DE2440367C2

DE2440367C2 - Verfahren zum Herstellen multimolekularer Schichten aus immunologisch komplexierten Proteinen auf einem Substrat

Info

Publication number: DE2440367C2
Application number: DE2440367A
Authority: DE
Inventors: Ivar Schenectady N.Y. Giaever
Original assignee: General Electric Co
Current assignee: General Electric Co
Priority date: 1973-08-30
Filing date: 1974-08-23
Publication date: 1984-03-15
Also published as: NL177628B; GB1486826A; FR2257259A1; CH617012A5; IT1020283B; JPS5070517A; DE2440367A1; BR7407193D0; DK151240C; JPS5916669B2; ATA704774A; AT347598B; DK457174A; SE7410971L; NL177628C; DK151240B; MX3121E; AU7251474A; FR2257259B1; SE457118B

Description

15. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das immunologisch reaktive erste Protein ein Antikörper und das immunologisch reaktive zweite Protein ein für den Antikörper spezifisches Antigen ist.

16. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß zum Verbessern des Kontrastes in immunologischen Oberflächentests zum Beschichten des Substrates mit der monomolekularen Schicht ein Inertprotein von einer geringeren Größe als das reaktive erste Protein verwandet wird, so daß die Moleküle des ersten Proteins voneinander durch die kleineren Moleküle des inerten Proteins getrennt und von diesen umgeben werden '.■ -.d daß das immunologisch reaktive zweite Protein e*ne geringere Größe als das erste Protein hat, so daß sich bei der immunologischen Reaktion eine relativ große Zahl der Moleküle des zweiten Proteins mit den Molekülen des ersten Proteins unter Bildung einer bimolekularen Schicht auf dem Substrat verbinden.

17. Verfahrennach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß die Moleküle des inerten Proteins 50 bis 90% und die Moleküle des reaktiven ersten Proteins dementsprechend 50 bis 10% der Oberfläche des Substrats bedecken.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen multimolekularer Schichten aus immunologisch komplexierten Proteinen gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.

Immunologische Reaktionen sind hoch spezifische biochemische Reaktionen, in denen ein als Antigen bekanntes erstes Protein sich mit einem zweiten, gegenüber dem Antigen spezifischen Protein verbindet, das als Antikörper bekannt ist und so ein immurologiscn komplexiertes Protein bildet. Immunologische Reaktionen, die in einem biologischen System, wie einem Tier oder einem Menschen, stattfinden, sind lebenswichtig für die Bekämpfung von Krankheiten. In einem biologischen System veranlaßt der Eintritt eines Fremdproteins, d. h. des Antigens, das biologische System, die spezifischen Antikörperproteine zu dem Antigen in einem Verfahren zu erzeugen, das derzeit noch nicht völlig verstanden ist. DiJ Antikörper-Proteinmoleküle ha^en verfügbare chemische Kombinations- oder Bindestellen, welche die auf dem Antigenmolekül ergänzen, so daß sich da:> Antigen und der Antikörper chemisch miteinander unter Bildung des immunologisch komplexierten Proteins verbinden können.

Da Antikörper durch biologische Systeme in Reaktion auf das Eindringen von Fremdproteinen in solche Systeme erzeugt werden, ist der Nachweis von Antikörpern, die in einem biologischen System vorhanden sind, von medizinisch diagnostischem Wert für die Bestimmung der Antigene, denen das System ausgesetzt wurde. Umgekehrt hat auch der Nachweis gewisser Antigene in einem biologischen System medizinisch diagnostischen Wert. Beispiele des diagnostischen Nachweises von Antigenen schließen den Nachweis der HCG-Proteinmoleküle im Urin als Nachweis für die

Schwangerschaft und den Nachweis der mit der Hepatitis verbundenen Antigenmoleküle (HAA) im Blut in Aussicht genommener Blutspender ein. Um solche diagnostischen Untersuchungen durchzuführen, muß das geeignete Protein mindestens eines immunologisch s reagierenden Paares erhalten werden.

Die einzige bekannte Quelle für ein Antikörperprotein ist ein lebendes biologisches System. Weiter ist es derzeit nur von Wirbeltieren bekannt, daö sie auf die Einführung eines Fremdproteins immunologische Reaktionen zeigen. So werden /. B. in dem Blutserum von Tieren und Menschen, die diesem entsprechenden Antigen ausgesetzt wurden, viele Antikörper gefunden. Viele Antigene können jedoch in Laboratoriumskulturen kontrollierbar hergestellt werden. Einige Antigene jedoch, wie z. B. die m>t der Hepatitis verbundenen Antigene sind derzeit, wie Antikörper, nur aus höheren lehenden biologischen Systemen erhältlich.

Die meisten Antigene sind Proteine oder enthalten Proteine als wesentlichen Bestandteil, während alle Antikörper Proteine sind. Da Proteine große Moleküle mit hohem Molekulargewicht sind, d. h. Polymere, die aus Ketten variabler Zahlen von Aminosäuren bestehen, kann jedes Antigen- und Antikörperprotein einige Bindestellen aufweisen. Die fünf Hauptklassen von n Antikörpern (Immunoglobuline IgG, IgM, IgA, IgE und IgD) sind augenscheinlich je durch mindestens zwei schwere (lange) Peptidketten aus Aminosäure und mindestens zwei leichte (kurze) Peptidkelten der Säuren charakterisiert, wobei die Bindung zwischen den Ami- jo nosäiireeinheiten als Peptidbindung bekannt ist. Diese schweren und leichten Peptidketten sind in der allgemeinen Gestalt des Buchstabens »Y« orientiert und die aktiven oder Kombinationsstellen sind die äußersten Enden der beiden Arme des Y-förmigen Antikörpers für a den IgG-Antikörper.

Immunologische Reaktionen können mittels verschiedener Techniken nachgewiesen werden, einschließlich des Gebrauches eines geeigneten Substrates, wie eines metallisierten Glas- oder eines Metallplättchens. Setzt man das Substrat einer Lösung des Antigens aus, so wird das Antigen physikalisch in einer dichten monomolekularen Schicht auf der Oberfläche des Substrates adsorbiert. Setzt man dadurch das Antigen-beschichtete Substrat einem Serum aus, das Antikörper für das Antigen enthält, so führt dies zu einer immunologischen Reaktion, bei der sich die Antikörper mittels der Bindestellen auf dem Antikörpermolekül, die jene auf dem Antigenmolekül ergänzen, selektiv an die Antigene anlagern und dabei mindestens eine bimolekulare Teilschicht aus immunologisch komplexiertem Protein auf der Substratoberfläche bilden.

Ein Beispie! des Nachweises einer solchen immunologischen Reaktion mittels Radioimmunoassay ist in der Zeitschrift »Science«, Band 158, Seiten 1570-1572 von 1967 beschrieben. Bei dem dort beschriebenen Verfahren gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 war das Substrat ein Rohr aus Kunststoff, das zuerst innen mit Antikörpermolekülen beschichtet wurde. Nach dem Entfernen der zum Bechichten benutzten Antikörperlösung wurden die Rohre erst dreimal mit 0,15 molarer NaCl und dann einmal mit einer verdünnten Proteinlösung aus 10% gealtertem menschlichen Plasma und' 0,01% Merthiolat in 0,15 molarer NaCl gewaschen. Danach inkubierte man die beschichteten Rohre mit antigenhaltigem Serum, das mit J¹²⁵ markierte Antigenmoleküle enthielt, für 16 Stunden bei 37° C. Es folgte das Absaugen des Serums und das Bestimmen des immunologisch komplexierten Antigens durch einminütiges Anordnen des Rohres in einem automatischen Gammazähler.

Das Buch »Radioimmunoassay Methods«, Churchill Livingstone Verlag (1971) weist auf den Seiten 405 bij 412 eine Zusammenstellung von Verfahren auf, mit denen Antigene und Antikörper unter Verwendung radioaktiver markierter Teile davon bestimmt werden können. Allen diesen Verfahren ist gemeinsam, daß entweder eine Antigen- oder eine Antikörperschicht an einem festen Substrat adsorbiert wird und daß man dünn das beschichtete Substrat mit einer Lösung des jeweils anderen Proteins inkubiert, wobei dieses andere Protein entweder schon radioaktiv markiert ist oder das Beschichten erst noch um ein oder mehrere Stufen fortgeführt wird.

