CN114002436A - 用于检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法 - Google Patents

用于检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，公开了一种用于检测人淀粉样蛋白‑β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法，该试纸包括底板、重叠设置在该底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体1F12，3G5；层析膜上的第一检测线包被有单克隆抗体1F12，第二检测线包被有单克隆抗体2C6，第三检测线包被有单克隆抗体4B1，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。本发明通过对试纸的细节组成等进行改进，得到能够检测不同形式人淀粉样蛋白‑β，如人淀粉样蛋白‑β单体、寡聚体，和磷酸化Tau蛋白，填补了当前检测领域基于胶体金试纸条实现同时检测人淀粉样蛋白‑β单体，寡聚体蛋白和磷酸化Tau蛋白的空白。

Description

用于检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层 析试纸及其制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，更具体地，涉及一种用于检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法，该试纸利用双抗体夹心检测抗原的原理，能够用于检测不同形式人淀粉样蛋白-β，包括人淀粉样蛋白-β单体(human amyloid betapeptide(1-42)Monomers,hAβ42Ms)、人淀粉样蛋白-β寡聚体(human amyloid beta peptide(1-42)Oligomers,hAβ42Os)和人磷酸化Tau蛋白(hp-Tau396,404)，该试纸及基于该试纸构成的试剂盒能够应用于检测，实现快速、灵敏的检测。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease，简称AD)是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床上以记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等全面性痴呆表现为特征。当前，痴呆已成为老年人的常见病，其中AD痴呆占60％～80％，是老年人失能和死亡的主要原因。截至2020年，中国阿尔茨海默病每年新发患者超过100万例，阿尔茨海默病总患者人数超过1000万例，10年复合增长率达到4％。而这一增长在中国城市人口中尤为显著，10年复合增长率将达到6％。目前，我国是全球AD患者数量最多的国家，AD患者数居世界第一，占世界AD患者总人口的1/4，而这个数字还在随人口老龄化攀升。根据国际阿尔茨海默病协会的报告显示，每3秒钟，全球就有一位AD患者产生，我国每年平均有30万新发病例。我国80岁以上的老年群体中，有11.4％的老人患有AD，并且60岁以上妇女患老年痴呆的概率通常是同年龄段男性的2到3倍。而且痴呆并不只发生在老年，早发型AD患者可能在四五十岁就出现症状，被定义为世界上第一位AD患者的女性奥古斯特·德特尔就只有51岁。
相比庞大的患病人群，公众认知程度低、患者就诊率低、缺少创新且有效的治疗手段、家庭及社会照护成本高等，成为我国阿尔茨海默病的现状。面对这样一个吞噬记忆的疾病，我们的应对方案却乏善可陈。AD防治是一个世界性难题，首要原因在于难以早期诊断。AD患病的病理特征包括含有淀粉样肽beta的斑块和含有Tau的神经纤维缠结(NFTs)。
本发明人所在课题组前期研究得到了分泌人淀粉样蛋白-β单克隆抗体的杂交瘤细胞株(中国专利申请号：202011227808.5)、用于检测人淀粉样蛋白-β双抗夹心ELISA检测试剂盒(中国专利申请号：202011227418.8)、分泌人抗丝氨酸磷酸化Tau蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(中国专利申请号：202110067436.2)、一种用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸及其制备(中国专利申请号：202110067679.6)，分别向中国国家知识产权局提出了专利申请。本申请请求引用这4件中国专利申请的全部内容(即，请求引用于2020年11月06日提交中国国家知识产权局专利局、申请号为202011227808.5、发明名称为“分泌人淀粉样蛋白-β单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用”的中国专利申请的全部内容；于2020年11月06日提交中国国家知识产权局专利局、申请号为202011227418.8、发明名称为“用于检测人淀粉样蛋白-β双抗夹心ELISA检测试剂盒”的中国专利申请的全部内容；于2021年1月19日提交中国国家知识产权局专利局、申请号为202110067436.2、发明名称为“分泌人抗丝氨酸磷酸化Tau蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株”的中国专利申请的全部内容；于2021年1月19日提交中国国家知识产权局专利局、申请号为202110067679.6、发明名称为“用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸及其制备”的中国专利申请的全部内容)。
前期研究结果表明外周血中42个氨基酸残基的淀粉样蛋白多肽(amyloid beta1-42,Aβ42)及其形成的可溶性Aβ42Os是AD很好的生物标志物。但是面对AD这种复杂的退行性神经疾病，基于单一的生物标志物检测的灵敏度和准确性还有待提高。基于AD疾病的两种主要假说，即淀粉样蛋白联级假说和磷酸化Tau蛋白联级假说，磷酸化Tau蛋白在疾病的进程中同样扮演着重要角色。Tau蛋白是一种微管相关蛋白，主要分布在神经元，其次是在神经胶质细胞。正常情况下，转录后的Tau发生磷酸化修饰而有利于微管的稳定。但是，Tau的过度磷酸化使它与微管蛋白的结合只有正常Tau蛋白的10％，且束缚了Tau蛋白对微管的稳定，造成神经纤维退化及功能障碍，而形成神经原纤维缠结(NFTs)。在病理状况下(如在AD中)，各种致病因素通过不同的病理途径导致Tau蛋白激酶与磷酸酯酶功能失衡，进而引起Tau蛋白的异常高水平磷酸化，以致其含磷酸盐受体的残基大多被磷酸化；从而使Tau蛋白与微管结合的动态平衡被打破，造成游离性Tau蛋白片段异常增多，最终使Tau蛋白发生异常聚集、纤维化和神经原纤维缠结形成。目前，研究人员在Tau蛋白上已发现大约有84个磷酸化位点，其中以Tau蛋白181、199、231、396、404位点进行磷酸化较为常见。当前，研究较多的磷酸化Tau蛋白包括p-Tau181、p-Tau231、p-Tau199，而p-Tau396，p-Tau404作为最早期的磷酸化位点，并且其磷酸化后更容易形成神经纤维缠结对突触的损伤最大，却很少被研究。以过度磷酸化的p-Tau396,404蛋白为核心形成的神经原纤维缠结是AD脑中的重要标志，糖基化与泛素化等与其关系密切。Tau蛋白功能异常改变可能是神经元功能障碍及死亡的必要环节，因而针对p-Tau396,404蛋白的代谢及功能作为靶点对积极预防和治疗AD等神经退行性疾病是非常有益的。当前已报道了多种针对hAβ42可溶性寡聚体的检测方法，较为遗憾的是，目前仅实现了单靶标的检测，且主要基于较为传统的ELISA检测方法。与传统的ELISA检测方法相比基于胶体金试纸条检测方法具有检测时间短通常仅需3-5min，操作简便可随时随地进行，检测成本低等诸多优点。此外，与单个生物标志物的检测方法相比，同时靶向hAβ42单体、可溶性寡聚体及hp-Tau396,404的多个生物标志物的检测方法能够有效的提高检测的灵敏度、特异性和准确性。但是，目前基于胶体金试纸条或其他形式的检测法，同时靶向hAβ42单体可溶性寡聚体及hp-Tau396,404的多生物标志物的检测方法还尚未报道。
综上所述，开发高特异性、高灵敏度同时检测可溶性hAβ42单体、hAβ42寡聚体和hp-Tau396,404的胶体金试纸条及对应的检测方法，对于阿尔茨海默的早期诊断具有重大意义。
发明内容
针对现有技术中hAβ42和hp-Tau396,404蛋白检测的以上缺陷，本发明的目的在于提供一种用于检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸及其制备方法，其中通过对试纸的细节组成等进行改进，得到能够同时检测人淀粉样蛋白-β(hAβ42)和磷酸化Tau(hp-Tau396,404)蛋白的胶体金免疫层析试纸，填补了当前hAβ42和hp-Tau396,404蛋白检测领域基于胶体金试纸条实现同时检测人Aβ42单体、寡聚体和hp-Tau396,404蛋白的空白；该试纸及利用该试纸构建的试剂盒，能够用于检测不同形式人淀粉样蛋白-β，包括人淀粉样蛋白-β单体(human amyloid beta peptide(1-42)Monomers,hAβ42Ms)、人淀粉样蛋白-β寡聚体(human amyloid beta peptide(1-42)Oligomers,hAβ42Os)和人磷酸化Tau蛋白(hp-Tau396,404)，用来快速定量检测hAβ42Ms、hAβ42Os和hp-Tau396,404含量，具有快速、特异强、灵敏高的特点，适用于快速、灵敏对阿尔兹海默症的早期诊断，对于患者的及时、准确地指导药物使用具有重要意义。
