DE3784576T2

DE3784576T2 - Optische polymerbedeckte strukturen.

Info

Publication number: DE3784576T2
Application number: DE8787306535T
Authority: DE
Inventors: Robin Edward Godfrey
Original assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Current assignee: Applied Research Systems ARS Holding NV
Priority date: 1986-07-24
Filing date: 1987-07-23
Publication date: 1993-09-23
Anticipated expiration: 2007-07-24
Also published as: DE3784576D1; JP2528134B2; IL83180A; AU7600787A; EP0254575B1; EP0254575A2; JPS63100355A; JP2592588B2; JPH0868749A; AU594176B2; ATE86744T1; GR3007383T3; EP0254575A3; CA1303981C; ES2038183T3; GB8618133D0; IL83180A0; US4992385A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von polymerbeschichteten Oberflächen, die für die Verwendung als optische Strukturen geeignet sind. Insbesondere betrifft sie Verfahren zur Herstellung von Oberflächen, die für die Verwendung in Sensoren, z. B. in Biosensoren, geeignet sind, worin ein Paar der Bindungspartner auf die Oberfläche einer polymerbeschichteten optischen Struktur aufgebracht wird, um eine Vorrichtung für den Nachweis der Gegenwart der komplementären Komponente in einer anschließend mit der Oberfläche in Kontakt gebrachten Probe zu bilden.
Die Eigenschaften der einfachen optischen Strukturen sind seit vielen Jahren bekannt und Strukturen wie beispielsweise Beugungsgitter finden verbreitet nicht nur als Mittel für das Verständnis und die Analyse der Welleneigenschaften elektromagnetischer Strahlung sondern auch in neuerer Zeit als Sensoren für den Nachweis chemischer, biochemischer oder biologischer Species in einer Probe Verwendung.
Die US-3 926 564 und US-3 979 184 beschreiben die Adsorption von immunologisch reaktiven Proteinen an rauhen metallischen Oberflächen derart, daß die Bindung einer komplementären Komponente die optischen Eigenschaften der Oberfläche in einer mit dem unbewaffneten Auge wahrnehmbaren Weise ändert.
Die EP-0 112 721 beschreibt die Herstellung und die Verwendung als Biosensoren von Beugungsgittern, die mit einem Material (nachfolgend als "spezifischer Bindungspartner" bezeichnet) beschichtet sind, das zur Bindung mit der zu untersuchenden Species (nachfolgend als "Ligand" bezeichnet) unter Bildung eines Komplexes befähigt ist. Die optischen Eigenschaften derartiger Beugungsgitter werden als Ergebnis der Komplexbildung zwischen den spezifischen Bindungspartner und dem Liganden verändert und dieses Phänomen kann demzufolge die Basis eines Assay-Systems bilden.
Ein nicht nur der Verwendung von beschichteten optischen Strukturen als Biosensoren sondern auch der Verwendung von optischen Standardstrukturen durch Experimentalphysiker gemeinsames Problem besteht in der Schwierigkeit, ihre Oberflächeneigenschaften zu kontrollieren. Das Trägersubstrat solcher optischen Strukturen besteht häufig aus Glas oder Kunststoffmaterial, jedoch kann die Oberfläche der Struktur eine dünne, zum Beispiel durch Vakuumabscheidung gebildete Metallschicht umfassen. Probleme können bei der Verwendung von metallbeschichteten Oberflächen in korrosiver Umgebung auftreten, die die Unversehrtheit einer Metallschicht zerstören kann. Andere anorganische Schichten, beispielsweise Siliziumdioxid, wurden auch als Beugungsgitteroberflächen beschrieben (siehe z. B. EP-0 112 721 und EP-0 178 083). Bestimmte optische Eigenschaften einer optischen Struktur, zum Beispiel ihre Reflexions- und/oder Transmissionseigenschaften, und jeder auftretende Oberflächenplasmonresonanzeffekt hängen von der Zusammensetzung, Dicke und Gleichmäßigkeit derartiger Oberflächenschichten ab. Die Zusammensetzung der Oberflächenschicht bestimmt auch ihre optischen Eigenschaften. Jedoch ist der Bereich der chemischen und physikalischen Eigenschaften bekannter anorganischer Schichten begrenzt. Ein weiteres Problem, dem man bei Verwendung derartiger optischer Strukturen als Biosensoren begegnen kann, besteht darin, daß einige biologisch aktive Moleküle, zum Beispiel Proteine, zumindest teilweise durch direkten Kontakt mit metallischen und bestimmten anorganischen Oberflächen inaktiviert werden können.
Im Gegensatz hierzu kann ein außerordentlich breiter Bereich chemischer und physikalischer Eigenschaften erzielt werden, indem man geeignete organische Polymere verwendet und es sind zahlreiche Techniken für die Bindung chemischer, biochemischer und biologischer Komponenten hieran bekannt. Unglücklicherweise führten frühere Versuche polymerbeschichtete Beugungsgitter herzustellen dazu, daß die Polymerbeschichtung nicht in der Lage war, hinreichend dem Oberflächenreliefprofil des Gitters zu entsprechen, wodurch seine inhärenten physikalischen Eigenschaften in hohem Ausmaß verzerrt wurden.
Wir haben nun gefunden, daß durch Verwendung einer speziellen, als "Lösungsmittelguß" bekannten Technik es möglich ist, eine optische Struktur mit einer gleichmäßig verteilten Oberflächenschicht von organischem Polymeren herzustellen, die gut dem Oberflächenreliefprofil der optischen Struktur entspricht.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung in ihrem breitesten Aspekt ein Verfahren zur Behandlung der Oberfläche einer optischen Struktur, das die Ausbildung einer dünnen Schicht aus organischem Polymeren unter Verwendung einer Lösungsmittelgußtechnik auf dieser Oberfläche umfaßt.
