 1 mg/ml naudan seerumialbumiinia 20

Liuotin on TBS kuten ennenkin.

DNA-näytteiden lisäyksen jälkeen ja ennen loppujen lisäystä täpliä kuumennetaan kaksi tuntia 80°C:ssa.

25 Saadut tulokset ovat seuraavat verrattuna standardi- systeemiin, jossa käytetään Milliporelevyä, jonka huokoskoko on 45μ .

Tukimateriaalien tulokset (1) A, C ja F heikosti näkyviä. Muut pisteet negatiivisia.

(2) A, B ja C värjäytyvät, D, E, F ja G negatiivisia.

(3) Kaikki pisteet positiivisia, D, E ja F muuttuvat intensiteetiltään asteittaisesti.

(4) A ja C heikosti positiivisia. Tausta suurempi.

35 (5) Eroaa merkittävästi Milliporesta.

(6) Tarkalleen sama kuin Millipore, jolla on sama huokoisuus.

76888 54 (7) D ei värjäydy, muuten sama kuin Millipore.

(8) A, B ja C värjäytyvät, D, E ja F heikompia kuin Millipore.

(9) A, C ja F värjäytyvät heikosti. Muut negatiivisia.

5 (10) A ja B positiivisia, C heikko, muut negatiivisia.

(11) A, B ja C positiivisia mutta heikkoja, D, E ja F näkyvän ja näkymöttämän rajalla (12) A, B ja C positiivisia, D, E ja F heikosti positiivisia.

10 Agar on sikäli edullista, että sillä on helppo päällystää karkea tuki ja se on läpinäkyvää, joten kvantitiointi voidaan suorittaa transmission avulla sen sijaan, että mitattaisiin reflektanssit kuten esimerkissä 5.

15

Esimerkki 11: Hengitysvirusvasta-aineprofiilit monipistemäärityksenä Tämä esimerkki on samanlainen kuin esimerkki 3, mutta antigeenit valitaan sellaisista hengitysviruksista, 20 joita yleensä ehdotetaan diagnostisiin tarkoituksiin sellaisena ryhmänä, joka on vaikea erottaa pelkkien oireiden perusteella. Tämä antigeeniryhmä saadaan Institut Virionista (Ziirich) ja 0,5 μΐ seuraavia antigeenejä TBS:ään laimennettuina (ilmoitettu suluissa) lisätään 25 edellisten esimerkkien mukaisiksi ryhmityksisksi Millipore-nitroselluloosaan (0,45y), jossa on painettu ruudukko kuten edellisissä esimerkeissä.

(1). Adenovirus (1/5), (2). Chlamydia (1/2), (3). Cytomegalovirus (laimentamaton), (3a). Cytomegalovirus-30 vertailu, negatiivinen antigeeni (laimentamaton), (4). Influenssa A (1/4), (5). Influenssa B (1/2), (6). Parainfluenssa 1 (laimentamaton), (7). Parainfluenssa 2 (laimentamaton), (8). Parainfluenssa 3 (laimentamaton), (8a). Influenssavertailu, negatiivinen antigeeni (laimen-35 tamaton), (9). Mycoplasma (1/2), (10). Q-kuume (1/2), (11). Respiratorinen synkytiaalivirus (1/2) ja lisäksi 55 7 6 8 8 8 4 ihmisen IgG-standardia (Nordic) määrinä 10, 4,65, 2,15 ja 1 U g/ml TBS:ssä ja liuoksessa, jossa on 1 mg/ml naudan seerumialbumiinia. Sitten nämä analysoidaan kuten edellisissä esimerkeissä seerumilla, joka on laimen-5 nettu suhteessa 1 : 100, 1 : 1000 ja 1 : 10 000 TBS:ään, jossa on 10 % hevosen seerumia, ja ilmaisussa käytetään kloorinaftolimenetelmää käyttämällä 1 : 1000 laimennusta vuohen anti-ihmis-IgG:stä, johon on liitetty peroksidaa-si (Nordic). Seuraavassa taulukossa on lueteltu tu-10 lokset seerumeille, jotka on toimitettu positiivisina vertailuseerumeina (Institut Virion).

