NL8302179A

NL8302179A - Dragers voor immunochemische meting en meetreagentia waarbij deze dragers worden gebruikt.

Info

Publication number: NL8302179A
Application number: NL8302179A
Authority: NL
Original assignee: Mochida Pharm Co Ltd
Priority date: 1982-06-18
Filing date: 1983-06-17
Publication date: 1984-01-16
Also published as: FR2534031A1; SE8303496L; JPS58221166A; GB8315228D0; GB2125963A; SE8303496D0; AR230886A1; DE3321629A1

Description

* t . .......... * VO 4884 k.

Dragers voor immunochemische meting en meetreagentia waarbij deze dragers worden gebruikt.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op dragers voor immunochemische meting, waarvan het oppervlak bekleed is met synthetische hars, en op reagentia voor immunochemische meting waarbij deze dragers worden gebruikt.

5 De laatste jaren zijn verscheidene reagentia voor immu nochemische meting gebruikt als middel om concentraties te meten van fysiologisch actieve stoffen zoals peptide-hormonen, steroïden, eiwitten enz., alsmede concentraties van geneesmiddelen die in vivo zijn toegediend, welke in zeer kleine hoeveelheden in fysiologische monsters zoals 10 serum, urine enz. aanwezig zijn. Hiervan worden vaak reagentia gebaseerd op de enzym-immuno-analyse, radio-immuno-analyse, fluoro-inmuno-analyse enz. gebruikt omdat deze een hoge meetgevoeligheid en een uitstekende kwantitatieve werkzaamheid hebben.

Deze reagentia omvatten in het algemeen (a) een onoplos-15 baar gemaakt antilichaam of onoplosbaar gemaakt antigeen,. verkregen door een antilichaam of antigeen dat met de te meten stof correspondeert, aan een drager te binden, en (b) een gemerkt antilichaam of gemerkt antigeen, verkregen door een antilichaam of antigeen te merken met een merkingsmid-del zoals een enzym, enz. Meting waarbij een dergelijk reagens wordt 20 gebruikt, wordt als volgt uitgevoerd: een te meten stof en een gemerkt antilichaam of gemerkt antigeen wordt in reactie gebracht met een onoplosbaar gemaakt antilichaam of onoplosbaar gemaakt antigeen, waarna het merkingsmiddel dat aan de drager is gebonden (vaste fase) en het niet gebonden maar in de vloeibare fase aanwezige merkingsmiddel worden ge-25 scheiden. Daarna wordt de activiteit van het merkingsmiddel in hetzij de vaste fase, hetzij de vloeibare fase gemeten, waardoor de hoeveelheid of concentratie van de te meten stof wordt vastgesteld. Daarom moet de drager niet antigeen, antilichaam of andere componenten die aan de immunologische reactie geen deel hebben, non-specifiek adsorberen.

30 Anderzijds is getracht om als dragers voor reagentia houders te gebruiken zoals bijvoorbeeld testbuizen enz. Met andere woorden heeft men verwacht dat door een antigeen of antilichaam te binden aan het oppervlak van de binnenwand van een houder zoals een testbuis, enz., 8302179 i 2 en gemerkt antigeen of gemerkt antilichaam in deze houder te brengen, een reagens wordt verkregen dat geschikt en stabiel voor opslag is en een onmiddellijke meting mogelijk maakt en derhalve geschikt kan worden toegepast.

5 De opslagstabiliteit van een dergelijk reagens is ech ter tot op heden niet bevredigend geweest en vertoonde het probleem dat na verscheidene maanden opslag de nauwkeurigheid en gevoeligheid van de meting afnemen. De uitvinders van de onderhavige uitvinding hebben een uitgebreid onderzoek verricht om de oorzaak voor dit probleem op te 10 helderen en als resultaat hebben ze gevonden dat de kwaliteitsverande-ring van een reagens na opslag kan worden toegeschreven aan het feit dat de als dragers toegepaste kunststof-testbuizen een kleine maar invloedrijke gaspermeabiliteit bezaten.