Im allgemeinen besitzt die Schicht des auf die Oberfläche des Gitters aufgebrachten Polymeren eine Dicke im Bereich von 5 Nanometer bis 100 Nanometer, vorzugsweise 15 bis 20 Nanometer. Das Polymere kann jedes geeignete Material sein, das in eine dünne Schicht unter Verwendung einer Lösungsmittelgußtechnik gegossen werden kann. Die Verwendung von Cellulosederivaten, wie zum Beispiel Cellulosenitrat, als Polymerschicht ist besonders bevorzugt, jedoch können andere Polymere ebenfalls, wie zum Beispiel die nachfolgend erwähnten, eingesetzt werden.
Wie zuvor erwähnt, hängen die optischen Eigenschaften einer optischen Oberfläche nicht nur von ihrem physikalischen Reliefprofil sondern auch von der Zusammensetzung der Oberflächenschicht oder -schichten ab. Somit kann das erfindungsgemäße Verfahren auf die Herstellung neuer beschichteter optischer Strukturen angewandt werden, die sich als wertvolles Werkzeug für den Experimentalphysiker unter gleichen erweisen können. Zusätzlich können bestimmte bevorzugte Oberflächenschichten, wie zum Beispiel diejenigen, die in der Lage sind, die Oberflächenplasmonresonanz zu unterstützen, zum Beispiel Silber, einer Korrosion, zum Beispiel durch wäßrige Umgebungen, unterliegen. Die vorliegende Erfindung schafft Mittel, eine derartige Schicht zu passivieren, so daß ihre Unversehrtheit unter den praktischen Arbeitsbedingungen beibehalten wird.
Die vorliegende Erfindung ist jedoch von besonderem Vorteil, wo die optischen Strukturen Beugungsgitter sind, die als Biosensoren analog zu den früheren Vorschlägen (sie z. B. EP- 0 112 721) verwendet werden sollen. Ein direkter Kontakt zwischen einem biologisch aktiven Material, wie zum Beispiel einem Antikörper oder Antigen, und einer Metalloberfläche können zu einer Verunreinigung oder Zerstörung seiner biologischen Aktivität führen. In dieser Situation wirkt die Polymerschicht vorteilhaft als Barriere. Weiterhin führen der breite Bereich der chemischen Eigenschaften von verschiedenen Polymeroberflächen (z. B. Verfügbarkeit freier Gruppen für die kovalente Bindung, Hydrophilie oder Hydrophobie, Oberflächenladung und dielektrische Eigenschaften) zu einer Vielfältigkeit und einem Spielraum für die Optimierung der Bindung oder Adsorption irgendeines speziellen Bindungspartners, wie beispielsweise eines Antikörpers oder eines Antigens. Es ist wichtig, unter Minimierung jedweder nicht-spezifischen Bindung oder sterischen Hinderung die native Konformation und biologische Aktivität des gewünschten Bindungspartners aufrechtzuerhalten und eine zufriedenstellende Immobilisierung auf der Oberfläche der optischen Struktur zu erzielen.
Das erfindungsgemäße Verfahren findet daher insbesondere Anwendung bei der Herstellung von Biosensoren und somit stellt die Erfindung gemäß einer Ausführungsform ein Verfahren zur Herstellung einer Vorrichtung für den Nachweis eines Liganden bereit, das das Aufbringen auf die Oberfläche einer optischen Struktur einer dünnen Schicht eines organischen Polymeren mit Hilfe einer Lösungsmittelgußtechnik und die Adsorption oder die Bindung an dem organischen Polymeren entweder direkt oder indirekt eines spezifischen Bindungspartners für den Liganden, den man nachzuweisen wünscht, umfaßt.
Erfindungsgemäß hergestellte Biosensoren sind vor allem für den Nachweis von Antikörpern oder Antigenen verwendbar (in welchem Fall der spezifische Bindungspartner entweder ein Antigen oder ein Antikörper monoklonal bzw. polyklonal sein wird), jedoch können andere Liganden durch die Verwendung anderer spezifischer Bindungspartner, wie nachstehend diskutiert, nachgewiesen werden. Die erfindungsgemäß hergestellten Sensoren sind jedoch nicht auf Biosensoren beschränkt und können chemische Sensoren, wie zum Beispiel chemische Gasdetektoren, umfassen, bei denen die spezifische Adsorption an der Polymerschicht oder die Absorption in die Polymerschicht stattfinden können.
Die optischen Eigenschaften einer mit einem spezifischen Bindungspartner beschichteten optischen Struktur werden durch Komplexbildung zwischen dem spezifischen Bindungspartner und dem komplementären Liganden verändert und bei einer Ausführungsform der Erfindung ist es durch Vergleich der optischen Eigenschaften eines Standard- (unbehandelten) Bereichs mit denjenigen eines behandelten Testbereichs der Oberfläche möglich, qualitativ oder quantitativ zu bestimmen, ob eine Bindungsreaktion in dem Testbereich stattgefunden hat. Bei einer anderen Ausführungsform, bei der beispielsweise der spezifische Bindungspartner ein Antikörper ist, wird ein für das zu untersuchende Antigen spezifischer Antikörper an zumindest einem diskreten Testbereich an der Oberfläche einer optischen Struktur adsorbiert oder gebunden und ein Protein, das kein spezifischer Bindungspartner für irgendeinen Liganden ist, der in der zu untersuchenden Probe vorhanden sein kann (vorliegend als "nicht-spezifisches