In der DE-AS 15 98 859 schließlich ist ein Verfahren zum Herstellen von Reagenzien für immunochemische Bestimmungen beschrieben, wobei die Reagenzien aus feinen Trägerteilchen bestehen, an denen erst ein gegenüber der immunochemischen Reaktion inertes Protein adsorbiert ist und erst dann das Antigen oder der Antikörper. Eine Ausführungsform der Trägerteilchen ist ein Kunstharzlatex, dessen Teilchen einen Durchmesser von 0,5 bis Ι,3μπι haben. Mit diesen Reagenzien soll eine spezifischere Agglutinierung mit dem "eweils korrespondierenden Protein möglich sein.

Bei all diesen bekannten Verfahren ist es jedoch ein Problem, daß, wenn man das beschichtete Substrat, das das Antigen-Antikörper-Komplexprotein aufweist, nachfolgend einer Lösung aussetzt, die das gleiche Antigen enthält oder von der man erwartet, daß sie dieses enthält, dieses nachfolgende Aussetzen im allgemeinen nicht zu einem weiteren Binden von Antigen an dem Antikörper fuhrt, da alle aktiven Stellen der Antikörper schon an die erste Antigenschicht gebunden sind, weil die aktiven Antigenmoieküie sich in sehr geringem Abstand voneinander befinden. So gibt es bei der Oberflächenimmunologie das Problem, daß sich die Antikörper an eine (Antigen-)Oberfläche binden und ihre Aktivität verlieren (d. h. ihre Fähigkeit sich weiter mit einem Antigen, einer Zelle oder einemVirus zu verbinden). Dieses Problem führt dazu, daß man bei einer relativ dicken adsorbierten Antigenrchicht, wie im Falle der HAA-Schicht, bei der man zwischen der monomolekularen und der bimolekularen Schicht auf dem Substrat nicht gut unterscheiden kann, weil z. B. das mit der Hepatitis verbundene Antigenmolekül mindestens 10-mal so groß ist, wie der Antikörper zum HAA, keine Möglichkeit hatte, eine Bestimnvng ohne Zuhilfenahme radioaktiver markierter Antikörper vorzunehmen.

Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, das eingangs genannte Verfahren dahingehend zu verbessern, daß damit mehr als bimolekulare Schichten immunologisch komplexierter Proteine hergestellt werden können.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch den kennzeichnenden Teil des Anspruchs 1 gelöst.

Vorteilhafte Ausfuhrungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens finden sich in den Unteransprüchen.

Durch aufeinanderfolgendes Eintauchen des beschichteten Substrates in Lösungen, die alternativ den gleichen Antikörper und das gleiche Antigen enthalten, kann man relativ lange Ketten von Aniigen-Antikorpcr-Komplexen von der Oberfläche des Substrates aufbauen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann dazu benutzt

werden. Zellen oder Viren immunologisch zu identifizieren, da die Wahrscheinlichkeit für einige der Antikörperrnoleküle, an den Enden der Ketten der Antigen-Antikörper-Komplexe eine Antigenstelle auf bestimmten Zellen oder Viren zu finden, ungeachtet der Irregularität der Oberfläche der Zelle oder des Virus, relativ hoch is¹,.

Weiter '.vird durch das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung bei Einsatz eines relativ großen immunologisch reaktiven Antigenproteins und eines relativ klei- n> nen immunologisch reaktiven Antikörperproteins durch die Anwesenheit der Moleküle des inerten Proteins erreicht, daß mehr Antikörpermoleküle an die Antigenmoieküle gebunden werden, als wenn die Antigenmoleküle dicht zusammengepackt sind und dabei ü entsteht eine sehr viel größere Änderung im Kontrast zwischen einer einzelnen und einer Doppelschicht auf einem mit zwei Proteinen beschichteten Substrat. Die Erfindung schafft so eine einfache Prozedur zur Unterscheidung zwischen einer einzigen Schicht aus einem 2n großen Antigen, wie dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen und einer Doppelschicht, die eine zweite Schicht aus kleinen Antikörpern einschließt, wie dem Hepatitis-Antikörper, und sie kann so bei der Analyse der zweiten Lösung benutzt werden, um die Anwesenheit des Antikörpers damit zu bestimmen.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Zeichnung näher erläutert. Im einzelnen zeigt

F i g. 1 eine Seitenansicht eines Substrates, nachdem es ers' in eine Lösung eines Antigens nach einem bekannten Verfahren und dann in eine Lösung des gegenüber dem Antigen spezifischen Antikörpers eingetaucht ist,

F i g. 2 eine Seilenansicht des Substrates, nachdem es zwei F.iiitauchstufen wie in F i g. 1 unterworfen wurde, η wobei jedoch das erste Eintauchen gemäß der Erfindung ausgeführt wurde,

Fig. .? eine Seitenansicht des Subtrates der F i g. 2 nach einer darauffolgenden immunologischen Reaktion, bei der das beschichtete Substrat in eine das u> gleiche Antigen enthaltende Lösung eingetaucht wurde.

F i g 4 eine Seitenansicht des Substrates der F i g. 3 nach einem weiteren Eintauchen des Substrates in eine Lösung, die den gleichen Antikörper enthielt und bei ■»'> dem die Antikörpermoleküle an den Enden der Ketten der Antigen-Antikörper-Komplexe Antigenstellen auf einem Virus oder einer Zelle finden, um diese immuno-* logisch zu identifizieren,

F i g. 5 eine Seitenansicht eines Substrates, nachdem 5» es zuerst in eine Lösung eines großen Antigens nach einem bekannten Verfahren und dann in eine Lösung eines gegenüber dem Antigen spezifischen kleineren Antikörpers eingetaucht worden ist,

F i g. 6 eine Seitenansicht des Substrates, nachdem es 5ί zwei Eintauchstufen wie in F i g. 5 unterworfen wurde, wobei jedoch das erste Eintauchen gemäß der vorliegenden Erfindung ausgeführt wurde,

F i g. 7 eine Seitenansicht des Substrates der F i g. 6 nach einer darauffolgenden immunologischen Reak- w> tion, bei der das beschichtete Substrat in eine Lösung eingetaucht wurde, die einen Antikörper zum Antikörper in der zweiten Lösung enthielt, und

F i g. 8 eine Draufsicht auf ein Substrat, das einen engen Bereich von aktiven inerten Proteinen aufweist, der von inertem Protein gemäß der vorliegenden Erfindung umgeben ist

In Fig. 1 ist eine stark vergrößerte Seitenansicht eines Teiles der diagnostischen Apparatur in Form einer dünnen Platte 10 aus einem geeigneten Substratmaterial, das Metall, Glas, Glimmer, Kunststoff, geschmolzenes Siliciumdioxyd oder ähnliches Material sein kann, wobei Metall bevorzugt ist, da es den größten Unterschied im Brechungsindex gegenüber Protein hat, gezeigt. Vorzugsweise hat das Substrat die Form eines Metall- oder metallisierten Glasplättchens. An dem Substrat 10, wenn es in eine Lösung aus im allgemeinen Salzwasser, das ein erstes interessierendes Protein enthält, welches biologisch ein Antigen oder ein Antikörper sein kann, eingetaucht wird, haftet durch Adsorption eine monomolekulare Schicht 11. Für den Zweck der vorliegenden Erfindung wird die auf der Oberfläche des Substrates 10 adsorbierte Schicht 11 im nachfolgenden als Antigenschicht beschrieben. Jedes Protein wird in einer solchen monomolekularen Schicht adsorbiert, doch findet eine weitere Adsorption nicht statt, d. h. das Protein haftet zwar an dem Substrat, nicht jedoch an sich selbst. So kann daher die Antigen-Proteinschicht 11 nur monomolekular und nicht von größerer Dicke sein. Die für das vollständige Beschichten des Substrates mit dem Antigenprotein erforderliche Zeit ist eine Funktion der Konzentration des Proteins in der Lösung, des Grades des Rührens der Lösung und der Lösungstemperalur. So bedeckt z. B. eine l%ige Rinderserum-Albuminlösung einen Objektträger in etwa 30 Minuten vollständig mit einer monomolekularen Antigen-Proteinschicht.