Hoewel glas een dragermateriaal is dat voor gas niet 15 permeabel is, omdat glas stoffen op non-specifieke wijze adsorbeert, is het gebruik van glas als drager niet geschikt. De uitvinders hebben een verdergaand onderzoek gepleegd om dit probleem op te lossen en hebben als resultaat gevonden dat door bekleding van het glasoppervlak met een synthetische hars, de non-specifieke adsorptie kan worden verhinderd. Het 20 gebruik van glas dat bekleed is met een synthetische hars als drager voor een reagens voor immunochemische meting was tot op heden niet bekend.

Doel van de onderhavige uitvinding is om dragers voor immunochemische meting te verschaffen die een non-specifieke adsorptie verhinderen.

25 Een ander doel van de onderhavige uitvinding is om dra gers voor immunochemische meting te verschaffen die worden verkregen door een glasoppervlak te bekleden met synthetische hars.

Een ander doel van de onderhavige uitvinding is om reagentia voor immunochemische meting te verschaffen, die (a) een on-30 oplosbaar gemaakt antilichaam of onoplosbaar gemaakt antigeen, verkregen door binding van het antilichaam of antigeen aan een glazen drager waarvan het. oppervlak bekleed is met synthetische hars, kan (b) een gemerkt antilichaam of gemerkt antigeen omvatten.

In de tekening is nu 35 fig. 1 een grafiek, waarin de standaardkrommen van voor beeld VII worden getoond? en 8302179 * 3 fig. 2 een grafiek, waarin de standaardkrommaivan voorbeeld VIII worden getoond.

Bekleding van een glazen drager kan als volgt worden uitgevoerd: een materiaal dat als drager bestemd is, zoals glaskor-5 reis, een glazen testbuis, enz., wordt met een synthetische harsoplossing of suspensie bevochtigd om genoemde hars op het oppervlak van de drager te doen hechten. Overmaat hars wordt indien nodig verwijderd en het bevochtigde dragermateriaal wordt daarna aan een warmtebehandeling onderworpen. De hars die na de warmtebehandeling niet op het dragermateriaal 10 is bekleed, wordt door wassen verwijderd. De aldus behandelde drager wordt daarna verbonden met een antilichaam of antigeen om een onoplosbaar gemaakt antilichaam of onoplosbaar gemaakt antigeen te verkrijgen.

Als bekledingsmiddel kunnen verscheidene synthetische harsen worden gebruikt. De synthetische hars kan in overeenstemming met 15 de chemische structuur en de werkingseigenschappen, worden ingedeeld in thermoplastische harsen en thermohardende harsen. De eerstgenoemde harsen zijn lineraire polymeren en worden week en vloeibaar'bij verwarming en worden vast bij afkoeling, welke cyclus herhaalbaar is. De laatstgenoemde zijn zodanige harsen dat hun condensatieprodukten in begin-20 stadia een lineaire structuur hebben maar grote moleculen zijn; bij verwarming worden ze eerst week en vloeibaar, maar ondergaan daarna een ver-knopingsreactie tussen de moleculen waarbij onoplosbare en niet smeltbare materialen met een driedimensionale structuur worden gevormd. Elk van deze typen synthetische harsen kan in de onderhavige uitvinding wor-25 den toegepast.

Als thermoplastische hars kunnen vinylchlorideharsen, polystyreenharsen, polypropeenharsen, acrylharsen, fluorharsen enz. worden gebruikt; als thermohardende hars kunnen siliconenharsen, fenolhar-sen, epoxyharsen, enz. worden gebruikt. Hiervan hebben de siliconen-30 harsen, polystyreenhar sen, acrylharsen en fluorharsen bijzondere voorkeur.

Als siliconenharsen kunnen worden genoemd siliconenoliën met een lineaire structuur, siliconenrubbers met een partieel verknoopte structuur, siliconenharsen die op het moment van gebruiken volledig verknoopt en gehard zijn enz. Hiervan hebben de siliconenoliën bijzondere 35 voorkeur.