76888 56 -P------------------------- -r rKnnNNNnn m m m n cm n n ro n m n ro m ! ,_l mnfnr^r^r^mnmnmnnr^onror^rococnr^nr^n^-i oooodooo-ioooddororoooooooooo

V

ro n n cn corocococor-^corororococot/oro

ο ο O O ro O OOOcOroOOOrororoo—'O

H * ' * ' ' ·············· ooooooonoooooooooooooooooo VV V y ^

:nJ

rH

H (0 •H (/3 0} tn ro co ro ro cm u-ir^rococommror-'

y -Η σ\ .—I OO —· ui Ο Ο I— I—I i—i ·—'OOOO—'OO

.p1 § doddoodoodoododooddodoodoo

•H M

iLor^r'r^r^r^r'-r^f^r^r^i^.r^r^r- :rg co —'oooooooooooooorocouooooooooo tn dodddddoddododdnoHooooodod

2 CD

g tn I $ 4¾ flj co r— r--~ tn r-~ r~ i— r-^ r-~ i— r-^i'^r'.r-'C'^r'-r^r'-r-'r'-rorocoror^ tn a r> ooo-ioooooooooooooooooooooo a M d d d d d d d d d d d d d d d d d d o" d d d d o’ o’ d 2 <ΰ

+J

!§ H

W 3 in n m in r-* m in m n- mr^r^in m cnrnr^r^r^m

^ \ ^ *00 I—<00*—*minm>—*»—'OOOOOO

0 3 dodod dodddodddddddddodoodd 3 a O fD uominuorouorororocococor-.-r^uomuocor^.r-.rocor^roror''

—I—I—I—ιΟ—ιΟΟΟΟΟΟΟΟ—I —11 —'OOOOOOOOO

J· ‘[1 dooddo’ddddddddddddddoddood

S 3 V V

tn a3 δ 'j 3s rorocororororocororocororocorororororocococororocoro ¢1 H oooooooooooooooooooooooooo P f d d o d o’ d o’ o’ d o d d d o’ o d ,d d ρ,ρ p p, ο q o’ o,

a «jj v wvwvvVWv ^WWVW^WV

§3 i ^ r- r-» ro m ro ro m r^ ro ro co ro ro

(rt 3 OOOO —I 0 0—1 O O O O O CO

jg ^ 00 0000000,0000000000000000 o’ OO

3 Cid π _j mm m m mmmmmmmmmmmm m mmmr^ -P cm oo ^ omoooooooooooomomoor-io [n ‘3 o o ooooc^iooo o. .o oooooooooooooo § § V VWV v v •H t7>

H1 *J

m c fMroiMrorMr^rorororororororo roi-'corororocororo ,C <ϊ| —I —'OOOOOOOOOOOOOO ooooooooo n ooooooooooddoooooddooooddo,

Sc v v ^ ^ I i ^ CO ]j 0->Nn<firi\DtNOOO\0HNP1'TlClv£) H <v| m sj in lO ΓΝ CO r~* I—* H «—4 H H I—t 1--4 1—4 |H ("Nj CV| (S C'J f\| (Nj 76888 57

Mitkään toimitetuista negatiivisista vertailunäyt-teistä eivät anna minkäänlaista positiivista reaktioita minkään seerumin kanssa.

5 Esimerkki 12: Pisteimmuunimäärityksen ja komple- menttifiksaatiomäärityksen vertailu hengitysvirus-vasta-aineprofiilien saamiseksi seerumeista

Komplementtifiksaatiomääritykset suoritetaan salo moille seerumeille kuin esimerkissä 11 ja samoilla

Institut Virionista saaduilla antigeeneillä käyttämällä heidän materiaalejansa ja kuvattua komplemettifiksaatio-menetelmää. Seerumit on luokiteltu ryhmiksi, joilla on sama tiitteri, ja sen jälkeen sijoitettu tiitterin 15 suuruuden mukaan pienenevässä järjestyksessä. Taulukossa olevat pystysuorat viivat tarkoittavat ryhmiä, joilla on sama tiitteri. Alleviivatut seerumit ovat sellaisia, jotka on toimitettu positiivisiksi kontrol-liseerumeiksi kyseiselle antigeenille.