Protein" bezeichnet), wird an zumindest einem diskreten Bezugsbereich an dieser Oberfläche adsorbiert oder gebunden. Das nicht-spezifische Protein kann zum Beispiel ein inaktivierter Antikörper oder ein gegen einen in den zu untersuchenden Proben nicht vorhandenen Liganden gerichteter Antikörper sein, beispielsweise kann, wenn die zu untersuchenden Proben Humanseren sind, das nicht-spezifische Protein ein Anti-Maus-Antikörper sein. Jegliche Unterschiede zwischen der nicht-spezifischen Bindung von zum Beispiel in der Testprobe vorhandenen Proteinen entweder an den spezifischen Antikörper oder das nicht-spezifische Protein können bestimmt werden, indem man die optischen Eigenschaften des Testbereichs mit dem Bezugsbereich nach dem Kontaktieren mit einer Probe, die das zu untersuchende Antigen nicht enthält, derart, daß erforderlichenfalls eine geeignete Korrektur vorgenommen werden kann. Ein Vergleich der optischen Eigenschaften der Test- und Standardbereiche eines ähnlichen Biosensors während oder nach dem Kontaktieren mit der zu untersuchenden Probe kann dann eine Messung der Komplexbildung zwischen dem zu untersuchenden Antigen und seinem spezifischen Antikörper liefern. Jeder Bereich kann eine kontinuierliche Schicht eines spezifischen Bindungspartners enthalten, oder jeder Bindungspartner kann in diskreten Intervallen innerhalb irgendeines gegebenen Bereichs vorliegen, um eine diskontinuierliche Schicht zu bilden.
Die erfindungsgemäß hergestellten Biosensoren können zum Beispiel in Assays analog zu den in EP-0 112 721 und EP-0 178 083 beschriebenen eingesetzt werden.
Somit wird gemäß einem weiteren Merkmal der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Liganden in einer Probe bereitgestellt, das das Kontaktieren dieser Probe mit einem durch das vorstehend definierte Verfahren hergestellten Biosensor und die Bestimmung, ob und gewünschtenfalls des Ausmaßes in dem und/oder der Geschwindigkeit mit der ein optisches Merkmal des Biosensors durch Bildung eines Komplexes zwischen dem Liganden und dem spezifischen Bindungspartner verändert wird.
Die vorliegende Erfindung sieht weiterhin einen Biosensor für den Nachweis eines Liganden vor, der eine optische Struktur umfaßt, die eine dünne Schicht eines organischen Polymeren trägt, das auf die Oberfläche der optischen Struktur durch eine Lösungsmittelgußtechnik aufgebracht worden ist, wobei das organische Polymere hierauf adsorbiert oder hieran gebunden, entweder direkt oder indirekt, einen spezifischen Bindungspartner für den Liganden, den man nachzuweisen wünscht, enthält.
Der Lösungsmittelguß von Polymeren auf feste oder flüssige Oberflächen stellt eine wohlbekannte Technik dar, die von Mano und Durao, Journal of Chemical Education (1973), 50, 228, beschrieben wird. Der Artikel "On the Technique of Making Thin Celluloid Films" von James Taylor, veröffentlicht in Journal of Scientific Instruments für 1925 und 1926, Bd. 3, Seiten 400-404, beschreibt die Bildung von Celluloidfilmen mit einer Dicke in der Größenordnung von 50 nm auf einer Wasseroberfläche
Die erfindungsgemäß verwendete Lösungsmittelgußtechnik umfaßt die Bildung eines dünnen Polymerfilms auf einer flüssigen Oberfläche unter Verwendung eines Lösungsmittels, wobei man anschließend eine gegenseitige Bewegung zwischen der Oberfläche der optischen Struktur auf der der Film gebildet werden soll und dem dünnen Polymerfilm auf der flüssigen Oberfläche herbeiführt derart, daß sie in Kontakt gelangen. Die Dicke des Films auf der Flüssigkeitsoberfläche wird in hohem Ausmaß die Dicke des Films auf der Oberfläche der optischen Struktur bestimmen und die Dicke des Films auf der Flüssigkeitsoberfläche wird ihrerseits von der Menge und der Natur des verwendeten Polymeren, dem Flächeninhalt und der Natur der Gußflüssigkeit bestimmt (die Bezeichnung "Gußflüssigkeit", wie sie vorliegend verwendet wird, bezieht sich auf die Flüssigkeitsmenge auf deren Oberfläche der Polymerfilm gegossen wird). Somit kann man zum Beispiel einen Tropfen aus einem Kapillarrohr einer Mischung von 3 g Cellulosenitrat in 100 ml Amylacetat dazu bringen, daß er sich auf einer ausreichend großen Wasserfläche ausbreitet, um einen Cellulosenitratfilm von lediglich einigen wenigen Nanometern Dicke zu ergeben.
Die Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf eine bevorzugte Ausführungsform, bei der die optische Struktur ein Beugungsgitter ist, eingehender beschrieben. Es versteht sich jedoch, daß andere optische Strukturen, wie zum Beispiel optische Wellenleiter, optische Fasern und metallbeschichtete Prismen in der richtigen Konfiguration, um Oberflächenplasmonresonanz zu zeigen, sämtlich vom Bereich der Erfindung umfaßt werden.
Wie zuvor erwähnt, kann das Trägersubstrat eines Beugungsgitters Glas oder Kunststoffmaterial umfassen; Polycarbonat ist besonders bevorzugt. Das Beugungsgitter kann innerhalb der Oberfläche des Trägersubstrats gebildet werden, welches zum Beispiel mit einem Metallfilm wie Silber, Gold, Kupfer, Nickel oder Aluminium, gebildet durch ein Verfahren der Dampfabscheidung, Elektrobeschichtung, Sputtern, Beschichten, Anstreichen, Sprühen oder sonstiges, bedeckt werden. Vorzugsweise ist die Metalloberfläche in der Lage, die Oberflächenplasmonresonanz zu fördern und insbesondere besteht sie aus Silber, und der Metallfilm wird durch Vakuumabscheidung aufgebracht.
