DK151240B - Fremgangsmaade til fremstilling af multimolekylaere lag af immunologisk reaktive proteiner paa et egnet substrat - Google Patents

Description

151240

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af multi-molekylære lag af immunologisk reaktive proteiner, ved hvilken (a) et egnet substrat belægges med et monomolekylært proteinlag bestående af et immunologisk reaktivt første protein, og (b) det be-5 lagte substrat dernæst behandles med en opløsning af et immunologisk reaktivt andet protein, der er specifikt for det første protein, til frembringelse af en immunologisk reaktion, ved hvilken det andet proteins molekyler bindes til det første proteins molekyler til dannelse af et bimolekylært lag.

10 Immunologiske reaktioner er yderst specifikke, biokemiske reaktioner, hvorved et første protein, kendt som antigenet, forener sig med et andet for antigenet specifikt protein, der er kendt som antistof under dannelse af et immunologisk protein kompleks. Immunologiske reaktioner, der forekommer i en biologisk organisme, såsom 15 et dyr eller menneske, er uundværlige for sygdomsbekæmpelse. I en biologisk organisme forårsager indtrængen af et fremmed protein, det vil sig antigenet, at den biologiske organisme danner specifikke antistof proteiner mod antigenet i en proces, der endnu ikke helt er forstået. Antistof proteinmolekylerne har tilgængelige kemiske kombi-20 nations- eller bindingscentre, som er komplementære til antigen molekylet, således at antigenet og antistoffet kombineres eller sammenknyttes kemisk under dannelse af det immunologiske proteinkompleks.

Som følge af, at antistoffer dannes i biologiske organismer, som 25 reaktion på indtrængen af fremmede proteiner i disse, er påvisningen af antistoffer, der forekommer i en biologisk organisme, af diagnostisk værdi ved bestemmelse af de antigener, som organismen har været udsat for. Omvendt har påvisningen af visse antigener i en biologisk organisme også diagnostisk værdi; eksempler på diagnostisk 30 påvisning af antigener omfatter påvisning af HCG-proteinmolekyler i urin, som graviditetsprøve, og påvisning af HAA-molekyler, der er antigener, som har forbindelse med leverbetændelse, i eventuelle bloddonorers blod. For at gennemføre sådanne diagnostiske prøver, må proteinet, fra mindst et immunologisk par, tilvejebringes.

35 Den eneste kendte kilde for antistof protein er* en levende bio logisk organisme. Nærmere bestemt er kun vertebrater for øjeblikket kendt for at udvise immunologiske reaktioner ved indføring af et fremmed protein. F.eks. er der fundet mange antistoffer i blodserum i dyr og mennesker, som er blevet udsat for de tilsvarende anti- 2 151240 gener. Mange antigener kan imidlertid fremstilles under kontrol i laboratoriekulturer. Imidlertid kan visse antigener, f.eks. antigener forbundet med leverbetændelse, ligesom antistoffer, for øjeblikket kun tilvejebringes fra de højere levende biologiske organismer.

5 De fleste antigener er proteiner eller indeholder proteiner, som en væsentlig del, hvorimod alle antistoffer er proteiner. Eftersom proteiner er store molekyler med høj molekylvægt, det vil sige er polymerer bestående af kæder af aminosyrer i forskelligt antal, kan antigen- og antistof proteinet hver have adskillige kombinationscentre.

10 De fem hovedklasser af antistoffer (immunoglobuliner Ig G, lg M, Ig A, Ig E og Ig D) er hver tilsyneladende ejendommelige ved mindst to lange peptidkæder af aminosyrer og mindst to korte peptidkæder af syrerne, i hvilke bindingen mellem aminosyreenhederne er kendt som en peptidbinding. Disse lange og korte peptidkæder er orienteret 15 med form som bogstavet "Y", og de aktive centre eller kombinationscentre er de yderste ender af de to arme af det Y-formede antistof i I g G-antistoffet.

Immunologiske reaktioner kan påvises ved forskellige metoder, herunder anvendelse af et passende substrat, såsom et metalbelagt 20 glas eller en metalplade. Udsættelse af substratet for en antigenopløsning vil bevirke, at antigenerne adsorberes fysisk i et tæt monomolekylært lag på sustratets overflade. Efterfølgende udsættelse af det antigenbelagte substrat for et serum indeholdende antistoffer mod antigenet, resulterer i den immunologiske reaktion, hvorved disse 25 antistoffer selektivt bindes til antigenerne ved de bindingscentre på antistofmolekylet, som er komplementære til de på antigenmolekylet værende, således at der derved dannes i det mindste et partielt bimolekylært lag af immunologiske proteinkomplekser på substratoverfladen.

30 Problemet opstår ved en efterfølgende udsættelse af det belagte substrat indeholdende antigen-antistofkompleksproteinet for en opløsning, der indeholder eller er mistænkt for at indeholde samme antigen. Den efterfølgende udsættelse vil almindeligvis ikke give yderligere binding af antigen til antistoffet, da alle de aktive centre 35 i antistofproteinerne allerede er bundet til det første antigenlag på grund af, at de aktive antigenmotekyler ligger meget tæt ved hinanden. I overfladeimmunologi er der således et problem ved at antistoffer, der bindes til en (antigen) overflade, mister deres aktivitet (det vil sige evne til at danne yderligere bindinger med et antigen, en celle eller et virus).

3 151240

Yderligere et problem, som ofte opstår, er den manglende evne til at skelne mellem de monomolekylære og bimolekylære proteinlag på bæreren, især hvis det adsorberede (antigen) lag er relativt tykt, som ved HAA-lag, eftersom det til leverbetændelse knyttede anti-5 genmolekyle er mindst 10 gange så stort som antistoffet til HAA.

Det er opfindelsens formål at forbedre nævnte kendte teknik, således at der kan fremstilles mere end bimolekylære lag af immunologisk reaktive proteiner.

Dette opnås med fremgangsmåden med de indledningvis angivne 10 karakteristika, nir den ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at substratet yderligere belægges med et immunologisk inert protein, som er adsorberbart til substratet, og på en sådan måde, at det første proteins molekyler er adskilte fra hinanden af de inerte proteiner.

