DE2738183A1 - Laenglicher hohler behaelter fuer immunochemische und enzymatische methoden - Google Patents
Laenglicher hohler behaelter fuer immunochemische und enzymatische methodenInfo
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- DE2738183A1 DE2738183A1 DE19772738183 DE2738183A DE2738183A1 DE 2738183 A1 DE2738183 A1 DE 2738183A1 DE 19772738183 DE19772738183 DE 19772738183 DE 2738183 A DE2738183 A DE 2738183A DE 2738183 A1 DE2738183 A1 DE 2738183A1
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Description
Die Erfindung betrifft Behälter, zum Beispiel Reagenzrohrchen,
die für Festphasen-immunchemische
und enzymatische Bestimmungen geeignet sind. Die Erfindung
betrifft weiterhin die Herstellung von solchen Behältern und
ihre Verwendung bei derartigen Methoden« Die erfindungsgemäßen Behälter sind besonders gut für Festphasen-Badioimmunoassay-Methoden
geeignet.
Es sind bereits zahlreiche Festphasen- -- immunchemische Methoden bekannt. So wird ?.um Beispiel
das verwendete biologisch aktive Reagens vor der Immunreaktion unlöslich gemacht, indem es an einen unlöslichen Träger angeheftet
wird« Dies geschieht beispielsweise durch physikalische Adsorption, durch kovalente Vernetzung oder durch kovalente Bindung. Im Falle eines Radioimmunoassay (RIA) wird ein Antikörper
vor der Umsetzung mit dem markierten und nicht markierten Antigen unlöslich gemacht.
Beispiele für verschiedene Reagensrohrchen als
- unlösliche Trager sind in den US-Patentschriften 3 721 528,
3 888 629, 3 768 979, 3 615 222, 3 865 ί>ί>2, 3 867 517 und
3 938 953 beschrieben. In diesen Patentschriften werden Rohrchen,
auch zweiteilige Rohrchen beachrieben, die mit verschiedenen biologisch aktiven Bubstanzen, wie Antigenen oder
Antikörper, beschichtet sind. Unlösliche Teilchen als Träger werden in den US-Patentschriften 3 f?5i 5!;5, 3 639 558 und
3 553 310 beschrieben. So beschreibt die US-PS 3 551 555 Polymerteilchen, die mit einem inerten Protein beschichtet sind,
an dem eine biologisch aktive Substanz adsorbiert ist. In der US-PS 3 553 310 werden Polymerteilchen beschrieben, die mit
einem inerten Protein beschichtet sind, an das eine biologisch aktive Substanz mittels eines Aldehyds angekuppelt ist. In der
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O 'J
υ >
Jo
US-Patentschrift 3 639 558 werden Polymerteilchen beschrieben,
an die ein inertes Protein angekuppelt ist, an das seinerseits die biologisch aktive Substanz angekuppelt IbI-. Ein Beispiel
eines Objektträgers und einer mikroporösen Membran wird in der US-Patentschrift 3 666 421 und in der deutschen Patentschrift
25 39 657 beschrieben. Schließlich werden in lon US-Patentschriften
3 555 143, 3 857 931, 3 914 400, 3 826 61% 3 793 445,
3 949 064, 3 646 346, 3 853 987» 3 708 572 und 3 714 345 verschiedene
Polymere und Kupplungsmittel beschrieben.
denen ein biologisch aktives Reagens verwendet; wird, das an
einen unlöslichen Träger angefügt ist, wurden deswegen entwikkelt,
um die Abtrennung des freien Antigens von dem an den
Antikörper gebundenen Antigen zu vereinfachen, Einige der derzeit
verfügbaren Reagent!en haben jedoch noch einige Nachteile,
beispielsweise zu viele Handhabungsstufen, sowie eine schlechte Reproduzierbarkeit und/oder Empfindlichkeit.
Festphasen-r immun-chemischen Methode, die eine
rasche Trennung ergibt und die genau,empfindlich und reproduzierbar
ist.
Gegenstand der Erfindung ist ein lunglicher, hohler Behälter für immun-chemische und enzymatischη Methoden, der dadurch
gekennzeichnet ist, daß er (a) ein unteres reaktives Teil aus einem polymeren Material, wobei das Teil an oinem Ende abgeschlossen
ist und wobei mindestens ein Teil seiner Innenoberfläche mit einem überzug eines inerten Proteine versehen ist,
an das eine biologisch aktive Substanz angefügt ist, und (b) ein abtrennbares, inertes oberes Teil, das au das untere Teil
angeschlossen ist und mit diesem in Verbindung steht, enthält.
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Die Verwendung dieses Behälters bei immun-chemischen Methoden ergibt eine einfache, leicht durchführbare Methode,
die genau,empfindlich und reproduzierbar ist. Die abtrennbaren
bzw. voneinander trennbaren Teile ergeben eire leichte und gleichförmige Herstellbarkeit. Der im wesentlichen gleichförmige
Überzug eines inerten Proteins aul einer kontinuierlichen
Oberfläche ergibt bei immun-chemischen Methoden eine verläßlichere und genauere Bestimmungs- oder Testmethode. Der Überzug
aus dem inerten Protein ermöglicht es, die biologisch aktive Substanz wirksam zu verwenden. Das inerte Protein stabilisiert
die biologisch aktive Substanz und erhöht ihre Aktivität. Es ergibt auch eine Oberfläche mit konstanten Eigenschaften.
Venn die biologisch aktive Substanz durch eine kovalente Bindung angefügt ist, dann kann die angefügte Menge erhöht werden. Die Eontrolle einer kovalenten Bindung der biologisch
aktiven Substanz an den Überzug aus dem inerten Protein ist leichter als bei anderen Anfügungsmethoden. Weiterhin wird
ein Ausbluten oder Auslaugen der biologisch aktiven Substanz in das Reaktionsgemisch durch die kovalente Bindung vermindert,
wodurch die Genauigkeit und Reproduzierbarkeit der immun-chemischen
Methode erhöht wird*
Durch die Erfindung wird weiterhin ein länglicher, hohler Behälter in Betracht gezogen, der dadurch gekennzeichnet
ist, daß er (a) ein unteres reaktives Teil aus einem polymeren Material, wobei das Teil an einem Ende abgeschlossen ist, und
wobei mindestens ein Teil seiner inneren Oberfläche und seiner äußeren Oberfläche mit einem inerten Protein beschichtet ist,
an das eine biologisch aktive Substanz angefügt ist, und (b) ein abtrennbares inertes oberes Teil, welches an das untere
Teil angeschlossen ist und mit diesem in Verbindung steht, enthält.
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Die Erfindung; bezieht eich weiterhin auf ein Verfahren
zur Herstellung solcher Behälter und zwar insbesondere auf ein technisches Herstellungsverfahren davon.
Die Erfindung richtet »ich weiterhin auf die Verwendung;
dieser Behälter für enz.ymat.leche raid immun-chemische Methoden,
insbesondere HIA-Metho&er*..
Das untere reaktive Teil des Behälters gemäß der Erfindung besteht aus einem polymeren Material oder aus polymeren
Katerialien. Geeignete polymere Materialien, die zur Herstellung
des unteren reaktiven Teils verwendet werden können, sind dem Fachmann bekannt. Fr handelt sich hierbei typischerweise um solche
polymere Materialien, die wasserunlöslich sind, eine niedrige Affinität für die angeheftete biologisch aktive Substanz haben
und die dazu imstande sind, verformt zu werden. Beispiele für solche Materialien sind organische Polymere, wie Kohlenwasserstoffpolymere,
zum Beispiel Polystyrol, Polyäthylen, Polypropylen, Polybutylen, diazotierten Polystyrol, Butylkautschuk und
andere Synthesekautschuke. Andere geeignete Polymere sind Polyester, Polyamide, Cellulose, Cellulosederivate, Acrylate, Methacrylate
und Vinylpolymere, wie zum Beispiel Polyvinylchlorid
und Polyvinylidenchlorid. Weitere geeignete Polymeren sind zum Beispiel Copolymere, wie substituierte Pfropf-Copolymere von
Polystyrol und Polytetrafluoräthylen. Es kann auch Glas verwendet
werden, typischerweise ein Glas, wie es für Beagenzrohrchen
und Laborgeräte verwendet wird. Aufgrund ihrer guten Verfügbarkeit im Handel und ihrer leichten Verarbeitbarkeit sind Copolymere
aus Äthylen und Acrylsäure besonders gut geeignete Polymere. Solche Copolymere enthalten typischerweise etwa 80 bis 97 Mol-%
Äthylen und etwa 3 bis 20 Mol-% Acrylsäure. Weitere bevorzugte
Polymere sind zum Beispiel Copolymere von Acrylsäure und Acrylamid, Methylmethacrylat und Acrylamid, Methylmethacrylat und
Methacrylamid und Methylmethacrylat und Acrylamid.