Soll das Beugungsgitter bei einer Art optischen Transmission verwendet werden, muß der Metallfilm ausreichend dünn sein, zum Beispiel bis zu 50 nm bei Silber derart, daß der Durchtritt des Lichts nicht übermäßig behindert wird. Soll das Beugungsgitter bei einer Art Reflexion verwendet werden, kann die Metallschicht dicker sein, beispielsweise bis zu 500 nm, vorzugsweise um 100 nm bei Silber, und vorzugsweise wird sie hinreichend dicht gemacht, um eine gut reflektierende Oberfläche auf dem Beugungsgittermuster in der Oberfläche des Trägersubstrats, zum Beispiel aus Kunststoff oder Glas, zu ergeben.
Eine bevorzugte Methode für das Aufbringen eines organischen Polymerfilms auf die Oberfläche eines metallisierten Beugungsgitters umfaßt die folgenden Stufen:
1. Das Einlegen eines metallisierten Polycarbonat-Beugungsgitters in ein die Gußflüssigkeit enthaltendes Bad, vorzugsweise deionisiertes destilliertes Wasser;
2. die Ausbildung eines dünnen Films des gewünschten Polymeren über der Oberfläche der Gußflüssigkeit; und
3. entweder das Anheben des Beugungsgitters durch die Gußflüssigkeit, um den Film des Polymeren auf der Oberfläche der Flüssigkeit einzubinden, oder das Ausfließenlassen der Gußflüssigkeit aus dem Bad derart, daß der Polymerenfilm auf der Oberfläche der Flüssigkeit mit dem Flüssigkeitsniveau abfällt, bis er eingebunden wird und sich über der Oberfläche des metallisierten Beugungsgitters ausbreitet, wobei in jedem Fall das Beugungsgitter in einem kleinen Winkel zur Horizontalen angeordnet ist, um das Ablaufen der Gußflüssigkeit von der Oberfläche des Beugungsgitters zu erleichtern.
Soll das Beugungsgitter als Biosensor wie vorstehend beschrieben verwendet werden, wird die Lösung des spezifischen Bindungspartners vorzugsweise während einer kontrollierten Zeitdauer und sofern geeignet unter kontrollierten Bedingungen hinsichtlich Temperatur, Druck, Feuchtigkeit und dergleichen mit dem Polymeren in Kontakt gelassen. Das Verfahren wird normalerweise unter "sauberen Raum"-Bedingungen durchzuführen sein und insbesondere wenn der Bindungspartner eine biologisch aktive Substanz ist, müssen sämtliche üblichen Vorsichtsmaßnahmen für die Handhabung derartiger Materialien ergriffen werden, um eine Verunreinigung und Denaturierung oder Inaktivierung auf irgendeine Weise zu vermeiden.
Jeglicher Lösungsüberschuß wird vorzugsweise aus der Polymeroberfläche entfernt und kann durch Absaugen oder Waschen zurückgewonnen und recyclisiert oder einfach als Abwasser abgewaschen werden.
Das fertiggestellte beschichtete Beugungsgitter kann getrocknet oder anderweitig behandelt und verpackt werden, wiederum im allgemeinen unter "sauberen Raum"-Bedingungen.
Techniken für die Bindung spezifischer Bindungspartner an festen Phasenträgern werden in der Literatur beschrieben. Der Bindungspartner kann an das Polymere entweder direkt oder indirekt gebunden werden. Die indirekte Bindung kann zum Beispiel dadurch bewirkt werden, daß man an das Polymere ein Reagens Y bindet, das selektiv mit einem Reagens Z, welches an dem spezifischen Bindungspartner vorgesehen ist, in Wechselwirkung tritt. In derartigen Fällen kann das Reagens Z beispielsweise derart sein, daß der spezifischen Bindungspartner gegenüber dem Reagens Y, welches in diesem Fall ein gegen Z gerichteter Antikörper sein wird, antigen wird. Z kann zum Beispiel Fluoresceinisothiocyanat, Rhodaminisothiocyanat, 2,4-Dinitrofluorbenzol, Phenylisothiocyanat oder Dansylchlorid sein. Die Reagentien Y und Z können alternativ ein spezifisches Bindungsprotein sein und der entsprechende Ligand ein solcher wie beispielsweise Avidin und Biotin.
Es ist ein erwünschtes jedoch nicht wesentliches Merkmal der Erfindung, eine kovalente Bindung des Bindungspartners an dem Polymeren zu schaffen.
Die Bindung des spezifischen Bindungspartners entweder direkt oder indirekt an das Polymere kann erleichtert werden, indem man die Polymerschicht aktiviert, um freie reaktive Gruppen für die Bindung zu schaffen. So kann zum Beispiel Cellulosenitrat durch Bromcyan in wäßriger Lösung mit einem bevorzugten pH von 10 bis 11 aktiviert werden. Typischerweise wird die Celluloseoberfläche mit der Bromcyanlösung während einer kontrollierten Zeitdauer typischerweise in der Größenordnung einiger weniger Minuten in Kontakt gelassen, während der pH innerhalb der vorstehend angegebenen Grenzen kontrolliert wird. Nach dieser Reaktion wird das Beugungsgitter aus der Bromcyanlösung entfernt und in kaltem destillierten Wasser gewaschen und hiernach gegebenenfalls getrocknet, und bis zum Aufbringen eines Bindungspartners hierauf, wie zum Beispiel eines Antikörpers oder eines antigenen Proteins, aufbewahrt.
