DE3321629A1

DE3321629A1 - Traeger zur immunochemischen bestimmung und messreagentien unter verwendung derselben

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Publication number: DE3321629A1
Application number: DE19833321629
Authority: DE
Inventors: Takashi Tokyo Kudo; Ei Tokyo Mochida; Hiroshi Kawaguchi Saitama Sato; Toshiyuki Urawa Saitama Sugawara
Original assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Mochida Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1982-06-18
Filing date: 1983-06-15
Publication date: 1984-01-05
Also published as: FR2534031A1; SE8303496L; JPS58221166A; GB8315228D0; GB2125963A; NL8302179A; SE8303496D0; AR230886A1

Description

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38 803 m/fg

MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD., Tokyo / Japan

Träger zur immunochemisehen Bestimmung und Messreagentien unter Verwendung derselben

Die Erfindung betrifft Träger zur immunochemisehen Bestimmung und Messreagentien unter Verwendung dieser Träger.

In den letzten Jahren wurde die Anwendung verschiedener Reagentien zur immunochemischen Bestimmung erprobt, um die Konzentrationen physiologisch aktiver Substanzen, wie Peptidhormone, Steroide, Proteine, etc., als auch die Konzentrationen verabreichter Arzneimittel in vivo, welche in den physiologischen Proben, wie Serum, Urin, etc., nur in sehr geringen Mengen vorliegen, zu bestimmen. Häufig verwendet man

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hierzu Reagentien, die auf einer Enzym-Immunobestimmung, Radio-Immunobestimmung, Fluoro-Immunobestimmung, etc., beruhen, da diese eine sehr hohe Messempfindlichkeit und eine ausgezeichnete quantitative Effizienz besitzen.

Diese Reagentien umfassen im allgemeinen (a) einen insolubilisierten Antikörper oder insolubilisiertes Antigen, welche erhalten werden durch Bindung eines Antikörpers oder Antigens, welche mit der zu bestimmenden Substanz korrespondieren, an einen Träger, und (b) einen markierten Antikörper oder ein markiertes Antigen, die erhalten werden durch Markieren eines Antikörpers oder Antigens mit einer Markierungssubstanz, wie z.B. einem Enzym, etc.. Die Bestimmung unter Verwendung eines derartigen Reagens wird wie folgt durchgeführt: Eine zu bestimmende Substanz und ein markierter Antikörper oder ein markiertes Antigen werden mit einem insolubilisierten Antikörper oder insolubilisierten Antigen umgesetzt, und dann werden das an den Träger (feste Phase) gebunde Markierungsagens und das nicht-gebundene Markierungsagens, das in der flüssigen Phase vorliegt, getrennt. Daraufhin wird die Aktivität des Markierungsagens entweder in der festen Phase oder in der flüssigen Phase gemessen, wodurch die Menge oder Konzentration der zu bestimmenden Substanz bestimmt wird. Deshalb darf der Träger nicht unspezifisch Antigen, Antikörper oder andere Komponenten, die nicht an der immunologischen Reaktion teilnehmen, adsorbieren.

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Andererseits hat man versucht, als Träger für Reagentien Behälter einzusetzen, z.B. Reagenzgläser, etc. ο In anderen Worten bedeutet dies, dass man durch Bindung eines Antigens oder Antikörpers an die OberflM-ehe der Innenwand eines Behälters, wie z.B. eines Reagenzglases, etc., und durch Plazieren des markierten Antigens oder markierten Antikörpers in diesen Behälter erwartet, ein Reagens zu erhalten, das für die Lagerung geeignet und stabil ist, eine sofortige Bestimmung erlaubt und somit in einfacher Weise verwendet werden kann.

Die Lagerstabilität eines solchen Reagens war jedoch bisher nicht befriedigend; es bestand das Problem, dass nach mehrmonatiger Lagerung die Genauigkeit und Empfindlichkeit der Messung abnahm. Die Erfinder haben daher umfangreiche Untersuchungen durchgeführt, um die Ursache dieses Problems aufzuklären? es wurde festgestellt, dass die Qualitätsveränderung des Reagens auf die Tatsache zurückzuführen ist, dass die als Träger verwendeten Kunststoffreagenzgläser eine zwar geringe, doch wirkungsvolle Gaspermeabilität aufwiesen.