76888 58 l—' vo 11— Μιηι^οΟ'-ΐΝΗΝη'ίΐηνοσίΟΜνίίΛσιΟ'-'Νη-ίιο

S>—‘I ^ ·—1 r-fr^r-iH^rgNfgNNCM

>-11-!*_I I _f 1 -H ti 1

Ο) Η Ή !(j fH

η ή > c <h g J/} «Η rH ^^ _ _ _ M Si ^ 3 U GTr-ί oo*«-« η oo μ ^ *^o σ> d'«N m o c"> co in vo^tTr-T^ r-* •P «Ρ rd I—I r—i <—I H CN *—I H H (S M f\J (M CM CM r-t fO^ ^ gj Od

>, 0) 1 1 CQ

-P *H -H

H D-t *<Τ5 S fd VO ΓΝ 00 in σ> ΙΛ >J CO|rN O^OHCTiHCOCN^OHMCO'JCMCn'i^D

&H rH Ή WJ r—» «—1 H H H CM , CM CN HHHHHCMCNCMCM

I P ^ Jj i '-1 I-1 I—1 1-» I-3 6 -u to -Η 3 •H cn ,3 in 3

§ Φ % O |H

3 -n 4J ϋ ty __ 5 y -H ri I------1 (-11 1 E -‘ίο y C H »-icNmi^voinlvof'OOnCTiOc'nvO'a’inr'-oocyiO'-'C'i'-icsi-^rm E *rn ifd (1) h|h hhhhcmcncnh h h h cs fvi n cm 5 fill U 3^1

r| ^ ^ ^ Sf I CN |<Λ m<fSHinr<<OCOOcnHNn<A<fiMDO\ONn-icO

^ .H^+J S -M ™ ^ , r—f I <—^ *—* <—< <—^ <—* ·—< <—< 1 < CN CN CN CN CN

*> W -Η -H :£0 W 1-1 '-11-1 1- o -H 4J ϋ > c

33 3 c £ & S

3 fi ,° 6 ^ *H I-II-----11-1

Vi S 'IS .¾ j iS cN|<r|^-< Γΐ<τΐΛιθ^«σ\ηνθΝ®σ\θΗΝη4ΐηΌθΗ(Ν m

§“* _J3 M B* W M 1—1 I HHHrtHCIMMCV|NlN<NHHHH

fd *H 5 * y s s s 5u •H id W tfl 0} fH *H Si *H ν · g -h J3 .¾ .3 .¾ 3 γ^|ιλ o|h cMn'jtrivocoa'OHCMn'i^^Nood'^cMn'ivo idMWrH M I CM CM I HHHHHHHHHHCNC^CNCS^ § I I ff d 1 § 1

Jj S 1 ^ $ -S' Ί ,Γ~1 I-1 I-1 I-1 I-1 I-1 nj Jj uj frt jj n I IOI cm vrinvOvOvTHcNcOviinHcooNOHcNnvorsco^nin

I JQ ffj I 1 CM j CM CM CM CM H r—i CM CM H H »—I H H H H H

ί J > a s a *

§ ti 35 1 ° «I

if i 0 i si 5 .9 "3 ·π δ m m s _JJ (Tj m 3) d cnjiojr^ oicOHNin^Hm^mmOHNnsf^ixOMn-jvo tOCO $4 ' Φ K*1 H —Ί I CN CN. rtHHHHrlriHHNNOININ, p· I 5 a 35 * t -1 -"——-1 & ^ rd S ^ *S 8 S m i2 id -P qJ δ Φ ·η o id fd Φ *0 f , *i r j I— — — -.. ,· .

K -P ^ W > -P 16¾ I h (M m \0|N on n moO^O^^iriOOiMn-iHMO^^MvDrv

<—* 1 HHHHHtMCNCNf-ir-iCNMt'ltMHH

76888 59

H

S

a

0\|sDr^»AvOH(NiriNCOOHCOHfO'iNnsi‘Aa'0^|frl'3·^ C , «—< i—« ,CN I r-ί r-l f-l H 1-H CM (NM CM (N

ff 1-1 *—-Il__I

! S I-1 I-1 |---—--1 .a vo n o\|<i ΐΛνο·ίοο·ίΠΝηΝ«)θΗΝηιοσ\θΗ ν|π m ό

P! i—< r-H r—1 i—I CNJ i—< r—i r—t i—t r—t i—< (N CN CN J CN CN CM

Q> CDlHlvD NHNn-ii/UOSOiOHN^-imoOOvONfl-iiOO

p CN 11—I t—1 ( ΗΗΗΗΗΗΗΗΝΝΜΝΝΓ^ | oo | lo *—< I cm en* m oo V-i Nt m on o -a·^ v£> oi vo1 Im n <r O h n irl O r—< r—i CN ] ΓΜ M N H i—t H H (S iN ·—* CN r-t r-ι r-t 5} on .—111~— ro I lo oineoocoOOHN^iovCHN'ivoNNfl'jio