15 Andre udførelsesformer for fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved det i underkravene 2-16 angivne.

Opfindelsen vil forstås bedre ud fra den efterfølgende beskrivelse taget i forbindelse med tegningen, hvor:

Fig. 1 er et standris af et substrat, efter det på kendt måde 20 har været neddyppet først i en opløsning af antigen og derpå i en opløsning af det for antigenet specifikke antistof,

Fig. 2 er et standris af et substrat efter, at det har været underkastet to neddypningstrin, som i fig. 1, men hvor 25 første nedypning er ifølge opfindelsen,

Fig. 3 et standris af substratet ifølge fig. 2, efter en efterfølgende immunologisk reaktion, hvorved det belagte substrat neddyppes i en opløsning indeholdende samme antigen, 30 Fig. 4 er et standris af substratet ifølge fig. 3, efter endnu en neddypning af substratet i en opløsning indeholdende samme antistof, og hvor antistofmolekylerne pi enderne af kæderne af antigen-antistofkomplekserne finder antigencentre på et virus eller en celle for immunologisk identi-35 f i kation af denne,

Fig. 5 er et standris af et substrat, efter at det på kendt måde har været neddyppet først i en opløsning af et antigen af stor størrelse og derefter i en opløsning af et mindre antistof, der er specifikt over for antigenet, 4 151240

Fig. 6 er et standris af et substrat, efter at det har været underkastet to neddypningstrin, som på fig. 5, men hvor første neddypning er ifølge opfindelsen,

Fig. .7 er et standris af substratet ifølge fig. 6, efter en efter-5 følgende immunologisk reaktion, ved hvilken det belagte substrat neddyppes i en opløsning, der indeholder et antistof til antistoffet i den anden opløsning, og Fig. 8 er et planbillede af et substrat, hvorpå der er et lille område med aktiv-inerte proteiner omgivet af inert protein.

10 På fig. 1 er vist et yderst forstørret standris af en del af et diagnostisk apparat i form af en tynd plade 10 af passende substratmateriale, hvilket kan være metal, glas, glimmer, plast, smeltet siliciumoxid, kvarts eller et lignende materiale, hvor metal foretrækkes, da det har den største forskel i brydningsindeks i forhold 15 til protein, og fortrinsvis er i form af en metalplade eller plade af metalliseret glas. Når substratet 10 neddyppes i en opløsning, sædvanligvis saltvand indeholdende et første protein af interesse, hvilket biologisk kan være et antigen eller antistof, adsorberes et monomolekylært lag 11 på substratet. For så vidt opfindelsen angår, vil 20 det lag 11, der adsorberes på overfladen af substratet 10, i det følgende blive betegnet som antigenlag, men antigenlaget kan for så vidt godt være et lag af antistof. Et hvilket som helst protein vil adsorbere i et sådant monomolekylært lag, men ingen yderligere adsorption vil finde sted, det vil sige, at proteinet vil binde til 25 substratet men ikke til sig selv. Antigenproteinlaget 11 kan således kun være monomolekylært og ikke af større tykkelse. Den tid, der kræves til at belægge substratet fuldstændig med antigenproteinet, er en funktion af koncentrationen af proteinet i opløsningen, graden af omrøring af opløsningen og opløsningens temperatur. Eksempelvis 30 dækker en 1% opløsning af okseserumalbumin en plade fuldstændigt i løbet af omkring 30 min. med et monomolekylært antigenproteinlag.

Efter at det monomolekylære lag af antigenprotein 11 er blevet dannet over i alt væsentligt hele overfladen af substratet 10, fjernes det belagte substrat fra opløsningen af antigenproteinet og neddyp-35 pes derefter i en opløsning indeholdende eller mistænkt for at indeholde det specifikt reagerende antistof protein til antigenproteinet.

Denne anden opløsning kan indeholde mange bestanddele ud over det specifikt reagerende antistofprotein, hvis tilstedeværelse det ønskes at påvise. Imidlertid vil intet andet protein end det specifikt reage- 5 151240 rende antistofprotein adhærere til det første antigenproteinlag på substratet. Kun hvis det specifikt reagerende antistof protein således er til stede i den anden opløsning vil immunologisk kompleksdannelse mellem antigenet og dets specifikt reagerende antistof finde stede, og 5 på substratet vil der, efter et stykke tid, være et bimolekylært proteinlag. Den nødvendige tid for adhæsionen af det andet (antistof) molekyllag 12 på det belagte substrat er igen en funktion af koncentrationen af det specifikt reagerende protein i opløsningen, graden af omrøring i opløsningen og opløsningens temperatur. For 10 antistoffer i blodserum kan dette tidsrum være si langt som en dag.

Det andet lag kan være et kun partielt lag eller et i alt væsentligt fuldstændigt lag, alt efter de ovenfor anførte tre faktorer.

Som vist på fig. 1 udnytter antistofmolekylerne i det tilfælde, hvor antigenlaget 11 dækker substratet 10 i det væsentlige fuld-15 stændigt, det vil sige, at afstanden mellem tilstødende antigenmolekyler er minimal, i det væsentlige alle deres kombinationscentre til at binde antigenmolekylerne, således at deres aktivitet går tabt, det vil sige, at i det væsentlige alle de aktive centre på antistofmolekylerne 12 forbinder sig med tilsvarende aktive centre på antigenmolekylerne 20 11. Denne substratbelægningsproces er beskrevet i beskrivelsen til GB patenterne nr. 1.443.181 og nr. 1.443.182.

På grund af det monomolekylære antigenlag 11, der er adsorbe-ret over i alt væsentligt hele overfladen af substratet 10 på fig. 1, binder det andet lag 12 af det specifikke antistof til dette antigen 25 sig dertil under dannelse af de bimolekylære lag, og ingen yderligere forbindelsesdannelse med yderligere protein, hverken antigen eller antistof, er mulig, da der ikke er nogen resterende aktive centre på antistofmolekylerne i laget 12. Ved fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse, bindes antistofmolekylerne i det andet lag 12 til 30 antigenmofekylerne i det første lag 11, men der er stadig centre, som er aktive til yderligere bindingsdannelse med andre antigenmolekyler i endnu en immunologisk reaktion. Grundlaget for fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse er vist på fig. 2 og har forbindelse med fremgangsmåden til dannelse af det første mono-35 molekylære lag af antigenmolekyler 11, som adsorberes på overfladen af substratet 10. Af illustrationshensyn er de heri afbillede antistoffer af IgG klassen, men der er ingen grund til, at antistoffer af de øvrige fire ovenfor angivne hovedklasser ikke kan anvendes i forbindelse med opfindelsen.