Nachdem die monomolekulare Schicht des Antigenproteins 11 auf im wesentlichen der gesamten Oberfläche des Substrates 10 gebildet ist. wird das beschichtete Substrat aus der Lösung des Anligenproteins herausgenommen und als nächstes in eine Lösung eingetaucht, die das gegenüber dem Antigenprolein spezifisch reagierende Antikörperprotein enthält oder von der man vermutet, daü sie dieses enthält. Diese zweite Lösung kann zusätzlich zu dem spezifisch reagierenden Antikörperprotein, dessen Anwesenheit nachgewiesen werden soll, viele Bestandteile enthalten. Fs wird jedoch kein anderes Protein als das spezifisch reagierende Antikörperprotein an der ersten Antigcnproleinschicht auf dem Substrat haften. Daher w ird nur dann, wenn das spezifisch reagierende Antikörperprotein in der zweiten Lösung vorhanden ist. ein immunologisches Komplexieren zwischen dem Antigen und seinem spezifisch reagierenden Antikörper stattfinden, und das Substrat wird nach einer bestimmten Zeit eine bimolekulare Proteinschicht aufweisen. Die für die Adhäsion der zweiten (Antikörper-)molekularen Schicht 12 auf dem bes:hichteten Substrat erforderliche Zeit ist wieder eine Funktion der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der Lösung, des G rades der Lösungsbewegung und der Lösungstemperatur. Für Antikörper in Blutserum kann diese Zeit etwa bis zu einem Tag betragen. Die zweite Schicht kann in Abhängigkeit von den obengenannten drei Faktoren nur eine Teilschicht oder eine im wesentlichen vollständige Schicht sein.

Wie in F i g. 1 dargestellt, benutzen in dem Falle, in dem die Antigenschicht 11 im wesentlichen vollständig das Substrat 10 bedeckt, d. h. wenn der Abstand zwischen benachbarten Antigenmolekülen sehr gering ist, die Antikörpermoleküle im wesentlichen alle ihre Kombinationsstellen, um sich mit den Antigenmolekülen zu verbinden und verlieren so ihre Aktivität, d. h. im wesentlichen alle aktiven Stellen auf den Antikörpermolekülen 12 verbinden sich mit entsprechenden aktiven Stellen auf den Antigenmolekülen 11. Dieses Sub-

stratbeschichtungsverfahren ist in der älteren deutschen Patentanmeldung P 23 30 702 der Anmelderin mit dem Titel »Verfahren und Apparat für den Nachweis und die Reinigung von Proteinen und Antikörpern« beschrieben.

Da die monomolekulare Antigenschicht 11 über im wesentlichen (.lie gesamte Oberfläche des Substrates 10 in Fig. 1 adsorbiert ist, verbindet sich die zweite Schicht 12 des spezifischen Antikörpers für dieses Antigen unter Bildung der bimolekularen Schicht damit und ein weiteres Kombinieren mit zusätzlichem Protein, sei es Antigen oder Antikörper, ist nicht möglich, da keine weiteren aktiven Stellen auf den Antikörpermolekülen in Schicht 12 vorhanden sind. In der vorliegenden Erfindung wurde ein Verfahren gefunden, durch das die Antikörpermoleküle in dsr zweiten Schicht 12 mit den Antigenmolekülen in der ersten Schicht 11 verbunden werticu können und gleichzeitig verbleibende aktive Stellen für eine weitere Verbindung mit anderen Antigenmolekülen in einer weiteren immunologischen Reaktion aufweisen. Die Grundlage der vorliegenden Erfindung ist in F i g. 2 dargestellt, und sie ist in dem Verfahren zum Bilden der ursprünglichen monomolekularcn Schicht aus Antigenmolekülen 11 enthalten, die an der Oberfläche des Substrates 10 adsorbiert werden. Zur Illustration sind die darin abgebildeten Antikörper solche der IgG-Klasse, doch gibt es keine Gründe, aus denen Antikörper der anderen vier Hauptklassen, die oben genannt sind, in der vorliegenden Erfindung nicht benutzt werden können.

Nach Auswahl des Substrates 10, auf dem der multimolekulare immunologisch komplexierte Film gebildet werden soll, wird dieses Substrat in eine Lösung im allgemeinen aus Salzwasser eingetaucht, die das Antigen enthält, wie im Falle des im Zusammenhang mit F i g. 1 beschriebenen Verfahrens. Im Unterschied zu diesem bekannten Verfahren wurde jedoch ein immunologisch inertes Protein zu der ersten Lösung vor dem Eintauchen des Substrates in diese Lösung hinzugegeben, so daß die auf der Oberfläche des Substrates 10 gebildete Adsorptionsschicht aas reaktiven Antigen-Proteinmolekülen 11 besteht, die voneinander und entlang der Substratoberfläche umgeben sind durch inerte Proteinmoleküle 20, wie in F i g. 2 gezeigt. Die Menge des zu der Lösung hinzugegebenen immunologisch inerten Proteins reicht aus, daß der durchschnittliche Abstand zwischen benachbarten Antigenmolekülen 11, die an ■lern Substrat 10 haften, im allgemeinen bei einigen hundert λ liegt.

Das (mit Antigen und Inertprotein) monomolekular beschichtete Substrat 10 wird dann aus der ersten Lösung entfernt und in eine zweite Lösung eingetaucht, die spezifischen Antikörper zum Antigen der ersten Lösung enthält. Da der Abstand zwischen den aktiven Steilen eines Antikörpermoleküls 12 (der IgG-KJasse) etwa 200 Ä beträgt, wird ein großer Anteil der Antikörpermoleküle 12 mit der zweiten Lösung, die sich mit den Antigenmolekülen 11 verbinden, aktive Bindestellen behaltenes kann mehr als eine verbleibende Bindestelle pro Molekül existieren je nach der speziellen Klasse des Antikörpermoleküls) für eine weitere Kombination mit zusätzlichen Antigenmolekülen in einer nachfolgenden immunologischen Reaktion. Irgendein Antikörpermolekül kann sich natürlich nicht mit mehr als einer aktiven Stelle auf irgendeinem Antigenmolekül verbinden. Wie in F i g. 2 gezeigt, werden die Antikörpsrmoleküle 12 aufgrund des ausreichenden Abstandes zwischen den benachbarten Antigenmolekülen 11 durc? die dazwischenliegenden immunologisch inerten Proteinmoleküle 20 an die Antigenmolekiile 11 gebunden, und im allgemeinen verbleibt jedem Antikörpermolekül 12 eine aktive Bindungsstelle 12 a für eine nachfolgende immunologische Reaktion. Ein·; der Hauptaufgaben der vorliegenden Erfindung ist so gelöst worden, daß Antikörper an eine monomolekulare Antigenschichtoberfläche derart gebunden sind, daß Bindestellen der Antikörper aktiv bleiben für weitere

ίο immunologische Reaktionen. Ist das aktive Antigen menschliches Serumalbumin, dann ist ein Beispiel für das immunologisch inerte Protein Eialbumin und die Antikörper werden aus Kaninchenserum erhalten. Im Falle einer l-%igen Albuminlösung aus menschlichem Serum beträgt die Konzentration des inerten Eialbuminproteins darin 1 bis 10%.

Nachdem das Substrat 10 aus der Antikörperlösung herausgenommen worden ist (d. h. nach den in F i g. 2 gezeigten Stufen) wird das bimolekular beschichtete

2u Substrat als nächstes in eine Lösung eingetaucht, die das gleiche Antigen wie die erste Lösung enthält oder in der man solches Antigen vermutet und diese Antigenmoleküle 30 werden selektiv an die verbleibenden aktiven Stellen 12 α der Antikörpermoleküle 12 in einer

>-, weiteren immunologischen Reaktion gebunden. Das Ergebnis ist in F i g. 3 gezeigt. Diese Prozedur kann so dazu benutzt werden, bei der Analyse einer Lösung leicht die Anwesenheit eines speziellen Antigens nachzuweisen. Andererseits kann diese Prozedur auch dazu

ίο benutzt werden, verschiedene Ketten abwechselnder Antigen-Antikörper-Moleküle aufzubauen, in denen jede Kette ihren Ursprung an der Oberfläche des Substrates 10 hat, und einen multimolekularen immunologisch komplexierten Film verschiedener Ketten alter-

n liierender Antigen-Antikörper-Moleküle darauf zu bilden. Der multimolekular komplexierte Film wird leicht nachgewiesen durch Betrachten des beschichteten Substrates mit einem optischen Instrument, wie einem Ellipsomeler. Andererseits kann der multimolekular

ίο komplexierte Film auch elektrisch durch Messen der Kapazität eines Kondensators mit leitenden Platten, die durch das Metall oder metallbeschichtete Substrat und einen Quecksilbertropfen oder eine andere geeignete Elektrode gebildet werden, untersuch' werden, wobei

•r, die Proteinschichten das Kondensator-Dielektrikum sind, wie in der oben genannten älteren deutschen Patentanmeldung im einzelnen beschrieben ist. Weiter ist in dieser älteren Patentanmeldung das Verfahren zum optischen Untersuchen durch einfache visuelle