^ I H^N H | H (»! HHHHHOJNOJ

i—t fö 3 % ä1-* 8 , i-ir~-11—11->1 1

>i n ® oo on o <r h rv ·ίΐη«σΐ(*ι>ίθΗ NnmMn-iHtsvON

S i—4 | r-ι r-l C\| M r—< i—4 CN H N N N N .—t ,—I .—I .—1 P> S n j . no r-~ oo I ui r i—t on t—( in | r-ι inNfO-jvotoONMNtONONn-iio ^ H I—11 (N | M | ·—1 r-H j HHHHH(\JCVINfN| fS|^

•rt (O

Μ-l d j^4 r—t

l 1 ,-, f-- -I

N IP no r» ooIi-h n n -j m|vo Μ»θΝθΗΝΠ·}ΐο(ΓιθΗΝίη·ιιη»ο

Jn *·— ·—* ·—« —«I HHHHr-lr-lrlN(MNNNNIM

.□ 1Λ ΙΛ (Ί ·ί^ ΟΛΟΟΟ\(ΊΗΓ-ΙΝ(ΟιθΓ-ιή^Νθ Nlco Oi O N >J NO

^ fN) ^ f*-"* Nj |_H| |_«—< CSj j__H H H H H|H H O) N OJ CN|

i· S

I 1

rC rH

0 ^

n -H | | I I

4J u <r |cvi ΓΟίΛνΟΓ^οοσ'ΟΗΝίΟ^ίΛνβ r->. I oo (^Or-fHrvjnsrin^

(¾ f3 r—^ i—< r—4 «—I r—4 r—t f—t «—< | i—t r—I CN CN CN <N CN CN CN

·“) w 76888 60

Tuloksista voidaan havaita, että lähes kaikissa tapauksissa positiiviset seerumit sattuvat suunnilleen samalle riville ja on olemassa jopa tapauksia, joissa molemmat määritykset osoittavat, että positiivisena toi-5 mitettu seerumi on itse asiassa negatiivinen tai tiit-teriltään hyvin matala. Kaikki määritykset korreloivat melko hyvin. Syyt poikkeuksiin saattavat olla siinä, että kaksi määrityssysteemiä tunnistaa eri vasta-aine-luokkia ja antigeeni tarjotaan kummassakin määrityksessä 10 vasta-aineelle hyvin erilaisessa muodossa.

Esimerkki 13: Pistemäärityksen käyttö monoklonaa- listen vasta-aineiden tyypityksessä

Kananpojan maksasta saadut ribosomaalisten prote-15 iinien monoklonaaliset vasta-aineet valmistetaan samoin kuin esimerkissä 8 ja vasta-aineiden spesifisyys määritetään menetelmällä Towbin et ai., Proc.Nat.Acad.Sci.

US, 16, 4350-4354 (1979). Hybridomaliuokset testataan vasta-ainetyypin suhteen seuraavalla tavalla.

20 Tyyppispesifiset vuohen antihiiri-immunoglobuliinivasta- aineet (Nordic) liuotetaan valmistajan ohjeiden mukaan, laimennetaan 30-kertaisesti ja 1 μΐ määrät lisätään pisteiksi nitroselluloosalie, liuskat tukitaan hevosen seerumilla kuten esimerkissä 1, inkuboidaan yön yli 25 huoneenlämpötilassa laimentamattomien hybridomaliuosten suodosten kanssa ja sen jälkeen sidotut vasta-aineet ilmaistaan immuuniperoksidaasivärjäyksellä kuten esimerkissä 1. Tulokset on esitetty seuraavassa taulukossa .