Die Bindung eines spezifischen Bindungpartners an der aktivierten Polymeroberfläche kann zweckmäßig durchgeführt werden, indem man eine Lösung des spezifischen Bindungspartners mit der Polymeroberfläche derart in Kontakt bringt, daß wenn das Polymere durch Anbringen reaktiver Gruppen wie vorstehend beschrieben, aktiviert worden ist, der Bindungspartner anhaften kann an oder sich verbinden kann mit den reaktiven Gruppen an der Polymeroberfläche. Typischerweise können Tröpfchen der Lösung auf die Polymeroberfläche aufgebracht werden und während einer kontrollierten Zeitdauer (typischerweise in der Größenordnung einiger Stunden) in einer kontrollierten Umgebung (insbesondere einer hinsichtlich der Feuchtigkeit kontrollierten Umgebung, um eine Trocknung zu verhindern) und unter sauberen Raum-Bedingungen derart belassen werden, daß eine ausreichende Menge des Bindungspartners an die Oberfläche des Polymeren gebunden wird.
Jedoch kann die Verwendung von Bromcyan ungeeignet sein, wenn das an das Polymere zu bindende Material von einem Protein verschieden ist, wie zum Beispiel ein antigenes Polysaccharid.
Die Erfindung besitzt einen weiten Anwendungsbereich und kann lediglich als ein Beispiel beim Nachweis von Streptococcen- Bakterien der Gruppe A oder bakteriellem Antigen in Kinderkrankheiten verwendet werden. Es versteht sich jedoch, daß die beschichteten Beugungsgitter- und Biosensor-Diagnostik- Testvorrichtungen, die durch die Erfindung hergestellt werden, in keiner Weise auf eine derartige Anwendung beschränkt sind und für jeden diagnostischen Test eingesetzt werden können vorausgesetzt, der geeignete Bindungspartner wurde auf die Oberfläche des Beugungsgitters aufgebracht.
Die Erfindung wird nachstehend im einzelnen unter Bezugnahme auf einen Antikörper oder ein Antigen als spezifischer Bindungspartner oder Ligand beschrieben. Die Erfindung ist jedoch nicht dahingehend zu verstehen, daß sie auf Methoden für die Herstellung von Biosensoren beschränkt ist, die für die Verwendung in Antikörper- oder Antigen-Assays geeignet sind, sondern sie umfaßt in ihrem Bereich jegliche Sensoren, die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt wurden, welche für den Nachweis irgendeiner chemischen, biochemischen oder biologischen Species in einer Probe verwendet werden können. Beispiele für geeignete Bindungspartner, die an einer optischen Struktur, welche nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellt worden sind, immobilisiert werden können, und von Liganden, die nach der erfindungsgemäßen Methoden einem Assay unterzogen werden können, finden sich in nachstehender Tabelle I. Tabelle I
Ligand spezifischer Bindungspartner
Antigen spezifischer Antikörper
Antikörper Antigen
Hormon Hormonrezeptor
Hormonrezeptor Hormon
Polynukleotidstrang komplementärer Polynukleotidstrang
Avidin Biotin
Biotin Avidin
Protein A Immunoglobulin
Immunoglobulin Protein A
Enzym Enzym-Kofaktor (Substrat oder Inhibitor)
Enzym-Kofaktor Enzym (Substrat oder Inhibitor)
Lektine spezifisches Kohlenhydrat
spezifisches Kohlenhydrat Lektine der Lektine
Das erfindungsgemäße Verfahren besitzt eine breite Anwendbarkeit, kann jedoch insbesondere angewandt werden auf die Schaffung von Biosensoren, die für den Assay geeignet sind von: Hormonen einschließlich Peptid-Hormonen (z. B. "thyroid stimulating hormone (TSH), luteinising hormone (LH), human chorionic gonadotrophin (hCG), follicle stimulating hormone (FSH), insulin and prolactin)" und Nicht-Peptid-Hormonen (z. B. Steroidhormone wie Cortison, Estradiol, Progesteron und Testosteron, oder Schilddrüsenhormone wie Thyroxin (T4) und Trijodthyronin), Proteinen (z. B. carcinoembryones Antigen (CEA) und alpha-Fetoproten (AFP)), Wirkstoffen (z. B. Digoxin), Zuckern, Toxinen, Vitaminen, Viren, Bakterien oder Mikroorganismen.
Es versteht sich, daß sich die Bezeichnung "Antikörper", wie sie vorliegend verwendet wird, in ihrem Bereich umfaßt:
a) jede der verschiedenen Klassen oder Unterklassen des Immunoglobins, z. B. IgG, IgM, abgeleitet von irgendeinem der üblicherweise verwendeten Tiere, z. B. Schafen, Kaninchen, Ziegen oder Mäusen,
b) monoklonale Antikörper,
c) intakte Moleküle oder "Fragmente" von Antikörpern, monoklonal oder polyklonal, wobei die Fragmente diejenigen sind, die den Bindungsbereich des Antikörpers enthalten, z. B. Fragmente ohne den Fc-Teil (z. V. Fab, Fab', F(ab')&sub2;) oder die sogenannten "half-molecule"-Fragmente, welche durch reduktive Spaltung der Disulfid-Bindungen, die die Komponenten mit schwerer Kette in dem intakten Antikörper verbinden, erhalten werden.
Das Verfahren zur Herstellung von Fragmenten der Antikörper ist aus dem Stand der Technik wohlbekannt und wird vorliegend nicht beschrieben.
Die Bezeichnung "Antigen", wie sie vorliegend verwendet wird, ist in dem Sinne zu verstehen, daß sie sowohl permanent antigene Species (z. B. Proteine, Bakterien, Bakterienfragmente, Zellen, Zellfragmente und Viren) als auch Haptene, die unter geeigneten Bedingungen antigen gemacht werden können, umfaßt.
Die folgenden Beispiele beschreiben die Herstellung von Cellulosenitratfilmen und ihre anschließende Überführung auf Beugungsgitter und die Bindung oder Adsorption biologischer Materialien an der Oberfläche derartiger polymerbeschichteter Gitter.