-,o Beobachtung durch Bestimmen der Zeit beschrieben, bevor ein sichtbares Amalgam zwischen einem Quecksilbertropfen und dem das Substrat beschichtenden Metailfilm durch die dazwischenliegenden Proteinschichten hindurch gebildet wird. Schließlich, und dies hat die größte Bedeutung, kann der multi molekular komplexierte Film auch optisch im reflektierten oder durchgehenden Licht untersucht werden, wie ebenfalls in der obigen älteren deutschen Patentanmeldung beschrieben. Bei dieser letztgenannten optischen Un-

6« tersuchung durch reflektiertes oder durchgehendes Licht ist das folgende eine erste Technik mit durchgehendem Licht, die erfolgreich angewendet worden ist: Das Substrat 10, das ein lichtdurchlässiges Substrat sein muß, wie Glas, Kunststoff, geschmolzenes Siliciumdi-

„5 oxyd, Glimmer, Quarz oder ähnliches und das vorzugsweise Glas ist, wobei Objektträger eine bequem erhältliche Ausruhrungsform sind, wird zuerst mit einer Vielzahl von Metallkügelchen durch Aufdampfen eines

Metalles, ι. U. Indium, auf das Substrat bedeckt. Das Indium wird z. B. langsam aus einem Tantaltiegel auf das Glassubstrat in einem gewöhnlichen Vakuum von etwa 5 x ICr⁵ mm Hg verdampft. Da die Indiumatome eine hohe Beweglichkeit auf der Oberfläche r*es Substrates haben und das Glassubstrat nicht merklich benetzen, agglomeriert das auf das Substrat aufgedampfte Indium zu kleinen Teilchen. Irgendein Metall mit ähnlichen Eigenschaften, so daß es bei seiner Verdampfung auf das Substrat ebenfalls Kügelchen bildet, kann verwendet werden. Außer Indium sind Gold, Silber, Zinn und Blei erfolgreich angewendet worden. Das Aufdampfen des Metalles wird fortgesetzt, bis das Substrat leicht braun gefärbt erscheint. Zu diesem Zeitpunkt haben die Metallküeelchen Durchmesser in der Größenordnung von 1000 A. Die genaue Größe der Kügelchen ist nicht kritisch, doch müssen sie Durchmesser haben gleich einem großen Anteil der Wellenlänge des sichtbaren Lichtes. Die nächste Stufe ist das Eintauchen des Kügelchen-bcrehichteten Substrates 10 in eine erste Lösung eine ersten immunologisch reaktiven Proteins, wie des Antigens 11 und des Inertproteins 20. Das erste reaktive Protein und das Inertprotein haften wieder in einer monomolekularen Schicht auf dem Substrat und den darauf befindlichen Metallkügelchen. Wenn sich eine monomolekulare Schicht gebildet hat, wird das beschichtete Substrat aus der ersten Lösung herausgenommen und in eine zweite Lösung eingetaucht, die das mit dem ersten Protein spezifisch reagierende Protein 12 enthält und das Ergebnis ist das Haften einer bimolekularen Proteinschicht ähnlich der in F i g. 2 gezeigten auf dem Substrat und den Metallkügelchen. Dann nimmt man das beschichtete Substrat aus der zweiten Lösung und taucht es in eine dritte Lösung, welche das reaktive Protein der ersten Lösung enthält oder vermutlich enthält. Ist dieses Protein vorhanden, dann wird eine dritte Schicht oder Teilschicht auf dem Substrat gebildet. Das beschichtete Substrat wird dann im durchfallenden Licht betrachtet und vom Aussehen des beschichteten Substrates wird die Dicke der daran haftenden Proteinschicht bestimmt und demgemäß, ob das erwartete Protein in der Lösung vorhanden war oder nicht. Der Nachweis der Proteinschichten entspricht den Variationen des Brauntones, der in dem beschichteten Substrat beobachtet wird. Diese Variationen sind recht deutlich und der Nachweis der Proteinschichten ist daher eine einfache Prozedur. Die Kügelchen allein auf dem Substrat erscheinen als ein erster Braunton, die mit einer monolekularen Proteinschicht bedeckten Kügelchen erscheinen als dunklerer Braunton und die mit einer bimolekularen Proteinschicht bedeckten Kügelchen erscheinen als noch dunklerer Braunton und schließlich sind die mit einer trimolekularen Proteinschicht bedeckten Kügelchen noch brauner. Diese Nachweismethode beruht auf der Tatsache, daß elektromagnetische Strahlung zu einem starken Grade durch leitende Kugeln mit Durchmessern gleich einem großen Anteil einer Wellenlänge der einfallenden Energie zerstreut wird und daß im Falle der Streuung durch solche Kügelchen die Streuung stark durch eine dünne dielektrische Schicht auf den Kügelchen beeinflußt wird. Eine zweite Technik für die optische Untersuchung mit reflektiertem Licht, die erfolgreich angewendet worden ist, ist die folgende: Ein Goldsubstrat, das aus Wirtschaftlichkeitsgründen vorzugsweise aus einer dünnen Goldschicht auf einem anderen Metall besteht, hat daran adsorbiert eine monomolekulare Schicht des ersten reaktiven Proteins 11 und des inerten Proteins 20 nach dem Eintauchen in die oben näher bezeichnete erste Lösung. Gold hat ein Absorptionsband innerhalb des sichtbaren Spektrums und diese Tatsache ist bestimmend fur die charakteristische Goldfarbe und gestal'et die Ausführung dieser speziellen optischen Untersuchungstechnik. Das Goldsubstrat kann bequenierweise ein Glas-Objektträger sein, der mit einer dünnen Indiumschicht bedeckt ist und darüber eine Goldschicht aufweist, wobei die Indiumschicht sowohl die

ίο Adhäsion zwischen dem Glas und dem Gold verbessert als auch die optischen Eigenschaften des Objektträgers. Das relative Reflexionsvermögen des Goldsubstrates als Funktion der Wellenlänge führt dazu, daß das Substrat die charakteristische hellgelbe Farbe des Goldmc-

!■> '-alls hat. wenn nicht irgendeine Proleinschicht darauf haftet. Bei Anwesenheit einer niononiolekular'n Schicht auf dem Substrat hat der Objektträger (Substrat) ein dunkelgelbes Aussehen. Nachdem man den

OhifL-'lt r:'iapr r'inpr I niiinti Miitn^^pt/1 h:il rlpr ii:ic n,->.

:c ,iienüber dem Protein Il immunologisch reagierende Protein 12 enthält und der Objektträger eine bimolekulare Proteinschicht aufweist, ergeben die Reilexionseigenschaften ein grünliches Aussehen, Eine dritte Proteinschicht führt /u einem noch grünlicheren Aus-

:> sehen. In Tests, die bisher durchgeführt worden sind, scheinen die optischen Untersuchungen des beschichte ten S übst rates durch rc lic ktiertos oder durchgehendes Licht, bei denen ein Metallkügelchen aufweisendes Substrat oder ein Goldsubstrat verwendet werden, die

jo im allgemeinen brauchbarsten Methoden zu sein. Weiter wurde festgestellt, dal.! diese beiden Techniken verschiedene Empfindlichkeiten als Funktionen der Dicke der interessierenden Proteinfilme aufweisen. Im Einzelfalle liegt die größte Empfindlichkeit bei der Technik

j) mit einem Substrat, das Metallkügelchen aufweist, bei Filmdicken unterhalb etwa 200 Ä. Die größte Empfindlichkeit des Goldsubstrates liegt bei Filmdicken, die größer sind als 30 A. Die im Einzelfalle angewendete Nachweismethode bestimmt so die Art des angewendeten Substrates 10 in jeder Analyse, d. h. ob das Substrat ein Metall oder ein metallisierter Glasobjektträger ist, das eine flache Metallbeschichtung (aus Gold als einem Beispiel) oder Metallkügelchen (aus Indium al" einem Beispiel) auf der Oberfläche aufweist, wie aucn in der obigen älteren deutschen Patentanmeldung erläutert. Der Einfachheit halber ist das Substrat 10 als eine flache Oberfläche aufweisend illustriert, obwohl die Oberfläche, an der die erste Antigenschicht adsorbiert ist, auch die vorgenannten Meiallkügelchen enthalten könnte.