Als polystyreenharsen kunnen worden genoemd voor algemene 8302179 4 doeleinden geschikte styreenhaxsen die verkregen worden door massa-homopolymerisatie van styreen; warmtebestendige styreenharsen, verkregen door een lineair polymeer te maken met een hogere polymerisatiegraad dan de voor algemene doeleinden geschikte styreenharsen of door copolymeri-5 satie met een monomeer dat warmtebestendigheid verleent, of door polymerisatie van α-methylstyreen; styreenharsen met hoge slagvastheid, verkregen door entpolymerisatie van styreen en butadieen, enz. Hiervan de voor algemene doeleinden geschikte styreenharsen bijzondere voorkeur.

Als acrylharsen kunnen worden genoemd polymeren van.

10 acrylzuuresters en polymeren van methacrylzuuresters, waarvan de polymeren van acrylzuuresters bijzondere voorkeur hebben.

Als fluorharsen kunnen worden genoemd polytetrafluor-etheen en polychloortrifluoretheen, waarvan het polytetrafluoretheen bijzondere voorkeur heeft.

15 Deze synthetische harsen kunnen worden gebruikt als een oplossing in een organisch oplosmiddel zoals hexaan, aceton, methylchlo-ride, chloroform, dichloroethaan, trichloroetheen, enz., in een concentratie van 1-30 w/w%, als poeder, als pasta, of als suspensie. Indien opgelost in een organisch Oplosmiddel, wordt de bekleding uitgevoerd 20 door het oppervlak van de drager in contact te brengen met de oplossing en het oppervlak vervolgens aan een warmtebehandeling te onderwerpen. Anderzijds kan een synthetische harsoplossing op het oppervlak van de drager worden gesproeid en daarna de warmtebehandeling worden uitgevoerd. De bekleding kan ook worden uitgevoerd door gesmolten synthetische hars 25' te gebruiken bij een temperatuur boven zijn smeltpunt in plaats van een oplossing in een organisch oplosmiddel te gebruiken. Verder is ook mogelijk om de synthetische hars tot een pasta te maken welke op het oppervlak van de drager kan worden bekleed, waarna verwarmd wordt om een bekleding te realiseren. Wanneer bijvoorbeeld een siliconenhars op een 30 dragermateriaal moet worden bekleed, wordt de hars opgelost in een oplosmiddel in een concentratie van 1 - 30%, bij voorkeur 5 - 10%, wordt het oppervlak van de drager in contact gebracht met deze oplossing, waarna overmaat oplossing wordt verwijderd, en wordt een warmtebehandeling uitgevoerd gedurende een uur bij ongeveer 180°C. Na koelen wordt de hars die 35 niet bekleed is, door wassen met trichloroetheen verwijderd. Na drogen wordt een beklede drager verkregen.

8302179 r~-«- # * 5 ·%.

De vorm van de drager kan worden gevarieerd, en bij wij-e van voorbeeld kunnen verscheidene vormen zoals korrels, testbuizen, trommelvormige korrels, titerplaten, ampullen, spuiten, enz. worden gebruikt.

5 Teneinde antilichaam of antigeen te binden aan de met synthetische hars beklede drager, kunnen procedures worden uitgevoerd zoals die beschreven in "Clinica Chimica Acta", 48, 15 (1973), "Journal of Immunology", 116, 1554 (1976), en "Science", 158, 1570 (1967). Bijvoorbeeld wordt anti a-fetoprotelne-antilichaam opgelost in een concentratie 10 van 1 mg/ml in glycinebuffer pH 8,2, en deze antilichaam-oplossing wordt in contact gebracht met glaskorrels of een glazen testbuis, die met een siliconenhars is bekleed, gevolgd door een reactie gedurende 3 uur bij 37°C. Daarna wordt gewassen met fysiologische zoutoplossing, gevolgd door toevoeging van fosfaatbufferoplossing met een pH 7,0, welke 1% normaal 15 konijnenserum bevat, en laat men gedurende een nacht bij 4°C staan om een antilichaam gebonden drager te vervaardigen.

Als het in immunochemische meting te gebruiken merkings- middel, kunnen enzymen (bijvoorbeeld peroxydase, β-galactosidase, basisch fosfatase, glucoseoxidase, enz.), radioactieve isotopen (bijvoorbeeld.