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Vorzugsweise liegt dan untere reaktive Teil in Form eines herkömmlichen Heagenzi-öhrchens vor» das bei immun-chemischen
Methoden verwendet wird. Die Lange des unteren reaktiven
Teils kann jede geeignete Große haben. Im allgemeinen ist das Teil so lang t wie es «x'forderl loh ietv daß die benotigte Menge
der biologisch aktiven Substanz der jeweiligen immun-chemischen oder mderen Testmethorl·,· «rna.! lea wird. Im allgemeinen beträgt die la
etwa 10 na bis 50 mm, vorzugsweise etwa 15 mm bis 25 mm und optimal
etwa fo <b». Di!/· Oavchmf.HBev beträgt etwa 5 mn bis 20 am,
vorzugsweise 10 bis 20 mm und optimal etwa 12 mm. Ein unteres
reaktives Teil, daß eine Länge von etwa 20 mm und einen Durchmesser
von etwa 12 mm hat, hat eine Kapazität von etwa 1,2 ml·
Naturgemäß hängt die Kapazität tron der Länge und dem Durchmesser
dee unter et Tf: Mis at>
Öle Anwendung de» unteren reaktiven Teils
führt zu einer erleichterten Herstellung. Dazu kommt noch, daß weniger tf:Uirstoft λ\Ά vf-.nißi.r· Einrichtungen benotigt werden.
Schließlich kann das untere reaktive Teil aus dem Polymeren hergestellt werden, das zum Beschichten und zur Anheftung der biologisch
aktiven Substanz am vorteilhaftesten ist, und das inerte obere Teil icann vorteilhaft erweise au3 Polypropylen oder Polyäthylen
gebildet werden, die beWe starr, leicht bearbeitbar
und relativ billig sind»
An das reaktive Bodenteil ist gemäß der Erfindung ein inertes Protein angeheftet. Unter der Bezeichnung "inertes Protein"
soll ein Protein verstanden werden, das an der immun-chemie
then Reaktion nicht teilnimmt und das die biologische Substanz
nicht nachteilig beeinflußt. Geeignete Proteine sind dem Fachmann bekannt. Beispiele hierfür sind proteinhaltige Materialien,
wie Serumalbumine oder Globulinev die aus verschiedenen
Tierarten erhalten worden sind, oder die andere gleichförmige Materialien seiix können^
Besonders bevorzugt werden Biuder-Gammaglobulin und
Gelatine, die leicht verfugbar sind. Zweckmäßigerweise sollte
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das verwendete proteinhaltige Material genügend homogen sein«
daß durch dessen Verwendung eine im wesentlichen kontinuierliche Oberfläche erhalten werden kann. Eine solche Oberfläche
ist mit den obigen Proteinen leicht erhältlich.
Ein weiter Bereich von biologisch aktiven Substanzen kann an das inerte Protein angefügt werden. Solche Substanzen
sind zum Beispiel Antigene und Antikörper mit immunologischen Eigenschaften sowie Enzyme mit enzymatischen Eigenschaften
.
Antigene können als Substanzen definiert werden, die
im Tier die Bildung eines Antikörpers stimulieren und die sich in beobachtbarer Weise mit diesem Antikörper umsetzen können.
Antigene haben im allgemeinen ein hohes Molekulargewicht von 10 000 oder mehr. Ein Hapten ist eine Substanz mit niedrigem
Molekulargewicht, die für sich selbst keine Antikörperreaktion provozLaen kann, die aber, wenn sie chemisch an eine hoch molekulare Substanz, zum Beispiel ein Protein, angekuppelt ist, eine
solche Antikörper reaktion hervorrufen kann, wobei das Hapten sich
mit dem resultierenden Antikörper umsetzen kann. Eine genauere Beschreibung von Antigenen wird beispielsweise in "Principles
of Immunology, Rose, Milgram and van Oss, Herausgeber MacMillan
Publishing Co., New Tork, N.Y. 1973" gegeben..
Als Reaktion auf eine Injektion von Antigenen erzeugt der Körper eines Tieres spezifische Antikörper, die sich mit
den Antigenen umsetzen und diese neutralisieren. Antikörper werden als Proteine mit der Löslichkeit von Globulinen klassifiziert.
Ihr Molekulargewicht fällt prinzipiell in zwei Gruppen, nämlich von ungefähr 160 000, die als normale Globuline bezeichnet
werden, und von 1 000 000, die als Makroglobuline bezeichnet werden. Bei den meisten Tierarten herrscht der Typ mit dem niedrigen
Molekulargewicht vor. Schwere Antikörper werden bei Pfer-
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/sr
den, Kühen und Schweinen, die mit Pneumokokken immunisiert
worden sind, sowie in Kaninchen, die mit roten Blutzellen von Schafen immunisiert worden sind, erzeugt. Das Molekulargewicht
der Antikörper unterscheidet sich nicht signifikant von den Molekulargewichten von Globulinen in normalen Seren von verschiedenen
Arten. Von besonderer Wichtigkeit wind die Globuline, die aus einer kontinuierlichen Beine von Proteinen mit
unterschiedlichen physikalischen und chemischen Eigenschaften und mit sich überlappenden biologischen Aktivitäten bestehen.
Sie zeigen weite Schwankungen der elektrophoretischen Mobilität
und sie werden über einen erheblichen Bereich von Elektrolytkonzentrationen ausgesalzt. Bei der Fällungsip.ethode mit Alkohol
ergeben sie viele Fraktionen. Sie haben Sediwentationskonstanten
von 7S bis 2OS (Svedberg-Einheiten).
Typische Antikörper, die an das inerte Protein angeheftet
werden können, sind zum Beispiel solche gegen die Heptene Bigoxin, Trijodthyronin (T3), Thyroxin (T4·), TSH, Angiot
ens in, Human-Choriongonadotropin und Insulin, die verschiedenen
biologisch aktiven Steroide, die Gallensäuren, andere Polypeptidhormone,
Enzyme und Isoenzyme sowie pharmakoLogisch aktive Substanzen,
wie Arzneimittel, mit denen Mißbrauch getrieben wird, sowie solche, die für die Therapie und für andere Zwecke verwendet werden
Enzyme, die an das inerte Protein angefügt werden können, sind zum Beispiel Diastase, Glucoseoxidase, Urease, Maltase,
Amylase, Peroxidase und andere Enzyme und Coenzyme.
Die unteren reaktiven Teile des Behälters werden erfindungsgemäß dadurch hergestellt, daß man (a) die Oberfläche
eines unteren reaktiven Teils unter Adsorptions-Bedingungen mit einem inerten Protein durch Adsorption beschichtet, (b) an
den überzug aus dem inerten Protein des unteren reaktiven Teils von (a) unter Kopplungs-Bedingungen , eine biologisch aktive Sub-
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to
stanz anheftet, (c) den unteren reaktiven Teil von (b) bei
dem die biologisch, aktive Substanz an den überzug des inerten
Proteins angeheftet ist, mit eines· Stabilisierungsmittel behandelt, um die biologisch aktive Substanz gegenüber einer
Denaturierung zu stabilisieren und daß man (d) das reaktive TeiD (c) bei Trocknungsbedingirageti, die keine wesentliche Denaturierimg
der biologisch aktiven Bubstanz hervorrufen, trocknet. Die erflndungsgemäßen Behälter werden sodann dadurch hergestellt,
daß man das inerte obere Teil an das untere reaktive Teil anfügt.
Die verwendete Menge des inerten Proteins, die optimale Ergebnisse liefert, hängt von der Natur des inerten Proteins,
dem reaktiven Teil und den biologischen Substanzen ab. Im Einzelfall ist die jeweilige Menge leicht durch orientierende
Vorversuche zu bestimmen. In typischer Weise wird nur ein dünner Film, zum Beispiel mindestens eine Schicht mit Moleküldicke des
Proteins an die Oberfläche angeheftet. Im allgemeinen handelt
es sich hierbei bereits um eine genügende Menge, um einen gleichformigen
überzug zu erhalten, an den die biologisch aktive Substanz angeheftet werden kann.
Das inerte Protein kann ohne weiteres an die Oberfläche durch beispielsweise Sprühen, Einweichen oder dergleichen unter
Bildung eines Überzugs aufgebracht werden. Vorzugsweise geschieht die Aufbringung in der Weise, daß man das reaktive Bodenteil in
eine wässrige Losung des inerten Proteins, vorzugsweise eine wässrige
Pufferlosung bei BeSchichtungsbedingungen eintaucht. Hierbei
wird das Protein an der Oberfläche des reaktiven Bodenteils adsorbiert. Es 1st vorteilhaft, wässrige Phosphatpufferlösungen
zu verwenden. Solche Puffer werden im allgemeinen dadurch hergestellt, daß man Dikaliumhydrogenphosphat und Kaliumdihydrogenphosphat
verwendet. Die dem gewünschten Pg-Wert entsprechenden
Mengen werden in Wasser aufgelost und der p^-Vert wird erforderlichenfalls
mit KOH oder HCl eingestellt. Gewünschtenfalls kann
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ein bakteriostatisehee Mittel, \xm las Wachstum von Mikroorganismen
zu inhibieren, zu der Pufferlösung zugesetzt werden, zum Beispiel Natriumazid oder Thimer»aal.
Das inerte Protein wird Lei Adsorptions-Bedingun
gen aufgebracht , die keine Denet.urierung des Proteins ergeben«
Im Einzelfall uäa$en din p^ und 1 eiuperaturbedingungen von
dem jeweiligen inerten Protein ab=. Adsorptions- Bedingungen sind zum Beispiel bekömmliche p^Weite, zum Beispiel von etwa
3 bis 10, and Umgebungstemperaturen, zum Beispiel von etwa 20
bis 300G. Obgleich auch bei höheren Aufbringungstemperaturen,
beispielsweise von nur- 40C oder ervgar bei 50°C, gearbeitet werden
kann, ergibt sich hierdurch kein signifikanter Vorteil. Im allgemeinen werden bei !Temperaturen von mehr als 5*;°C
die Proteine denaturiert» Andererseits ist bei Temperaturen unterhalb vou '40C das Protein uchwieng aufzubringen«. So wird zum Beispiel
Binder-Gammaglobulin im allgemeinen bei einem p^-Vert von
5 bis 7« optimal von 6,4 bei Baumtemperatur aufgebracht.