Obwohl Glas ein Trägermaterial darstellt, das keine Gasdurchlässigkeit aufweist, ist die Verwendung von Glas als Träger nicht geeignet, da dasselbe unspezifisch Substanzen adsorbiert. Die Erfinder haben ihre Untersuchungen fortgesetzt, um dieses Problem zu lö~ sen. Es wurde gefunden, dass bei Beschichten der Glasoberfläche mit einem synthetischen Hars die unspezifische Adsorption verhindert werden kann,, Die Verwendung von Glas, das mit einem synthetischen Harz beschichtet ist, als Träger für ein Reagens zur immunochemischen Bestimmung war bisher nicht bekannt.

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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, Träger zur immunochemisehen Bestimmung zur Verfügung zu stellen, welche die unspezifische Adsorption verhindern.

Diese Aufgabe wird gemäss der Erfindung dadurch gelöst, dass Träger zur immunochemisehen Bestimmung geschaffen werden, welche man durch Beschichten einer Glasoberfläche mit einem synthetischen Harz erhält.

Ausserdem umfasst die Erfindung Reagentien zur immunochemischen Bestimmung, welche (a) einen insolubilisierten Antikörper oder ein insolubilisiertes Antigen, welche erhalten werden durch Bindung des Antikörpers oder Antigens an einen Träger aus Glas, dessen Oberfläche mit einem synthetischen Harz beschichtet ist, und (b) einen markierten Antikörper oder ein markiertes Antigen umfassen.

Fig. 1 stellt ein Diagramm der Standardkurven von ' Beispiel 7 dar, und

Fig. 2 ist ein Diagramm der Standardkurven von Beispiel 8.

Die Beschichtung eines Glasträgers kann wie folgt durchgeführt werden: Das als Träger vorgesehene Material, wie z.B. Glaskugeln, ein Reagenzglas aus Glas, etc., wird mit einer Lösung oder einer Suspension eines synthetischen Harzes benetzt, damit das genannte Harz auf der Trägeroberfläche haftet. Falls dies erforderlich ist, wird überschüssiges Harz entfernt und das benetzte Trägermaterial im folgenden wärmebehandelt. Das Harz, das nach der Wärmebehandlung nicht

als Beschichtung auf dem Trägermaterial haftet, wird durch Waschen entfernt. Der auf diese Weise behandelte Träger geht dann eine Bindung mit einem Antikörper oder Antigen ein, um einen insolubilisierten Antikörper oder ein insolubilisiertes Antigen zu erhalten»

Als Beschichtungsagens können verschiedene synthetische Harze verwendet werden. Die synthetischen Harze können nach ihrer chemischen Struktur oder den Verarbeitungsbedingungen in thermoplastische Harze und wärmehärtbare Harze klassifiziert werden. Erstere stellen lineare Polymere dar, die beim Erwärmen erweichen und fliessfähig, beim Abkühlen fest werden, wobei dieser Zyklus wiederholbar ist. Letztere stellen Harze dar, deren Kondensationsprodukte im frühen Stadium linear sind, jedoch grosse Moleküle darstellen; beim Erwärmen erweichen sie und werden zunächst fliessfähig, doch dann erfolgt eine Vernetzungsreaktion zwischen den Molekülen unter Bildung unlöslicher und nicht-schmelzbarer Substanzen mit dreidimensionaler Struktur. Jeder dieser Typen von synthetischen Harzen kann gemäss der Erfindung verwendet werden.

Als thermoplastisches Harz können Vinylchloridharze, Polystyrolharze, Polypropylenharze, Acrylharze, Fluorharze, etc. verwendet werden; als wärmehärtbare Harze kann man Siliconharze, Phenolharze, Epoxyharze, etc. verwenden. Besonders bevorzugt sind unter diesen Harzen die Siliconharze, Polystyrolharze, Acrylharze und Fluorharze.

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Als Siliconharze sind zu nennen: Siliconöle mit einer linearen Struktur, Silicongummi mit einer teilweise vernetzten Struktur, Siliconharze, die zur Zeit der Verarbeitung vollständig vernetzt und ausgehärtet sind. Besonders bevorzugt sind unter diesen die Siliconöle.

Als Polystyrolharze sind zu nennen: Allzweck-Styrolharze, die erhalten werden durch Masse-Homopolymerisation von Styrol; wärmebeständige Styrolharze, die erhalten werden durch Herstellung eines linearen Polymers mit einem Polymerisationsgrad, der über dem von Allzweck-Styrolharzen liegt, oder durch Copolymerisation mit einem Monomer, welches die Hitzeresistenz verleiht, oder durch Polymerisieren von alpha-Methylstyrol; hoch schlagfeste Styrolharze, die erhalten werden durch Pfropfpolymerisation von Styrol und Butadien, etc.. Unter diesen sind die Allzweck-Styrolharze besonders bevorzugt.