125 3 20 I, H, enz.), fluorescerende materialen (bijvoorbeeld fluorescelne isothiocyanaat, tetramethylrhodamine isothiocyanaat, enz.), enz. worden gebruikt. Wanneer de gevoeligheid, nauwkeurigheid, eenvoud, enz. in aanmerking worden genomen, heeft het gebruik van een enzym de meeste voorkeur. De methode voor het merken van het antilichaam of antigeen met deze 25 merkingsmiddelen is in het algemeen bekend, en merken met enzymen kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd volgens de methode van Nakane, Kawaoi et al. (“J. Histochem. Cytochem.", 22, 1084 (1974)).

Gebruikmakend vein het bovenstaand verkregen meetrea-gens, samengesteld uit het onoplosbaar gemaakte antilichaam of onoplos-30 baar gemaakte antigeen en het gemerkte antilichaam of gemerkte antigeen, kunnen verscheidene fysiologisch werkzame stoffen worden gemeten. Bijvoorbeeld wordt een te testen oplossing die tot een geschikte concentratie is verdund, toegevoegd aan een testbuis die daaraan gebonden antilichaam draagt en wordt de antigeen-antilichaamreactie uitgevoerd. Na de reactie 35 wordt de testbuis gewassen, en wordt gemerkt antilichaam aan de testbuis toegevoegd. Daarna wordt deze testbuis gewassen, waarna de hoeveelheid 8302179 6 aan de testbuis gebonden gemerkt antilichaam met geschikte middelen wordt gemeten- De hoeveelheid van de te meten stof wordt berekend door vergelijking van de gemeten waarde met de standaardkromme, die verkregen wordt door op soortgelijke wijze te werken bij de standaard van een be-5 kende concentratie -

Omdat omstandigheden zoals de hoeveelheid van het monster, de concentratie en hoeveelheid van het gebruikte gemerkte antilichaam, de reactietemperatuur en de tijd, enz. afhankelijk van de aard van de te meten stof, de titer van het gebruikte antilichaam, de 10 aard van het merkingsmiddel, enz. kunnen variëren, worden bij het in de praktijk brengen van de meting optimale condities in elk meetsysteem proefondervindelijk vastgesteld.

De reagentia voor immunochemische meting volgens de onderhavige uitvinding omvatten zoals bovenstaand beschreven a) een 15 onoplosbaar gemaakt antilichaam of onoplosbaar gemaakt antigeen en b) een gemerkt antilichaam of gemerkt antigeen, en desgewenst kan het reagens verder voor het gemak van de meting een buffer, een standaardoplossing en, in het geval een enzym als merkingsmiddel wordt gebruikt, een en-zymsubstraat een oplossing voor het oplossen van het enzymsubstraat, een 20 reactiestopper, enz. bevatten.

De bufferoplossing wordt gebruikt om het monster tot een geschikte concentratie te verdunnen en ook om de plaats van de anti-geen-antilichaamreactie op een geschikte pH en ion-sterkte te houden. Als een dergelijke bufferoplossing kunnen op het immunochemische gebied 25 conventionele en gebruikelijke bufferoplossingen, bijvoorbeeld glycine gebufferde zoutoplossing, fosfaat gebufferde zoutoplossing, boraat gebufferde zoutoplossing enz. worden gebruikt. Om de reproduceerbaarheid van de reactie te vergroten, kan verder een geschikte hoeveelheid eiwit, bijvoorbeeld 0,01 - 5%, bij voorkeur 0,5 - 2% van runderserumalbumine 30 (verder aangeduid als BSA) aanwezig zijn.

Het gemerkte antilichaam of gemerkte antigeen wordt verkregen door een antilichaam of antigeen te merken met een enzym, een radioactief isotoop of een fluorescerende stof. Door meting van de gemerkte stof die bindt aan of niet bindt aan de te meten stof, die gebonden 35 is aan de vaste fase door de antigeen-antilichaamreactie, kan de te testen fysiologisch werkzame stof in de oplossing worden gemeten.

8302179

JT

7

Sommige of alle bestanddelen van het meetreagens volgens de onderhavige uitvinding kunnen in gelyofiliseerde vorm verkeren en indien dat het geval is, kan met het reagens een geschikt oplosmiddel voor het oplossen vein de gelyofiliseerde bestanddelen worden ver-5 bonden. Verder kan het reagens volgens de onderhavige uitvinding worden gepresenteerd in de vorm van een meet-set door benodigdheden zoals test-buizen, pipetten enz. bij te voegen om zijn gebruik te vergemakkelijken.