Das Verfahren der Bildung multimolekularer (drei Schichten) immunologisch komplexierter Filme, wie es in F i g. 3 abgebildet ist, ist besonders von Bedeutung beim Untersuchen einer Lösung auf gewisse Proteine,

z. B. ein Hormon, da Hormone und Antiserum für Hormone im allgemeinen erhältlich sind. Wenn daher die dritte Schicht das interessierende Hormon ist, ist es leicht nachweisbar.
Schließlich ist das Bilden multimolekularer, immunologisch komplexierter Filme gemäß der vorliegenden Erfindung auch von Bedeutung beim immunologischen Identifizieren von Zellen oder Viren. Wie in F i g.4 illustriert, ist durch Aufbauen einer Vielzahl von Ketten aus Antigen-Antikörper-Komplexen von den Oberflächen des Substrates 10 die Wahrscheinlichkeit für verschiedene der Antikörpermoleküle an den Enden der verschiedenen Ketten relativ hoch, eine Antigensielle auf einer Zelle oder einem Virus 40 zu finden. Und diese

Wahrscheinlichkeit bleibt hoch, unabhängig von der Irregularität der Oberfläche der Zelle oder des Virus. Wie bekannt, weist die Zellmembran, die jede Zelle ein-^ schließt, sich nach außen erstreckende Moleküle auf," die als »Transplantations«-Antigene bezeichnet werden. Diese Antigene sind die, die dazu benutzt werden, die erste Schicht 11 in einem Zweischichtensystem für die immunologische Identifizierung von Zellen zu bilden, wobei die interessierenden Zellen die dritte Schicht darstellen wurden. Im Falle eines Vierschichtensystems aus Antigen-Antikörper-Ketten, wie es in F i g. 4 abgebildet ist, würden die erste und die dritte Schicht (11 und 30) aus den Transplantations-Antigenen bestehen. Es ist ebenfalls bekannt, daß ein Virus eine Proteinschicht aus Proteinmolekülen aufweist, die ,-5 aufgespalten und getrennt werden können und solche Moleküle werden zur Bildung der ersten bzw. ersten und dritten Schicht in Zwei- bzw. Vierschichtensystemen von Antigen-Antikörper-Ketten verwendet, die man zuir. immunologischen Identifizieren eines Virus 40 benutzt. Die Antikörper 12 in der zweiten Schicht und 41 in der vierten Schicht wurden natürlich spezifisch zu der speziellen Zelle oder dem speziellen Virus sein, das untersucht wird.

Aufgrund der vorliegenden Beschreibung ist es klar, aaß die vorliegende Erfindung eine neue Methode für dxs Binden von Antikörpern an eine Oberfläche schafft, so daß sie aktiv bleiben und multimolekulare immunologisch komplexierte Filme auf einem Substrat bilden können durch den Zusatz eines immunologisch inerten Proteins ausreichender Menge zu einer ersten Lösung, die ein immunologisch reaktives Antigenprotein enthält. Das Eintauchen eines geeigneten Substrates in die erste Lösung bildet durch Adsorption auf der Oberfläche des Substrates eine monomolekulare Schicht aus reaktiven Antigen-Proleinmolekülen, die durch die inerte Moleküle voneinander getrennt sind. Die Bildung einer solchen speziellen monomolekularen Schicht gestattet dann das nachfolgende Eintauchen des beschichteten Substrates in eine zweite Lösung, die den zum ersten Antigen spezifischen Antikörper enthält, so daß die Antikörpermoleküle an die Antigenmoleküle gebunden werden und gleichzeitig weitere aktive Stellen frei haben, um in nachfolgenden immunologischen Reaktionen zu agieren. Das beschichtetcSubstrat kann dann nachfolgend in eine Lösung eingetaucht werden, die das gleiche Antigen wie die erste Lösung enthält oder in der man dieses Antigen vermutet, und diese Prozedur kann wiederholt werden, um einen Aufbau verschiedener Ketten abwechselnder Antigen-Antikörpermoleküle zu verursachen.

In F i g. 5 ist eine stark vergrößerte Seitenansicht eines Teiles der diagnostischen Apparatur in Form einer dünnen Platte 10 aus einem geeigneten Substratmaterial gezeigt, das Metall, Glas, Glimmer, KunststolT, geschmolzenes Siliciumüioxyd, Quarz oder ähnliches Material sein kann, wooei Metall bevorzugt ist, da es den größten Unterschied im Brechungsindex zum Protein aufweist, und vorzugsweise liegt das Substrat in Form eines Metall- oder metallisierten M Glasplättchens vor. Wird das Substrat 10 in eine erste Lösung allgemein aus Salzwasser eingetaucht, die das erste interessierende Prolein enthält, das biologisch ein Antigen oder ein Antikörper sein kann, wird dieses auf dem Substrat in einer monomolekularen Schicht 11 adsorbiert. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird die an der Oberfläche des Substrates lOadsorbiertc Schicht 11 nachfolgend als Antigenschicht beschrieben. Jedes Protein wird in einer solchen monomolekularen Schicht adsorbiert, doch findet eine weitere Adsorption nicht statt, d. h. das Protein haftet an dem Substrat, jedoch nicht an sich selbst Die Antigen-Proteius-chicht II kann daher nur monomolekular sein und keine größere Dicke aufweisen. Die für das vollständige Beschichten des Substrates mit dem Antigenprotein erforderliche Zeit ist eine Funktion dei Konzentration des Proteins in der Lösung, des Grades des Rührens der Lösung und der Lösungstemperatur. So beschichtet z. B. eine Konzentration von 1 mg/cm³ des mit der Hepatitis verbundenen Antigens einen Objektträger in etwa 10 Minuten vollständig mit einer monomolekularen Antigen-Proteinschicht

Nachdem sich die monomolekulare Schicht des Antigenproteins 11 auf im wesentlichen der gesamten Oberfläche des Substrates 10 gebildet hat, wird das beschichtete Substrat aus der Lösung des Antigenproteins entfernt und als nächstes in eine zweite Lösung eingetaucht, die das mit dem Antigenprotein spezifisch reagierende Antikörperprotein enthält oder vermutlich enthält. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird angenommen, daß das an der Oberfläche des Substrates 10 adsorbierte Protein 11 immer größer ist als das damit immunologisch reaktive Protein, das eine zweite Schicht auf dem Substrat bildet. Die zweite Lösung kann zusätzlich zr dem spezifisch reagierenden kleineren Antikörperprotein, dessen Anwesenheit nachgewiesen werden soll, viele Bestandteile enthalten. Es wird jedoch kein anderes Protein als das spezifisch reagierende Antikörperprotein an der ersten Antigen-Proteinschicht auf dem Substrat haften. Es wird daher nur dann ein immunologisches Komplexieren zwischen dem Antigen und seinem spezifisch reagierenden Antikörper stattfinden, und das Substrat wird nach einer gewissen Zeit nur dann eine bimolekulare Proteinschicht tragen, wenn das spezifisch reagierende Antikörperprotein in der zweiten Lösung vorhanden isL Die für die Adhäsion der zweiten (Antikörper-) molekularen Schicht 12 auf dem beschichteten Substrat erforderliche Zeit ist wiederum eine Funktion der Konzentration des spezifisch reagierenden Proteins in der Lösung, des G rades der Lösungsbewegung und der Lösungstemperatur. Für Antikörper im Blutserum kann diese Zeit bis zu einem Tag betragen. Die zweite Schicht kann je nach den drei oben genannten Faktoren entweder nur eine Teilschicht oder eine im wesentlichen vollständige sein.

In dem Falle, wie er in F i g. 5 dargestellt worden ist. in dem die Antigenschicht 11 im wesentlichen vollständig das Substrat 10 bedeckt, d. lii. wenn der Abstand zwischen benachbarten Antigenmolekülen sehr gering ist, ist die Zahl der Antikörpermoleküle 10, die an irgendeinem bestimmten Antigcnmolekül gebunden werden kann, wegen der begrenzten Oberfläche des Antigenmoleküls, die für solche immunologische Reaktionen verfügbar ist, begrenzt. Dieses Substratbeschichtungsverfahren ist in der oben genannten älteren deutschen Patentanmeldung der Anmelderin beschrieben,