为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种用于同时检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸，包括底板，以及重叠设置在该底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，其特征在于，所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体1F12和3G5；所述层析膜上设有三条检测线和一条质控线，记这三条检测线分别为第一检测线、第二检测线和第三检测线，所述第一检测线包被有单克隆抗体1F12，所述第二检测线包被有单克隆抗体2C6，所述第三检测线包被有单克隆抗体4B1，所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；
其中，分泌单克隆抗体1F12的杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020131；分泌单克隆抗体2C6的杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020132；分泌单克隆抗体3G5的杂交瘤细胞株Hustaumab-3G5于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020219；分泌单克隆抗体4B1的杂交瘤细胞株Hustaumab-4B1于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020218。
按照本发明的另一方面，提供了一种用于同时检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸，包括底板，以及重叠设置在该底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，其特征在于，所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体2C6和3G5；所述层析膜上设有三条检测线和一条质控线，记这三条检测线分别为第一检测线、第二检测线和第三检测线，所述第一检测线包被有单克隆抗体2C6，所述第二检测线包被有单克隆抗体1F12，所述第三检测线包被有单克隆抗体4B1，所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；
其中，分泌单克隆抗体1F12的杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020131；分泌单克隆抗体2C6的杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020132；分泌单克隆抗体3G5的杂交瘤细胞株Hustaumab-3G5于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020219；分泌单克隆抗体4B1的杂交瘤细胞株Hustaumab-4B1于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020218。
按照本发明的又一方面，提供了一种用于同时检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸，包括底板，以及重叠设置在该底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，其特征在于，所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体2C6和4B1；所述层析膜上设有三条检测线和一条质控线，记这三条检测线分别为第一检测线、第二检测线和第三检测线，所述第一检测线包被有单克隆抗体2C6，所述第二检测线包被有单克隆抗体1F12，所述第三检测线包被有单克隆抗体3G5，所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；
其中，分泌单克隆抗体1F12的杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020131；分泌单克隆抗体2C6的杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020132；分泌单克隆抗体3G5的杂交瘤细胞株Hustaumab-3G5于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020219；分泌单克隆抗体4B1的杂交瘤细胞株Hustaumab-4B1于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020218。
按照本发明的再一方面，提供了一种用于同时检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸，包括底板，以及重叠设置在该底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，其特征在于，所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体1F12和4B1；所述层析膜上设有三条检测线和一条质控线，记这三条检测线分别为第一检测线、第二检测线和第三检测线，所述第一检测线包被有单克隆抗体1F12，所述第二检测线包被有单克隆抗体2C6，所述第三检测线包被有单克隆抗体3G5，所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；
其中，分泌单克隆抗体1F12的杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020131；分泌单克隆抗体2C6的杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020132；分泌单克隆抗体3G5的杂交瘤细胞株Hustaumab-3G5于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020219；分泌单克隆抗体4B1的杂交瘤细胞株Hustaumab-4B1于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020218。
作为本发明的进一步优选，所述第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，所述第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，所述第三检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体4B1，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
或者，所述第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，所述第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，所述第三检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体4B1，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
或者，所述第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，所述第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，所述第三检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体3G5，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
或者，所述第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，所述第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，所述第三检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体3G5，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体。
作为本发明的进一步优选，胶体金标记的单克隆抗体，是按包括如下步骤的制备方法制备得到的：
S1：取10mL烧制完成的胶体金溶液，加入100-300μL 0.1M K2CO3溶液，混匀，然后在磁力搅拌下向其中加入含有100-300μg目标单克隆抗体的溶液，混匀后静置10-30min；其中，所述目标单克隆抗体为单克隆抗体1F12、单克隆抗体2C6、单克隆抗体3G5或单克隆抗体4B1；