6 151240

Efter valg af det substrat 10, hvorpå den multimolekylære film af immunologiske komplekser skal dannes, neddyppes dette substrat i en første opløsning, sædvanligvis saltvand indeholdende antigenet, som ved den ovenfor i forbindelse med fig. 1 beskrevne fremgangs-5 måde. Men i modsætning til denne tidligere fremgangsmåde er et immunologisk inert protein blevet tilsat til den første opløsning inden neddypningen af substratet, således at det adsorptionslag, der dannes på overfladen af substratet 10, består af de reaktive anti-genproteinmolekyler 11, adskilt fra hinanden (og over substratover-10 fladen omgivet) af inerte proteinmolekyler 20, som det ses på fig. 2. Mængden af det immunologisk inerte protein, der er tilsat opløsningen, er tilstrækkelig til, at den gennemsnitlige afstand mellem tilstødende antigenmolekyler 11, der adhærerer til substratet 10, sædvanligvis vil være adskillige hundrede Ångstrøm.

15 Det med antigen-inertprotein i monomolekylært lag belagte substrat 10 fjernes derefter fra den første opløsning og neddyppes derpå i en anden opløsning indeholdende de antistoffer, der er specifikke over for antigenet i den første opløsning. Da afstanden mellem de aktive centre for et antistofmolekyle 12 (af IgG-klassen) er 20 omtrent 200 Ångstrøm, vil en større brøkdel af de antistofmolekyler 12 i den anden opløsning, som forbinder sig med antigenmolekylerne 11, stadig have deres resterende kombinationscentre (og der kan være mere end et resterende aktivt center pr. molekyle, alt efter den nærmere bestemte klasse af antistofmolekyler) aktive for yder-25 ligere kombination med yderligere antigenmolekyler i en efterfølgende immunologisk reaktion. Ethvert antistofmolekyle kan naturligvis ikke kombineres med mere end et aktivt center på noget antigenmolekyle.

Som det ses på fig. 2, er antistofmolekylerne 12 således, på grund af den tilstrækkelige afstand mellem tilstødende antigenmolekyler 11 30 frembragt af de immunologisk inerte proteinmolekyler 20, bundet til antigenmolekylerne 11, og almindeligvis har hvert antistofmolekyle 12 et kombinationscenter 12a, der stadig er aktivt for en efterfølgende immunologisk reaktion. Formålet med opfindelsen er således blevet opfyldt, idet antistoffer er blevet bundet til en overflade (af et 35 monomolekylært antigenlag), således at kombinationscentre af antistofproteinerne forbliver aktive for yderligere immunologiske reaktioner. I det tilfælde, hvor det aktive antigen er human-serum-albumin, er det immunologisk inerte protein f.eks. ægalbumin f og antistofmolekylerne fås fra et kaninserum. Ved en 1% opløsning af 151240 ! 7 human-serumalbumin, ligger koncentrationen af det inerte æg-albuminprotein i serumet i området fra 1-10%.

Efter at substratet 10 er blevet fjernet fra antistofopløsningen, se fig. 3, (det vil sige efter de pi fig. 2 viste trin), neddyppes det 5 bimolekylært belagte substrat 10 derpå i en opløsning indeholdende eller mistænkt for at indeholde samme antigen som første opløsning, og sådanne mistænkte antigenmolekyler 30 vil selektivt binde til de resterende aktive centre 12a i antistofmolekylerne 12 i endnu en immunologisk reaktion. Fremgangsmåden kan således anvendes til 10 analyse af en opløsning og nem påvisning af tilstedeværelse af et bestemt antigen i denne. Alternativt kan fremgangsmåden anvendes til at frembringe en opbygning af adskillige kæder af vekselvis anti-gen-antistofmolekyler, hvorhos hver kæde har sin oprindelse ved overfladen af substratet 10 for derved, ved immunologisk kompleks-15 dannelse, at danne en multimolekylær film af de talrige kæder af vekselvis antigen-antistofmolekyler på denne. Filmen af multimolekyl-ære komplekser erkendes let ved at betragte det belagte substrat med et optisk instrument, såsom et elipsometer. Alternativt og som beskrevet mere detaljeret i beskrivelsen til førnævnte GB patenter 20 nr. 1.443.181 og nr. 1.443.182 og i beskrivelsen til GB patent nr.

1.479.661 kan filmen af multimoiekylære komplekser også undersøges elektrisk ved at måle den elektriske kapacitet af en kondensator med lederplader dannet af metalsubstratet eller det metalbelagte substrat og en kviksølvdråbe eller en anden egnet elektrode, hvor kondensa-25 torens dielektrikum er proteinlagene. Som beskrevet i disse patentskrifter kan filmen af multimoiekylære komplekser også undersøges optisk ved visuel betragtning uden hjælpemidler ved at bestemme det tidsrum, der går, inden et synligt amalgam er dannet mellem en dråbe kviksølv og metalfilmbelægning på substratet med proteinlagene 30 imellem. Endelig og vigtigst kan filmen af multimoiekylære komplekser undersøges optisk med reflekteret eller transmitteret lys, som forklaret i ovennævnte patentskrifter. Ved sidstnævnte optiske undersøgelse ved hjælp af reflekteret eller transmitteret lys er det følgende en første (transmitteret lys) metode, som er blevet anvendt med 35 held:

Substratet 10, som skal være et lystransmitterende substrat, såsom glas, plast, smeltet siliciumoxid, glimmer, kvarts eller lignende, og fortrinsvis er glas, hvor mikroskopglas er en let tilgængelig kilde, belægges først med en flerhed af små metalkugler, 8 151240 ved at pidampe et metal, f.eks. indium pi substratet. F.eks. fordampes dette indium langsomt fra en tantalskil på glassubstratet i et almindeligt vakuum på omkring 5 x 10 ^ mm kviksølv. Som følge af, at indiumatomerne har en stor mobilitet på substratets overflade 5 og ikke befugter glassubstratet væsentligt, agglomererer det pi substratet pådampede indium til små partikler. Et hvilket som helst metal med lignende egenskaber, som vil bevirke, at det danner små kugler på substratet, når det pådampes dette, kan anvendes. Ud over indium er guld, sølv, tin og bly blevet anvendt med held.