Als Acrylharze sind zu nennen: Polymere von Acrylsäureestern und Polymere von Methacrylsäureester^ wobei die Polymeren von Acrylsäureestern besonders bevorzugt sind.

Als Fluorharze bzw. Fluorkautschuke sind zu nennen: Polytetrafluorethylen und Polychlortrifluorethylen, unter welchen Polytetrafluorethylen besonders bevorzugt ist.

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Diese synthetischen Harze können in Form einer Lösung in einem organischen Lösungsmittel, wie Hexan, Aceton, Methylchlorid, Chloroform, Dichlorethan, Trichlorethan, etc., bei einer Konzentration von 1 bis 30 G/G %, als Pulver, als eine Paste oder als eine Suspension verwendet werden. Bei Auflösung in einem organischen Lösungsmittel erfolgt die Beschichtung, indem man die Oberfläche des Trägers in Kontakt mit der genannten Lösung bringt und im folgenden die Oberfläche einer Wärmebehandlung unterwirft. Alternativ kann eine Lösung eines synthetischen Harzes über die Oberfläche des Trägers gesprüht und im folgenden eine Wärmebehandlung ausgeführt werden. Die Beschichtung kann auch unter Verwendung eines geschmolzenen synthetischen Harzes bei einer Temperatur über dessen Schmelzpunkt anstelle der Verwendung einer Lösung in einem organischen Lösungsmittel erfolgen. Ausserdem ist es auch möglich, das synthetische Harz in eine teigartige Form zu bringen, um die Oberfläche des Trägers damit zu beschichten, worauf dieser erwärmt wird, um die Beschichtung zu bewirken. Wenn z.B. ein Siliconharz auf ein Trägermaterial durch Beschichtung aufzubringen ist, so löst man das Harz in einem Lösungsmittel mit einer Konzentration von 1 bis 30 %, vorzugsweise 5 bis 10 %, bringt die Oberfläche des Trägers in Kontakt mit dieser Lösung, entfernt dann die überschüssige Lösung und führt bei ca. 180⁰C 1 h lang eine Wärmebehandlung durch. Nach dem Abkühlen wird das Harz, das nicht als Beschichtung aufgetragen ist, durch Waschen mit Trichlorethylen entfernt. Mach dem Trocknen erhält man einen beschichteten Träger=

Die Form des Trägers kann auf verschiedene Weise ausgestaltet sein. Man verwendet verschiedene Formen, wie z. B. Kugeln, Reagenzgläser, trommeiförmige Kugeln, Tüpfelplatten, Ampullen, Spritzen, etc..

Um den Antikörper oder das Antigen an den mit synthetischem Harz beschichteten Träger zu binden, bedient man sich ähnlicher Verfahren, wie sie in "Clinica Chimica Acta" 48, 15 (1973), "Journal of Immunology", 116, 1554 (1976), und "Science", 158, 1570 (1967), beschrieben werden. Es wird z.B. Anti-alpha-fötoprotein-antikörper in einer Konzentration von 1 mg/ml in Glycinpuffer, pH 8,2, aufgelöst. Diese Antikörperlösung wird in Kontakt mit Glaskugeln oder einem Reagenzglas aus Glas, welche mit einem Siliconharz beschichtet sind, gebracht, und im folgenden 3 h bei 37°C zur Umsetzung stehen gelassen. Man wäscht mit physiologischer Kochsalzlösung und fügt daraufhin Phosphatpufferlösung von pH 7,0, welche 1 % normales Kaninchenserum enthält, zu, lässt über Nacht bei 4⁰C zur Bildung des Antikörper-gebundenen Trägers stehen.

Als Markierungsagens zur Verwendung bei immunochemischen Bestimmungen können verwendet werden: Enzyme (z.B. Peroxidase, ß-Galactosidase, alkalische Phosphatase, Glucoseoxidase, etc.)/ radioaktive Isotope

125 3
(z.B. I, H, etc.), fluoreszierende Substanzen ,(z.B. Fluorescein-isothiocyanat, Tetramethylrhodamin-isothiocyanat, etc.), etc.. Im Hinblick auf die Empfindlichkeit, Präzision und Einfachheit, etc. ist die Verwendung eines Enzyms am meisten bevorzugt.

Das Verfahren zum Markieren des- Antikörpers oder Antigens mit diesen Markierungage.ntien ist allgemein bekannt. Die Markierung mit Enzymen kann z.B. nach der Methode von Nakane, Kawaoi et al ("J. Histochem. Cytochem.", 2_2, 1084 [1974]) durchgeführt werden.