Voorbeelden van de door de meetreagentia volgens de onderhavige uitvinding te meten stoffen omvatten eiwithormonen zoals men-10 selijk chorion-gonadotrofine, insuline,menselijk groeihormoon, enz; eiwit-houdende stoffen zoals α-fetoprotelne (verder aangeduid als AFP), type B hepatitis virus (HBs), immunoglobuline, een antigeen-antilichaam-complex, celluloplasmine, transferrine, enz., en haptenen zoals thyroxine, estradiol, progesteron, testosteron, fenytolne, fenobarbital, enz.

15 De meetreagentia volgens de onderhavige uitvinding zijn vrij van ηση-specifieke adsorptie door dragers, en ze hebben daardoor niet alleen een hoge meetnauwkeurigheid, maar ook een uitstekende stabiliteit welke een stabiele opslag gedurende een jaar of langer mogelijk maakt.

20 De onderhavige uitvinding wordt meer in het bijzonder beschreven aan de hand van het volgende experimentele voorbeeld en de bereidings- en meetvoorbeelden.

Experimenteel voorbeeld Stabiliteit van AFP meetreagens 25 Een conventioneel AFP meetreagens, waarin van een poly- styreenhars testbuis als drager gebruik wordt gemaakt, en een AFP meetreagens volgens de onderhavige uitvinding, waarin van een glazen testbuis gebruik wordt gemaakt die bekleed is met siliconenhars, werden bereid volgens het onderstaand beschreven voorbeeld VI, en hun opslagstabilitei-30 ten werden vergeleken. Ze werden gedurende 1 maand, 3 maanden en 1 jaar bij 4°C opgeslagen. Daarna werden ze onderzocht op stabiliteit van hun reactiviteiten, gebruikmakend van een blanco oplossing (die geen AFP bevatte) en een AFP oplossing (80 ng/ml). Optische obsorbanties van deze oplossingen werden respectievelijk gemeten door de reagentia zoals 35 in voorbeeld VII zal worden beschreven. De verschillen in optische absor-antie tussen de blanco oplossing en de AFP oplossing werden vastgesteld 8302179 8 en de resultaten met betrekking tot het verschil in absorbantie voor een opslagperiode van 0 dagen als 100% genomen, worden in tabel A getoond.

Zoals in tabel A getoond, wordt de reactiviteit (ver-5 schil in de absorbantie) bij het conventionele reagens na een opslag gedurende een jaar verminderd tot 60%, terwijl bij het reagens volgens de onderhavige uitvinding praktisch geen vermindering van reactiviteit werd waa-genomen, zelfs niet na opslag gedurende een jaar. De vermindering van de reactiviteit veroorzaakt vanzelfsprekend een vermindering van 10 de meetnauwkeurigheid en meetgevoeligheid.

TABEL A

Opslagperiode 0 1 maand 3 maanden 1 jaar

Conventioneel reagens 100% 94% 82% 60%

Reagens volgens 15 de uitvinding 100% 98% 98% 97%

Voorbeeld I

Bereiding van met siliconenhars beklede testbuizen

Een hoeveelheid van 1 ml van een met n-hexaan tot 10% verdunde oplossing van een siliconenhars (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd.

20 KC88) werd in elk van een reeks glazen testbuizen gebracht (10 x 75 mm) . Nadat men deze testbuizen gedurende 10 min bij kamertemperatuur had laten staan, werd de oplossing van de siliconenhars in n-hexaan door opzuigen verwijderd. Daarna werden de testbuizen gedurende 1 uur op 180°C verwarmd en de gelegenheid gegeven om af te koelen. Deze testbuizen werden 25 gewassen met 2 ml trichloroetheen, en gedroogd om met siliconenhars beklede testbuizen te vervaardigen.