Da die monomolekulare Antigenschicht 11 über im wesentlichen die gesamte Oberfläche des Substrates 10 in F i g. 5 adsorbiert ist, verbindet sich die zweite Schicht 12 aus dem kleineren spezifischen Antikörper für dieses Antigen in einer dünnen Schicht unter Bildung einer bimolekularen Schicht damit. Da jedoch die Proteine der zweiten Schicht 12 eine geringere Größe haben als die Proteine der ersten Schicht Il und vveil demgemäß die zweite Schichl; weniger dicht ist als die

erste (Antigen-)Schicht, ist es klar, daß es beträchtliche Schwierigkeiten bei dem Unterscheiden zwischen dieser einzelnen und derDoppelprotetnschichtauf dem Substrat 10 geben kann. Ein gutes Beispiel für diese Situation ist der Fall, daß die erste Schicht 11 aus dem mit der Hepatitis verbundenen Antigen besteht und die zweite Schicht 12 aus dem spezifischen Antikörper zum HAA. Die Untersuchung des beschichteten Substrates mit einem optischen Instrument, wie dem Eilipsometer, gestattet einem nicht leicht zwischen der einzelnen (Antigen-) und einer Teil- oder verdünnten Doppel-(Antigen-Antikörper-KornpIex)Schicht auf dem Sub-, strat zu unterscheiden, und so kann nicht leicht bestimmt werden, ob die zweite Lösung tatsächlich irgendeinen der Antikörper zum HAA enthielt und so ist es ein solches diagnostisches Verfahren von geringem Wert. In der vorliegenden Erfindung wurde ein Verfahren gefunden, mit dem eine sehr viel größere Zahl von Antikörpermolekülen in der zweiten Schicht 12 an die Antigenmoleküle der ersten Schicht H gebunden werden kann, so daß eine sehr viel größere Änderung im Kontrast zwischen der einzelnen und der Doppelschicht verursacht wird. Die Grundlage der vorliegenden Erfindung ist in F i g. 6 dargestellt und in dem Verfahren zum Bilden der ursprünglichen monomolekularen Schicht aus Antigenmolekülen 11 enthalten, die auf der Oberfläche des Substrates lö adsorbiert wird. Zur Illustration sind die abgebildeten Antikörper aus der IgG-Klasse, doch gibt es keine Gründe, aus denen Antikörper der anderen vier Hauptklassen, die oben genannt wurden, nicht in der vorliegenden Erfindung angewendet werden können.

Νλ-ch dem Auswählen des Substrates 10, auf dem der bimolekulare immunologische Komplexfilm gebildet werden soll, wird dieses Substrat in eine erste Lösung eingetaucht, die allgemein aus Salzwasser besteht, das das Antigen enthält, wie dies im Falle des Verfahrens im Zusammenhang mit Fig. 5 beschrieben wurde. Im Gegensatz zu diesem vorherigen Verfahren wurde jedoch hier vor dem Eintauchen des Substrates in die Lösung ein immunologisch inertes Protein zu der ersten Lösung hinzugegeben, so daß die auf der Oberfläche des Substrates 10 gebildete Adsorptionsschicht aus relativ großen reaktiven Antigenproteinmolekülen 11 besteht, die entlang der Substratoberfläche voneinander getrennt und umgeben sind von inerten Proteinmolekülen 20, wie in F i g. 6 gezeigt. Die inerten Proteinmoleküle 20 haben eine Größe, die mindestens etwas geringer ist und vorzugsweise beträchtlich geringer als die der Antigenmoleküle 11, um die größtmögliche Oberfläche und damit mehr Bindestellen der Antigenmoleküle 11 für das nachfolgende Verbinden mit den Antikörpermolekülen erreichbar zu machen. Die Menge des immunologisch inerten Proteins 20, die zu der Lösung hinzugegeben wird, ist ausreichend, um im allgemeinen mit dem inerten Protein 20 Vi bis Vw der Fläche der vollständigen Adsorptionsschicht zu bedecken, d. h. das Antigen bedeckt dementsprechend Vi bis '/io der Fläche, obwohl dies keine Begrenzung der vorliegenden Erfindung darstellt, da der durchschnittliche Abstand zwischen benachbarten Antigenmolekülen auch durch die Zahl der aktiven Stellen auf dem jeweiligen Antigenmolekül und der Art, in der solche Moleküle an dem Substrat haften, bestimmt ist, d. h. der Zahl der aktiven Antigenstellen, die freiliegen. In dem Falle, in dem das Antikörpermolekül 12 sehr viel kleiner ist als das Antigen, ist ein größerer Abstand der Antigenmoleküle erwünscht, während bei einem nur leicht kleineren Antikörpermolekül gegenüber dem Antigen ein geringerer Abstand zwischen den Antigenmolekülen toleriert werden kann, um den maximalen Vorteil der vorliegenden Erfindung zu erhalten. Als ein Ergebnis des großen Antigsnproteins relativ zum inerten Proteinmolekül wird ein Hauptanteil der Oberfläche des Antigenmoleküls frei bleiben und seine entsprechenden Bindestellen sind für eine Kombination mit Antikörpermolekülen in einer nachfolgenden immunologischen Reaktion zugänglich.

Das (mit Antigen- und Inertprotein) monomolekular beschichtete Substrat 10 wird dann aus der ersten Lösung entfernt und in eine zweite Lösung eingetaucht, die die für das Antigen der ersten Lösung spezifischen

;₅ Antikörper enthält. Als Resultat der größeren Oberfiäche und derzahlreicheren Antigenstellen, die auf den Antigenen freiliegen, da die Antigene durcht'.e kleineren Inertproteine in F i g. 6 umgeben sind, verglichen mit Fig. 5, können die Antigenmoleküle in F i g. 6 leichter immunologisch mit einer größeren Anzahl von Antikörpern als in F i g. 5 kombinieren.

Wie in F i g. 6 gezeigt, wird daher eine größere Zahl von Antikörpermolekülen 12 im allgemeinen mitjedem Antigenmolekül kombinieren als im Falle der Fig. 5, und es ist aus dem Vergleich der F i g. 5 und 6 offensichtlich, daß wegen dergrößeren Zahl von Antikörpermolekülen, die in der zweiten Schicht vorhanden ist, eine sehr viel größere Änderung im Kontrast zwischen der einzelnen und der Doppelschicht in der Ausführungsform der Erfindung der F i g. 6 erhalten wird. So hat z. B. die erste Lösung eine solche Konzentration des mit der Hepatitis verbundenen Antigens (HAA) und des Rinderserumalbumins (BSA), welches das inerte Protein ist, daß das HAA ¹A der Oberfläche in der monomolekularen Schicht und das inerte BSA-Protein die verbleibenden ³U der Oberfläche bedeckt und die zweite Lösung ist eine verdünnte Lösung des HAA-Antikörpers. Das oben beschriebene Verfahren kann daher bei der Analyse dazu benutzt werden, leicht die Anwcsenheil eines spezifischen Antikörpers zu einem besonderen, relativ großen Antigen nachzuweisen.

Das mit einer Doppelschicht bedeckte Substrat der Fig. 6 kann danach in eine dritte Lösung oder ein Serum eingetaucht werden, das Antikörper 30 zu den Antikörpern 12 der zweiten Schicht enthält, um eine dritte Schicht aufzubauen, wie dies in F i g. 7 dargestellt ist. Da jedes Antikörpermolekül 12 verschiedene Antigendeterminanten hat, kann es im allgemeinen mit verschiedenen Molekülen 30, die Antikörper zu den

so Antikörpern 12 sind, kombinieren und dabei eine relativ dicke dritte Schicht aus solchen zweiten Antikörpermolekülen 30 bilden. Die Anwesenheit der dichten dritten Schicht 30 zeigt die Anwesenheit der zweiten Schicht 12 und schafft so einen noch größeren Kontrast zwischen der monomolekularen und der bimolekularen Schicht aus Antigen und erstem Antikörper. Im letzteren Falle helfen die inerten Proteinmoleküle 20 zwischen den großen Antigenmolekülen 11 in der ersten Schicht auch mit, ein Halten nichtspezifischen Proteinmaterials in dem Serum, das die Antikörper zu dem Antikörper eines solchen Antigens enthält, an dem Substrat zu verhindern. So wird ein zweifacher Gewinn erzielt, indem mehr spezifisch gebundene Antikörper für jedes Antigenmolekül erhalten werden und weniger nicht-spezifisch gebundenes Protein auf dem Substrat vorhanden ist, und all dies resultiert aus dem Gebrauch des Inertproteins, um die großen Antigenmoleküle im Abstand voneinander zu halten und die Oberfläche des

Substrates, die jedes Antigenmolekül umgibt, mit solchem inerten Protein zu bedecken. Die zur Bildung der dritten Schicht in F i g. 7 angewendete Prozedur ist daher brauchbar bei der Analyse der zweiten Lösung, von der man annimmt, daß sie Antikörper 12 enthalt, da das nachfolgende Eintauchen des beschichteten Substrates in die dritte Lösung einen beträchtlich verstärkten Kontrast schafft zwischen der monomolekularen Schicht und der bimolekularen, die tatsächlich nun eine trimolekulare Schicht ist, wenn eine bimolekulare Schicht aufgrund der Tatsache vorhanden war, daß die zweite Lösung tatsächlich den Antikörper 12 enthielt.