76888 61

Monoklonaalinen Värjäy5 vasta-aineella, joka kohdistuu vasta-aine_ IgG vastaan_IgM vastaan_

Anti-S6 + ^ Anti-L7 - +

Anti-L18a +

Anti-Pl/P2 - +

Anti-rRNA - + JO Monoklonaaliset vasta-aineet on nimitetty sen ribo- somaalisen proteiinin mukaan, jonka kanssa ne reagoivat, käyttäen kansainvälistä luokitusta. Anti-rRNA on suunnattu ribosomaalista RNA:ta vastaan. Taulukon tyypitys on varmistettu erillisillä kokeilla, joissa 15 vasta-aineet on analysoitu sakkaroosigradienteilla:

IgG:n sedimentaatiovakio on 7S ja IgM:n 19 S.

Tämä esimerkki osoittaa, että vasta-aineet voidaan sijoittaa tukimateriaaliin ja niitä voidaan käyttää vastaavien antigeenien ilmaisemiseen edellyttäen, että 2o sopiva ilmaisusysteemi on tarjolla. Tällä määritysmenetelmällä on käyttöä, kun halutaan kvantifioida yksittäisiä vasta-aineluokkia ihmisen seerumeista, mitä usein vaaditaan kliinisissä analyyseissä. Tällä systeemillä voidaan konstruoida pakkaus, jolla voidaan 25 analysoida ja kvantifioida kaikki vasta-aineluokat samanaikaisesti yhdellä operaatiolla.

Esimerkki 14: Immunologisiin analyyseihin tarkoi tetut pakkaukset 30 Välineet konstruoidaan lisäämällä 0,5 yl määrät edellisten esimerkkien antigeenejä pisteiksi. Anti-geeniliuoksista tehdään pisteet yhdensuuntaisiksi riveiksi Millipore-levyille (huokoskoko 0,45μ ), joissa on painettu ruudukko kuten edellisissä esimerkeissä.

35 Nämä käsitellään epäspesifisten sidoskohtien tukkimiseksi 10% hevosen seerumilla kuten edellä ja kuivataan ilmalla. Levyt leikataan liuskoiksi niin, että jokai- 76888 62 seen liuskaan tulee yksi piste kutakin antigeeniä ja liuskat suljetaan muovipakkauksiin. Immunologisen analyysin suorittamiseen tarvittavat reagenssit valmistetaan seuraavasti.

5 A. TBS, joka sisältää 10 % hevosen seerumia, lyofili-soidaan 100 ml erissä.

B. Vuohen anti-ihmisimmunoglobuliinit laimennetaan suhteessa 1 : 1000 TBSsään, jossa on 10 % hevosen seerumia, ja lyofilisoidaan 100 ml erissä.

10 C. TBS lyofilisoidaan 100 ml erissä.

D. 4-kloori-1-naftoli jaetaan 9 mg eriin ja suljetaan ampulleihin.

E. Vetyperoksidi (30 %) jaetaan 0,1 eriin ja suljetaan ampulleihin.

15 Näitä pakkauksia voidaan varastoida määräämätön ai ka ja käyttää sen jälkeen seuraavalla tavalla seerumin sisältämien tuntemattomien vasta-aineiden analysointiin edellä olevien esimerkkien mukaista metodologiaa noudattaen. A, B ja C rekonstituoidaan kukin 100 ml:11a 20 tislattua vettä. Sitten A käytetään tuntemattomien seerumien laimentamiseen, B käytetään indikaattorivasta-aineensidontareaktioon ja yksi erä rekonstituoitua C:tä sekä yksi ampulli D:tä ja E:tä käytetään värireaktio-seoksen tekoon. Muut C-erät rekonstituoidaan tar-25 peen mukaan kunkin vasta-aineen sitoutumisen jälkeistä pesua varten.

Näin saadaan samat tulokset kuin edelläolevissa esimerkeissä.

Claims (23)