Unter Verwendung des vorstehend erhaltenen Messreagens, das sich aus einem insolubilisierten Antikörper oder insolubilisierten Antigen und dem markierten Antikörper oder markierten Antigen zusammensetzt, können verschiedene physiologisch aktive Substanzen gemessen werden. Es wird z.B. die zu untersuchende Lösung, die auf eine geeignete Konzentration verdünnt worden ist, in ein Reagenzglas gegeben, das den Antikörper in gebundener Form enthält, und es wird die Antigen-Antikörper-Reaktion durchgeführt. Nach Durchführung der Reaktion wird das Reagenzglas gewaschen und markierter Antikörper zu demselben zugegeben. Daraufhin wird dieses Reagenzglas gewaschen und im folgenden mit Hilfe geeigneter .'Mittel die Menge des an das Reagenzglas gebundenen markierten Antikörpers gemessen. Die Menge der zu bestimmenden Substanz berechnet man durch Vergleich des gemessenen Wertes mit der Standardkurve, die erhalten wird, indem man in ähnlicher Weise den Standard mit bekannter Konzentration misst.

Bei der praktischen Durchführung der Bestimmung ermittelt man experimentell für jedes Messystem die optimalen Bedingungen, wie z.B. die Menge der Probe, die Konzentration und Menge von verwendetem markierten Antikörper, die Reaktionstemperatur und Reaktionszeit, etc., von der Art der zu bestimmenden Substanz, dem Titer des verwendeten Antikörpers, der Art des Markierungsagens, etc., abhängen können.

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Die Reagentien zur immunochemisehen Bestimmung gemäss der Erfindung umfassen, wie vorstehend beschrieben, (a) einen insolubilisierten Antikörper oder ein insolubilisiertes Antigen, und (b) einen markierten Antikörper oder ein markiertes Antigen; sofern dies für die Messung erforderlich ist, kann das Reagens im weiteren enthalten: einen Puffer, eine S.tandardlösung, und bei Verwendung eines Enzyms als Markierungsagens, ein Enzymsubstrat, eine Lösung zur Auflösung des Enzymsubstrates, einen Reaktionsstopper, etc. .

Die Pufferlösung verwendet man zum Verdünnen der Probe auf eine geeignete Konzentration sowie zur Aufrechterhaltung eines geeigneten pH-Wertes und einer geeigneten Ionenstärke an der Reaktionsstelle der Antigen-Antikörper-Reaktion. Als Pufferlösung können verwendet werden: herkömmliche Pufferlösungen, die üblicherweise auf dem immunochemisehen Gebiet verwendet werden, z.B. Glycin-gepufferte Kochsalzlösung, Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, Borat-gepufferte Kochsalzlösung, etc.. Um die Reproduzierbarkeit der Reaktion zu verbessern, kann eine geeignete Proteinmenge, z.B. 0,01 bis 5 %, vorzugsweise 0,5 bis 2 %, an Rinderserumalbumin (im folgenden als BSA bezeichnet) enthalten sein.

Der markierte Antikörper oder das markierte Antigen werden erhalten durch Markierung eines Antikörpers oder Antigens mit einem Enzym, einem radioaktiven Isotop oder einer fluoreszierenden Substanz. Durch Bestimmung der markierten Substanz, die an die zu bestimmende Substanz, die durch Antigen-Antikörper-Reaktion an die feste Phase gebunden worden ist, bindet

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oder nicht bindet, kann die physiologisch aktive Substanz in der Lösung, die zu bestimmen ist, gemessen werden.

Einige oder sämtliche Bestandteile des Messreagens gemäss der Erfindung können in lyophilisierter Form vorliegen. Wenn dies der Fall ist, wird dem Reagens ein geeignetes Lösungsmittel zur Auflösung der lyophilisierten Bestandteile zugefügt. Ausserdem kann das Reagens gemäss der Erfindung als Messkit zur Verfügung gestellt werden, indem solches Beiwerk, wie Reagenzgläser, Pipetten, etc., ergänzend zugegeben werden, um die Bestimmung zu erleichtern.

Beispiele der mit Hilfe der Messreagentien gemäss der Erfindung zu bestimmenden Substanz umfassen Proteinhormone, wie human-Chorongonadotropin, Insulin, menschliches Wachstumshormon, etc.; proteinartige Substanzen, wie alpha-Fötoprotein (im folgenden als AFP bezeichnet), Typ B-Hepatitisvirus (HBs), Immunoglobulin, einen Antigen-Antikörper-Komplex, Celluloplasmin, Transferrin, etc., und Haptene, wie Thyroxin, Östradiol, Progesteron, Testosteron, Phenytoin, Phenobarbital, etc..