S2：向所述步骤S1得到的试样中逐滴加入100μL含10-20wt％BSA的溶液，混匀后静置10-30min；接着，对于该试样，4000r/min离心10-30min进行第一次离心，然后将第一次离心得到的上清移到另一离心管中，8000r/min离心10-30min进行第二次离心；接着，再将第二次离心得到的上清移到另一离心管中，12000r/min离心10-30min进行第三次离心，去上清；如此，该试样三次离心所得的沉淀即为胶体金标记的单克隆抗体的浓缩液；相应的，所述胶体金标记的单克隆抗体的浓缩液具体为胶体金标记的单克隆抗体1F12的浓缩液、胶体金标记的单克隆抗体2C6的浓缩液、胶体金标记的单克隆抗体3G5的浓缩液或胶体金标记的单克隆抗体4B1的浓缩液。
作为本发明的进一步优选，所述胶体金溶液中的胶体金为氯金酸在柠檬酸钠还原下烧制获得的30-40nm的胶体金颗粒。
作为本发明的进一步优选，所述底板为PVC底板。
按照本发明的又一方面，提供了制备上述用于同时检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备样品垫步骤：样品垫采用玻璃纤维膜，使用含1wt％BSA、2wt％Sucrose、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液处理玻璃纤维膜1h后，烘干制成样品垫；
制备结合物释放垫步骤：结合物释放垫采用玻璃纤维膜，使用含0.03wt％Tris、2wt％Sucrose、0.2wt％Casein、1wt％BSA、0.1wt％PVP、1wt％NaN3、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液预处理玻璃纤维膜1h后烘干备用；接着，根据结合物释放垫上期望包被的胶体金标记的单克隆抗体的种类，将2种胶体金标记的单克隆抗体的浓缩液混合均匀，用8mL重悬液溶解均匀的铺于该玻璃纤维膜上，37℃干燥24h后，密封备用；
制备层析膜步骤：层析膜采用硝酸纤维素膜，在层析膜上设置三条检测线和一条质控线，其中，第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，第三检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体4B1，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
或者，第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，第三检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体4B1，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
或者，第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，第三检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体3G5，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
或者，第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，第三检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体3G5，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
组装试纸条步骤：将所述样品垫、所述结合物释放垫和所述层析膜依次压覆在底板上，并且在边缘重叠2～3mm；吸水垫压覆在所述层析膜的另一端且边缘重叠2～3mm，即可组装得到用于同时检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸。
按照本发明的最后一方面，本发明提供了一种用于定量检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试剂盒，其特征在于，包括如上述用于同时检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸以及与该试纸配合使用的金标免疫分析仪，能够检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的含量。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有仅能检测Aβ42不能区分单体和寡聚体以及尚无hp-Tau396,404检测技术相比，本发明利用前期研究积累所得的抗hAβ42蛋白抗体1F12、抗hAβ42蛋白抗体2C6，抗hp-Tau396,404蛋白抗体4B1、抗hp-Tau396,404蛋白抗体3G5基于双抗体夹心胶体金显色原理构建胶体金免疫层析试纸，其中，固定于结合物释放垫上的胶体金标记的hAβ42和hp-Tau396,404蛋白抗体复合物和检测线的抗hAβ42和hp-Tau396,404蛋白抗体分别识别hAβ42和hp-Tau396,404蛋白的不同的抗原决定簇，以结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体1F12和3G5，第一检测线包被有单克隆抗体1F12，第二检测线包被有单克隆抗体2C6，第三检测线包被有单克隆抗体4B1，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体为例，当待测样品中含有hAβ42单体、寡聚体和hp-Tau396,404蛋白时，首先在结合物释放垫形成hAβ42单体/寡聚体蛋白-胶体金-hAβ42蛋白抗体1F12复合物和hp-Tau396,404-胶体金-hp-Tau396,404蛋白抗体3G5复合物，从而与检测线上的抗hAβ42蛋白抗体1F12结合，在第一条检测线显色，剩余的hAβ42单体/胶体金-hAβ42蛋白抗体1F12复合物与检测线上的抗hAβ42蛋白抗体2C6结合在第二条检测线显色，最后hp-Tau396,404-胶体金-hp-Tau396,404蛋白抗体3G5复合物与检测线上的抗hp-Tau396,404蛋白抗体4B1结合在第三条检测线显色，质控线会一直显色以保证试纸条有效。当待测样品中不含有hAβ42和hp-Tau396,404蛋白时，只有质控线会显色。
还是以结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体1F12和3G5，第一检测线包被有单克隆抗体1F12，第二检测线包被有单克隆抗体2C6，第三检测线包被有单克隆抗体4B1，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体为例，基于该试纸得到的胶体金免疫层析试剂盒，则是同时基于双抗体夹心胶体金显色以及金标免疫分析仪定量的原理，可实现定性、定量检测；相应的，在检测应用时，可以先将胶体金免疫层析试纸平放，吸取一系列含hAβ42和hp-Tau396 ,404蛋白浓度梯度的样品，每个浓度梯度的样品取50μL分别滴加到样品垫上；这些样品经过层析作用与结合物释放垫上的胶体金标记的hAβ42蛋白抗体1F12和hp-Tau396,404蛋白抗体3G5复合物特异性结合；待样品中的hAβ42和hp-Tau396,404蛋白与胶体金标记的hAβ42和hp-Tau396,404蛋白抗体复合物进一步经过三条检测线和质控线；静置(如静置5min)，最后通过金标免疫分析仪对检测线的显色强度进行测量，即可对样品中的hAβ42和hp-Tau396,404蛋白含量进行定量检测。本申请定量检测hAβ42和hp-Tau396,404蛋白双抗体夹心胶体金免疫层析试剂盒采用胶体金免疫层析试纸条结合金标免疫分析仪，可同时实现对样品中的hAβ42单体蛋白、hAβ42寡聚体和hp-Tau396,404蛋白实现快速定量检测，极大的缩短了检测时间，并可实现大批量样品的快速准确筛查。
与目前的常ELISA检测试剂盒方法相比，以结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体1F12和3G5，第一检测线包被有单克隆抗体1F12，第二检测线包被有单克隆抗体2C6，第三检测线包被有单克隆抗体4B1，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体为例，本发明中的试纸及试剂盒具有以下优势：
(1)本发明的双抗夹心胶体金试纸条技术提供了一种快速、灵敏的检测Aβ42单体和寡聚体的蛋白的检测技术，对比当前仅能检测Aβ42不能很好的区分单体和寡聚体蛋白，导致其检测结果与疾病进程不相关，从而失去检测意义。本发明中的试纸条能够同时检测人淀粉样蛋白-β单体和寡聚体，能够为AD的早期诊断提供一种可靠性的判断依据。本发明所建立的双抗夹心胶体金试纸条对hAβ42Os检测灵敏度高达78pg，而对Aβ42Ms的检测灵敏度可达到156pg；
(2)本发明的双抗夹心胶体金试纸条技术填补了当前缺乏快速、灵敏的检测p-Tau396,404蛋白的空白，本发明中的试纸条能够快速、灵敏的检测人磷酸化Tau蛋白，能够为AD的早期诊断提供一种可靠性的判断依据。其所建立的双抗夹心胶体金试纸检测灵敏度高达156pg；