Herstellung von Cellulosenitratfilmen und Überführung auf Beugungsgitter

Sämtliche Lösungen und Gußflüssigkeiten, die für die Herstellung von Polymerfilmen und ihrem. Transfer auf Beugungsgitter verwendet werden, sollten zur Entfernung verunreinigender Partikel filtriert werden und alle Maßnahmen sollten in einem sauberen Raum vorgenommen werden.
Bei einer bevorzugten Methode wird ein Gußtank der Art gewählt, daß die Fläche der Wasseroberfläche höher (um einen Faktor von 5 oder mehr) ist als die Fläche des zu bedeckenden Gitters. Dies stellt sicher, daß das Beugungsgitter nicht durch eine Kante des gegossenen Polymerfilms bedeckt wird. Benötigt man eine sehr dünne Polymerschicht, ist der Flächeninhalt des Gußtanks vorzugsweise ausreichend größer als die Fläche des gegossenen Films, um jeden "Kanteneffekt" zu vermeiden, zum Beispiel ist sie um den Faktor 5 größer. Für dickere Filme kann es jedoch bevorzugt sein, das Polymere in einem Ring auf der Oberfläche auf die Gußflüssigkeit, deren Fläche einfach für die Kontrolle der Dicke der Polymerschicht eingestellt werden kann, zu gießen.
Der Tank wird insbesondere zur Entfernung von Fett, oberflächenaktiven Mitteln oder anderen Verunreinigungen gereinigt, und ein Beugungsgitterträger wird am Boden des Tanks angebracht. Dieser Träger kann zum Beispiel ein Drahtgitter umfassen, das in einem kleinen Winkel zu der Horizontalen angebracht ist, damit Wasser zwischen dem gegossenen Film und dem Beugungsgitter abfließen kann, wenn die beiden in Kontakt gebracht werden.
Der Tank wird mit destilliertem Wasser gefüllt. Es kann vorteilhaft sein, ist jedoch nicht wesentlich, den pH oder die Ionenstärke dieses Wassers einzustellen, um eine gute Adhäsion des Polymerfilms an dem Beugungsgitter zu unterstützen. Der Wasserspiegel muß oberhalb der Oberfläche der Beugungsgitter, die auf dem Träger ruhen sollen, liegen.
Die Beugungsgitter werden auf den Träger vor oder nach Zugabe von Wasser mit der Gitterseite nach oben aufgebracht. Die Beugungsgitter sollten sauber und frei von Fett, oberflächenaktiven Mitteln oder anderen Verunreinigungen sein, bevor sie in den Gußtank gelangen.
Sobald sich die Wasseroberfläche beruhigt hat, wird ein Tropfen Cellulosenitratlösung, zum Beispiel Cellulosenitrat in Amylacetat, auf das Zentrum der Wasseroberfläche getropft. Vorausgesetzt, die Wasseroberfläche ist frei von oberflächenaktiven Mitteln, breitet sich die Cellulosenitratlösung zu einer gut definierten kreisförmigen Fläche aus und der Flüssigkeitsfilm trocknet innerhalb weniger Sekunden. Die Trocknungsgeschwindigkeit des Films kann kontrolliert werden, indem man den Gußtank mit einem Deckel bedeckt, der mit einer kleinen Öffnung im Zentrum versehen ist, durch die die Celluloselösung aufgebracht wird. Bei gleichmäßiger Filmdicke können reflektierte Lichtinterferenzfarben beobachtet werden, da der Film zunehmend dünner trocknet.
Ist die Wasseroberfläche nicht sauber, ist die Dicke des gebildeten Cellulosefilms nicht gleichmäßig und er breitet sich in einem nicht kreisförmigen Fleck mit sich nach außen erstreckenden "Fingern" aus. Die ungleichmäßige Filmdicke wird aufgrund der statistischen Verteilung von reflektierten Interferenzfarben sichtbar.
Eine Polymerfilmdicke von etwa 16 Nanometern wird durch Zusatz von 10 Mikrolitern einer 9 %igen Cellulosenitratlösung (9 g Cellulosenitrat in 100 ml Amylacetat) gebildet.
Sobald der Film getrocknet ist, fließt Wasser durch einen Abfluß am Boden des Tanks derart ab, daß der getrocknete Polymerfilm sich auf die Beugungsgitteroberfläche absenkt. Das Beugungsgitter und ihr Träger werden vorsichtig aus dem Tank entfernt und mehrere Minuten trocknen gelassen.
Wir fanden, daß die Adhäsion des Cellulosenitrats an den silberbeschichteten Polycarbonat-Beugungsgittern erhöht wird, indem man die Polymerfilme auf destilliertem Wasser gießt, dessen pH durch Zusatz beispielsweise von NaOH auf 9 eingestellt worden ist.
Die Verwendung irgendwelchen anderen Lösungsmittel-gießbaren Polymeren ist bei geeigneter Wahl der Lösungsmittel und Gußoberflächen möglich. Somit können zum Beispiel Celluloseacetatfilme aus Amylacetat, Polystyrol aus Xylol, Pplyisobutylen aus Petrolether und Polyvinylchlorid/Acetat-Copolymerfilme aus Cyclohexanon auf Wasseroberflächen gegossen werden. In einigen Fällen kann eine Zwangsausbreitung der Lösung auf der Gußflüssigkeit unter Verwendung üblicher Techniken notwendig sein.
Die Filmdicke kann durch sorgfältige Wahl von
- Polymerlösungskonzentration,
- Volumen des auf die Gußflüssigkeitsoberfläche aufgebrachten Materials,
- Lösungsmitteltyp
kontrolliert werden.
Zum Beispiel ist Amylacetat amphiphil und breitet sich rasch über einer reinen Wasseroberfläche aus. Andere Lösungsmittel können sich nicht so rasch ausbreiten, was eine Zunahme der Filmdicke zur Folge hat.
Die Technik ist nicht auf den Guß auf eine Wasseroberfläche beschränkt und es können auch andere Flüssigkeiten für die Gußoberfläche eingesetzt werden, vorausgesetzt, das verwendete Lösungsmittel ist in hohem Grade unmischbar mit der Gußflüssigkeit und die Polymer enthaltende Lösung besitzt eine geringere Dichte als die Gußflüssigkeit. So kann zum Beispiel Ethylcellulose auf Quecksilber gegossen werden, Diisocyanate zusammen mit Polyolen können auf Quecksilber ko-vergossen werden und Gelatine kann aus Wasser auf Tetrachlorkohlenstoff gegossen werden. Es ist auch möglich, dünne Polymerschichten unter Verwendung der Lösungsmittelgußtechnik herzustellen, um das Polymere auf einer festen Oberfläche zu gießen. So kann zum Beispiel Polyethylenterephthalat aus Trifluoressigsäure, Polycarbonat aus Methylenchlorid, Polyvinylformal aus Dioxan, Polysulfon aus Chloroform, Celluloseacetat aus Aceton gegossen werden, und Polypropylen kann aus Xylol gegossen werden, in jedem Fall auf einem geeigneten Substrat. Es versteht sich, daß beim Gießen des Polymeren auf eine Gußflüssigkeit die Gußflüssigkeit mit dem Material des hierin eingetauchten Beugungsgitters verträglich sein muß und wenn das Polymere auf eine feste Oberfläche gegossen wird, muß das Lösungsmittel, das verwendet wird, um das Polymere vor dem Gießen in Lösung zu bringen, mit dem Material der festen Oberfläche verträglich sein.