Um die Auftrdngung des inerten Proteins zu erleichtern,
kann die Oberfläche des unteren reaktiven Teils vor der Aufbringung
mit verschiedenen Materialien behandelt werden, um die Adsorption des inerter* Proteins zu verstärken. Solche Materialien
sind zum Beispiel Losungsmittel, Netzmittel, Säuren oder Basen·
Netzmittel, vorteilhafterweise Natriumdodecylsulfat,
werden alu Uetergens verwendet» um die Überfläche zu säubern
und sie benetzbar zu machen. Venn die Polymeren Carboxylgruppen auf der Oberfläche enthalten, dann ist es oftmals zweckmäßig,
sie mit einer salzbildenden Base, zum Beispiel EOH, zu behandeln, um sie in die Salzform umzuwandeln. Auf diese Weise wird
den Polymeren eine negative Ladung verliehen, die eine erhöhte
elektrische Anziehung ergibt, wodurch die Adsorption weiter verstärkt wird. Die Base trägt auch dazu bei, die Oberfläche zu säu-
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bem. Es kann weiterhin vorteilhaft ,ie Ui. (LLe Ladungsverteilung
auf der Oberfläche gleich derjenigen des inerten Proteins zu machen, das aufgetragen werden jot.l , Die β kann beispielsweise
dadurch geschehen, daß man die Oberfläche vor dem Beschichten mit einer wässrigen Pulieriöeung wuscht, welche etwa
den gleichen yj.-WeTt hai, wif <1<? '^BChiehtutigalösung, die das
inerte Patella enthält.
Die biologisch aktive Substanz kanti durch alle beliebigen
geeigneten Maßnahmen augeheftet werden. Solche bekannte geeignete Maßnahmen sind sum Beispiel die Adsorption, die kovalentfc
Bindung> die J,on1.e«he Bindung und dan Einfangen. Es
wird bevorzugt, die biologisch aktive Substanz durch eine kovalente
Bindung anzuheften, da o*j Ln diesem Falle leichter ist,
die Kopplunpereaktlop zu Vo nt ro Π.leren, and das Produkt stabiler
ist.
Methoden zur chemischen, d.h. kovalenten, Bindung von
biologisch aktive« Substanzen a»; Inerte Proteine werden beispielsweise
in den US-Patentschriften 3 553 310 und 3 639 558 beschrieben, auf die! öuudrückllti» itezug genommen wird. Bei einer
bevorzugten Methode der kovalenten Bindung der biologisch aktiven Bubstanz an <laa inerte Protein geht man eo vor, daß man zunächst
das Protein mit einem Aldehyd·.Kopplungsmittel behandelt
und sodann die biologisch aktive Substanz bei solchen Bedingungen aufbringt, di»>
es gestatten, laß sich der Aldehyd kovalent sowohl mit dem inerten Protein als auch mit der biologisch aktiven
Substanz verbindet > Geeignete Aldehyd-Kopplungsmittel sind zum Beispiel solche, die eine χ,β-Unsättigung (äthylenisch) und/
oder eine Vielzahl von Aldehydgruppen haben. Es wird bevorzugt, ein Aldehyd aus der Gruppe oGβ-ungesättigter Aldehyde, Dialdehyde
oder Gemische davon zu verwenden, um Aldehydreaktionsprodukte mit dem überzug aus dem inerten Protein zu bilden. Die OC,ßungesättigten
Aldehyde können Verbindungen mit der allgemeinen
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Formel
ι1 ι2 ι ·
H-C-C-C-H
sein, worin R^ oder P2 unabhängig vone5nander für Wasserstoff
oder eine Methylgruppe stehen. Repräsentative Beispiele für diesen Typ von Aldehyd sind Acrolein, Methacrolein und 2-Butenal.
Es können auch Dialdehyde verwendet werden, wie zum Beispiel
Glutaraldehyd, Propandial und Butandial.
Venn einer dieser Aldehyde mit der Oberfläche des inerten Proteins in Berührung gebracht wird, dann wird das Protein
stabilisiert und durch Vernetzung polymerisiert. Die aktiven Aldehydgruppen werden an die Oberflächen fixiert. Bei diesen Gruppen handelt es sich vermutlich um üarbonylgruppen, die
als solche gegenüber den Amingruppen von biologisch aktiven Substanzen hoch reaktiv sind, da sie kovalente Bindungen zwischen
den Proteinteilchen und den biologisch aktiven Substanzen bilden.
Alternativ zu den Aldehyden können auch andere Kapplungematerialien
verwendet werden, zum Beispiel Verbindungen, die zwei oder mehrere der folgenden reaktiven Gruppen haben:
Azo-, Sulfonsäure-, durch Nitrogruppen aktivierte Fluor-, Azid-, Imin- und reaktive Chlorgruppen, die mit einem Hing mit geeigneter
Resonanzstruktur verbunden sind. Diese reaktiven Gruppen sind dazu imstande, sich mit den primären Amino-, Sulfylhydryl-,
Carbonsäure-, Hydroxyl- und Phenolgruppen von Substanzen, die das inerte Protein bilden, sowie von biologischen Substanzen,
die angekoppelt werden sollen, umzusetzen.
Beispiele für solche Kopplungsmittel sind Bisdiazobenzidindisulfonsäure,
Tetraazo-p-phenylendiamin, Difluordinitrobenzol, Difluordinitrophenylsulfon, Carbodiimide, Toluol-
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ίο
diieocyanat, Cyanurchlorid, Dichlortriazin und H-t-Butyl-5-methylisoxazoliumperchlorat.
Geeignete Carbodiimide sind zum Beispiel !!,H-Dicyclohexylcarbodiimid, 1-.X.thyl-3-(3-dimethylamino-propyl)-carbodiimidhydrochlorid
und 1~Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-(4-)-äthylcarbodiimid)-metho-p-toluolsulf
onat ·
Alternativ können die oben genannten biologisch aktiven Substanzen auch durch Adsorption nach der in der US-FS
3 551 555 beschriebenen Methode angeheftet werden.
Die bei dem bevorzugten Verfahren gemäß der Erfindung verwendete Menge des Kopplungsmittels hängt von dem jeweiligen
inerten Protein und der jeweiligen anzukoppelnden biologisch aktiven Substanz ab. Diese Menge kann im Einzelfall
durch einige orientierende Vorversuche ohne weiteres bestimmt werden. Typischerweise handelt es sich um eine Menge, um das
inerte Protein zu vernetzen und um genügend Stellen zu schaffen, daß an das inerte Protein eine genügende Menge der biologisch
aktiven Substanz angek ppelt wird, um die gewünschte immun-chemische
oder enzymatische Methode durchzuführen. Im Falle von
Aldehyden handelt es sich im allgemeinen um Mengen von 0,1 bis etwa 10 % (Gew./Vol.), vorzugsweise etwa 1 bis etwa 2 % (Gew./Vol.)
Typischerweiee wird das Kopplungemittel in einer wässrigen Pufferlösung aufgebracht und zwar am besten in einem Phosphatpuffer,
der andere Bestandteile enthalten kann, zum Beispiel Antioxidantien und bakteriostatische Mittel. Bas K pplungsmittel
kann bei jedem beliebigen geeigneten pg-Vert, beispielsweise von etwa 3 bis etwa 10, aufgebracht werden.
Das Kopplungsmittel kann geeigneterweise bei Baumtemperatur aufgebracht werden. Es kann zwar auch bei niedrigeren
Temperaturen gearbeitet werden, zum Beispiel bei nur A-0C, doch
ergeben Temperaturen unterhalb A-0C keinerlei signifikante Vor-
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teile. Andererseits kann zwar auch bei höheren Temperaturen,
zum Beispiel bis zu 3O0C, gearbeitet werden, doch ergeben solche
Temperaturen ebenfalls keinerlei signifikante Vorteile. Im Falle von Aldehyden beträgt der pH-Wert im allgemeinen etwa
6 bis 8 und die Temperatur beträgt im allgemeinen etwa 20 bis 30°C.
Um die Anheftung des Kopplungsmittels an das inerte
Protein zu erleichtern, wird das Protein vorteilhafterweise mit
dem gleichen Puffer, jedoch ohne das Kopplungsmittel, vor der Behandlung mit dem Puffer gewaschen, der das Kopplungsmittel
enthält. Da das Kopplungsmittel beim p^-Vert der Pufferlosung
am stabilsten ist, ergibt dieser Vaschvorgang eine Umgebung, die für die Stabilität des Kopplungsmittels am geeignetsten ist.