(3)本发明的双抗夹心胶体金试纸条技术对比其他检测方法能够同时实现对不同形式的可溶性的人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的高灵敏度、高特异性的同时检测。相较于仅能检测Aβ42不能区分单体、寡聚体和缺乏人磷酸化Tau蛋白的检测技术，本发明中的试纸条能够同时检测多种阿兹海默病的核心标志物，能够为AD的早期诊断提供更具可靠性的判断依据；
(4)本发明采用的双抗夹心胶体金试纸条技术具有操作简便、快速等特点，适合于基层推广应用；此外，检测结果可以通过肉眼直接观察和判定结果，可实现快速判定(例如可仅需5min)，无需昂贵的仪器如正电子发射计算机断层显像、核磁共振成像等进行淀粉样蛋白-β的诊断；
(5)基于双抗夹心胶体金试纸条的敏感、特异，成本低廉，便于操作等诸多优势，本发明在一定程度上提高了我国阿兹海默综合症的检测能力，为阿兹海默综合征的临床实时快速诊断提供技术基础，对提高我国医疗机构对阿兹海默综合症的病情监控和快速检测水平，以及普及先进技术在基层检验检疫机构的推广应用均具有重要意义。
基于本发明，单克隆抗体1F12、2C6、3G5、4B1其它组合形式得到的试纸及试剂盒，也具有相当的特点。例如，结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体2C6和3G5，第一检测线包被有单克隆抗体2C6，第二检测线包被有单克隆抗体1F12，第三检测线包被有单克隆抗体4B1，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；又例如，结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体2C6和4B1，第一检测线包被有单克隆抗体2C6，第二检测线包被有单克隆抗体1F12，第三检测线包被有单克隆抗体3G5，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；再例如，结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体1F12和4B1，第一检测线包被有单克隆抗体1F12，第二检测线包被有单克隆抗体2C6，第三检测线包被有单克隆抗体3G5。
通过本发明所构思的以上技术方案，与现有技术相比，本发明利用前期研究积累所得的抗p-hTau396,404蛋白抗体3G5、抗p-hTau396,404蛋白抗体4B1、抗hAβ42蛋白抗体1F12、抗hAβ42蛋白抗体2C6，建立了同时检测3种AD核心生物标志物的胶体金免疫层析流动试纸条用于高特异性、灵敏度的定量检测hAβ42Ms、hAβ42Os、p-hTau396,40，以实现对AD疾病的早期检测，填补了针对多靶标检测试剂盒的空白。
本发明在前期的一种分泌人淀粉样蛋白-β单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用(中国专利申请号：202011227808.5)的基础上，通过大量实验摸索单克隆抗体1F12，2C6可能结合的表位，因为具有不同表位的单克隆抗体是实现对Aβ42蛋白的关键。因此，本发明通过对Aβ42肽的截短，通过dot blot的方法鉴定出两株单克隆抗体的抗原决定簇。dot blot结果表明，单克隆抗体1F12特异性识别Aβ42蛋白3-9位氨基酸，单克隆抗体2C6特异性识别Aβ42蛋白3-9位氨基酸、13-19位氨基酸、18-25位氨基酸、29-36位氨基酸。上述结果表明，筛选得到了两株单克隆抗体是具有不同表位的。基于这一对抗体，本发明通过两种抗体配对，通过夹心ELISA方法，实现1F12/1F12组合检测Aβ42寡聚体、1F12/2C6组合检测Aβ42单体和寡聚体。
进一步的本发明在前期的一种分泌抗丝氨酸磷酸化tau蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(中国专利申请号：202110067436.2)的基础上，通过大量实验摸索单克隆抗体3G5，4B1可能结合的表位，因为具有不同表位的单克隆抗体是实现对p-Tau396,404蛋白的关键。因此，我们通过对p-hTau396,404肽的截短，通过dot blot的方法鉴定出两株单克隆抗体的抗原决定簇。dot blot结果表明，单克隆抗体3G5特异性识别396位点丝氨酸磷酸化的Tau蛋白，但是不识别非396位点丝氨酸磷酸化的Tau蛋白。单克隆抗体4B1特异性识别396和404位点丝氨酸磷酸化的Tau蛋白，但是不识别非396和404位点丝氨酸磷酸化的Tau蛋白。上述结果表明，筛选得到了两株单克隆抗体是磷酸化位点选择性的。基于这一对抗体，本发明通过两种抗体配对，通过夹心ELISA方法，首次筛选得到特异性检测p-hTau396,404的抗体对。
此外，本发明对比我们前期的研究成果：一种用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸及其制备(中国专利申请号：202110067679.6)实现同时检测人淀粉样蛋白-β的单体、寡聚体，本发明进一步的结合阿兹海默病的另一个核心生物标志物磷酸化Tau蛋白，利用新发现的不同抗原单克隆抗体之间的配合作用机制，通过对以1F12、3G5为金标抗体，1F12、2C6、4B1为划膜抗体；以2C6、3G5为金标抗体，2C6、1F12、4B1为划膜抗体；以2C6、4B1为金标抗体，2C6、1F12、3G5为划膜抗体；以1F12、4B1为金标抗体，1F12、2C6、3G5为划膜抗体，4种不同抗原的单克隆抗体之间的组合进行探索。最终结果显示，以1F12、3G5为金标抗体，1F12、2C6、4B1为划膜抗体，其检测效果最佳。本发明首次建立了同时检测hAβ42Ms、hAβ42Os、p-hTau396,404的胶体金免疫层析试纸条，实现短时间、可视化对3种核心生物标志物的高灵敏度、特异性的检测。
另一方面，本发明通过对试纸条的优化，进一步提高了hAβ42Ms、hAβ42Os检测限由原现的154pg，提高到现在的78pg。本发明报道的该项技术首次实现了对阿兹海默病的3个核心生物标志物检测，对于阿兹海默病的及时诊断与预防具有重要意义。
附图说明
图1中的A是1F12、2C6这2种抗体的识别表位图；图1中的B是3G5、4B1这2种抗体的识别表位图。
图2是本发明基于胶体金免疫层析试纸条检测hAβ42单体、hAβ42寡聚体、hp-Tau396 ,404蛋白示意及结果判定图；其中，图2中的A对应本发明基于胶体金免疫层析试纸条检测hAβ42单体、hAβ42寡聚体、hp-Tau396,404蛋白示意图；图2中的B对应本发明胶体金免疫层析试纸条结果判定图，各试纸条自左向右依次对应：p-Tau396,404+Aβ42Ms+Aβ42Os、p-Tau396,404+Aβ42Ms、p-Tau396,404+Aβ42Os、p-Tau396,404、PBS。
图3中的A为本发明烧制30nm胶体金的光谱图；图3中的B为本发明烧制30nm胶体金的透射电镜图；图3中的C为本发明烧制30nm胶体金及对应复合物(胶体金偶联抗体1F12、3G5)的粒径测量结果图；图3中的D为本发明烧制30nm胶体金及对应复合物(胶体金偶联抗体1F12、3G5)的电势测量结果图；图3中的E为本发明烧制30nm胶体金偶联抗体1F12、3G5的SDS-PAGE结果图；图3中的F为本发明复合物(即，本发明烧制30nm胶体金偶联抗体1F12、3G5)的ELISA活性检测图。
图4中的A为本发明基于胶体金免疫层析试纸条检测hAβ42单体、hAβ42寡聚体、hp-Tau396,404蛋白的特异性可视化图，试纸条自左向右依次对应p-Tau396,404+Aβ42Ms+Aβ42Os、Aβ40Ms+np-Tau231、Aβ40Ms+Cis-Tau、Aβ40Ms+Trans-Tau、Aβ40Ms+p-Tau231、Aβ40Os+np-Tau231、Aβ40Os+Cis-Tau、Aβ40Os+Trans-Tau、Aβ40Os+p-Tau231、PBS；图4中的B为本发明基于胶体金免疫层析试纸条检测hAβ42单体、hAβ42寡聚体、hp-Tau396,404蛋白的灵敏度可视化图，试纸条自左向右依次对应浓度40ng/mL、20ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、1.25ng/mL、0.625ng/mL、0.31ng/mL、0.156ng/mL、0.078ng/mL、0(即PBS)；图4中的C为基于胶体金免疫层析试纸条检测hAβ42单体、hAβ42寡聚体、hp-Tau396,404蛋白的特异性灰度值图，各柱状标记自左向右依次对应p-Tau396,404+Aβ42Ms+Aβ42Os、Aβ40Ms+np-Tau231、Aβ40Ms+Cis-Tau、Aβ40Ms+Trans-Tau、Aβ40Ms+p-Tau231、Aβ40Os+np-Tau231、Aβ40Os+Cis-Tau、Aβ40Os+Trans-Tau、Aβ40Os+p-Tau231、PBS；图4中的D和E为基于胶体金免疫层析试纸条检测hp-Tau396,404蛋白、hAβ42单体蛋白、hAβ42寡聚体蛋白的标准曲线。
图5中的A为胶体金标记的单克隆抗体1F12和3G5为例其检测hAβ42单体蛋白、hAβ42寡聚体蛋白、p-Tau396,404蛋白的灵敏度可视化图；图5中的B为胶体金标记的单克隆抗体2C6和4B1为例其检测hAβ42单体蛋白、hAβ42寡聚体蛋白、p-Tau396,404蛋白的灵敏度可视化图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