Die Messreagentien gemäss der Erfindung sind frei von unspezifischer Adsorption durch die Träger; sie bes.itzen daher nicht nur eine hohe Messgenauigkeit, sondern auch eine ausgezeichnete Stabilität, die eine Lagerung derselben für ein Jahr oder länger erlaubt.

Die vorliegende Erfindung wird durch die folgenden experimentellen Beispiele und Herstellungs- und Messbeispiele näher erläutert, ohne dass dieselben den Umfang der Erfindung beschränken sollen.

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Experimentelles Beispiel 1 Stabilität von AFP-Messreagens

Im folgenden werden verglichen: ein herkömmliches AFP-Messreagens unter Verwendung eines Polystyrolharz-Reagenzglases als Träger, und ein AFP-Messreagens gemäss der Erfindung, unter Verwendung eines Reagenzglases aus Glas, welches mit Siliconharz, entsprechend dem nachfolgenden Beispiel 6, beschichtet wurde, und deren Lagerstabilitäten. Es erfolgte Lagerung bei 4°C für einen Monat, 3 Monate und 1 Jahr. Dann wurde die Stabilität ihrer Reaktionsfähigkeit unter Verwendung einer Kontroilösung (welche kein AFP enthielt) und einer AFP-Lösung (80 ng/ml) untersucht. Die Extinktionen dieser Lösungen wurden jeweils mit den Reagentien gemessen, wie dies in Beispiel 7 beschrieben ist. Die Unterschiede der Extinktion zwischen der Kontroilösung und der AFP-Lösung wurden ermittelt und die Ergebnisse in Relation zum Extinktionsunterschied in Tabelle 1 aufgeführt, wobei die Lagerzeit von 0 Tagen als 100 % angenommen wurde.

Aus Tabelle 1 geht hervor, dass bei dem herkömmlichen Reagens die Reaktionsfähigkeit (Extinktionsunterschied) nach einjähriger Lagerung auf 60 % vermindert ist, wohingegen bei dem Reagens gemäss der Erfindung praktisch keine Reduzierung der Reaktionsfähigkeit selbst nach einjähriger Lagerung zu beobachten ist. Die Reduzierung der Reaktionsfähigkeit geht natürlich Hand in Hand mit einer Verminderung der Messgenauigkeit und Messempfindlichkeit.

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Tabelle 1

Lagerzeit Herkömmliches 5 Reagens

1 Monat 3 Monate 1 Jahr

100 % 94 %

82 %

60 %

Reagens gemäss der Erfindung

100

98

98 %

97 %

Beispiel 1

Herstellung von Reagenzgläsern, die mit Siliconharz beschichtet sind:

Eine Lösung aus einem Siliconharz (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd., KC88), auf 10 % verdünnt mit η-Hexan, wurde jeweils in einer Menge von 1 ml zu Reagenzgläsern aus Glas (10 χ 75 mm) zugegeben. Nach 10-minütigem Stehenlassen dieser Reagenzgläser bei Raumtemperatur wurde die Siliconharz/n-Hexan-Lösung durch Absaugen entfernt. Daraufhin wurden die Reagenzgläser 1 h lang auf 180⁰C erwärmt und dann zum Abkühlen stehen gelassen. Diese Reagenzgläser wurden mit 2 ml Trichlorethylen gewaschen und getrocknet, wobei Siliconharzbeschichtete Reagenzgläser erhalten wurden.

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Beispiel 2

Herstellung von Glaskugeln, die mit Siliconharz beschichtet sind:
5

100 Glaskugeln (8 mm Durchmesser) wurden in eine 10%ige Siliconharzlösung in η-Hexan (Shin Etsu Chemical Co., Ltd. KC88) eingetaucht. Nach 10-minütigem Stehenlassen bei Raumtemperatur wurden'die Kugeln mit Hilfe einer Pinzette in eine Glasschale, gegeben, dann 1 h auf 180⁰C erwärmt und im folgenden zur Abkühlung stehen gelassen. Die Kugeln wurden dann fünfmal mit- \ ι 50 ml Triachlorethylen gewaschen, wobei" Siliconharz-' beschichtete Glaskugeln erhalten wurden. ■-15 ■ ■

Beispiel 3 N>

Herstellung von Reagenzgläsern, die mit Polystyrol- ' / harz beschichtet sind; " j

; j

Ein bei 18O⁰C geschmolzenes Polystyrolh'arz (Sanko !