63 7 6 8 8 8

1. Väline immunologisten analyysien suorittamiseksi, joka väline käsittää luonnollisista polymeerisistä hiilihydraateista, niiden synteettisesti modifioiduista, ristikytketyis-tä tai substituoiduista johdannaisista tai polyamidista tai polysulfonikopolymeeristä muodostuvan huokoisen kiinteän tukiaineen, tunnettu siitä, että siihen on ennalta valitulla tavalla ryhmitelty antigeenejä ja/tai immunoglobulii-neja rajoitetuille adsorptioalueille, jotka yhdisteet kiinnittyvät tiukasti eivätkä levity huokoisella pinnalla, ja jotka alueet on saatu aikaan saattamalla erät näiden immuno-reaktiivisten yhdisteiden liuoksia tai suspensioita suoraan kosketukseen tukiaineen kanssa mekaanisesti siirtämällä, ja että huokoisessa kiinteässä tukiaineessa olevat ylimääräiset adsorptiokohdat mahdollisesti kyllästetään proteiineilla, joilla ei ole spesifistä kykyä reagoida mainittujen immuno-reaktiivisten yhdisteiden kanssa.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnet-t u siitä, että ylimääräiset adsorptiokohdat kyllästetään kokoseerumilla tai fysiologisella suolaliuoksella tai jollain muulla laimentimella laimennetulla kokoseerumilla, lämpötilassa, joka on huoneenlämpötilan ja n. 50 °C:n välillä, ja että tukiaine mahdollisesti kuivataan ja/tai sitä kuumennetaan korotetussa lämpötilassa.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnet-t u siitä, että immunoreaktiiviset yhdisteet ovat antigeenejä, jollaisia ovat ihmisen koepalamateriaali, nisäkkään kudokset tai solut, kehon nesteet, sienet, protozoat, meta-zoaloiset, bakteerit, mykoplasma, virukset tai näistä johdetut valmisteet.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnet-t u siitä, että huokoinen kiinteä tukiaine on levyn muodossa .

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen väline, tunnet-t u siitä, että levyn paksuus on suunnilleen välillä 0,01 - 64 76888 0,5 mm.

6. Patenttivaatimuksen 4 mukainen väline, tunnet-t u siitä, että levyn paksuus on noin 0,1 mm.

7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnet-t u siitä, että huokoinen kiinteä tukiaine on typpihapon tai 1-7 hiiliatomia sisältävän alifaattisen karboksyylihapon selluloosaesteri, tai tällaisten esterien seos.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen väline, tunnet-t u siitä, että huokoinen kiinteä tukiaine on nitrosellu-loosa.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen väline, tunnet-t u siitä, että huokoinen kiinteä tukiaine on nitrosellu-loosalevy, jonka huokoskoko on n. 0,45 /um.

10. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnet-t u siitä, että ennalta valitut adsorptioalueet ovat mikro-pisteiden muodossa, joiden halkaisija on alle 2 mm tai viivojen muodossa, joiden leveys on 2 mm tai vähemmän.

11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnet-t u siitä, että ennalta valittu adsorptioalue koostuu yhdestä yksittäisestä pisteestä.

12. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnet-t u siitä, että immunoreaktiiviset yhdisteet on lisätty huokoiseen kiinteään tukiaineeseen pipetoimalla käsin tai mekaanisesti tai nestemäisten tai kaasumaisten ponneaineiden avulla.

13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnet-t u siitä, että immunoreaktiiviset yhdisteet ovat ihmisestä tai eläimistä peräisin olevia immunoglobuliineja tai niiden fragmentteja, jotka on tarkoitettu reumafaktorin detektioon ja kvantifiointiin.

14. Patenttivaatimuksen 1 mukainen väline, tunnet-t u siitä, että immunoreaktiivinen yhdiste on kiertävinä immuunikomplekseina tunnettujen antigeeni-vasta-ainekomplek-sien detektioon tarkoitettu komplementtiproteiini.

15. Pakkaus immunologista analyysiä varten, joka pakkaus sisältää huokoisen kiinteän tukiaineen, laitteet immunologis- 65 76888 ten reaktioiden suorittamiseksi ja reagenssit indikaattori-systeemiä varten osiin jaettuna tai kuivattuina, tunnet-t u siitä, että huokoinen kiinteä tukiaine on jonkin patenttivaatimuksista 1-14 mukainen väline.

16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen pakkaus, tunnettu siitä, että reagenssit indikaattorisysteemiä varten ovat (a) radioaktiivisesti leimattu vasta-aine, fluoresoivaan indikaattoriin konjugoitunut vasta-aine tai vasta-aine, joka on konjugoitunut entsyymiin, joka kykenee saamaan aikaan vä-rireaktion sopivan substraatin kanssa, tai (b) vasta-aine ja radioaktiivisesti leimattu tai fluoresoivaan indikaattoriin tai entsyymiin konjugoitunut komplement-tiproteiini, tai (c) vasta-aine, komplementtiproteiini ja komplementtispesi-finen vasta-aine, joka on radioaktiivisesti leimattu tai kon-jugoitunut fluoresoivaan indikaattoriin tai entsyymiin.