10 Pådampningen af metal fortsættes, indtil substratet fremtræder med en lysebrun farve. På dette tidspunkt har de små metal kugler diametre af størrelsesordenen 1000 Å. Den nøjagtige størrelse af kuglerne er ikke kritisk, men de skal have diametre lig med en stor brøkdel af en bølgelængde for synligt lys. Næste trin består i at 15 neddyppe det kuglebelagte substrat 10 i en første opløsning af et første immunologisk reaktivt protein, såsom antigenet 11, og det inerte protein 20. Det første reaktive protein og det inerte protein adhærerer igen i et monomolekylært lag over substratet og metalkuglerne på dette. Nar et monomolekylært lag er dannet, fjernes det 20 belagte substrat derefter fra den første opløsning og neddyppes i en anden opløsning indeholdende det over for det første protein specifikt reagerende protein 12, hvilket resulterer i, at substratet og metalkuglerne opnår et bimolekylært proteinlag, der adhærerer dertil, svarende til det på fig. 2 viste (som dog er uden metal-25 kuglerne). Det belagte substrat fjernes derefter fra den anden opløsning og neddyppes i en tredie opløsning, som indeholder eller mistænkes for at indeholde det reaktive protein i den første opløsning; hvis proteinet er til stede, dannes et tredie lag (eller partielt lag) på substratet. Det belagte substrat betragtes derefter 30 ved hjælp af transmitteret lys, og en bestemmelse af tykkelsen af det proteinlag, der adhærerer dertil, og følgelig af tilstedeværelsen eller fraværet af det formodede protein foretages ud fra udseendet af det belagte substrat. Påvisningen af proteinlag svarer til variationer i den bruntoning, som iagtages i det belagte substrat. Disse varia-35 tioner er ganske udtalte, og påvisningen af proteinlagene er derfor en ganske enkel fremgangsmåde. Partiklerne alene på substratet viser sig som en første nuance af brunt, partikler belagt med et monomolekylært proteinlag viser sig som en mørkere nuance af brunt, partikler dækket med et bimolekylært proteinlag, viser sig som en 9 151240 endnu mørkere nuance af brunt, og partikler dækket med et tri-molekylært proteinlag synes endnu mørkere. Denne pivisningsmetode er baseret på den kendsgerning, at elektromagnetisk stråling spredes i stort omfang af ledende kugler med diametre, der er lig 5 med en stor brøkdel af en bølgelængde af den indfaldende stråling, og at spredningen, når der sker spredning fra sådanne kugler, påvirkes stærkt af en tynd dielektrisk belægning, der er påført kuglerne.

En anden metode til optisk undersøgelse ved hjælp af reflekteret 10 lys, som er blevet anvendt med held, er følgende: På et guldsubstrat, som af økonomiske grunde fortrinsvis er et tyndt guldlag som belægning på et andet metal, adsorberes et monomolekylært lag af det første reaktive protein 11 og det inerte protein 20 efter neddypning i den ovenfor beskrevne første op-15 løsning. Guld har et adsorbtionsbånd i det synlige spektrum, og denne kendsgerning betinger guldets karakteristiske farve og udførelsen af den her omhandlede særlige optiske undersøgelsesmetode. Guldsubstratet kan passende være en glasplade belagt med et tyndt indiumlag, der er overtrukket med guldlaget, hvorhos indium-20 laget forbedrer både adhæsionen mellem glasset og guldet såvel som pladens optiske egenskaber. Guldsubstratets relative reflektivitet som funktion af bølgelængden, resulterer i, at substratet har den for metallisk guld karakteristiske lysegule farve i fravær af adhærerende proteinlag på guldet. Ved tilstedeværelse af et monomolekylært lag på 25 substratet er prøvepladens udseende (substratet) mørkeguit. Efter at prøvepladen har været udsat for en opløsning indeholdende det over for proteinet 11 immunologisk reagerende protein 12, hvor proteinet 11 befinder sig i det første lag sammen med det inerte protein 20, findes på prøvepladen er bimolekylært proteinlag og en reflektivitets-30 egenskab, som giver et grønligt udseende. Et tredie proteinlag giver et endnu mere grønt udseende. Ved de forsøg, som indtil nu er blevet gennemført, ser det ud til, at optiske undersøgelser af et belagt substrat ved hjælp af reflekteret eller transmitteret lys og under anvendelse af et substrat indeholdende metalkugler eller et 35 guldsubstrat er de mest alment anvendelige. Yderligere er det blevet fastslået, at ovennævnte to metoder har forskellige følsomheder som funktion af tykkelserne af de proteinfilm, der har interesse. Ved den metode, der benytter et substrat indeholdende metalkugler, forekommer den største følsomhed ved film med tykkelser under ca.

10 151240 200 Å. Gu Id substratmetoden har den største følsomhed ved film med en tykkelse over 30 Å. Den særlige påvisningsmetode, der anvendes, bestemmer således den substrattype 10, der anvendes ved den enkelte analyse, det vil sige, om substratet skal være en metalplade 5 eller en metalliseret glasplade med en flad metal- (f.eks. guld-) belægning eller metal- (f.eks. indium-) kugler på overfladen, som det igen er forklaret i beskrivelserne til ovennævnte patenter. Af forenklingsmæssige grunde er substratet 10 vist med en flad overflade, men det må forstås, at den overflade, hvortil det første 10 antigenlag adsorberer, også kunne indeholde førnævnte små metal-kugler.

Fremgangsmåden til dannelse af multimolekylære (3 lag) film af immunologiske komplekser, som vist på fig. 3, er særlig betydningsfuld ved undersøgelse af en opløsning for et bestemt protein, f.eks.

15 et hormon, eftersom hormoner og antiserum til hormoner er generelt tilgængelige. Når det tredie lag således er det hormon, der har interesse, er det let påviseligt.

Endelig er dannelse af multimolekylære film af immunologiske komplekser ifølge opfindelsen også af betydning ved immunologisk 20 bestemmelse af celler eller vira. Som vist på fig. 4 er der således ved opbygning af en flerhed af kæder af antigen-antistofkomplekser fra overfladen af substratet 10 relativt høj sandsynlighed for, at adskillige af antistofmolekylerne for enden af de forskellige kæder finder et antigent center på en celle eller en virus 40, og denne 25 sandsynlighed forbliver høj uanset uregelmæssigheden af overfladen af cellen eller virus'et. Som det er velkendt, har den cellemembran, som indeslutter hver celle, molekyler, der strækker sig udad fra membranen, og som kaldes utransplanterings"-antigener. Disse antigener er de, der anvendes ved dannelse af det første lag 11 i et 30 tolags-system til immunologisk identifikation af celler, hvor den celle, der er af interesse, vil udgøre det tredie lag. Ved et firelags-system af antigen-antistofkæder, som vist på fig. 4, vil første og tredie lag (henholdsvis 11 og 30) bestå af transplanterings-antigener. På lignende mide er det velkendt, at et virus har en proteinkappe af 35 proteinmolekyler, som kan opspaltes og adskilles, og sådanne molekyler danner det første henholdsvis det første og tredie lag i to-henholdsvis firelagssystemer af de antigen-antistofkæder, der anvendes til immunologisk identifikation af et virus 40. Antistofferne 12 i andet lag og 41 i fjerde lag vil naturligvis være specifikke over for 11 151240 den bestemte celle eller virus, der undersøges for.