Bindung biologischer Materialien an die Polymeroberfläche

Drei verschiedene Methoden zur Kupplung biologischer Moleküle an eine Cellulosenitratpolymeroberfläche auf einem Beugungsgitter wurden in Betracht gezogen:
a) die kovalente Bindung
b) die nicht-kovalente Adsorption
c) die kovalente Bindung des biologischen Moleküls an ein Polymeres, das in dem Cellulosenitrat eingeschlossen ist.

a) kovalente Bindung

Es gibt erprobte Verfahren für die kovalente Bindung biologischer Materialien, wie von Proteinen, an Cellulosematerial. Veröffentlichte Verfahren umfassen die Verwendung chemischer Reagentien, die die Polymereinheit modifizieren, um reaktive Gruppen zu bilden, welche sich kovalent an typische Proteingruppen, wie zum Beispiel freie Aminogruppen, binden.
Üblicherweise verwendete chemische Reagentien umfassen:
- Bromcyan
- Tosylchlorid
- Titankomplexe
- Carbodiimid
- Cyanurchlorid
- Oxiran
- Perjodat.

b) nicht-kovalente Adsorption

Es zeigte sich, daß biologische Moleküle, zum Beispiel Schafserumproteine, Ribonukleasen und Immunoglobuline sich sehr wirksam am Cellulosenitrat binden. Die einfache Zugabe einer wäßrigen Proteinlösung bei Raumtemperatur oder geringerer Temperatur führte zu gebundenem Protein, das durch Waschen mit Wasser, Pufferlösungen oder Detergentien nicht leicht entfernt werden konnte.
Zum Beispiel führte die Inkubation eines Cellulosenitratbeschichteten Gitters während 2 Stunden bei Raumtemperatur in 10 mgml&supmin;¹ Rinder-γ-globulin, 50 mM NaHCO&sub3;, pH 9, zu einer übermäßigen Bedeckung des Beugungsgitters mit dem Protein. Verschiedene Behandlungen, wie zum Beispiel mit mildem Detergens (5 % Tween 20), Puffer (50 mM NaHCO&sub3;), n-Heptan, und bei einem zwischen pH 2 und 10,6 cyclisierebden pH beeinträchtigten nicht die Bindung des Proteins. Eine stärkere Detergensbehandlung (z. B. 2 % SDS) erwies sich als für den Cellulosenitratfilm schädigend.