17. Patenttivaatimuksen 15 mukainen pakkaus, tunnettu siitä, että laitteet immunologisten reaktioiden suorittamiseksi tarkoittaa monikoloista muovitarjotinta ja että indikaattorisysteemin reagenssit tarkoittavat lyofili-soitua seosta, jossa on entsyymikonjugoitua vasta-ainetta, suoloja, puskureita ja kantajaseerumia tai kantajaproteiinia, lyofilisoitua seosta, jossa on ennaltamäärätyt määrät entsyymin kromogeenista substraattia, suoloja ja puskureita, ja ampulleja, jotka sisältävät ennaltamäärätyt tilavuudet nestemäistä entsyymisubstraattia.

18. Patenttivaatimuksen 15 mukainen pakkaus, tunnettu siitä, että huokoinen kiinteä tukiaine sisältää ryhmiteltynä yhtä tai useampaa spesifistä vasta-ainetta ja että reagenssit indikaattorisysteemiä varten sisältävät substraatin, kofaktorin tai prosteettisen ryhmän indikaattorient-syymille tai kytketylle entsyymisarjalle, joka signaloi anti-geeni-vasta-ainereaktiota, tai signaalisysteemi on kovalent-tinen entsyymi-antigeeniaddukti.

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen pakkaus, t u n - 66 7 6 8 8 8 n e t t u siitä, että huokoinen kiinteä tukiaine sisältää ryhmiteltynä yhtä tai useampaa spesifistä vasta-ainetta yhdessä indikaattorientsyymin tai kytketyn entsyymisarjän kanssa .

20. Patenttivaatimuksen 15 mukainen pakkaus, tunnettu siitä, että huokoinen kiinteä tukiaine sisältää ryhmiteltynä ihmisestä tai eläimistä peräisin olevia immu-noglobuliineja tai niiden fragmentteja, jotka on tarkoitettu reumafaktorin detektointiin ja kvantitiointiin, tai ryhmiteltynä komplementtiproteiinia, joka on tarkoitettu kiertävinä immuunikomplekseina tunnettujen antigeeni-vasta-ainekomplek-sien detektioon.

21. Jonkin patenttivaatimuksista 1-20 mukaisen välineen tai pakkauksen käyttö spesifisten antigeenien ja/tai spesifisten vasta-aineiden detektioon tai kvantifiointiin immuno-määritysmenetelmillä, kun halutaan diagnosoida, seurata tai ennustaa ihmisten tai eläinten sairauksia, tai mainittuja antigeenejä ja vasta-aineita koskevassa tutkimus- ja kehitystyössä .

22. Menetelmä jonkin patenttivaatimuksista 1-14 mukaisen välineen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että erät antigeenien ja/tai immunoglobuliinien liuoksia tai suspensioita saatetaan suoraan kosketukseen huokoisen kiinteän tukiaineen kanssa mekaanisesti siirtämällä ennaltavalitun ryhmittelyn aikaansaamiseksi, ja haluttaessa näin saatu väline käsitellään proteiineilla, joilla ei ole spesifistä kykyä reagoida mainittujen immunoreaktiivisten yhdisteiden kanssa, huokoisessa kiinteässä tukiaineessa olevien ylimääräisten adsorptiokohtien kyllästämiseksi.

23. Immunologinen analysointimenetelmä, tunnet-t u siitä, että jonkin patenttivaatimuksista 1-14 mukaista välinettä, sen jälkeen kun sitä on käsitelty sopivasti ei-spesifisiä proteiineja sisältävällä tukkimisliuoksella kaikkien ylimääräisten sitoutumiskohtien kyllästämiseksi, inku-boidaan detektoitavia immunoreaktiivisia yhdisteitä sisältävän näytteen kanssa, mahdollisesti tukkimisliuoksen läsnäol- 67 76888 lessa, ja haluttaessa pestään, sitten inkuboidaan indikaat-torivasta-aineen liuoksen kanssa tai minkä tahansa signaloin-tisysteemin kanssa, joka tunnistaa aluksi näytteen kanssa in-kuboitaessa syntyneen immunologisen kompleksin, mahdollisesti tukkimisliuoksen läsnäollessa, ja indikaattorisysteemi kehitetään ja/tai kvantitioidaan.