与前期研究分泌人淀粉样蛋白-β单克隆抗体的杂交瘤细胞株(中国专利申请号：202011227808.5)、用于检测人淀粉样蛋白-β双抗夹心ELISA检测试剂盒(中国专利申请号：202011227418.8)、用于检测人淀粉样蛋白-β的胶体金免疫层析试纸及其制备(202110067436.2)、及分泌人抗丝氨酸磷酸化Tau蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株(中国专利申请号：202110067679.6)相似，本发明中hAβ42蛋白抗体1F12是由分泌抗人Aβ42蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12所制备，杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12的保藏号为：CCTCC NO：C2020131；hAβ42蛋白抗体2C6是由分泌抗人Aβ42蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6所制备，杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6的保藏号为：CCTCC NO：C2020132。分泌单克隆抗体2C6的杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020132；本发明中p-Tau396,404蛋白抗体3G5是由分泌抗人p-Tau396,404蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株Hustaumab-3G5所制备，杂交瘤细胞株Hustaumab-3G5于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2020219；p-Tau396,404蛋白抗体4B1是由分泌抗人p-Tau396,404蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株Hustaumab-4B1所制备，杂交瘤细胞株Hustaumab-4B1于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020218。
实施例1：抗Aβ42蛋白抗体1F12、2C6和抗p-Tau396,404蛋白抗体3G5、4B1表位的鉴定
1.1、设计不同位置截短的多肽：Aβ蛋白第3-9个氨基酸(Aβ3-9):EFRHDSG、Aβ蛋白第13-19个氨基酸(Aβ13-19):HHQKLVF、Aβ蛋白第18-25个氨基酸(Aβ18-25):VFFAEDVG、Aβ蛋白第29-36个氨基酸(Aβ29-36):GAIIGLMV、Aβ蛋白第29-36个氨基酸(Aβ29-36):VGGVVIA；396位点丝氨酸磷酸化Tau蛋白(p-Tau396):TDHGAEIVYK-[Ser(P)]PVVSGDTSPRHL、404位点丝氨酸磷酸化Tau蛋白(p-Tau404):TDHGAEIVYKSPVVSGDT[Ser(P)]PRHL、非396位点丝氨酸磷酸化Tau蛋白(np-Tau396):TDHGAEIVYK-SPVVSGDTSPRHL、非404位点丝氨酸磷酸化Tau蛋白(np-Tau404):TDHGAEIVYKS-PVVSGDTSPRHL。所有设计的多肽均由现有多肽合成技术合成。
1.2、Dot blot验证
(1)包被不同截短的多肽：用CBS缓冲液稀释不同截短的多肽至终浓度为10μg/mL，然后在硝酸纤维素膜上依次滴加20μL，于室温干燥10min。
(2)封闭：包被完成后，TBS-T洗涤3次后，加入封闭液，于37℃封闭2h；
(3)加入一抗：封闭完成后，分别加入单克隆抗体1F12、2C6、3G5、4B1于37℃反应1h。
(4)加入酶标二抗：TBS-T洗涤3次后，分别加入HRP标记的山羊抗小鼠的二抗，于37℃反应1h；
(5)显色：反应结束后，TBS-T洗涤3次后，加上显影剂进行成像；
结果：单克隆抗体1F12识别Aβ3-9，单克隆抗体2C6识别Aβ3-9、Aβ13-19、Aβ18-25、Aβ29-36结果如图1中的A所示；单克隆抗体3G5特异性识别p-Tau396，而不识别p-Tau404、np-Tau396、np-Tau404，而4B1特异性识别p-Tau396和p-Tau404，而不识别np-Tau396、np-Tau404，结果如图1中的B所示。
实施例2：
如图2中的A所示，本实例提供的同时检测hAβ42单体、寡聚体、hp-Tau396,404蛋白的双抗夹心胶体金免疫层析试纸条，包括PVC底板、以及重叠设置在PVC底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，结合物释放垫上包被有胶体金标记的hAβ42蛋白抗体1F12和hp-Tau396,404蛋白抗体3G5复合物，层析膜上设有三条检测线(Test Line，T)和一条质控线(Control Line，C线)，三条检测线分别包被有抗hAβ42蛋白抗体1F12、2C6和hp-Tau396,404蛋白抗体4B1，所述质控线包被有羊抗鼠IgG。
层析膜上的检测线包被有浓度为1mg/mL的抗hAβ42蛋白抗体1F12、2C6和抗hp-Tau396,404蛋白抗体4B1。层析膜上的质控线包被有浓度为0.5mg/mL的羊抗鼠IgG。
本试纸条基于双抗体夹心原理实现检测，固定于结合物释放垫上的胶体金标记的hAβ42和hp-Tau396,404蛋白抗体复合物和检测线的抗hAβ42和hp-Tau396,404蛋白抗体分别识别hAβ42和hp-Tau396,404蛋白的不同的抗原决定簇，当待测样品中含有hAβ42单体、寡聚体和hp-Tau396,404蛋白时，首先在结合物释放垫形成hAβ42单体/寡聚体蛋白-胶体金-hAβ42蛋白抗体1F12复合物和hp-Tau396,404-胶体金-hp-Tau396,404蛋白抗体3G5复合物，从而与检测线上的抗hAβ42蛋白抗体1F12结合，在第一条检测线显色，剩余的hAβ42单体/胶体金-hAβ42蛋白抗体1F12复合物与检测线上的抗hAβ42蛋白抗体2C6结合在第二条检测线显色，最后hp-Tau396 ,404-胶体金-hp-Tau396,404蛋白抗体4B1复合物与检测线上的抗hp-Tau396,404蛋白抗体4B1结合在第三条检测线显色，质控线会一直显色以保证试纸条有效。当待测样品中不含有hAβ42和hp-Tau396,404蛋白时，只有质控线会显色。
图2中的B为本申请的快速检测试纸条结果判定图在检测线显色，而质控线会一直显色以保证试纸条有效。当待测样品中不含有hAβ42和hp-Tau396,404蛋白时，只有质控线会显色；当待测样品中仅含有hAβ42寡聚体蛋白时，只有第一条质控线会显色；当待测样品中仅含有hAβ42单体蛋白时，只有第二条质控线会显色；当待测样品中仅含有hp-Tau396,404蛋白时，只有第三条质控线会显色；当待测样品中同时含有hAβ42单体，寡聚体和hp-Tau396,404蛋白时，第一、二、三条质控线会同时显色。
实施例3：一种胶体金标记的hAβ42、hp-Tau396,404蛋白抗体1F12、3G5复合物的制备方法
2.0、烧制30-40nm胶体金颗粒
参照Juewen Liu等制备胶体金的方法，制备粒径为30nm的胶体金，具体操作步骤如下：
向彻底洗净的250mL锥形瓶中依次加入99mL去离子水和1mL 1％氯金酸溶液，振荡混匀。用恒温电热搅拌器进行晃荡加热，调整电热搅拌器的电压和转速，并保持不变，加热数分钟后，待溶液开始轻微沸腾，一次性快速加入过滤后的1％柠檬酸三钠溶液1.5mL。继续加热数分钟后，溶液颜色由无色渐渐变为灰色，接着由灰色变黑色，再由黑色变紫色，最后逐渐变成红色。待溶液颜色保持红色不再变化时，保持溶液沸腾状态继续加热20min。然后关闭电热器，继续缓慢晃荡溶液直至冷却至室温。将制备好的胶体金溶液转移至干净无菌的丝口瓶中，封口置于4℃冰箱中避光保存。将制备好的不同粒径的胶体金溶液分别用紫外可见光光谱法和透射电镜法进行检测，所制备出的胶体金颗粒的粒径大小。
2.1、胶体金质量的鉴定
2.1.1、目测法
肉眼直接观察所制备得到的胶体金溶液，观察溶液的颜色和透明度。胶体金颗粒的粒径大小会影响溶液的颜色。目前，最常制备的胶体金颗粒的粒径为30nm，对应的颜色为酒红色。
2.1.2、紫外分光光度法
取适量种胶体金溶液于波长为450-650nm处进行紫外可见分光光度扫描，测定不同粒径的胶体金溶液的最大吸收波长，同时观察最大吸收峰的峰形和峰宽。
2.1.3、透射电镜扫描鉴定法
取一张干净的滤纸铺在培养皿中，将用于透射电镜的铜网正面朝上放置于滤纸上。取25μL制备好的胶体金溶液滴加于铜网上，将培养皿放于通风处，使得铜网慢慢晾干。然后将制备好的铜网置于透射电镜下观察胶体金粒子的大小、形态以及分布的均一性。
结果：目测法观察到烧制的胶体金为紫红色，在523nm处出现最大吸收峰，透射电镜下观察到烧制的金形态均一，大小大约为30nm，其结果如图3中的A、B、C所示。
2.1.4、胶体金标记的hAβ42和hp-Tau396,404蛋白抗体1F12、4B1复合物的制备
(1)各取10mL烧制完成的胶体金溶液，分别加入200μL 0.1M K2CO3溶液，各自混匀，在磁力搅拌下分别加入200μg的hAβ42和hp-Tau396,404蛋白抗体1F12、3G5溶液，分别混匀，静置10min；