Plastic Co., Ltd.) wurde in einer Menge von jeweils 1 ·

ml in Reagenzgläser aus Glas (10 χ 75 mm) gegeben, i

schnell durch Absaugen entfernt und zum Abkühlen ste- j hen gelassen, wobei Polystyrol-beschichtete Reagenz- ~^f glaser erhalten wurden.

Beispiel 4

Herstellung von Reagenzgläsern, die mit Acrylharz beschichtet sind:

Ein bei 200⁰C geschmolzenes Acrylharz (Sanko Plastic Co., Ltd.) wurde in einer Menge von jeweils 1 ml in Reagenzgläser aus Glas (10 χ 75 mm) gegeben, schnell durch Absaugen entfernt und zum Abkühlen stehen gelassen, wobei Acrylharz-beschichtete Reagenzgläser erhalten wurden.

Beispiel 5

Herstellung von Reagenzgläsern, die mit Fluorharz beschichtet sind:

Eine Suspension eines Fluorharzes (Asahi Glass Co., Ltd.) wurde auf die Innenwand von Reagenzgläsern aus Glas (10 χ 75 mm) aufgesprüht, dieselben auf 400°C erwärmt und zum Abkühlen stehen gelassen, wobei Fluorharz-beschichtete Reagenzgläser erhalten wurden.

Beispiel 6
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Herstellung von AFP-Messreagens

(a) Herstellung von Anti-AFP-Antikörper

AFP, das aus dem Ascites eines Hepatoma-Patienten nach der Methode von Nishi et al ("Cancer Res.", 30, 2707 [1970]) extrahiert und gereinigt worden war,

wurde in physiologischer Kochsalzlösung in einer Konzentration von 2 mg/ml aufgelöst. Davon wurden U,5 ml mit 0,5 ml Freund's-Komplett-Adjuvant vermischt. Kaninchen wurden fünfmal oder öfter mit diesem Gemisch immunisiert, um Anti-AFP-Serum zu erhalten. Dieses Anti-Serum wurde zweimal mit Natriumsulfat ausgesalzt und die Globulinfraktion gesammelt, um Anti-AFP-Antikörper herzustellen.

(b) Herstellung von Anti-AFP-Antikörper-gebundenen Reagenzgläsern

Zu den gemäss Beispiel 1, 3, 4 und 5 beschichteten Reagenzgläsern wurde 0,5 ml Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (im folgenden als PBS bezeichnet),

welche 1 mg Anti-AFP-Antikörper enthielt, zugegeben. Die Umsetzung erfolgte 3 h bei 37°C; daraufhin wurden die Reagensgläser mit PBS gewaschen, wobei Antikörper-gebundene Reagenzgläser erhalten wurden. 20

(c) Herstellung von Enzym-markiertem Anti-AFP-Antikörper

Es wurde ein Enzym-markierter Antikörper nach der Methode von Nakane, Kawaoi et al ("J. Histochem. Cytochem.", ^2, 1084 [1974]) hergestellt. 5 mg Meerrettichperoxidase (im folgenden als HRPO) bezeichnet, wurden in 1 ml 0,3 M Natriumhydrogencarbonat-Lösung aufgelöst. 0,1 ml l%iges 2,4-Dinitrofluorbenzol wurden zu demselben zugegeben und das Gemisch 1 h lang bei Raumtemperatur gerührt. Zu dieser Lösung wurde 1 ml 0,08 M Natriumperjodat-Lösung zugegeben und die

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Lösung 30 Minuten bei Raumtemperatur vermischt, im folgenden 1 ml 0,16 M Ethylenglycol-Lösung zugegeben und das Vermischen eine weitere Stunde bei Raumtemperatur fortgesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde gegen 0,01 M Carbonatpuffer, pH 9,5, über Nacht dialysiert; dann wurde 1 ml Anti-AFP-Antikörper zugegeben, der vorstehend unter (a) hergestellt worden war, und in 0,01 M Carbonat-Puffer, pH 9,5, in einer Konzentration von 5 mg/ml aufgelöst wurde; es erfolgte Umsetzung für -3 h bei Raumtemperatur; daraufhin wurden 5 mg Natriumborhydrid zugegeben und die Reaktion 3 h lang bei 4°C fortgesetzt. Nach Durchführung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch über Nacht gegen PBS dialysiert, unter Verwendung von Sephadex G 200 fraktioniert und gereinigt, wobei HRPO-markierter Anti-AFP-Antikörper erhalten wurde.