Die erfindungsgemäß verwendete Menge der biologisch aktiven Substanz hängt im Einzelfall von der Natur des inerten
Proteins und der biologisch aktiven Substanz ab. Die Mengen können
im Einzelfall durch einige orientierende Vorversuche leicht ermittelt werden. Typischerweise handelt es sich um eine ausreichende
Menge, um die in Betracht gezogene Beetimmungs- oder Analysenmethode
durchzuführen. So beträgt beispielsweise im Falle eines bestimmten DigoxLnantiserums die Verdünnung (d.h. Teile
des Antiserums, das den Antikörper enthält/Teile der Behandlungelösung)
etwa V300 000bis etwa V360 Q00, vorzugsweise V325
i / 000*
Die biologisch aktive Substanz wird vorteilhafterweise in wässriger Lösung, vorzugsweise in einer wässrigen Phosphatpufferlösung,
aufgebracht. Sie wird bei solchen Anheftungsbedingungen aufgebracht, die das Protein nicht denaturieren. Solche
Bedingungen sind zum Beispiel Raumtemperatur, obgleich auch höhere oder niedrigere Temperaturen angewendet werden können, und
Pjj-Werte im Bereich von 3 bis etwa 10. Auch Temperaturen von nur
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4-0C oder niedriger und sogar von bis zu 5O0C können geeigneterweise
angewendet werden. Es wird, jedoch kein signifikanter Vorteil erhalten, wenn man bei Temperaturen oberhalb 5O0C arbeitet.
Im Falle von Antikörpern gegenüber Digoxin, Tri;Jodthyronin und Thyroxin werden im allgemeinen p^-Werte von 6 bis 7
angewendet»
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines Schutzmittels» um die biologisch aktive Substanz gegenüber einer
Denaturierung während der Aufbringung weiter zu schützen. Dieses Schutzmittel wird im aligemeinen in einer wirksamen Menge verwendet,
daß ein solcher Schutz erzielt wird, indem die Denaturisierungsfaktoren
vermindert werden. So ist zum Beispiel das Schutzmittel in erheblich größeren Meugen vorhanden als die biologisch
aktive Substanz. Das Schutzmittel schützt in der Weise, daß es zuerst denaturiert wird, wenn die biologisch aktive Substanz
aufgebracht wird. Es ist besonders vorteilhaft, ein solches Schutzmittel beim technischen Betrieb zu verwenden. Solche Schutzmittel
sind zum Beispiel Hinderserumalbumin oder andere Schutzproteine, die die biologisch aktive Substanz oder den adsorbierenden
Froteinüberzug nicht nachteilig beeinflussen. Im Falle von Rinderserumalbumin wird dies im allgemeinen in einer Menge
von etwa 0,05 % (Gew./Vol.) bis etwa 1 % (Gew.AoI.), vorzugsweise
0,1 bis etwa 0,2 % (Gew./Vol.) verwendet.
Um die Anheftung der biologisch aktiven Substanz zu erleichtern, wird vor der Aufbringung der biologischen Substanz
auf das reaktive Teil dieses vorteilhafterweise mit dem gleichen Puffer gewaschen, der die biologisch aktive Substanz enthält,
Nach dem Aufbringen der biologisch aktiven Substanz wird es bevorzugt, sofort gegebenenfalls vorhandene überschüssige,
nicht umgesetzte biologisch aktive Substanz zu entfernen.
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il
Im Falle von Antikörpern wird dies vorteilhafterweise dadurch erzielt, daß man mit einer Aminosäure-Pufferlösung behandelt,
die einen pg-Wert von im allgemeinen etwa 1 bis 3 aufweist.
Ein Glycin-Natriumchloridpuffer wird bevorzugt. Nach dieser Behandlung werden die reaktiven Teile vorzugsweise mit einer
Pufferlösung mit einem Pg-Vert im allgemeinen Bereich von 6
bis 8 behandelt, um den pg-Wert auf nahezu neutral zu bringen.
Sodann wird das untere reaktive Teil mit einem Stabilisierungsmittel
behandelt, um die Aktivität der angekoppelten biologisch aktiven Substanz gegenüber einer Denaturierung
zu stabilisieren. Ein solches Stabilisierungsmittel ist zum Beispiel Polyvinylalkohol mit einer Viskosität von 4 bis 6 cPs
(4 %ige (Gew.AoI.) Lösung) bei 20°C. Die Anwendung erfolgt im
allgemeinen in einer wirksamen stabilisierenden Menge, beispielsweise von 2 % (Gew.Aol.). Bas Stabilisierungsmittel wird gewöhnlich
in Lösung in einem wässrigen Puffer, vorzugsweise in einem Phosphatpuffer, von Baumtemperatur angewendet. Im allgemeinen hängt der pH-Wert dieser Pufferlösung von dem Pg-Vert ab,
bei dem die biologisch aktive Substanz am stabilsten ist. Nach der Behandlung mit dem Stabilisierungsmittel wird das untere
reaktive Teil abtropfen gelassen und es wird bei solchen Trocknungsbedingungen getrocknet, die zu keiner Denaturierung der
biologisch aktiven Substanz führen. Es ist vorteilhaft, um . Vakuum zu trocknen. * Hierzu können alle beliebigen handelsüblichen Trockner verwendet werden, wobei die Trocknungstemperaturen
im allgemeinen 10 bis 450C, vorzugsweise 25 bis 350C, betragen.
Zwischen jeder der oben genannten Stufen wird es bevorzugt, mehrere Waschungen mit Wasser anzuwenden, um zu gewährleisten,
daß keine Verunreinigungen mitgetragen werden. Im allgemeinen werden die Behandlungelösungen während ihrer Anwendung
mit einer Geschwindigkeit gerührt, die das inerte Protein, den Oberzug aus dem inerten Protein, die biologisch aktive Substanz
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oder den Überzug aus dem inerten Protein, an den die biologisch
aktive Substanz angefügt worden ist, nicht nachteilig beeinflussen
oder die keine zu starke Blasenbildung ergeben. Die Rührbedingungen sollen jedoch ausreichend sein, daß eine vollständige
Vermischung gewährleistet wird und die entsprechende Behandlung durchgeführt wird« So kann zum Beispiel im Falle einer inerten
Proteinbehandinngslösung die Rührgescbwindigkeit leicht bestimmt
werden, indem man eine Anzahl von Ansätzen mit verschiedenen Geschwindigkeiten
durchrührt und die* optimalen Suhrgeschwindigkeiten
bestimmt« Sie gleiche Arbeitsweise kann auch dazu herangezogen werden, um die Rührgeschwindigkeit für die Behandlungslosungen
v die den Aldehyd und die biologisch aktive Substanz enthalten,
sowie für die verschiedenen Pufferlösungen zu bestimmen.
Im allgemeinen werden etwa 6 Teile Behandlungslosung für Jedea unter© xe&ktWe Teil verwendet- Es können aber auch
größere oder kleinere Mengen verwendet werden, zum Beispiel etwa 2 bis 12 Teile pro unteres reaktives Teil.
Das abtrennbare inerte obere Teil der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann aus einem der oben genannten Polymeren
sowie Glas bestehen. Unter der Bezeichnung "inert11 soll verstanden
werden, daß das Teil nicht in nachteiliger Weise die biologischen Substanzen beeinflußt, die beim immun-ahemischen
Test teilnehmen. Polymere, die wegen ihrer Eignung und aufgrund ihrer niedrigen Kosten in tpyischer Weise verwendet werden, sind
zum Beispiel Polypropylen und Polyäthylen· Ein weiterer Vorteil ist ihre Starrheit. Der Zweck des inerten oberen Teils ist naturgemäß
eine geeignete Kapazität zu schaffen, um die immun chemische oder enzymatische Methode durchzuführen. Gewöhnlich
wird dieses Teil aus einem Teil oder Teilen hergestellt, die an beiden Enden offen sind und die an das untere reaktive Teil
angefügt sind. Das inerte obere Teil kann durch alle beliebigen Maßnahmen bzw. Einrichtungen angefügt sein, um einen Behälter,
aus dem nichts heraussickem kann (zum Beispiel einen wasser-
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dichten Behälter) zu schaffen. So kann zum Beispiel das Bodenteil
so ausgestaltet sein, daß es genau über das obere Teil paßt. Das obere Teil kann auch durch Wärmeverschließen oder
andere geeignete Maßnahmen bzw. Einrichtungen, die dem Fachmann bekannt sind, angefügt sein. Die Größe des inerten oberen Teils
kann je nach der verwendeten immun-chemischen oder enzymati sehen
Methode variieren, wie es im Einzelfall dem Fachmann bekannt ist. Im allgemeinen betragt die Lange etwa 50 mm bis etwa 100 mm,
vorzugsweise etwa 55 mm bis etwa 80 mm und optimal 65 mm. Der Durchmesser ist im allgemeinen der gleiche wie derjenige des
unteren reaktiven Teils.
Die Erfindung wird anhand der beigefügten Zeichnung näher erläutert. Es zeigen:
Figur 1 eine erfindungsgemäße Vorrichtung in Form eines Röhrchens
,
Figur 2 das inerte obere Teil und
Figur 3 das untere reaktive Teil.
Figur 3 das untere reaktive Teil.
Bei den in den Figuren dargestellten Vorrichtungen hat das untere reaktive Teil 1 an seiner inneren Oberfläche 3 und seiner
äußeren Oberfläche 4- einen überzug eines inerten Proteins,
an das die biologisch aktive Substanz angefügt ist« Das inerte, abtrennbare obere Teil 2 ist an das untere reaktive Teil 1 angefügt.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung hat das untere reaktive Teil des erfindungsgemäßen Behälters
sowohl auf der inneren als auch auf der äußeren Oberfläche einen Überzug eines inerten Proteins, an das durch kovalente Bindung
eine biologisch aktive Substanz angeheftet ist.