I fig. 5 ses et stærkt forstørret standrids af en del af et diagnostisk middel i form af en tynd plade 10 af et egnet substratmateriale, som kan være metal, glas, glimmer, plast, smeltet sili-5 ciumoxid, kvarts eller et lignende materiale, hvor metal foretrækkes, idet det har den største forskel i brydningsindeks i forhold til protein, og hvor pladen fortrinsvis har form af en metalplade eller metalliseret glasplade. Når substratet 10 neddyppes i en første opløsning, almindeligvis saltvand indeholdende et første protein af 10 interesse, som biologisk kan være et antigen eller antistof, adsor-beres dette på substratet i et monomolekylært lag 11. I forbindelse med opfindelsen vil det lag 11, der adsorberes på overfladen af substratet 10, i det følgende blive skrevet som et antigenlag.

Ethvert protein vil adsorbere i et sådant monomolekylært lag, men 15 ingen yderligere adsorption vil finde sted, det vil sige, at proteinet vil bindes til substratet men ikke til sig selv. Antigenproteinlaget kan således kun være monomolekylært og ikke af større tykkelse.

Den tid, der er nødvendig for fuldstændig at belægge substratet med antigenproteinet, er en funktion af koncentrationen af proteinet i 20 opløsningen, graden af omrøring af opløsningen og opløsningens temperatur. F.eks. dækker en opløsning af det antigen, der er knyttet til leverbetændelse, i en koncentration pi 1 miligram pr. cm en plade fulstændig i løbet af ca. 10 min. med et monomolekylært antigenproteinlag.

25 Efter at det monomolekylære lag af antigenprotein 11 er blevet dannet over i det væsentlige hele overfladen af substratet 10, fjernes det belagte substrat fra opløsningen af antigenproteinet og neddyppes derefter i en anden opløsning indeholdende eller mistænkt for at indeholde det antistof protein, der reagerer specifikt med 30 antigenproteinet. I forbindelse med opfindelsen vil det blive antaget, at det protein 11, der adsorberes på overfladen af substratet 10, altid har en større størrelse end det protein, som er immunologisk reaktivt med det og danner det andet lag på substratet. Den anden opløsning kan indeholde mange bestanddele ud over det specifikt 35 reagerende mindre antistof protein, hvis tilstedeværelse det ønskes at påvise. Imidlertid vil intet andet protein end det specifikt reagerende antistofprotein adhærere til det første antigenproteinlag på substratet. Således vil der kun ske immunologisk kompleksdanneise mellem antigenet og det specifikt reagerende antistof, hvis det spe- 12 151240 cifikt reagerende anti stof protein er til stede i den anden opløsning, og på substratet vil der, efter en tid, være et bimolekylært proteinlag. Den tid, der kræves for adhæsion af det andet (antistof) molekylære· lag 12 på det belagte substrat, er igen en funktion af 5 koncentrationen af det specifikt reagerende protein i opløsningen, graden af omrøring af opløsningen og opløsningens temperatur. For antistoffer i blodserum kan dette tidsrum være på op til en dag. Det andet lag kan være et kun partielt lag eller et i alt væsentlige fuldstændigt lag alt efter de ovenfor opregnede tre faktorer.

10 I det tilfælde, hvor antigenlaget 11 i alt væsentligt dækker substratet 10 fuldstændigt, det vil sige, hvor afstanden mellem tilstødende antigenmolekyler er minimal, er det antal antistofmolekyler 12, som kan binde til et bestemt antigenmolekyle, som vist på fig. 5, begrænset på grund af den begrænsede overflade, der er til 15 rådighed pi antigenmolekylet for den immunologiske kompleksdannelse. Denne substratbelægningsproces er omtalt i beskrivelsen til førnævnte GB patenter nr. 1.443.181 og nr. 1.443.182.

På grund af, at det monomolekylære antigenlag 11 er adsor-beret, over i det væsentlige hele overfladen af substratet 10 på fig.

20 5, bindes det andet lag 12 af det specifikke antistof med mindre størrelse til antigenet i et tyndt lag til dannelse af det bimolekylære lag. På grund af, at proteinerne i det andet lag 12 er mindre en proteinerne i det første lag 11, og også pi grund af, at det andet lag er meget mindre tæt end det første (antigen) lag, er det imidler-25 tid ganske klart, at der kan være betydelig vanskelighed ved at skelne mellem det enkelte og det dobbelte proteinlag på substratet 10. Et godt eksempel herpå, er det tilfælde, hvor det første lag 11 er det til leverbetændelse knyttede antigen (HAA), og det andet lag 12 er et antistof, der er specifikt over for HAA. Betragtning af det 30 belagte substrat med et optisk instrument, såsom et elipsometer, gør det ikke let at skelne mellem et enkelt (antigen) lag og et partielt eller fortyndet dobbelt (antigen-antistofkompleks) lag på substratet, hvorfor det ikke er let at afgøre, om den anden opløsninge virkelig indeholder antistoffer til HAA, og en sådan diagnostisk prøve er 35 derfor kun af ringe værdi. Ved fremgangsmåden ifølge den fore liggende opfindelse kan et meget større antal antistofmolekyler i det andet lag 12 bindes til et antigenmolekyle i det første lag 11 og derved danne en meget større kontrastforskel mellem det enkelte og det dobbelte lag. Grundlaget for fremgangsmåden ifølge den fore 13 151240 liggende opfindelse er vist på fig. 6 og har forbindelse med fremgangsmåden til dannelse af det første monomolekylære lag af antigenmolekyler 11, som er adsorberet pi overfladen af substratet 10.

Til illustrationsformil er de i figuren afbillede antistoffer af IgG 5 klassen, men der er ingen grund til, at antistoffer af de andre fire ovenfor opregnede hovedklasser ikke kan anvendes ifølge opfindelsen.