c) Einschluß des reaktiven Polymeren

Dieses Verfahren trennt die beiden wichtigen Funktionen der Beugungsgitterschicht
- die Adhäsion und Anpassung an die Gitteroberfläche
- die Reaktivität gegenüber Protein oder anderen biologischem Material oder dem Bindungspartner
und genügt jedem Erfordernis mit einem separaten Polymeren.
Man läßt ein Monomermaterial in das an dem Beugungsgitter fixierte Polymer diffundieren. Das Monomer wird dann polymerisiert, um ein Netzwerk des zweiten Polymeren zu ergeben, das in dem ersten fixierten Polymeren verwickelt ist. Das zweite Polymere wird derart ausgewählt, daß es chemische Gruppen aufweist, die gegenüber Protein oder anderen biologischen Molekülen reaktiv sind.
So werden zum Beispiel Beugungsgitter, die mit Cellulosenitrat nach dem vorliegend beschriebenen Verfahren beschichtet sind, mit 1 %iger wäßriger Glutaraldehyd-Monomerlösung, pH 5,5, 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Der pH wird dann auf 10 eingestellt und die Beugungsgitter 30 Minuten belassen, um eine Polymerisation des Glutaraldehyds zu ermöglichen. Die Polymerisation kann durch optische Messungen der dekadischen Extinktion bei 235 nm überwacht werden. Solche Techniken wurden bereits beschrieben, siehe beispielsweise US-4 001 583. Frei-reaktive Carbonylgruppen in dem Polyglutaraldehyd werden somit an der Oberfläche der Polymerschicht freigelegt.
Die Behandlung dieser Beugungsgitter mit Proteinlösungen, zum Beispiel 5 mgml&supmin;¹ Rinder-γ-globulin oder 5 mgml&supmin;¹ Ribonuklease bei 4 ºC über Nacht in 50 mM NaHCO&sub3;, pH 9, führt zu einer starken Bindung zwischen dem Protein und dem Polyglutaraldehyd, was vermutlich das Resultat der kovalenten Bindung zwischen den Polyglutaraldehydcarbonylgruppen und den Aminogruppen der Proteine ist.

Claims

1.) Verfahren zur Behandlung der Oberfläche einer optischen Struktur, das die Bildung einer dünnen Schicht eines organischen Polymeren unter Verwendung einer Lösungsmittelgußtechnik umfaßt, wobei die Lösungsmittelgußtechnik die Bildung eines dünnen Films des Polymeren auf einer Flüssigkeitsoberfläche unter Verwendung eines Lösungsmittels und die anschließende Herbeiführung einer gegenseitigen Bewegung zwischen der Oberfläche der optischen Struktur, auf der der Film ausgebildet werden soll, und dem dünnen Polymerfilm auf der Flüssigkeitsoberfläche beinhaltet, derart, daß sie in Kontakt gebracht werden.

2.) Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die optische Struktur einen Teil einer Vorrichtung für den Nachweis eines Liganden bildet, wobei das besagte Verfahren weiterhin die Adsorption oder die Bindung an dem organischen Polymeren entweder direkt oder indirekt eines spezifischen bindenden Partners für den Liganden, den man nachzuweisen wünscht, umfaßt.

3.) Verfahren gemäß Anspruch 2, worin der spezifische bindende Partner ein Antigen oder ein Antikörper ist.

4.) Verfahren gemäß Anspruch 2 oder 3, worin das organische Polymere vor dem in Kontaktbringen mit dem spezifischen bindenden Partner aktiviert wird, wodurch die Bindung des spezifischen bindenden Partners an das organische Polymere erleichtert wird.

5.) Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, worin der spezifische bindende Partner ein Antikörper ist, welches das Aufbringen dieses Antikörpers auf zumindest einen getrennten Bereich der organischen Polymeroberfläche, derart, daß ein oder mehrere Testbereiche gebildet werden, und das Aufbringen auf zumindest einen anderen getrennten Bereich der Polymeroberfläche, derart, daß ein oder mehrere Bezugsbereiche gebildet werden, eines Proteins, umfaßt, das keinen Liganden, der in der zu untersuchenden Probe vorhanden sein kann, spezifisch bindet.

6.) Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die optische Struktur ein Beugungsgitter ist.

7.) Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Polymere Cellulosenitrat ist.

8.) Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Polymerschicht 5 bis 100 Nanometer dick ist.

9.) Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, worin die Oberfläche der optischen Struktur einen Metallfilm umfaßt.

10.) Verfahren gemäß Anspruch 9, worin der Metallfilm in der Lage ist, einer Oberflächenplasmonresonanz standzuhalten.

11.) Verfahren gemäß Anspruch 10, worin das Metall Silber ist.

12.) Verfahren gemäß Anspruch 1 zum Aufbringen eines organischen Polymerfilms auf die Oberfläche eines metallisierten Beugungsgitters, umfassend die folgenden Stufen:

i) das Einlegen eines metallisierten Polycarbonatbeugungsgitters in ein die Gußflüssigkeit enthaltendes Bad,

ii) die Ausbildung eines dünnen Films des gewünschten Polymeren über der Oberfläche der Gußflüssigkeit, und

iii) entweder das Anheben des Beugungsgitters durch die Gußflüssigkeit, um den Film des Polymeren auf der Oberfläche der Flüssigkeit einzubinden, oder das Ausfließen lassen der Gußflüssigkeit aus dem Bad, derart, daß der Polymerenfilm auf der Oberfläche der Flüssigkeit mit dem Flüssigkeitsniveau abfällt, bis er eingebunden wird und sich über der Oberfläche des Beugungsgitters ausbreitet, wobei in jedem Fall das Beugungsgitter in einem kleinen Winkel zur Horizontalen angeordnet ist, um das Ablaufen der Gußflüssigkeit von der Oberfläche des Beugungsgitters zu erleichtern.

13.) Biosensor für einen Ligandennachweis, der das Produkt eines Verfahrens gemäß Anspruch 2 ist.

14.) Biosensor gemäß Anspruch 13, worin die optische Struktur ein Beugungsgitter ist.

15.) Verfahren zum Nachweis eines Liganden in einer Probe, welches das in Kontaktbringen der Probe mit einem Biosensor gemäß Anspruch 13 oder 14 und die Bestimmung, ob, und gewünschtenfalls des Ausmaßes, in dem, und/oder der Geschwindigkeit, mit der ein optisches Merkmal des Biosensors durch Bildung eines Komplexes zwischen dem Liganden und dem spezifischen bindenden Partner verändert wird, umfaßt.