(d) Herstellung von AFP-Standardlösung

AFP wurde aus dem Ascites eines Hepatoma-Patienten nach der Methode von Nishi et al (Literaturstelle wie vorstehend) extrahiert und gereinigt. Das AFP wurde in PBS, welches 1 % BSA und 0,'l % Tween 20 enthielt, in Konzentrationen von jeweils 160, 80, 40, 20 und 10 ng/ml aufgelöst.

(e) Herstellung von AFP-Messreagentien

Unter Verwendung der Reagenzgläser, die den Anti-AFP-Antikörper gebunden enthielten, und dem

HRPO-markierten Anti-AFP-Antikörper, der wie vorstehend unter (b) und (c) angegeben hergestellt wurde, wurden AFP-Messreagentien mit den folgenden Kombinationen bereitet:
35

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1) Reagenzglas mit gebundenem Anti-AFP,

2) HRPO-markierter Anti-AFP-Antikörper,

3) AFP-Standardlösung,

4) Enzymsubstrat (o-Phenylendiamin),

5) Lösung zur Auflösung des Enzymsubstrates (PBS, welches 6 mM/l Wasserstoffperoxid enthielt),

6) Reactionsstopper (1 N Salzsäure),

7) Pufferlösung (PBS, welches 1 % BSA enthielt). 10

Beispiel 7 Bestimmung von AFP

Die AFP-Standardlösungen entsprechender Konzentrationen des AFP-Messreagens, hergestellt im vorstehend beschriebenen Beispiel 6, wurden zu 0,1 ml jeweils in Reagenzgläsern gemäss der Erfindung, die mit verschiedenen synthetischen Harzen beschichtet worden waren, und zum Vergleich, in Reagenzgläsern, die nicht denen gemäss der Erfindung entsprachen und nicht mit einem synthetischen Harz beschichtet worden waren, aufgenommen. 0,4 ml PBS, welches 1 % BSA enthielt, wurden zu jedem Reagenzglas zugegeben; es wurde gerührt und 2 h zur Umsetzung stehen gelassen.

Nach Beendigung der Reaktion wurde jedes Reagenzglas mit destilliertem Wasser gewaschen. Dann wurden 0,5 ml HRPO-markiertes Anti-AFP, hergestellt im vorstehend beschriebenen Beispiel 6(c) 2000-fach mit PBS, welches 1 % BSA enthielt, verdünnt, zugegeben und 2 h lang bei Raumtemperatur umgesetzt. Nach Beendigung der Reaktion wurde jedes Reagenzglas mit destilliertem Wasser gewaschen. Um die Aktivität der HRPO zu

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bestimmen, wurden 0,5 ml Substratlösung (PBS, welches 6 mM/1 Wasserstoffperoxid und 20 itiM/l o-Phenylendiamin enthielt), zu jedem Reagenzglas zugegeben und das Gemisch bei Raumtemperatur 30 Minuten lang stehen gelassen, wobei es vor Lichteinwirkung abgeschirmt wurde. Es wurden 2 ml IN Salzsäure zugegeben und mit dem Reaktionsgemisch vermischt; die Intensität der entwickelten Farbe wurde bei einer Wellenlänge von 492 nm bestimmt. Die Ergebnisse für die Standardkurven sind -in Fig. 1 wiedergegeben. In den Fällen, wo Reagenzgläser verwendet wurden, die nicht denen der Erfindung entsprachen, ist eine unspezifische Adsorption durch die Reagenzgläser aus Glas zu beobachten, was sich durch intensive Farbentwicklung selbst im Falle von 0 ng/ml AFP sowie auch durch die Tatsache ergibt, dass der Gradient der Standardkurve niedrig ist. Wenn andererseits die Reagenzgläser gemäss der Erfindung verwendet werden, ist eine Farbentwicklung in Abwesenheit von AFP kaum zubeobachten und ausserdem sind die Gradienten der Standardkurven ziemlich hoch, d.h. eine genaue Bestimmung ist möglich.

Beispiel 8
Bestimmung von AFP

(a) Herstellung von I-AFP

20/ug AFP, extrahiert und gereinigt aus dem Ascites eines Hepatoma-Patienten nach der Methode von Nishi et al (Literaturstelle vorstehend angegeben),

125
ImCi Na I und 250/ug Chloramin T wurden in

y · · β

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- 23 -

0,225 ml 0,05 M Phosphat-Pufferlösung (pH 7,2) 60 Sekunden lang umgesetzt, und dann t>Ü0,ug Nciti i uinpyrosülfit zugegeben und wiederum 60 Sekunden lang zur Umsetzung stehen gelassen. Nach Zugabe von 5 mg KI wurde das Reaktionsgemisch einer Gelfiltration auf Sephadex G-50 unterworfen; die erste Fraktion wurde

125
zur Gewinnung von I-markiertem AFP gesammelt.