Efter valg af det substrat 10, hvorpå den bimolekylære film af immunologiske komplekser skal dannes, neddyppes dette substrat i 10 en første opløsning, almindeligvis saltvand indeholdende antigenet, som ved den ovenfor i forbindelse med fig. 5 beskrevne fremgangsmåde. Men i modsætning til denne tidligere fremgangsmåde er et immunologisk inert protein blevet tilsat til den første opløsning inden neddypning af substratet t~ det andet, således at det adsorptionslag, 15 der dannes på overfladen af substratet 10, består af de relativt store reaktive antigenproteinmolekyler 11 adskilt fra hinanden og omgivet hen over substratoverfladen af inerte proteinmolekyler 20, som vist på fig. 6. De inerte proteinmolekyler 20 har en størrelse, som i det mindste er noget mindre og fortrinsvis betydeligt mindre 20 end antigenmolekylerne 11, således at det største overfladeareal (og derfore flere kombinationscentre) forbliver tilgængeligt på antigen-molekylerne 11 til senere binding med antistofmolekyler. Den mængde af det immunologisk inerte protein 20, der tilsættes opløsningen, er tilstrækkelig til, at det inerte protein 20 normalt dækker 1/2 til 9/10 25 af arealet af hele adsorptionslaget, det vil sige, at antigenet tilsvarende dækker 1/2 til 1/10 af arealet, idet dette dog ikke altid er en nødvendig betingelse, da en tilstrækkelig gennemsnitlig afstand mellem tilstødende antigenmolekyler også bestemmes af antallet af aktive centre på det bestemte antigenmolekyle, og den måde hvorpå 30 sådanne molekyler binder til substratet, det vil sige det antal antigene aktive centre, som forbliver frie. I det tilfælde, hvor antistof mole kyl et 12 er meget mindre end antigenet, er en større afstand mellem antigenmolekylerne ønskelig, hvorimod en mindre afstand mellem antigenmolekylerne kan tolereres, hvis antistofmole-35 kylet kun er lidt mindre end antigenet, for at opnå den bedste virkning ved udøvelse af opfindelsen. Som følge af den store størrelse af antigenproteinet i forhold til det inerte proteinmolekyle, vil et større område af overfladen af antigenmolekylet forblive fri og have sine tilsvarende bindingscentre til rådighed for kombination med 14 151240 antistofmolekyler ved en senere immunologisk reaktion.

Det (med antigen-inertprotein) monomolekylært belagte substrat 10 fjernes derefter fra den første opløsning og neddyppes derpå i en anden opløsning indeholdende de antistoffer, der er specifikke for 5 antigenet i den første opløsning. Som følge af, at et større overfladeareal (og flere antigencentre) forbliver fri på antigenerne, når antigenerne omgives af det mindre, inerte protein på fig. 6, kan antigenmolekylerne på fig. 6 i sammenligning med dem pi fig. 5 lettere danne immunologiske forbindelser med et større antal anti-10 stof mole kyl er.

Som det ses i fig. 6, vil et større antal antistofmolekyler 12 således almindeligvis forbinde sig med hvert antigenmolekyle end i det på fig. 5 viste tilfælde, og det er ud fra en sammenligning af fig. 5 og 6 klart, at en meget større kontrastforskel opnås mellem 15 enkelt- og dobbeltlag ved den på fig. 6 viste udførelsesform for opfindelsen (på grund af det større antal antistofmolekyler, som findes i det andet lag). Som eksempel på udøvelse af opfindelsen har en første opløsning en tilstrækkelig koncentration af det til leverbetændelse knyttede antigen (HAA) og inert protein i form af okse-20 serumalbumin (BSA) til, at HAA dækker 1/4 af overfladearealet i et monomolekylært lag, og det inerte BSA-protein dækker de resterende 3/4 af arealet, og en anden opløsning er en fortyndet opløsning af antistof til HAA. Den ovenfor beskrevne fremgangsmåde kan således anvendes ved analyse af en opløsning til nem påvisning af tilstede-25 værelsen af et antistof, der er specifikt over for et bestemt antigen af forholdsvis stor størrelse.

Substratet i fig. 6, der er belagt med et dobbeltlag, kan derefter neddyppes i en tredie opløsning eller et serum indeholdende antistoffer 30 til de antistoffer 12, der findes i det andet lag, til 30 opbygning af et tredie lag, som vist i fig·. 7. Da hvert antistofmolekyle 12 har adskillige antigene determinanter, kan det almindeligvis danne forbindelser med adskillige molekyler 30, som er antistoffer til antistof proteinet 12 for derved at danne et relativt tæt tredie lag af sådanne sekundære antistofmolekyler 30. Tilstedeværelsen af det 35 tætte tredie lag 30 er en Indikation på tilstedeværelsen af det andet lag 12 og tilvejebringer en endnu større forskel mellem det monomolekylære lag og det bimolekylære antigen-primære antistof lag. I dette sidste tilfælde medvirker de inerte proteinmolekyler 20 mellem de store antigenmolekyler 11 i det første lag også til at hindre, at 15 151240 det ikke-specifikke proteinmateriale i det serum, som indeholder antistoffer til antistofproteinet for dette antigen, klæber til substratet.

Der er således den dobbelte gevinst, at der opnås mere specifikt bundne antistoffer til hvert antigenmolekyle, og at der er mindre 5 ikke-specifikt bundet protein på substratet, hvilket skyldes anvendelsen af det inerte protein til adskillelse af de store antigenmolekyler fra hinanden og til dækning af den overflade af substratet, der omgiver hvert antigenmolekyle, med dette inerte protein.

Den fremgangsmåde, der er anvendt ved dannelse af det tredie lag i 10 fig. 7, er derfor anvendelig ved analyse af en anden opløsning, der er mistænkt for at indeholde antistoffet 12, da den efterfølgende neddypning af det belagte substrat i den tredie opløsning, vil tilvejebringe betydeligt forbedret kontrast mellem det monomolekylære lag og det bimolekylære lag (i virkeligheden nu et trimolekylært lag, 15 hvis et bimolekylært lag findes på grund af, at den anden opløsning faktisk inderholder antistoffet 12).

Tilstedeværelsen af det andet (antistof) proteinlag i den i fig. 6 viste udførelsesform, som også indiceres ved hjælp af det tredie (antistof 30) proteinlag i den i fig. 7 viste udførelsesform, kan let 20 verificeres ved at betragte det belagte substrat med et optisk instrument, såsom et ellipsometer. Som beskrevet ovenfor og mere detaljeret i beskrivelserne til ovennævnte GB patenter nr. 1.443.181, nr. 1.443.182 og nr. 1.479.661 er en anden mulighed, at proteinlagene kan undersøges elektrisk ved at mile den elektriske kapacitet 25 af en kondensator med ledende plader dannet af metalsubstrat eller et metalbelagt substrat og en kviksølvdråbe eller en anden passende elektrode, hvor kondensatorens dielektrikum er proteinlagene. Som beskrevet i beskrivelserne til ovennævnte GB patenter samt ovenfor i forbindelse med den multimolekylære film, kan proteinlagene også 30 undersøges optisk ved visuel observation uden hjælpemidler ved at bestemme det tidsrum, der forløber, inden et synligt amalgam dannes mellem en dråbe kviksølv og en metalfilmbelægning på substratet med proteinlaget imellem. Endelig og vigtigst kan proteinlagene undersøges optisk med reflekteret eller transmitteret lys som forklaret i 35 ovennævnte patentskrifter samt ovenfor i forbindelse med den multimolekylære film.