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Die Erfindung richtet sich schließlich auch auf Abtrennungssysteme
für immunchemische Methoden, um Antigen- oder Haptenkonzentrationen zu bestimmen, insbesondere bei RIA-Bestimmungen
oder -tests. Solche RIA-Methoden und die Techniken ihrer Durchführung sind dem Fachmann bekannt, »Sie werden in den
Beispielen näher erläutert.
1300 untere reaktive Teile mit der in Figur 3 gezeigten Gestalt und mit einer Kapazität von 1,1 ml, die aus
einem Polymeren von Polyäthylen und Acrylsäure (92 Mol-% Polyäthylen
und 8 Mol-% Acrylsäure) bestanden, wutMen wie folgt
hergestellt.
(1) Die 13OO unbehandelten unteren Teile wurden in
einen Edelstahl- oder Polyäthylenbehälter eingetaucht, der 7800 ml einer 0,5 %igen wässrigen Natriumdodecylsulfat- (NaDS)
lösung enthielt. Es wurde 30 Minuten bei Baumtemperatur gerührt. (2) Die NaDS Lösung wurde entfernt und durch 7800 ml Wasser ersetzt.
Die Teile wurden sodann 5 Minuten laug gewaschen. Dieser
Wasch Vorgang wurde zweimal wiederholt. (3) I"*ß Wasser wurde entfernt
und durch 7800 ml einer wässrigen 0,2 α Kaliumhydroxidlösung ersetzt. Die Teile wurden 30 Minuten !eng in dieser Lösung,
gerührt. (4) Sodann wurde die Kaliumhydroxidlösung entfernt und durch Wasser ersetzt. Die Teile wurden darin c) Minuten lang gewaschen. Dieser Waschvorgang wurde wiederholt, bis der pfl-Wert
der Endwaschlösung 7*0 betrug. (5) Das Wasser wurde entfernt und durch eine wässrige 0,1 m Phosphatlösung; (pß 6,4), welche
0,1 % Rinder-Gammaglobulin und 0,1 % Natriumazid enthielt, ersetzt.
D ie Teile wurden sodann 30 Minuten lang in dieser Lösung
gerührt. (6) Die Gamma-Globulinlösung wurde entfernt, durch Wasser
ersetzt und die unteren reaktiven Teile wurden darin 5 Minuten lang gewaschen. Dieser Waschvorgang wurde dreimal wieder-
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holt. (7) Das Wasser wurde durch 7800 ml einer Phosphatpufferlösung
(0,1 m, Pg 7»4), welche 2 % Glutaraldehyd enthielt, ersetzt
und die unteren Teile wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur
in dieser Losung gerührt. (8) Die Glutaraldehydlösung
wurde entfernt, durch 7800 ml Wasser ersetzt und die Teile wurden darin 10 Minuten lang gewaschen. Dieser Wnschvorgang wurde
zweimal wiederholt. (9) Das Wasser wurde durch eine wässrige Phosphatpufferlösung (0,01 i, Pg 7*0), welche DigoxLnantikörper
(von Ziegen) mit einer Verdünnung von 1:160 000, normales Ziegenserum mit einer Verdünnung von 1:32 000, 0,1 % Rinderserumalbumin
und 0,01 % Natriumazid enthielt, ersetzt. Die unteren Teile
wurden in dieser LoDung eine Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt. (10) Die Behandlungslosunp, wurde durch 7800 ml Wasser ersetzt
und die unteren reaktiven Teile wurden 10 Minuten lang gewaschen. Der Waschvorgang wurde ztreimal wiederholt. (11) Das
Wasser wurde durch 7800 ml einer wässrigen Glycinnatriumchloridpufferlösung
(0,1 m, pfl 2,3) ersetzt und die Teile wurden darin
30 Minuten lang bei Baumtemperatur gewaschen. (12) Die Glycinpufferlösung
wurde entfernt und durch 7800 ml einer 0,1 m Phosphatpufferlösung mit einem Pg-Wert von 7»4 ersetzt· Die Teile
wurden darin 10 Minuten lang gewaschen. Dieser Waschvorgang wurde einmal wiederholt. (13) Der Phosphatpuffer wurde entfernt und
durch 7800 ml einer wässrigen, phosphatgepufferten Kochsalzlösung (0,01 m, Pjt 7»4, 0,9 % NaCl) ersetzt. Die unteren Teile wurden
in dieser Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt. (14) Die phosphatgepufferte Kochsalzlösung wurde entfernt und durch
7800 ml eines 0,01 m Phosphatpuffers mit einem pg-Wert von 7,4,
welcher 2 % Polyvinylalkohol und 0,01 % Natriumazid enthielt, entfernt. Die Teile wurden darin 30 Minuten lang gerührt. (15)
Die unteren reaktiven Teile wurden etwa 2 Stunden lang im Vakuum getrocknet. (16) An die unteren reaktiven Teile wurden die inerten
oberen Teile durch Schnappen angefügt. Auf diese Weise wurde ein herkömmliches Reagenzglas bzw. Reagenzrohrchen erhalten, das
für Festphasen-RIA-Methoden geeignet war. Das inerte
obere Teil bestand aus Polypropylen und hatte eine Länge von
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etwa 8,26 cm.
Beispiel 2
ΒΙΑ-Methode
ΒΙΑ-Methode
Iu ein herkömmliches Heagenzglasgestell werden 12 gemäß
der Erfindung, herg«<ot;ellLo Koagenzröhrchen gegeben, die mit
Digoxinantikorper beschichtet sind. In jedes Röhrchen werden
1 ml eines Pigoxittreaktlonsgemi&ohes einpipettiert, welches
J-125-DigorLn in einer Phosphatpufferlösung (0,1 η Phosphat,
Pg '?\*\ 0,9 % Natriumchlorid) enthält. In jedes Röhrchen werden
100/Ul eines Standardserums mit der entsprechenden Verdünnung
von J)igoxinv &«,h» 0 ng pro ml in die Röhrchen 1 und 2, 0,4 ng
pro ml in die Rohrchen 3 und 4, 1 ng pro ml in die Röhrchen 5
und 6* 2 ng pro ml in die Röhrchen 7 und 8, 3 ng pro ml in die
Röhrchen 9 wt»-ö 10 und 5 ng pro ml in dio Röhrchen 11 und 12 einpipettiert.
Sas Gestell wird 5 bis 10 Sekunden lang vorsichtig geschwenkt. Sodann wird etwa 1 Stunde, bei etwa 37°C im Wasserbad
inkubiert. Das Gestell wird entfernt und der Inhalt aller Röhrchen wird sorgfältig dekantiert» In jedes Röhrchen werden
2 ml destilliertes Wasser gegeben und es wird erneut dekantiert.
Die Röhrchen werden 1 Minute lang in einem Gammazähler gezählt. Die Errechnungen werden wie folgt durchgeführt:
1. Die Nettoimpulsrate pro Minute für alle Standards wird
errechnet, indem die durchschnittliche Impulsrate des Instrumentenhintergrunds abgezogen wird.
2. Die korrigierte Impulsrate für jeden Satz von Standards wird als prozentualer Teil der durchschnittlichen (0 ng
pro ml) Standardimpulsrate ausgedrückt (% B*/Bo**)
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korrigierte Impulsrate, Impulse
% B/B - pro Minute χ 1(χ)
% B/B - pro Minute χ 1(χ)
korrigierte Impulsrate, Impulse
pro Minute von (0 ng pro ml)
pro Minute von (0 ng pro ml)
* -B- Prozent gebunden in allen anderen Röhrchen
** -B0 - Prozent gebunden in dem 0 ng pro ml Standard,
** -B0 - Prozent gebunden in dem 0 ng pro ml Standard,
3. Auf halb-logarithmischem Papier wird % B/Bo für jede Standardkonzentration
gegen die Konzentration von Digoxin als ng pro ml aufgetragen.
Bei der obigen Verfahrensweise wurden die folgenden Ergebnisse erhalten.
Probe (ng/ml) Restimpulsrate (netto) ß/B
(Impulse pro Minute)
(Impulse pro Minute)
6202. 100 %
">6006 (durchsehn.)
0,4 4886 81,4
0,4 4920 81,9
1,0 4032 67,1
1,0 3960 65,9
2,0 2232 37,2
2,0 2470 41,1
3,0 1712 28,5
3,0 1725 28,7
5,0 1247 20,8
5,0 1023 17,0
Ein Diagramm der obigen Ergebnisse zeigt die Empfind lichkeit und Reproduzierbarkeit dieses Tests an.
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Es wird vie in Beispiel 1 verfahren, um untere reaktive
Teile mit Antikörpern gegen Tridodthyronin (T,) zu beschichten,
mit der Ausnahme, daß die Verdünnung der AntikörperbeschichtungslSsung
in der Stufe (9) 1:10 000 war und daß das normale Ziegenserum weggelassen wurde. Ansätze von mehreren hundert
unteren reaktiven Teilen wurden hergestellt, wobei da« Volumen der Behandlungslösung auf 6,0 ml pro Teil eingestellt
wurde. Diese Teile wurden sodann dazu verwendet, um die Trljodthyroninaufnähme
in Serumproben zu bestimmen*
Die folgenden Losungen wurden zur Behandlung de:» oben
beschriebenen erfindungsgemäßen Behälter verwendet.