Voorbeeld II

Bereiding van met siliconenhars beklede glaskorrels

Honderd glaskorrels (met een diameter van 8 mm) werden 30 gedompeld in een 10%-ige n-hexaanoplossing van een siliconenhars (Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. KC88). Nadat men ze gedurende 10 min bij kamertemperatuur had laten staan, werden de korrels met een pincet in een glazen schaal gebracht, daarna gedurende een uur op 180°C verwarmd en de 8302179 gelegenheid gegeven om af te koelen. Ze werden vervolgens 5 keer met 50 ml trichloroetheen gewassen om met siliconenhars beklede glaskorrels te vervaardigen.

9

Voorbeeld III

5 Bereiding van met polystyreenhars beklede testbuizen

Men bracht een hoeveelheid van 1 ml van een polystyreenhars (Sanko Plastic Co., Ltd.), die bij 180eC was gesmolten, in elk van een reeks glazen testbuizen (10 x 75 mm), verwijderde snel door aanzuigen en liet afkoelen om met polystyreen beklede testbuizen te vervaardigen.

10 Voorbeeld IV

Bereiding van met acrylhars beklede testbuizen

Men bracht een hoeveelheid van 1 ml van een acrylhars (Sanko Plastic Co., Ltd.), die bij 200°C was gesmolten, in elk van een reeks glazen testbuizen (10 x 75 mm), verwijderde snel door aanzuigen 15 en liet afkoelen om met acrylhars beklede testbuizen te vervaardigen. Voorbeeld V

Bereiding van met fluorhars beklede testbuizen

Een suspensie van een fluorhars (Asahi Glass Co., Ltd.) werd versproeid over de binnenwanden van glazen testbuizen (10 x 75 mm), 20 verhit tot 400°C, en de gelegenheid gegeven om af te koelen teneinde met fluorhars beklede testbuizen te vervaardigen.

Voorbeeld VI

Bereiding van AFP meetreagens a) Bereiding van anti-AFP antilichaam 25 Uit de ascites van een hepatoma-patiënt volgens de me thode van Nishi et al ("Cancer Res.", 30, 2707 (1970)) geëxtraheerde en gezuiverde AFP werd opgelost in fysiologische zoutoplossing bij een concentratie van 2 mg/ml, waarvan 0,5 ml gemengd werd met 0,5 ml van Freund's compleet adjuvans. Konijnen werden 5 keer of vaker gelmmuni-30 seerd met dit mengsel om anti-AFP serum te verkrijgen. Dit anti-serum werd twee keer met natriumsulfaat uitgezout en de globulinefractie werd verzameld om anti-AFP antilichaam te bereiden.

b) Bereiding van anti-AFP antilichaam gebonden testbuizen 8302179

Aan de respectievelijk in de voorbeeld I, III, IV en V

35 bereide beklede testbuizen werd 0,5 ml fosfaat gebufferde zoutoplos

sing (verder aangeduid als PBS) toegevoegd, welke 1 mg van het anti-AFP

10 antilichaam bevatte. Er werd gedurende 3 uur bij 37°C een reactie gerealiseerd, waarna de testbuizen met PBS werden gewassen om antilichaam gebonden testbuizen te bereiden. - c) Bereiding van met enzym gemerkt anti-AFP antilichaam 5 Een met enzym gemerkt antilichaam werd bereid volgens de methode Nakane, Kawaoi et al ("J. Histochem. Cytochem.”, 22, 1084 (1974)). Men loste 5 mg mierikswortel peroxidase (verder aangeduid als HRPO) op in 1 ml 0,3M natriumwaterstofcarbonaatoplossing. Men voegde daaraan 0,1 ml van een 1%-ig 2,4-dinitrofluorobenzeen toe, en roerde 10 het mengsel gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Aan deze oplossing voegde men 1 ml van 0,08 M natriumperjodaatoplossing toe en men mengde de oplossing bij kamertemperatuur gedurende 30 min, waarna men 1 ml van een 0,16 M ethyleenglycoloplossing toevoegde en het mengsel verder gedurende een uur bij kamertemperatuur voortzette. Het reactiemengsel werd 15 gedurende een nacht gedialyseerd tegen 0,01 M carbonaatbuffer pH 9,5; daarna werd 1 ml van het anti-AFP antilichaam, bereid in bovenstaande trap (a) en opgelost in 0,01 M carbonaatbuffer pH 9,5 in een concentratie van 5 mg/ml, toegevoegd en werd gedurende 3 uur bij kamertemperatuur gereageerd, waarna 5 mg natriumborohydride werd toegevoegd en de reactie 20 gedurende nog eens 3 uur bij 4°C werd voortgezet. Na de reactie werd het reactiemengsel gedurende een nacht gedialyseerd tegen PBS, gefractio-neerd en gezuiverd onder toepassing van Sephadex G 200 teneinde met HRPO gemerkt anti-AFP antilichaam te bereiden.