(b) Bestimmung von AFP
10

0,1 ml einer jeden AFP-StandardlÖsung, wie sie in

Beispiel 6 (d) hergestellt worden ist, und 0,1 ml

125

I-AFP, welches in Beispiel 8 (a) hergestellt

wurde, und 20.000-fach mit PBS, welches 1 % BSA enthielt, verdünnt wurde, wurden zu jedem Reagenzglas gemäss der Erfindung (hergestellt in Beispiel 6 (b)) und zu jedem Reagenzglas aus Glas, das nicht der Erfindung entsprach und nicht mit einem synthetischen Harz beschichtet worden war, zugegeben. Daraufhin wurden 0,3 ml PBS, welches 1 % BSA enthielt, zugegeben, gerührt und 18 h lang bei 4°C zur Umsetzung stehen gelassen. Nach Durchführung der Reaktion wurde jedes Reagenzglas, mit destilliertem Wasser gewaschen und die Radioaktivität eines jeden Reagenzglases gemessen. Die Ergebnisse für die Standardkurven sind in Fig. 2 wiedergegeben.

Wie aus Fig. 2 hervorgeht, erlauben die Reagenzgläser gemäss der Erfindung eine genaue Bestimmung, was auf die grösseren Gradienten der Standardkurven zurückzuführen ist.

Claims

• #·· • α * O O · β Ί??Ί R?9 HOFFMANN · EITLE & PARTNER PATENT-UND RECHTSANWÄLTE PATENTANWÄLTE DIPL.-ING. W. EITLE · DR. RER. NAT. K. HOFFMANN · DIPL.-ΙΝβ. W. LEHN □IPU--ING. K. FOCHSLE · DR. RER. NAT. B. HANSEN · DR. RER. NAT. H.-A. BRAUNS · DIPL.-ΙΝβ. K. GORG DIPL.-ING. K. KOHLMANN · RECHTSANWALT A. NETTE 38 803 m/fg MOCHIDA PHARMACEUTICAL CO., LTD., Tokyo / Japan Träger zur immunochemisehen Bestimmung und Messreagentien unter Verwendung derselben Pate ntansprüche

1. Träger zur immunochemisehen Bestimmung mit einer "für den Kontakt mit der zu bestimmenden Substanz adaptierten Oberfläche, dadurch

gekennzeichnet-, dass die genannte Oberfläche mit einem synthetischen Harz beschichtet ist.

2. Träger gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass dieser einen Behälter umfasst und die genannte Oberfläche eine Innenwand des Behälters darstellt.

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3. Träger gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , dass der Behälter ein Reagenzglas darstellt.

4. Träger gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass der Träger Glaskugeln umfasst.

5. Träger gemäss einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , dass derselbe'aus Glas besteht.

6. Träger gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass das synthetische Harz aus der Gruppe der thermoplastischen Harze und wärmehärtbaren Harze ausgewählt wird.

7. Träger gemäss einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet , dass das synthetische Harz aus der Gruppe, bestehend aus Siliconharz, Polystyrolharz, Acrylharz und Fluor= harz ausgewählt wird.

8. Reagens zur immunochemisehen Bestimmung g e kennzeichnet durch:

a) insolubilisierte Antikörper oder insolubilisierte Antigene, die an die Oberfläche eines Trägers aus Glas gebunden sind, wobei die Oberfläche mit einem synthetischen Harz beschichtet ist, und

b) markierte Antikörper oder markierte Antigene.

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9. Reagens gemäss Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet , dass der Träger eine innere Oberfläche eines Behälters umfasst.

10. Reagens gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet , dass der Behälter ein Reagenzglas darstellt.

11. Reagens gemäss Anspruch 8, dadurch g e -

kennzeichnet, dass der Träger Glaskugeln umfasst.

12. Reagens gemäss einem oder mehreren der Ansprüche 8 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das synthetische Harz aus der Gruppe bestehend aus Siliconharz, Polystyrolharz, Acrylharz und Fluorharz ausgewählt wird.

13. Reagens gemäss Anspruch 8, dadurch g e -

kennzeichnet, dass mindestens einer der genannten insolubilisierten Antikörper oder insolubilisierten Antigene und die genannten markierten Antikörper oder markierten Antigene in lyophilisierter Form vorliegen.