1. Fhosphatpuffex-, 0,1 m, ρ« 6,4 (X)
a) Unter Buhren werden 9,96 g Kaliumdihydrogenphosphat zu
Wasser gegeben.
b) Zu der Losung von t a) werden 4,66 g Dikallumhydrogenphoephat
gegebenο
c) Hit Wasser wird auf 900 ml verdünnt und es werden 1,0 g Natriumazid zugesetzt. Der p^-Wert wird mit einem Pg-Meter
gemessen. Wenn der Pjv-Wert sich außerhalb des Bereiches
von 6V5 biß 6,5 befindet, dann wird in der erforderlichen
Weise mit KOH oder HCl-Losungen eingestellt.
d) Es wird auf 1 Liter verdünnt.
2. Phosphatpuffer, 0,1 m, Pg 7,4 (II)
a) Unter Rühren werden 2,66 g Kaliumdihydrogenphosphat in
Wasser gegeben.
b) Unter Rühren werden 14-,0O g Dikaliumhydrogenphosphat zu
der Lösung 2 a) gegeben.
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c) Die Lösung 2 b) wird auf 900 ml verdünnt und der
wird mit einem pg-Meter gemessen· Venn der Pg-Vert sich
nicht im Bereich von 7»3 bis 7,5 befindet, dann wird er
in der erforderlichen Weise mit KOH oder HCl-Losungen eingestellt.
d) Sie Lösung 2 c) wird auf 1 Liter verdünnt.
3« Phosphatpuffer, 0,01 m, Pg 7,0, 0,01 % Natriumazid (III)
a) Zu Wasser werden 0,533 g Kaliumdihydrogenphosphat unter
Rühren gegeben.
b) Zu der Losung 3 &) werden unter Rühren 1,056 g Dikaliumhydrogenphosphat
gegeben.
c) Sie Losung 3 b) wird mit Wasser auf 900 ml verdünnt und
es werden 100 mg Natriumazid zugesetzt« Der pg-Wert wird
mit einem Pg-Meter gemessen. Erforderlichenfalls wird der
P0 mit EOH oder HCl-Lösung auf einen Wert von 7,0 bis 7,1
eingestellt.
d) Die Losung 3c) wird auf 1 Liter verdünnt.
4. Glyoinpuffer, 0,1 a, pg 2,3 (I)
a) Unter Rühren werden 7,5 g Glycin und 5,85 g Natriumchlorid zu 600 ml HgO gegeben.
b) Zu der Lösung 4 a) werden 5»3 ml konzentrierte HCl gegeben
und es wird auf 900 ml verdünnt. Wenn der pg-Wert außerhalb
des Bereiches von 2,3 bis 2,4 liegt, dann wird in der erforderlichen
Weise mit EOH oder HCl-Losungen eingestellt. Mit Wasser wird auf 1,0 verdünnt.
100 untere reaktive Teile mit der in Figur 3 gezeigten Gestalt mit einer Eapazität von 1,1 ml und bestehend aus
einem Polymeren von Polyäthylen und Acrylsäure (92 Mol-$ PoIy-
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äthylen und 8 Mol-% Acrylsäure) wurden wie folgt hergestellt.
(1) Die 100 unbehandelten unteren Teile wurden In
einen Edelstahl- oder Polyäthylenbehälter eingetaucht, der 600 ml einer 0,5 %igen wässrigen Hatriumdodecylsulfat- (VaDS)
lösung enthielt. Es wurde 60 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. (2) Die NaDS-Losung wurde entfernt und durch 600 ml
Wasser ersetzt. Die Teile wurden darin 5 Minuten lang gewaschen. Dieser Wasohvorgang wurde zweimal wiederholt. (3) Das Wasser
wurde entfernt und durch 600 ml einer wässrigen 0,2 η Kaliumhydroxidlösung ersetzt. Die Teile wurden 30 Minuten lang in dieser
Lösung gerührt» (4) Die Kaliumhydroxidlosung wurde sodann entfernt, durch Wasser ersetzt und die Teile wurden darin 5 Minuten
lang gewaschen. Dieser Waschvorgang wurde wiederholt, bis der ρ«-Wert der Endwaschlosung 7 bis 8 betrug. Das Wasser wurde
entfernt und durch Phosphatpuffer (I) ersetzt. Die Teile wurden darin 5 Minuten lang gewaschen. (5) Das Wasser wurde entfernt
und durch Phosphatpuffer (I) ersetzt, welcher 0,05 % Rinder-Gammaglobulin
enthielt. Die Teile wurden in dieser Lösung 30 Minuten
lang gerührt. (6) Die Gammaglobulinlösung wurde entfernt, durch Wasser ersetzt und die unteren reaktiven Teile wurden
darin 5 Minuten lang gewaschen. Dieser Waschvorgang wurde zweimal wiederholt. Das Wasser wurde entfernt und durch Phosphatpuffer
(II) ersetzt. Die Teile wurden darin 5 Minuten lang gewaschen· (7) Das Wasser wurde durch 600 ml eines Phosphatpuffers
(II) mit 2 % Glutaraldehyd ersetzt. Die unteren Teile wurden 60 Minuten bei Baumtemperatur in dieser Lösung gerührt. (8) Die
Glutaraldehydlösung wurde entfernt und durch 600 ml Wasser ersetzt.
Die Teile wurden darin 5 Minuten lang gewaschen. Dieser Wasohvorgang wurde zweimal wiederholt. Das Wasser wurde entfernt
und durch Phosphatpuffer (III) ersetzt. Die Teile wurden darin 5 Minuten lang gewaschen. (9) Das Wasser wurde durch Phosphatpuffer
(III) ersetzt, der Digoxin-Antikörper (von Ziegen), Verdünnung 1:325 000 bis 1:335 000, und 0,1 % Rinderserumalbumin
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enthielt. Die unteren Teile wurden zwei Stunden lang bei Baumtemperatur
in dieser Lösung gerührt. (10) Die Behandlungslosung wurde durch 600 ml Wasser ersetzt und die unteren reaktiven
Teile wurden 5 Minuten lang gewaschen. (11) Das Wasser wurde durch 600 ml Glycinpuffer (I) ersetzt und die Teile wurden 30
Hinuten bei Raumtemperatur gerührt. (12) Der Glycinpuffer wurde entfernt und durch 600 ml Phosphatpuffer (II) ersetzt. Die 'Teile
wurden darin 5 Minuten lang gewaschen. Dieser Waschrorgang wurde zweimal wiederholt. (13) Der Phosphatpuffer wurde entfernt und
durch 600 ml Phosphatpuffer (II) mit 2 % Polyvinylalkohol ersetzt.
Die Teile wurden darin 30 Minuten lang gerührt. (14) Die unteren reaktiven Teile wurden etwa 2 Stunden lang im Vakuum getrocknet. (15) An die reaktiven unteren Teile wurden durch Einschnappen die inerten oberen Teile angefügt. Auf diese Weise
wurden herkömmliche Beagenzröhrchen erhalten, die für Festphasen-RIA-Methoden
geeignet waren. Das inerte obere Teil
bestand aus Polypropylen und es hatte eine Lange von etwa 60 mm.
Es wurde wie in Beispiel 4 verfahren, um untere reaktive
Teile mit Antikörpern gegenüber Trijodthyronin (T,) sau beschichten,
mit der Ausnahme, daß die Verdünnung der Antikörperbeschichtungslösung
in der Stufe (9) 1:300 000 betrug und daß es sich um den Antikörper von Ziegen handelte. Ansätze von mehreren
hundert unteren reaktiven Teilen wurden hergestellt, wobei das Volumen der Behandlungslösung auf der Basis von 6,0 ml pro
Teil eingestellt wurde.
Es wurde wie in Beispiel 4 verfahren, um untere reaktive
Teile mit Antikörpern gegenüber Thyroxin (T^) zu beschichten,
mit der Ausnahme, daß die Verdünnung der Antikörperbeschichtungslösung
in der Stufe (9) 1t2000 betrug und daß es sich um Antikörper von Kaninchen handelte. Bei der Herstellung der An-
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sätze wurde daß Volumen der Bohfjn<Uun{';Mlösung auf der Basis
von 6,0 ml pro Teil eingestellt»
Beispiel 7
T4-RIA
T4-RIA
Tu to in herkiiutfulUilu.« Ivt.ug-rii./.rölirchentfetitell weiden
14 erfindungsgemäß heigeeteilte Reageiizröhrchen, die mit Thyroxin-Antikörpern
beschießt·«Ι* sjliul; eiitftebracht.. In jedes Iföhrchen
werden 1 ml eines Thyroxinreaktionsgemisches einpipettiert,
welches Veronalpuffer (0,076 m, pH R,G), 0,01 % Natriumazid,
Mg ANS, 900 ug/ml und 200 pg/ml J-125 Thyroxin (0,1 /uC/ml) enthält
* In alle> Röhrchen mit Ausnahme ν υπ zwei würden 25 /Ul von
Standardlos'iDR Ja eier .vnikspr'xsheri/iftii Vei.'-Iiinnung von Thyrcurin,
d.h. O ugpOlOOmlin die Röhrchen I und 2, 2,0 ug pro 100 ml in die
Röhrchen 3 ixafi ^,^'ug ο ■ 100 ml in
<lJt R?! kirche α ,'5 und 6,10 ug pro
ml in die Röhrchen 7 und 8,20 ug pro 100 ml die Röhrchen 9 und 10 und 40 ugpiolOOmlin die Röhrchen 11 and 12 einpipettiert. In
die Röhrchen 13 und 14 werden 25 /Ul der zu bestimmenden Seren
einpipettierb- Dat! Gestell wird vorsichtig 5 bis 10 Sekunden
lang geschwenkt. Sodann wird im Wasserbad etwn eine Stunde lang
bei etwa 37°G inkubiext;. Das Gestell wird herausgenommen und
der Inhalt allex* RoiircLeti wiixl sorg.tUl.tig dekantiert. In jedes
Röhrchen werden 2 ml destilliertes Wasser gegeben und es wird dekantiert. Die Röhrchen werden iti einem Gammazähler eine Minute
lang gezählt. Die Errechnlangen erfolgen wie folgt:
1. Di© Hetfcoimpulsrafcü pro Minute für alle Standards wird
errechnet, indem di« durchschnittliche Impulsrate des
Instrumentenhintergründe abgezogen wird.