(2)对于静置完成后的每个试样溶液，逐滴加入100μL含20％BSA，混匀，静置10min，4000r/min离心10min，上清移到另一管，8000r/min离心10min，上清移到另一管，12000r/min离心10min，去上清，所得的沉淀即胶体金标记的hAβ42和hp-Tau396,404抗体1F12、3G5复合物的浓缩液。
2.2.4、金标抗体的生物学鉴定
2.2.4.1、金标抗体的粒径、电势的测量
将胶体金标记的单抗1F12、3G5混合物，各用1mL的重悬液混匀后进行金标抗体的粒径、电势的测量。
结果：金标抗体1F12、3G5的粒径、电势的值显著大于未标记的金颗粒，表明单抗1F12、3G5已成功偶联到金颗粒上，其结果如图3中的C、D所示。
2.2.4.2、金标抗体的活性检测
将单抗1F12、3G5成功偶联到金颗粒上并保持抗体原本的生物学活性，是制备胶体金试纸条的前提。我们分别利用SDS-PAGE、ELISA来验证金标抗体1F12、3G5是否具有抗体原本的生物学活性。
SDS-PAGE具体步骤如下：
(1)配制12％的SDS-PAGE胶；
(2)取金标记的1F12、3G5抗体，加入上样缓冲液后，煮沸10min；
(3)将煮沸的样品加入胶孔，按照90v恒压跑1.5h；
(4)跑胶完成后将胶取下，用染色液染色，脱色后观察蛋白条带；
结果：SDS-PAGE结果表明单抗1F12、3G5已经成功偶联上金颗粒，保持了抗体的典型的特征，其结果如图3中的E所示。
ELISA具体步骤如下：
(1)包被抗原：用CBS缓冲液稀释hAβ42、hp-Tau396,404蛋白至终浓度为10μg/mL，然后每孔加入100μL，于4℃包被过夜；
(2)封闭：包被完成后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入200μL的封闭液，于37℃封闭2h；
(3)加入金标抗体：封闭完成后，每孔用PBS-T洗涤3次，然后每孔加入金标抗体，室温孵育2h；弃上清，每孔用PBS-T洗涤3次；
(4)加入酶标抗体：每孔加入100μL HRP标记的山羊抗小鼠的二抗，室温反应1h；
(5)显色：反应结束后，弃孔中液体，PBS-T洗涤3次后，每孔加入100μL TMB，于37℃反应15min；
(6)终止：每孔加入50μL 2M H2SO4终止反应，然后在酶标仪上读取OD450；
结果：ELISA结果表明，单抗1F12、3G5成功偶联到金颗粒上并保持抗体原本的生物学活性，其结果如图3中的F所示。
实施例4：同时检测hAβ42单体、寡聚体、hp-Tau396,404蛋白双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条的制备方法
3.1、制备样品垫：所述样品垫采用玻璃纤维膜，使用含1％BSA、2％Sucrose、0.1％PEG、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液处理玻璃纤维膜1h后，烘干制成样品垫；
3.2、制备结合物释放垫:所述结合物释放垫采用玻璃纤维膜，使用含0.03％Tris、2％Sucrose、0.2％Casein、1％BSA、0.1％PVP、1％NaN3、0.1％PEG、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液预处理玻璃纤维膜1h后烘干备用；采用实施例3中方法所制备的胶体金标记的hAβ42和hp-Tau396,404抗体1F12、3G5复合物的沉淀用8mL重悬液溶解均匀的铺于玻璃纤维膜上，37℃干燥24h后，密封备用。
3.3、制备层析膜：所述层析膜采用硝酸纤维素膜，在层析膜上设置三条检测线和一条质控线，所述检测线包被有1mg/mL的抗hAβ42和hp-Tau396,404蛋白单克隆抗体1F12、2C6、4B1，所述质控线包被有0.5mg/mL的羊抗鼠IgG。
3.4、组装试纸条：样品垫、结合物释放垫、层析膜依次压覆在PVC底板上，并且在边缘重叠2～3mm；吸水垫压覆在层析膜的另一端且边缘重叠2～3mm，得到组装的定量检测不同形式hAβ42和hp-Tau396,404蛋白双抗夹心胶体金免疫层析试纸条。
实施例5：检测hAβ42单体、寡聚体、hp-Tau396,404蛋白双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条的特异性、灵敏度评估
4.1、特异性评估
分别制备10μg/mL hAβ42单体蛋白、hAβ42寡聚体蛋白、hAβ40单体蛋白、hAβ40寡聚体蛋白、hp-Tau396,404、np-Tau231、p-Tau231、Cis-hTau、Trans-hTau、PBS，分别取50μL滴加到试纸条上，5min后读取结果，进行特异性评估。
结果：从测试的试纸条的结果可以看出，建立的双抗夹心胶体金试纸条能特异的与hAβ42单体、寡聚体、hp-Tau396,404蛋白反应，其特异性的检测结果如图4中的A和C所示。
4.2、灵敏度评估
制备不同浓度的hAβ42单体蛋白、hAβ42寡聚体蛋白、p-Tau396,404蛋白，浓度从40ng/mL到0.078ng/mL(即78pg/mL)，分别滴加到试纸条上，5min后读取结果，进行灵敏度评估。
结果：从测试的试纸条的结果可以看出，建立的双抗夹心胶体金试纸条检测Aβ42寡聚体蛋白的最低检测限为78pg，检测hAβ12单体蛋白和hp-Tau396,404蛋白的最低检测限为156pg，其灵敏度的检测结果如图4中的B所示。建立的标准曲线如图4中的D、E所示，由图4中的D可知，灰度值Y与p-Tau396,404蛋白的浓度X(单位ng/mL)两者关系的标准曲线为Y＝3.147*X+5.633(R2＝0.9657)；由图4中的E可知，灰度值Y与Aβ42Ms蛋白的浓度X(单位ng/mL)两者关系的标准曲线为Y＝2.343*X+7.559(R2＝0.9371)；灰度值Y与Aβ42Os蛋白的浓度X(单位ng/mL)两者关系的标准曲线为Y＝3.192*X+14.26(R2＝0.9212)。
上述实施例主要是以胶体金标记的单克隆抗体1F12和3G5为例，得到的用于检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸，其结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体1F12和3G5；层析膜上设有三条检测线和一条质控线，记这三条检测线分别为第一检测线、第二检测线和第三检测线，第一检测线包被有单克隆抗体1F12，第二检测线包被有单克隆抗体2C6，第三检测线包被有单克隆抗体4B1，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。除了胶体金标记的单克隆抗体1F12和3G5外，胶体金标记的单克隆抗体2C6和3G5同样也适用；即，结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体也可以为2C6和3G5；层析膜上设有三条检测线和一条质控线，记这三条检测线分别为第一检测线、第二检测线、第三检测线，第一检测线也可以包被有单克隆抗体2C6，第二检测线也可以包被有单克隆抗体1F12，第三检测线包被有单克隆抗体4B1，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。另外，胶体金标记的单克隆抗体2C6和4B1同样也适用；即，结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体也可以为2C6和4B1；层析膜上设有三条检测线和一条质控线，记这三条检测线分别为第一检测线、第二检测线、第三检测线，第一检测线也可以包被有单克隆抗体2C6，第二检测线也可以包被有单克隆抗体1F12，第三检测线包被有单克隆抗体3G5,质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。而胶体金标记的单克隆抗体1F12和4B1同样也适用；即，结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体也可以为1F12和4B1；层析膜上设有三条检测线和一条质控线，记这三条检测线分别为第一检测线、第二检测线、第三检测线，第一检测线也可以包被有单克隆抗体1F12，第二检测线也可以包被有单克隆抗体2C6，第三检测线包被有单克隆抗体3G5,质控线包被有羊抗鼠IgG抗体，质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。虽然后3组的效果逊于胶体金标记的单克隆抗体1F12和3G5这一组，但仍能用于检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白。
另外，胶体金标记的单克隆抗体1F12、胶体金标记的单克隆抗体2C6、胶体金标记的单克隆抗体3G5、胶体金标记的单克隆抗体4B1，类似的，可以是按包括如下步骤的制备方法制备得到的：
S1：分别取四份每份10mL烧制完成的胶体金溶液，各加入100-300μL 0.1M K2CO3溶液，各自混匀，在磁力搅拌下向第一份试样中加入含有100-300μg单克隆抗体1F12的溶液，向第二份试样中加入含有100-300μg单克隆抗体2C6的溶液，向第三份试样中加入含有100-300μg单克隆抗体3G5的溶液，向第四份试样中加入含有100-300μg单克隆抗体4B1的溶液，各自混匀，分别静置10-30min；