Når der er tale om proteinlag, fjernes det belagte substrat imidlertid derefter fra den anden opløsning og neddyppes i en tredie opløsning, som indeholder et protein, der er reaktivt over for det 16 151240 reaktive protein i den anden opløsning (såsom et antistof til antistoffet), til dannelse af et tredie lag (eller et partielt lag) på substratet, hvis det andet lag er til stede. Det belagte substrat iagttages derefter i transmitteret lys, og ud fra udseendet af det be-5 lagte substrat foretages der en bestemmelse af tykkelsen af det proteinlag, der adhærerer til substratet, og dermed en bestemmelse af, om det andet protein 12 er til stede eller ej.

Forskellen mellem enkelte og dobbelte proteinlag kan forøges endnu mere ved at afsætte antigenet og det inerte protein på sub-10 stratet 10 som en enkelt opløsningsdråbe og derefter neddyppe substratet belagt med dråben i en opløsning, der kun indeholder det inerte protein 20, således at der dannes et monomolekylært lag af det lille antigen- inert-proteinområde fuldstændig omgivet af det inerte protein, som vist på fig. 8. Dette aspekt bevirker, at problemet med 15 ikke-specifik adsorption overvindes i det tilfælde, hvor antistofpro-teinerne findes i et serum, da det inerte protein på den resterende overflade af substratet hindrer, at nonspecifikke proteiner i serumet adhærerer til substratet, og forbedrer derved kontrasten.

De ovenfor beskrevne enkle fremgangsmåder har gjort det 20 muligt at påvise leverbetændelse ved en prøve, der er lige så følsom som radioimmunostandardprøven.

Endelig er den ovenfor beskrevne fremgangsmåde af betydning ved immunologisk identifikation af virus og enzymer. Alle antigener af virustypen er større end deres specifikke antistoffer, hvorimod 25 antigenerne af enzymtypen kan være større eller mindre alt efter den særlige enzymtype. En fremgangsmåde til identifikation af et bestemt virus eller et stort enzym, hvilken fremgangsmåde er kendt som inhiberingsprøven, gennemføres på følgende vis:

Det nærmere bestemte virus eller det store enzym anbringes i 30 en første opløsning (almindeligvis saltvand) sammen med det inerte protein, og substratet neddyppes derefter i denne opløsning, eller alternativt anbringes en dråbe af opløsningen på substratet, og substratet neddyppes derefter i en opløsning af kun det inerte protein. Efter at et monomolekylært lag af virus'et eller enzymet (det 35 vil sige antigenet) og det inerte protein er blevet adsorberet på overfladen, fjernes det belagte substrat fra den første opløsning.

Prøver af humanserum, som skal undersøges for tilstedeværelse af det nærmere bestemte virus eller enzym, fremstilles ved deri at blande en mængde af kendte antistoffer for det nærmere bestemte 151240 ' 17 virus eller enzym, hvilken mængde er afpasset således at den kan fjernes immunologisk fra blandingen, hvis virus'et eller enzymet er til stede i serumprøven. Det monomolekylært belagte substrat ned-dyppes derefter i eller udsættes for den i forvejen fremstillede 5 serumprøve og undersøges efter fjernelse fra denne ved en af de ovenfor beskrevne metoder. Hvis undersøgelsen af substratet viser tilstedeværelse af kun et monomolekylært lag, vides det, at det undersøgte humanserum oprindeligt indeholdt det bestemte virus eller enzym. Hvis et bimolekylært lag imidlertid påvises, indicerer dette, 10 at serumet oprindeligt ikke indeholdt dette virus- eller det store enzymantigen, da antistofproteinerne ikke dannede immunologiske forbindelser med deres specifikke antigen (virus eller enzym) i serumprøven, og derfor var frie til at danne forbindelser med antigenet i det første, adsorberede lag på substratet.

15 Skønt det reaktive protein, der adsorberes på substratover fladen, ovenfor er beskrevet som et antigen, bør det forstås, at det reaktive protein i første lag kan være et antistof, og proteinet i det andet lag vil da være det for dette antistof specifikke antigen, medens proteinet i tredie lag igen er antistof proteinet. Således kan 20 det reaktive protein, der adsorberes på substratoverfladen som et første lag af reaktivt protein, og som ovenfor er beskrevet som et antigen, være et antistof, og det andet proteinlag vil da være det specifikke antigen herfor, hvilket arrangement især er anvendeligt i tilfælde, hvor antistofmolekylet er større end dets specifikke anti-25 gen; et eksempel herpå er antistoffet til insulin.

Claims (16)

151240

1. Fremgangsmåde til fremstilling af multimolekylære lag af im- 5 munologisk reaktive proteiner, ved hvilken (a) et egnet substrat belægges med et monomolekylært proteinlag bestående af et immunologisk reaktivt første protein, og (b) det belagte substrat dernæst behandles med en opløsning af et immunologisk reaktivt andet protein, der er specifikt for det første protein, til frembringelse af en 10 immunologisk reaktion, ved hvilken det andet proteins molekyler bindes til det første proteins molekyler til dannelse af et bimolekylært lag, kendetegnet ved, at substratet yderligere belægges med et immunologisk inert protein, som er adsorberbart til substratet, og på en sådan måde, at det første proteins molekyler er 15 adskilte fra hinanden af de inerte proteiner.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at substratet er en metalliseret plade.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet ved, at det immunologisk reaktive første protein er et antigen, og 20 det immunologiske reaktive andet protein er et antistof, der er specifikt for antigenet.

4. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående krav, kendetegnet ved, at antistoffet er et antistof af immunoglobulin Ig G klassen.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendetegnet ved, at antigenet er et enzym, det inerte protein er okse-serumalbumin, og antistoffet tilvejebringes fra en kanin, der tidligere er blevet injiceret enzymet.

6. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af de foregående 30 krav, kendetegnet ved, at belægningen af substratet med et monomolekylært lag af det første protein og inert protein omfatter: i) dannelse af en første opløsning af et proteinantigen, ii) tilsætning af en tilstrækkelig mængde af det inerte protein til den første opløsning, 35 iii) neddykning af substratet i den første opløsning til belæg ning af substratet med et monomolekylært proteinlag, hvor mængden af det inerte protein er tilstrækkelig til, at proteinantigenmolekylerne adskilles fra hinanden i det monomolekylære lag af de inerte proteinmolekyler, og 151240 iv) fjernelse af det med det monomolekylære lag belagte substrat fra den første opløsning.

7. Fremgnagsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at substratet er plant, og at be- 5 lægningen af substratet med et monomolekylært lag af det første protein og inert protein omfatter: i) dannelse af en første opløsning af inert protein, ii) tilstrækkelig neddykning af substratet i den første opløsning til at belægge substratet med et partielt monomoleky- 10 lært lag af det inerte protein, iii) fjernelse af det partielt belagte substrat fra den første opløsning, iv) dannelse af en anden opløsning af immunologisk reaktivt første protein, 15 v) neddykning af det partielt belagte substrat i den anden op løsning til belægning af den tilbageblevne overflade på substratet med et partielt monomolekylært lag af det immunologisk reaktive første protein, således at det monomolekylære lag omfatter det immunologisk reaktive første- 20 proteins molekyler adskilt fra hinanden af de inerte proteiner, og vi) fjernelse af det med det monomolekylære lag belagte substrat fra den anden opløsning.

8. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 25 1-5, kendetegnet ved, at belægningen af substratet med et monomolekylært lag af det første protein og inert protein omfatter: i) dannelse af en fortyndet første opløsning af det immunologisk reaktive første protein, ii) tilstrækkelig neddykning af substratet i den første opløs- 30 ning til at belægge substratet med et partielt monomoleky lært lag af det første protein, iii) fjernelse af det partielt belagte substrat fra den første opløsning, iv) dannelse af en anden opløsning af det inerte protein, 35 v) neddykning af det partielt belagte substrat i den anden op løsning til belægning af den tilbageblevne overflade af substratet med et partielt monomolekylært lag af det inerte protein, således at det monomolekylære lag består af det 151240 immunologisk reaktive første proteins molekyler adskilt fra hinanden af det inerte proteins molekyler, og vi) fjernelse af det med det monomolekylære lag belagte substrat fra den anden opløsning.

9. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 1-5, kendetegnet ved, at der dannes en proteinantigen-opløsning, at substratet neddykkes tilstrækkeligt i antigenopløsningen til at belægge substratet med et partielt monomolekylært lag af antigenet, at det partielt belagte substrat fjernes fra antigen- 10 opløsningen, og at det partielt belagte substrat neddykkes i en opløsning af det tilsvarende antistof, hvor opløsningen er et serum, og de i serumet værende proteiner ud over antistofferne fungerer som det inerte protein og hæfter til substratet til fuldstændiggørelse af det monomolekylære proteinlag, der indeholder antigenmolekyler, 15 som er adskilt fra hverandre af inerte proteinmolekyler, og antistofmolekylerne fra serumet danner det andet lag.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 6, kendetegnet ved, at man tilsætter det inerte protein i en tilstrækkelig mængde til, at den gennemsnitlige afstand mellem nærliggende proteinantigenmole- 20 kyler i det monomolekylære lag på substratet vil være adskillige hundrede Ångstrøm.

11. Fremgangsmåde ifølge at hvilket som helst af kravene 6-10, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter: (c) fjernelse af det med det bimolekylære lag belagte substrat 25 fra antistofopløsningen, (d) efterfølgende behandling af det belagte substrat med en tredie opløsning, der er mistænkt for at indeholde det samme antigen, som der er i den første opløsning, til frembringelse af en immunologisk reaktion med antistoffet, hvor de tilbageblevne aktive 30 centre på antistofmolekylerne bindes kemisk med antigenmolekylerne, hvis disse er til stede i den tredie opløsning, og (e) undersøgelse af det belagte substrat til afgørelse af, om der er et tredie lag derpå, som i givet fald indicerer tilstedeværelsen af antigenet i den tredie opløsning.

12. Fremgangsmåde ifølge et hvilket som helst af kravene 6-10, kendetegnet ved, at man tilbereder den første opløsning af det immunologisk reaktive første protein på en sådan måde, at de antigener, der forekommer i de yderste dele af en speciel celle eller et specielt virus, adskilles, og der dannes en opløsning heraf, samt 151240 at: (c1) det med det bimolekylære lag belagte substrat fra antistof-opløsningen fjernes, (d‘) det belagte substrat efterfølgende neddykkes i en tredie 5 opløsning, der er mistænkt for at indeholde den specielle celle eller det specielle virus, således at antistofmolekylerne bindes til de antigene centre på cellen eller viruset, og (e1) det belagte substrat undersøges til afgørelse af, om der er et tredie lag derpå indicerende tilstedeværelsen af den specielle celle 10 eller det specielle virus i den tredie opløsning.

13. Fremgangsmåde ifølge krav 12, kendetegnet ved, at den desuden omfatter: (f) fjernelse af det belagte substrat fra den tredie opløsning, og 15 (g) efterfølgende behandling af det belagte substrat med en fjerde opløsning, der indeholder det samme antistof, som er i den nævnte anden opløsning, til frembringelse af en immunologisk reaktion, hvor aktive centre på antistofmolekylerne i den fjerde opløsning bindes med antigenmolekyler fra den tredie opløsning.

14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter: (h) fjernelse af det belagte substrat fra den fjerde opløsning, (j) efterfølgende behandling af substratet, der har kæder af antigen-antistof, som er opbygget ud fra substratoverfladen, med en 25 femte opløsning, der er mistænkt for at indeholde celler eller virus, således at antistofmolekylerne i kæderne af antigen-antistof -komplekser finder antigene centre på cellen eller viruset til frembringelse af binding hertil, (k) fjernelse af det belagte substrat fra den femte opløsning, 30 og (l) undersøgelse af substratet til afgørelse af, om tilbageblevne aktive centre på antistofmolekylerne er blevet forenet med antigene centre på cellerne eller viruspartiklerne fra den femte opløsning.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 1 eller 2, kendetegnet 35 ved, at det immunologiske reaktive første protein er et antistof, og det immunologisk reaktive andet protein er et antigen, som antistoffet er specifikt over for.

16. Fremgangsmåde ifølge krav 1 anvendt til forbedring af kontrasten i en overfladeimmunologisk prøve med proteinantigener af 151240 forholdsvis stor størrelse, kendetegnet ved, at substratet belægges med et monomoiekylært proteinlag, der består af et proteinantigen og et inert protein af mindre størrelse end proteinantigenet, således at antigenmolekylerne adskilles fra hinanden og omgives langs 5 substratoverfladen af mindre inerte proteinmolekyler, og at det belagte substrat dernæst behandles med en opløsning af et antistof, der er specifikt for proteinantigenet og af mindre størrelse end dette, til frembringelse af en immulogisk reaktion hermed, hvorved antistofmolekylerne bindes til proteinantigenmolekylerne til dannelse 10 af et bimolekylært lag på substratet.