2. Die korrigierte Impulsrate für jeden Satz von Standards wird als prozentualer Teil der· durchschnittlichen (0 ug pro
100 ml)-Standardimpulsrate ausgedrückt (% B*/BQ**).
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2738Ί83 3$·
korrigierte Impulsrate des Standards,
a/ B λ« m Impulse pro Minute χ 10C
10 ' ο " korrigierte Impulsrate,
Impulse pro Minute von (0 ug pro 100 ml), Impulse pro Minute
* -B ■ Prozent gebunden in allen anderen Rohrchen
·· -B , « Prozent gebunden in dem 0 ug pro 100 ml Standard.
3. Aul halb-logarithmißchem Papier wird % B/B für ,1ede Standardkonzentration
gegen die Konzentration von T4 als ug pro 100 ml aufgetragen»
Bei dei· obigen Verfakrenßweiso wurden die folgenden
Ergebnisse erhalten.
Probe (ug/100 ml) | durchschnittliche Rest impulsrate (netto) (Impulse pro Minute) |
B/Bo(%) |
0 | 32591 | 100 % |
2 | 25525 | 78,3 |
5 | 20909 | 64-,2 |
10 | 14774 | 45,8 |
20 | 9916 | 30Λ |
40 | 6802 | 20,9 |
zu bestimmende Prob«» |
17603 | 54,0 |
Ein Diagramm der obigen Ergebnisse zeigt die Empfindlichkeit und Reproduzierbarkeit des Tests an.
Beispiel 8
ü?3-Aufnahmetest
ü?3-Aufnahmetest
In ein herkömmliches Reagenzröhrchengestell werden 6 erfindungsgemäß hergestellte Röhrchen, die mit T3-Antikorpern
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beschichtet sind, eingebracht. In jedes Röhrchen werden 1 al
eines T3-Reaktionsgemisches einpipettiert, welches 0,05 m Tris-(bjdroxymethyl)-aminomethau,
pH 7,5, 0,05 % Natriumazid, 100 pg/ml
J-125 Trijodthyronin enthält. In jedes der drei Röhrchen werden
25/Ul eines Standardserumn einpipettiert. In die anderen drei
Rohrchen werden 25/ttl der zn bestimmenden Seren einpipettiert.
Das Gestell wird 5 bie 10 Sekunduli lang vorsichtig geschwenkt
und sodann wird in Wasserbad etwa eine Stunde bei etwa 20 bis 260C inkubiert· Das Gestell wird herausgenommen und der Inhalt
aller Röhrchen wird sorgfältig dekantiert. 2 ml destilliertes Wasser werden in jedes Rohrchen gegeben und es wird erneut dekantiert.
Sie Röhrchen werden in einem Gammazähler eine Hinute
lang gezählt. Die Errechnungen erfolgen wie folgt:
1· Die Nettoimpnierate pro Minute für alle Standards wird
errechnet, indem die durchschnittliche Impulsrate des Instrumentenhintergrunds abgezogen wird.
2. Der Thyro-Bindungskapazitäts- (TBC) index für jede Serumprobe
wird nach folgender Formel errechnet:
Hettuimpulsrate
des Standard«,
Impulse pro Mi-
des Standard«,
Impulse pro Mi-
Hettoimpulsrate
der zu bestimmenden Probe, Impulse
pro Minute
der zu bestimmenden Probe, Impulse
pro Minute
* bestimmt aus Standardserum
χ Normalisierungefaktor* - TBC-Index
Ende der Beschreibung
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Claims (1)
- KRAUS & WEISERTPATENTANWÄLTEDR WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER DRING. ANNEKÄTE WEISERT DlPL-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 ■ TELEFON 089/797077-797078 · TELEXTELEGRAMM KRAUSPATENT1534 WK/SiBYK-MALLINCKRODT CHEMSCHE PRODUKI)K (IMBH Siet ζ enbach-S teinbergLänglicher hohler Behälter für immunchemische und enzymatiacheMethodenPaten tansprüc ti e1, Länglicher hohler Behälter für iramauchemische und enzymatische Methoden, dadurch gekennzeichnet, daß er (a) ein unteres reaktives Teil aus einem polymeren Mater ■'-Mi, wobei das Teil, ai einem Ende abgeschlossen ist und wobei mindestens ein Teil seiner Innenoberfläche mit einem Überzug ein*«) inerten Proteins versehen ist, an das eine biologisch aktive Substanz angefügt ist, und (b) ein abtrennbares, inerte?: oberes Teil Ί das an das untere Teil angeschlossen ist und mit diesem in Verbindung steht, enthält.2. Behälter nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Substanz ein Antikörper ist.3· Behälter nach Anspruch 2, dadurch gokennzeichnet, daß das reaktive Teil den überzug auf einem Teil seiner inneren Oberfläche und einem Teil seiner äußeren Oberfläche aufweist.4-. Behälter nach Anspruch 3t dadurch gekennzeichnet,809810/0772ORIGINAL INSPECTEDdaß die Antikörpersubstanz kovalent an das inerte Protein gebunden ist.5· Behälter nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß er in Form eines Rohrchens vorliegt.6. Behälter nach Anspruch 4V dadurch gekennzeichnet, daß das inerte Protein Gelatine oder Rinder-Gammaglobulin ist.7· Behälter nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet» daß das reaktive Teil aus einem Copolymeren aus Äthylen und Acrylsäure besteht.8. Behälter nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Substanz mittels eines Aldehydkopplungsmittels kovalent gebunden ist,9· Behälter nach Anspruch 4-, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ein Antikörper gegenüber Trijodthyronin, Thyroxin oder Digoxin ist.10. Behälter nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß das inerte Protein Rinder-Gammaglobulin ist, daß das Kopp. lungsmittel Glutaraldehyd ist, daß das untere Teil aus einem Copolymeren aus Polyäthylen und Acrylsäure besteht und daß das obere Teil aus Polypropylen besteht.11. Immunchemisches oder enzymatiaches Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Antigens und/oder eines Haptens in einer bestimmten Menge einer wässrigen Probe, bei dem die wässrige Lösung mit (1) einem unlöslichen Träger, an den eine biologisch aktive Substanz angeheftet worden ist, die dazu imstande ist, sich mit dem Antigen und/oder Hapten umzusetzen, und (2) einer abgemessenen Menge eines809810/0772markierten Antigens und/oder Haptens in Berührung gebracht wird, um nach Erreichen eines Gleichgewichtszustands ein Zweiphasensystem zu bilden, welches eine feste Phase, die einen Teil des markierten Antigens und/oder Haptens einen Teil des nicht mar^ kierten Antigen und/oder Haptenv gebunden an die biologisch aktive Substanz, aufweist, und eine flüssige Phase, die den Rest des ungebundenen markierten Antigens und/oder Haptens und des nicht markierten Antigens und/oder Haptens enthält, und bei dem die zwei Phasen getrennt werden und die Konzentration bestimmt wird» dadurch gekennzeichnet, daß man als unlöslichen Träger den Behälter nach Anspruch 1 verwendet.12. Radioimmunassay -Verfahren zur Bestimmung der Konzentration eines Antigens und/oder Haptens in einer bestimmten Menge einer wässrigen Probe, bei dem die wässrige Lösung Kit (1) einem unlöslichen Träger, an den eine biologisch aktive Substanz angeheftet worden ist, die dazu imstande ist, sich mit dem Antigen und/oder Hapten umzusetzen und (2) einer abgemessenen Menge des radioaktiv markierten Antigens und/oder Haptens in Bertlhrung gebracht wird, um nach Erreichen eines Gleichgewichtszustands ein 2-Phasensystem zu bilden, welches eine feste Phase, die einen Teil des markierten Antigens und/oder Haptens und einen Teil des nicht markierten Antigens und/oder Haptens, gebunden an die biologisch aktive Substanz, aufweist und eine flüssige Phase, welche den Rest des ungebundenen markierten Antigens und/ oder Haptens und des nicht markierten Antigens und/oder Haptens enthält, und bei dem die zwei Phasen getrennt werden und die Radioaktivität von mindestens einer der Phasen gemessen wird, wobei die gemessene Radioaktivität eine Funktion der Konzentration des Antigens und/oder Haptens in der wässrigen Probe ist, dadurch gekennzeichnet, daß man als unlöslichen Träger den Behälter nach Anspruch 1 verwendet.809810/077213. Verfahren nenb Annprucb 1?, dadurch gekennzeichnet,daß man ale. biologisch e.ktjwt Rub» ·Λ μ» finen Antikörper verwendete14» Vfii".frtlix*er! >jp< - '■'M^rmii Ii1 :ip<lurch gekennzeichnet,daß dap reaktive Teil de>r flberawp. auf einem Teil seiner inneren t».