S2：向所述步骤S1得到的四份试样中分别逐滴加入100μL含10-20wt％BSA的溶液，各自混匀后分别静置10-30min；接着，对于每一份试样，4000r/min离心10-30min进行第一次离心，然后将第一次离心得到的上清移到另一离心管中，8000r/min离心10-30min进行第二次离心；接着，再将第二次离心得到的上清移到另一离心管中，12000r/min离心10-30min进行第三次离心，去上清；如此，这四份试样三次离心所得的沉淀即分别为胶体金标记的单克隆抗体1F12、2C6、3G5、4B1的浓缩液。
在实施例6，我们选择其中的一种组合进行比较，即，结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体为2C6和4B1；层析膜上设有三条检测线和一条质控线，记这三条检测线分别为第一检测线、第二检测线、第三检测线，第一检测线也可以包被有单克隆抗体2C6，第二检测线也可以包被有单克隆抗体1F12，第三检测线包被有单克隆抗体3G5,质控线包被有羊抗鼠IgG抗体。
实施例6、不同抗体对组合检测hAβ42单体、寡聚体、hp-Tau396,404蛋白双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条的灵敏度评估
5.1、30nm胶体金的制备，请见实施例3
5.2、胶体金标记的hAβ42和hp-Tau396,404蛋白抗体2C6、4B1复合物的制备
(1)各取10mL烧制完成的胶体金溶液，分别加入200μL 0.1M K2CO3溶液，各自混匀，在磁力搅拌下分别加入200μg的hAβ42和hp-Tau396,404蛋白抗体2C6、4B1溶液，分别混匀，静置10min；
(2)对于静置完成后的每个试样溶液，逐滴加入100μL含20％BSA，混匀，静置10min，4000r/min离心10min，上清移到另一管，8000r/min离心10min，上清移到另一管，12000r/min离心10min，去上清，所得的沉淀即胶体金标记的hAβ42和hp-Tau396,404抗体2C6、4B1复合物的浓缩液。
5.3、同时检测hAβ42单体、寡聚体、hp-Tau396,404蛋白双抗体夹心胶体金免疫层析试纸条的制备方法
5.3.1、制备样品垫：所述样品垫采用玻璃纤维膜，使用含1％BSA、2％Sucrose、0.1％PEG、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液处理玻璃纤维膜1h后，烘干制成样品垫；
5.3.2、制备结合物释放垫:所述结合物释放垫采用玻璃纤维膜，使用含0.03％Tris、2％Sucrose、0.2％Casein、1％BSA、0.1％PVP、1％NaN3、0.1％PEG、0.05％Tween-20的磷酸盐缓冲液预处理玻璃纤维膜1h后烘干备用；采用5.2方法所制备的胶体金标记的hAβ42和hp-Tau396,404抗体2C6、4B1复合物的沉淀用8mL重悬液溶解均匀的铺于玻璃纤维膜上，37℃干燥24h后，密封备用。
5.3.3、制备层析膜：所述层析膜采用硝酸纤维素膜，在层析膜上设置三条检测线和一条质控线，所述检测线包被有1mg/mL的抗hAβ42和hp-Tau396,404蛋白单克隆抗体2C6、1F12、3G5，所述质控线包被有0.5mg/mL的羊抗鼠IgG。
5.3.4、组装试纸条：样品垫、结合物释放垫、层析膜依次压覆在PVC底板上，并且在边缘重叠2～3mm；吸水垫压覆在层析膜的另一端且边缘重叠2～3mm，得到组装的定量检测不同形式hAβ42和hp-Tau396,404蛋白双抗夹心胶体金免疫层析试纸条。
5.4、不同抗体对组合灵敏度评估
制备不同浓度的hAβ42单体蛋白、hAβ42寡聚体蛋白p-Tau396,404蛋白，浓度从40ng/mL到0.078ng/mL(即78pg/mL)，分别滴加到试纸条上，5min后读取结果，进行灵敏度评估。
结果：从测试的试纸条的结果可以看出，实施例2－5所对应的胶体金标记的单克隆抗体1F12和3G5，其检测hAβ42单体蛋白、p-Tau396,404蛋白的灵敏度为156pg/mL、hAβ42寡聚体蛋白的灵敏度为78pg/mL，要好于实施例6所对应的胶体金标记的单克隆抗体2C6和4B1，其检测hAβ42单体蛋白、p-Tau396,404蛋白的灵敏度为625pg/mL、hAβ42寡聚体蛋白的灵敏度为156pg/mL，结果如图5中的A、B所示。
本发明中用于同时检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白胶体金免疫层析试纸，根据实际需求，可以被进一步裁减成目标尺寸的试纸条，以便于使用；另外，该试纸还可以参考现有技术，与金标免疫分析仪配合或者与生物学软件配合进行灰度值计算构建用于定量检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试剂盒，在此不再详述。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种用于同时检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸，包括底板，以及重叠设置在该底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，其特征在于，所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体1F12和3G5；所述层析膜上设有三条检测线和一条质控线，记这三条检测线分别为第一检测线、第二检测线和第三检测线，所述第一检测线包被有单克隆抗体1F12，所述第二检测线包被有单克隆抗体2C6，所述第三检测线包被有单克隆抗体4B1，所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；
其中，分泌单克隆抗体1F12的杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020131；分泌单克隆抗体2C6的杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2020132；分泌单克隆抗体3G5的杂交瘤细胞株Hustaumab-3G5于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020219；分泌单克隆抗体4B1的杂交瘤细胞株Hustaumab-4B1于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2020218。
2.一种用于同时检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸，包括底板，以及重叠设置在该底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，其特征在于，所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体2C6和3G5；所述层析膜上设有三条检测线和一条质控线，记这三条检测线分别为第一检测线、第二检测线和第三检测线，所述第一检测线包被有单克隆抗体2C6，所述第二检测线包被有单克隆抗体1F12，所述第三检测线包被有单克隆抗体4B1，所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；
其中，分泌单克隆抗体1F12的杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020131；分泌单克隆抗体2C6的杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2020132；分泌单克隆抗体3G5的杂交瘤细胞株Hustaumab-3G5于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020219；分泌单克隆抗体4B1的杂交瘤细胞株Hustaumab-4B1于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2020218。
3.一种用于同时检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸，包括底板，以及重叠设置在该底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，其特征在于，所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体2C6和4B1；所述层析膜上设有三条检测线和一条质控线，记这三条检测线分别为第一检测线、第二检测线和第三检测线，所述第一检测线包被有单克隆抗体2C6，所述第二检测线包被有单克隆抗体1F12，所述第三检测线包被有单克隆抗体3G5，所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；
其中，分泌单克隆抗体1F12的杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020131；分泌单克隆抗体2C6的杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2020132；分泌单克隆抗体3G5的杂交瘤细胞株Hustaumab-3G5于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020219；分泌单克隆抗体4B1的杂交瘤细胞株Hustaumab-4B1于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2020218。