Die Anwesenheit der zweiten (Antikörper 12) Proteinschicht in der Ausführungsform der Fig. 6, die auch durch die dritte (Antikörper 30) Proteinschicht in F i g. 7 angedeutet ist, kann leicht nachgewiesen werden durch Betrachten des beschichteten Substrates mit einem optischen Instrument, wie einem Ellipsometer. Die Proteiaschichten können andererseits auch elektrisch untersucht werden, wie dies im einzelnen in der oben genannten älteren Patentanmeldung der Anmelderin beschrieben ist, indem man die elektrische Kapazität eines Kondensators mißt, der leitende Platten aufweist, die aus dem Metall- oder metallbeschichteten Substrat und einem QuecksUbertropfen oder einer anderen geeigneten Elektrode gebildet sind und bei dem das Kondensator-Dielektrikum durch die Proteinschicht gebildet wird. Weiter können die Proteinschichten, wie in der genannten älteren Patentanmeldung und oben bezüglic!/ des multimolekularen komplexierten Filmes beschrieben, auch optisch untersucht werden, indem man sie visuell beobachtet und dabei die Länge der Zeit bestimmt, bevor ein sicb'bares Amalgam zwischen einem Quecksilbertropfen und dem Metallfilm auf dem Substrat gebildet wird, wobei sich die Proteinschichten dazwischen befinden. Schließlich, und diese Art der Untersuchung ist die bedeutendste, können die Proteinschichten auch optisch mit reflektiertem oder durchgehendem Licht untersucht werden, wie in der genannten älteren Patentanmeldung und oben mit Bezug auf den multimolekularen komplexierten F^;tm beschrieben. Im Falle der Proteinschichten wird das beschichtete Substrat dann aus der zweiten Lösung herausgenommen und in eine dritte Lösung eingetaucht, die ein reaktives Protein bezüglich des reaktiven Proteins in der zweiten Lösung enthält (wie einen Antikörper zu dem Antikörper), um eine dritte Schicht (oder eine Teilschicht) auf dem Substrat zu bilden, wenn die zweite Schicht vorhanden ist. Das beschichtete Substrat wird dann mit durchgehendem Licht beobachtet und von dem Aussehen des beschichteten Substrates wird eine Bestimmung der Dicke der am Substrat haftenden Proteinschicht gemacht und dementsprechend eine Bestimmung hinsichtlich der Anwesenheit oder Abwesenheit des zweiten Proteins 12.

Der Kontrast zwischen einfachen und Doppelproteinschichten kann zu einem noch größeren Ausmaß verstärkt werden, indem man das Antigen und inerte Protein auf das Substrat IQ als einen einzelnen Lösungstropfen aufbringt und danach das tropfbeschichtete ω Substrat in eine Lösung eintaucht, die nur das inerte Protein 20 enthält, um eine monomolekulare Schicht zu bilden, in der der kleine Antigen-Inertprotein-Bereich vollständig von dem Inertprotein umgeben ist, wie in Fig. 8 dargestellt. Diese Ausführungsform löst das Problem der nicht-spezifischen Adsorption tür den Fall, daß Antikörper in einem Serum vorhanden sind, da das InertDrotein auf der Oberfläche des Substrates die nichtspezifischen Proteine in dem Serum an einem Haften an dem Substrat hindert und so den Kontrast verbessert.

Die oben beschriebenen einfachen Prozeduren haben in der Möglichkeit resultiert, die Hepatitis mit einem Test nachzuweisen, der so empfindlich ist wie der Standard-Radioimmuntest (standard radioimmuneassy test).

Schließlich ist die oben beschriebene Prozedur von Bedeutung bei der immunologischen Identifizierung von Viren und Enzymen. Alle Antigene des Virustyps sind größer als ihre spezifischen Antikörper, während die Antigene des Enzymtyps größer oder kleiner sein können, je nach der spezifischen Enzymart. Eine Prozedur für die Identifizierung eines speziellen Virus oder eines großen Enzyms, die als Inhibitionstest bekannt ist, wird in folgender Weise ausgeführt: _;

Ein spezielles Virus oder großes Enzym wird in eine erste Lösung (allgemein Salzwasser) zusammen mit dem !nertprotein eingebracht und in diese Lösung wird das Substrat eingetaucht oder es wird ein Tropfen der Lösung auf dem Substrat angeordnet und das Substrat dann in eine Lösung von nur dem Inertprotein eingetaucht. Nachdem eine monomolekulare Schicht des Virus oder Enzyms (d. h. des Antigens) und des Inertproteins an dem Substrat adsorbiert wurde, entfernte man das beschichtete Substrat aus der ersten Lösung. Proben menschlichen Serums, die auf die Anwesenheit des speziellen Virus oder Enzyms getestet werden sollen, werden vorbereitet durch Einmischen einer Menge bekannter Antikörper zu dem spezifischen Virus oder Enzym, und zwar in einer ausreichenden Menge, um dieses immunologisch aus der Mischung zu entfernen, wenn das Virus oder Enzym in derSerumprobe vorhanden ist. Das monomolekular beschichtete Substrat wird dann in die vorher zubereitete Serumprobe eingetaucht oder ihr ausgesetzt und nach dem Entfernen davon gemäß irgendeiner der oben beschriebenen Prozeduren untersucht. Wenn die Betrachtung des Substrates das Vorhandensein nur einer monomolekularen Schicht darauf anzeigt, dann weiß man, daß das untersuchte menschliche Serum ursprünglich das spezielle Virus oder Enzym enthielt. Wird jedoch eine bimolekulare Schicht nachgewiesen, dann zeigt dies, daß das Serum ursprünglich solches Virus oder große Enzymantigen nicht enthielt, da die Antikörper sich nicht immunologisch mit ihrem spezifischen Antigen (Virus oder Enzym) in derSerumprobe verbanden und sie daher in der Lage waren, sich mit dem Antigen der auf dem Substrat adsorbierten ersten Schicht zu verbinden.

Aufgrund der vorstehenden Beschreibung ist klar, daß die Erfindung ein neues Verfahren zur Verbesserung des Kontrastes in immunologischen Oberflächentests zwischen einer Einzel- und einer Doppelschicht aus Protein schafft, indem ein immunologisch inertes Protein ausreichender Menge zu einer ersten Lösung hinzugegeben wird, die ein immunologisch reaktives Antigenprotein enthält.

Neben den spezifischen Ausführungsformen und Beispielen, die beschrieben wurden, sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung noch verschiedene Modifikationen und Variationen möglich. So könnte z. B. das inerte Protein in einer Lösung getrennt von dem Antigen verwendet werden, und das Substrat würde in diese separate Lösung als Vorstufe oder Zwischenstufe zwischen Eintauchungen in eine verdünnte Lösung der Antigen- und der Antikörperlösung eingetaucht werden. Als andere Möglichkeit für den Fall, daß die Anti-

körper in einem Serum vorhanden wären, würde eine verdünnte Lösung des Antigens zur Bildung einer unvollständigen ersten Schicht auf dem Substrat verwendet werden und das inerte Protein würde in einer solchen Lösung vermieden werden, da die nicht-spezifisehen Proteine in dem Serum als das Inertprotein wirken und an dem Substrat haften und so als Abstandshaltemittel zwischen den Antigenmolekülen wirken würden.

Die Erfindung kann auch dazu benutzt werden, Enzyme nachzuweisen, indem man eine verdünnte Lösung des Enzyms benutzt, um die Antigene in der ersten Schicht zu erhalten und Rinderserumalbumin als das Inertprotein zu der ersten Lösung hinzugibt und eine Lösung eines Antikörpers zu dem Enzym (von einem Kaninchen, dem zuvor das Enzym injiziert worden ist) in der zweiten Lösung benutzt und dann das bimolekular beschichtete Substrat in eine dritte Lösung

eintaucht, von der man annimmt, daß sie das Enzym enthält und man dann anschließend das Substrat auf die Anwesenheit einer dritten Schicht untersucht, die aus dem speziellen Enzym gebildet werden würde. Obwohl das auf der Substratoberfläche adsorbierte reaktive Protein im Rahmen dieser Anmeldung als ein Antigen beschrieben worden ist, ist es jedoch klar, daß das reaktive Protein der ersten Schicht auch ein Antikörper sein könnte und das Protein der zweiten Schicht würde dann das Antigen sein, das spezifisch für diesen Antikörper ist und die dritte Proteinschicht würde dann wieder der Antikörper sein. Eine solche Anordnung aus einer ersten Antikörperschicht und einer zweiten Antigenschicht, die spezifisch zu dem Antikörper ist, wäre in solchen Fällen brauchbar, in denen ein Antikörpermolekül größer ist als sein spezifisches Antigenmolekül, was z. B. hinsichtlich des Antikörpers zum Insulin der Fall ist.