· · iv*'V '(< ./ >■·,..!nfo t al »' ».» Oberfläche aufweißt.15· ' r "e.iiT-(v) ;>».;·;·. i-> verweh. i\k ^ . ί durch gekennzeichnetidaß die Arji-ikoririP.rwwbP-tas·'«·. kovalent an das inerte Protein gebunden ißt.16c Verfahre» «μ·Λι jiu.».Kprutoii 11>V dadurch gekennzeichnet,daß d(i> ^ebeJiet ii ·λ>·λ ·-·*v».«5|* TioWrclu nf« vorliegt*17. \ -' i^lrtTj, 1M 1,sjjiuv]: -ibν uaciuvch gekennzeichnet,daß dar ir>r-rte Proi^irt. Grlatine oder Winder-Gammaglobulin iet18c Yer.fahrtb vifc« b Anspruch 17s dadurch gekennzeichnet,daß dati 'reaktive Tefi.l tkv.h einem Copolymeren aus Äthylen und19. ^'er'abron u*.dl· A»sp:r«c]i, ibv dadurch gekennzeichnet,daß die biologisch aktive Substan?; mittels eines Aldehydkupp-eDi gebunden ist.20c ν*ei Jahroi.' nov.h Auai^i-u^lu 19V dadurch gekennzeichnet,daß der Antikörper ei» Antikörper gegenüber Trijodthyronin, Thyroxin oder Digoxin ist.21t Veriahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet,daß das Jaerte Protein Hinder-Güjaraaglobulin ist, daß das Kupplungsmittel Glutaraldehyd ist, daß das untere Teil aus einem Copolymeren aue Polyäthylen und Acrylsäure besteht und daß das obere Teil aus Polypropylen besteht.809810/0772BAD ORIGINAL22. Verfahren zur Herstellung des untexcn reaktiven Teils des Behälters nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) durch Adsorption die Oberfläche eines unteren reaktiven Teils aus einem polymeren Material, wobei das Teil an einem Ende abgeschlossen ist, mit einem inerten Protein unter Adsorptions-Bedingungen beschichtet, (b) an den Überzug aus dem inerten Protein auf dem unteren reaktive*. TelJ. von (a) unter Kopplungs-Bedingungen eine biologisch airing) Bubstanz anheftet, (e) das untere reaktive Teil von (b),bei dem die biologisch aktive Substanz an den Überzug aus dem inerten Protein angeheftet ist, mit einem Stabilisierungsmittel behandelt, um die biologisch aktive Substanz gegenüber einer Deimfririerung zu stabilisieren und daß man (d) das reaktive TeiJ 'inter solchen Trocknungsbedingungen trocknets die keine wesentliche Denaturierung der biologisch aktiven Substanz Thewirl?«u,23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch. g«kuanzeichnet, daß die biologisch aktive Substanz an den Überzug aus dem inerten Protein durch eine kovalente Bindung ai^/hef'let Ist»24. Verfahren nach Anspruch 23, dadur <■■ gekennzeichnet, daß die biologisch aktive Substanz ein Antikörper ist.23. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß das inerte Protein in einer Phosphatpufiarlöeung enthalten ist, daß der Antikörper in einer Phospb> !,pufferlösung enthalten ist, daß das zur kovalenten Bindung des Antikörpers verwendete Kopplungsmittel in einer Phosphatpu.f * erlösung enthalten ist und daß das Stabilisierungsmittel in einer Phosphatpufferlösung enthalten ist.26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Phosphatpufferlösungv welche den Antikörper enthält, zusätzlich ein inertes Protein enthält, um eine Denaturierung des Antikörpers zu verzögern.809810/0772BAD ORIGINAL27· Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper mittels eines Aldehyd-Kopplungsmittels kovalent gebunden ist«28. Verfahren naeb Anspruch 2'/v dadurch gekennzeichnet, daß das reaktive Teil aus einem ^polymeren aus Polyäthylen und Acrylsäure zusammengesetzt Ihb.29« Verfahren nach Anspruch ^iJ., dmktrch gekennzeichnet5 daß das inerte Protein, das an der Oberfläche adsorbiert ist, Rinder-Gammaglobulin ist und daß das inerte Protein zur Verzögerung der Denatu.riex.iing des .Antikörpers Riuderserumalbumin ist.30. Verfahren nach Anspruch 29« dadurch gekennzeichnet, daß der ih'tlkörper ο in Antikörper gep^nüt-ei TrLJodthyronin, Thyroxin oder Dlgoxin ist*31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß der Stabilisator Polyvinylalkohol ist.32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß man das untere reaktive Teil Im Vakuum trocknet.33· Verfahren zur Herstellung eines unteren reaktiven Teils aus einem Copolymeren aus Polyäthylen und Acrylsäure, wobei das Teil an einem Ende abgeschlossen ist und auf mindestens einem Teil seiner inneren Oberfläche einen Überzug des inerten Proteins Rinder-Gammaglobulin aufweist, an den Digoxin-Antikörper angeheftet ist, dadurch gekennzeichnet, daß man (a) die Oberfläche des unteren reaktiven Teils aus einem Copolymeren aus 92 Gew.-# Polyäthylen und 8 Gew.-% Acrylsäure, wobei das Teil an einem Ende abgeschlossen ist, mit einer auf das Gesamtvolumen der Lösung bezogenen OV5 gew.-%igen wässrigen Lösung809810/0772BAD ORIGINALvon Natriumdodecylsulfat säubert und sodann ein- oder mehrmals mit Wasser wäscht, (b) das untere reaktive Teil von (a) mit einer genügenden Menge einer wässrigen Kaliumhydroxidlösung behandelt, daß die Carboxylgruppen auf der Oberfläche in die ßalzform umgewandelt werden, ein oder mehrmals mit Wasser und sodann mit einer Phosphatpufferlösung mit einem Pg-Wert von etwa 6,4 wäscht, (c) durch Adsorption die Oberfläche des unteren reaktiven Teils von (b) beschichtet* indem man dns Teil in eine Phosphatpufferlösung unter Adsorptions-Bedingungen eintaucht, welche das inerte Protein Rinder-Gammaglobulin enthält, und sodann ein- oder mehrmals mit Wasser und hierauf mit einer Phosphatpufferlosung mit einem p,y-Wert von etwa 7t^ wäscht, (d) genügend Glutaraldehyd ankuppelt, um eine Anheftung des Antikörpers gegenüber Digoxin an den überzug aus dem Rinder-Gammaglobulin auf dem reaktiven Teil von (r) zu ermöglichen, indem man das reaktive Teil in eint Fhospli« I pufferlösung mit einem p„-Wert von etwa 7,4 eintaucht* welche, bezogen auf das Gesamtvolumen der Lösung etwa 2 Gew.-% Glutaraldehyd enthält, und sodann ein- oder mehrmals mit Wasser und hierauf mit einer Phosphatpufferlösung mit einem p„-Wert von 7iO wäscht, (e) einen Antikörper gegenüber Digoxin an den (vl utas fü dehyd auf dem reaktiven Teil von (d) kuppelt, indem man das reaktive Teil unter anheftenden Bedingungen in eine Phoephetpufferlösung mit einen p„-Wert von 7»0 eintaucht, welche Antikörper gegenüber Digoxin in einer Verdünnung von 1/325 (X)O bis 1/33 J> 000 und als Schutzmittel Rinderserumalbumin, um eine Denaturierung dee Antikörpers zu verzögern, enthält, ein- oder mehrmals mit Wasser und sodann mit einer Glycinpufferlöiiung mit einem p„-Wert von etwa 2,4 wäscht, um gegebenenfalls vorhandene nicht an den Glutaraldehyd gekuppelte Antikörper zu entfernen* (f) ein- oder mehrmals mit einer Phosphatpufferlösung mit einem pH-Wert von 7»4 wäscht und sodann mit einer Phosphatpufferlösung mit einem p„-Vert von etwa 7»4ν welche, bezogen auf das Gesamtvolumen der Lösung, 2 Gew.-% Polyvinylalkohol als Stabilisierungsmittel enthält und daß man (g) unter Bedingungen im Vakuum trocknet, welche809810/0772keine weρentliehe Denaturierung des Antikörpers ergeben.34. Verfahren zur Herstellung eii<es ländlichen, hohlenBehältern für immunchemische und enzymatische Methoden, dadurch gekennzeichnet·, daß wan eii.i eibtrennbaro'i, inertes oberes Teil an das untere reaktive Teil gemäß Anspruch 33 anheftet, so daß BJ.el\ 6f>.*>< jueii* s>>-eiri 'J.'oil iü Verbindung mit· dem unteren Teil befindet.809810/0772BAD OPIGlNAL
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