4.一种用于同时检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸，包括底板，以及重叠设置在该底板上的吸水垫、层析膜、结合物释放垫和样品垫，其特征在于，所述结合物释放垫上包被有胶体金标记的单克隆抗体1F12和4B1；所述层析膜上设有三条检测线和一条质控线，记这三条检测线分别为第一检测线、第二检测线和第三检测线，所述第一检测线包被有单克隆抗体1F12，所述第二检测线包被有单克隆抗体2C6，所述第三检测线包被有单克隆抗体3G5，所述质控线包被有羊抗鼠IgG抗体；
其中，分泌单克隆抗体1F12的杂交瘤细胞株Hustabomab-1F12于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020131；分泌单克隆抗体2C6的杂交瘤细胞株Hustabomab-2C6于2020年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2020132；分泌单克隆抗体3G5的杂交瘤细胞株Hustaumab-3G5于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020219；分泌单克隆抗体4B1的杂交瘤细胞株Hustaumab-4B1于2020年11月10日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：C2020218。
5.如权利要求1、2、3或4所述用于同时检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，所述第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，所述第三检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体4B1，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
或者，所述第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，所述第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，所述第三检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体4B1，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
或者，所述第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，所述第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，所述第三检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体3G5，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
或者，所述第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，所述第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，所述第三检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体3G5，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体。
6.如权利要求1、2、3或4所述用于同时检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，胶体金标记的单克隆抗体，是按包括如下步骤的制备方法制备得到的：
S1：取10mL烧制完成的胶体金溶液，加入100-300μL 0.1M K2CO3溶液，混匀，然后在磁力搅拌下向其中加入含有100-300μg目标单克隆抗体的溶液，混匀后静置10-30min；其中，所述目标单克隆抗体为单克隆抗体1F12、单克隆抗体2C6、单克隆抗体3G5或单克隆抗体4B1；
S2：向所述步骤S1得到的试样中逐滴加入100μL含10-20wt％BSA的溶液，混匀后静置10-30min；接着，对于该试样，4000r/min离心10-30min进行第一次离心，然后将第一次离心得到的上清移到另一离心管中，8000r/min离心10-30min进行第二次离心；接着，再将第二次离心得到的上清移到另一离心管中，12000r/min离心10-30min进行第三次离心，去上清；如此，该试样三次离心所得的沉淀即为胶体金标记的单克隆抗体的浓缩液；相应的，所述胶体金标记的单克隆抗体的浓缩液具体为胶体金标记的单克隆抗体1F12的浓缩液、胶体金标记的单克隆抗体2C6的浓缩液、胶体金标记的单克隆抗体3G5的浓缩液或胶体金标记的单克隆抗体4B1的浓缩液。
7.如权利要求6所述用于同时检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述胶体金溶液中的胶体金为氯金酸在柠檬酸钠还原下烧制获得的30-40nm的胶体金颗粒。
8.如权利要求1、2、3或4所述用于同时检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸，其特征在于，所述底板为PVC底板。
9.制备如权利要求1－8任意一项所述用于同时检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
制备样品垫步骤：样品垫采用玻璃纤维膜，使用含1wt％BSA、2wt％Sucrose、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液处理玻璃纤维膜1h后，烘干制成样品垫；
制备结合物释放垫步骤：结合物释放垫采用玻璃纤维膜，使用含0.03wt％Tris、2wt％Sucrose、0.2wt％Casein、1wt％BSA、0.1wt％PVP、1wt％NaN3、0.1vol％PEG、0.05vol％Tween-20的磷酸盐缓冲液预处理玻璃纤维膜1h后烘干备用；接着，根据结合物释放垫上期望包被的胶体金标记的单克隆抗体的种类，将2种胶体金标记的单克隆抗体的浓缩液混合均匀，用8mL重悬液溶解均匀的铺于该玻璃纤维膜上，37℃干燥24h后，密封备用；
制备层析膜步骤：层析膜采用硝酸纤维素膜，在层析膜上设置三条检测线和一条质控线，其中，第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，第三检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体4B1，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
或者，第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，第三检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体4B1，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
或者，第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，第三检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体3G5，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
或者，第一检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体1F12，第二检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体2C6，第三检测线包被有浓度为0.5-2mg/mL的单克隆抗体3G5，所述质控线包被有浓度为0.5-2mg/mL的羊抗鼠IgG抗体；
组装试纸条步骤：将所述样品垫、所述结合物释放垫和所述层析膜依次压覆在底板上，并且在边缘重叠2～3mm；吸水垫压覆在所述层析膜的另一端且边缘重叠2～3mm，即可组装得到用于同时检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸。
10.一种用于定量检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1－8任意一项所述用于同时检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的胶体金免疫层析试纸以及与该试纸配合使用的金标免疫分析仪，能够检测人淀粉样蛋白-β和磷酸化Tau蛋白的含量。
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