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

Claims

IO Patentansprüche:

1. Verfahren zum Herstellen multimolekularer Schichten aus immunologisch komplexierten Proteinen durch

a) Beschichten eines geeigneten Substrates mit einer ersten Schicht aus einem immunologisch reaktiven ersten Protein und

b) Aussetzen des beschichteten Substrates gegenüber einer Lösung eines immunologisch reaktiven zweiten Proteins, welches eins spezifische immunologische Reaktion mit dem ersten Protein eingeht, unter Bildung einer Doppelschicht auf dem Substrat,

dadurch gekennzeichnet, daß das Substrat ferner einem immunologisch inerten Protein ausgeseti·.·_ wird, das an dem Substrat adsorbierbar ist derart dsß die Moleküle des ersten Proteins voneinander durch die Moleküle des inerten Proteins getrennt sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß das Subsirat ein mit einer Metallschicht versehener Objektträger ist.

3. Verfahren nach Anspruch I oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das immunologisch reaktive erste Protein ein Antigen und das immunologisch reaktive zweite Protein ein gegenüber dem Antigen spezifischer Antikörper ist.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper einer aus der Immunoglobulin-Klasse IgG ist.

5. Verfahren nach Ansprua. 4, dadurch gekennzeichnet, daß das Antigen ein Enzym, das inerte Protein Rinderserumalbumin und der Antikörper der eines Kaninchens ist, dem vorher das Enzym injiziert worden war.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche i bis 5. dadurch gekennzeichnet, daß man zum Beschichten des Substrates mit einer munomolekularen Schicht aus dem ersten Protein und dem inerten Protein

i) ein; erste Lösung von einem immunologisch reaktiven Antigenprotein zubereitet,

ii) das inerte Protein in ausreichender Menge zu der ersten Lösung hinzugibt.

iii) das Substrat in die erste Lösung eintaucht und

iv) das mit der ersten Schicht bedeckte Substrat aus der ersten Lösung herausnimmt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Beschichten des Substrats mit einer monomolekularcn Schicht aus dem ersten Protein und dem inerten Prolein

i) eine erste Lösung des immunologisch inerten Proteins zubereitet,

ii) das Substrat in die erste Lösung eintaucht, um es mit einer Teilschicht des Inertproteins zu bedecken.

iii) das teilweise beschichtete Substrat aus der ersten Lösung entfernt,

iv) eine zweite Lösung aus dem immunologisch reaktiven ersten Protein zubereitet,

v) das teilbcschichtcte Substrat in die zweite Lösung eintaucht, um die verbleibende Oberfläche des Substrates mit einer Teilschicht aus dem zweiten Protein zu bedecken, so daß die monomolekulare Schicht aus den Molekülen des ersten Proteins besteht, die voneinander durch die inerten Proteinmoleküle getrennt sind und

vi) das mit der monomolekularen Schicht bedeckte Substrat aus der zweiten Lösung entfernt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis S, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Beschichten des Substrates mit einer monomo'ekularen Schicht aus dem ersten Protein und dem inerten Protein

i) eine erste verdünnte Lösung eines immunologisch reaktiven ersten Proteins zubereitet,

ii) das Substrat in die erste Lösung eintaucht, um es mit einer monomolekularen Teilschicht des ersten Proteins zu bedecken,

iii) das teilweise bedeckte Substrat aus der ersten ,Lösung entfernt.

iv) eine zweite Lösung aus dem immunologisch inerten Protein zubereitet,

v) das teilbeschichtete Substrat in die zweite Lösung eintaucht, um die verbleibende Oberfläche des Substrates mit einer monomolekularen Teilscnicht des inerten Proteins zu bedecken, so daß die mononiolekulare Schicht aus den Molekülen des ersten Proteins besteht, die voneinander durch inerte Proteinmoleküle getrennt sind und

9. Verfahren nach einem der Ansprüche I bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man eine erste Losung aus immunologisch reaktivem Antigenprotein zubereitet,

das Substrat in die erste Lösung eintaucht, um es mit einer monomolekuhrenTcilschicht aus Antigenprotein zu beschichten.

das teilweise beschichtete Substrat aus der ersten Lösung entfernt und

das teilbeschichtete Substrat in eine Lösung des entsprechenden Antikörperproteins eintaucht, wobei die Antikörper in einem Serum vorhanden sind und die außer den Antikörpern in dem Serum enthaltenen Proteine als das inerte Protein wirken und an dem Substrat haften und so die monomolekulare Schicht aus Antigenmolekülen vervollständigen, die dadurch voneinander durch inerte Proteinmoleküle getrennt sind und die Antikörper-Protcinmoleküle des Serums eine /weite mononiolekulare Schicht bilden.

10. Verfahren nach Anspruch 6. dadurch gekennzeichnet, daß man von dem inerten Protein eine solche Menge zu der ersten Lösung hinzugibt, daß der durchschnittliche Abstand zwischen benachbarten Antigenproteinmolekülen in der monomolekularen Schicht einige hundert Angström betrügt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10. dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden weiteren Stufen umfaßt:

c) Entfernen des mit einer bimolekularen Schicht bedeckten Substrates aus der Antikörperlösung und

d) nachfolgendes Aussetzen des beschichteten Substrates gegenüber einer dritten Lösung, von

der man vermutet, daß es das gleiche Antigen enthält, das in der ersten Lösung vorhanden ist, um eine immunologische Reaktion mit dem Antikörper zu verursachen, in der die verbleibenden aktiven Stellen auf den Antikörpermolekülen sich chemisch mit den Antigenmolekülen in der dritten Lösung verbinden, wenn solche in der dritten Lösung vorhanden sind.

e) Untersuchen des beschichteten Substrates dahingehend, um zu bestimmen, ob sich eine dritte Schicht auf dem Substrat gebildet hat, und dadurch die Anwesenheit des Antigens in der dritten Lösung festzustellen.

12. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die erste Lösung aus dem immunologisch reaktiven ersten Protein dadurch zubereitet, daß man

die Antigene, die in den äußersten Teilen einer spezifisclien Zelle oder eines Virus vorhanden sind, abtrennt und davon eine Lösung zubereitet, und man weiter

c') das mit der bimolekularen Schicht beschichtete Substrat aus der Antikörperlösung herausnimmt und

d') danach in eine dritte Lösung eintaucht, von der man annimmt, daß sie die spezielle Zelle oder das Virus enthält, so daß die Antikörpermoleküle Antigenstellen auf der Zelle oder dem su Virus finden, um eine Bindung damit einzugehen, und man das

e') beschichtete Substrat untersucht, um zu bestimmen, ob sich darauf eine dritte Schicht befindet und dadurch die Anwesenheit der speziellen Zelle oder des Virus in der dritten Lösung anzuzeigen.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeicht ;t, daß es die folgenden weiteren Stufen umfaßt:

f) Entfernen des beschichteten Substrates aus der dritten Lösung und

g) nachfolgendes Aussetzen des beschichteten Substrats gepenüber einer vierten Lösung, die den gleichen Antikörper enthält, der in der zweiten Lösung vorhanden ist, um eine immunologische Reaktion zu bewirken, in der aktive Stellen der Antiiförpermoleküle in der vierten Lösung sich mit Antigenmolekülen von der dritten Lösung verbinden.

14. Verfahren nach Anspruch 13, gekennzeichnet durch die folgenden weiteren Stufen:

h) Entfernen des beschichteten Substrates aus der vierten Lösung

i) nachfolgendes Aussetzen des Substrates mit den Ketten der Antigen-Antütörper-Komplexe, die von der Oberfläche des Substrates aus aufgebaut sind, gegenüber einer fünften Lösung, von der man annimmt, daß sie Zellen oder Viren spezifisch zu dem Antikörper in den Ketten der Antigen-Antikörper-Komplexe enthält, so daß diese Antikörper Antigen-Reaktionsstellen auf der Zelle oder dem Virus finden, um sich dsirut zu verbinden,

k) Entfernen des beschichteten Substrates aus der fünften Lösunß und

1) Untersuchen des Substrates, um zu bestimmen, ob die auf den Antikörpennolekükn verbliebenen aktiven Stellen sich mit Antigenstellen auf den Zellen oder dem Virus in der fünften Lösung verbunden haben.