d) Bereiding van AFP standaardoplossing 25 AFP werd geëxtraheerd en gezuiverd uit de ascites van een hepatoma-patiënt volgens de methode van Nishi et al., supra. Het AFP werd opgelost in PBS, dat 1% BSA en 0,1% Tween 20 bevatte, in concentraties van respectievelijk 160, 80, 40, 20 en 10 ng/ml.

e) Bereiding van AFP meetreagentia 30 Gebruikmakend van de anti-AFP antilichaam gebonden test buizen en het met HRPO gemerkte anti-AFP antilichaam, die respectievelijk in bovenstaande trappen (b) en (c) zijn bereid, werden AFP meetreagentia bereid die de volgende combinaties bezaten: 1) anti-AFP gebonden testhuis 35 2) met HRPO gemerkt anti-AFP antilichaam 3) AFP standaardoplossing 8302179 11 4) enzymsubstraat (o-fenyleendiamins) 5) oplossing om het enzymsubstraat op te lossen (PBS dat 6 mM/1 water-stofperoxyde bevat) 6) reactiestopper (1 N zoutzuur) 5 7) bufferoplossing (PBS, dat 1% BSA bevat).

Voorbeeld VII Meting van &FP

De AFP standaardoplossingen met de respectievelijke concentraties van het AFP meetreagens, bereid in het bovenstaand beschre-10 ven voorbeeld VI, werden in een hoeveelheid van telkens 0,1 ml gebracht in de testbuizen volgens de onderhavige uitvinding die met verscheidene synthetische harsen waren bekleed, en ter vergelijking in andere testbuizen dan volgens de onderhavige uitvinding, die niet met enige synthetische hars waren bekleed. Men voegde 0,4 ml PBS dat 1% BSA bevatte, 15 aan elke testbuis toe, en roerde vervolgens en liet gedurende 2 uur staan om een reactie te bewerken. Na voltooiing van de reactie werd elke testbuis met gedestilleerd water gewassen. Vervolgens werd 0,5 ml toegevoegd van het met HRPO gemerkte anti-AFP, bereid in het bovenstaand beschreven voorbeeld VI (c) en 2000-voudig verdund met PBS dat 1% BSA be-20 vatte, en werd gedurende 2 uur bij kamertemperatuur een reactie uitgevoerd. Na voltooiing van de reactie werd elke testbuis met gedestilleerd water gewassen. Om de HRPO activiteit te meten, werd 0,5 ml substraatoplossing (PBS), dat 6 mM/1 waterstoiperoxyde en 20 mM/1 o-fenyleendiamine bevatte) aan elke testbuis toegevoegd en liet men het mengsel gedurende 30 25 minuten bij kamertemperatuur reageren terwijl er tegen licht was afgeschermd. Men voegde 2 ml IN zoutzuur toe en mengde, en de intensiteit van de ontwikkelde kleur werd gemeten bij een golflengte van 492 nm. De resultaten voor de standaardkrommen worden in fig. 1 gegeven. Wanneer de andere testbuizen dan die volgens onderhavige uitvinding werden gebruikt, 30 kon worden waargenomen, dat non-specifieke adsorptie door de glazen testbuizen optrad zoals bleek uit de intensieve kleurontwikkeling, zelfs in het geval van 0 nh/ml AFP en verder uit het feit dat de gradiënt van de standaardkromme klein was. Wanneer daarentegen de testbuizen volgens de onderhavige uitvinding werden gebruikt, was een nauwkeurige meting 35 mogelijk, omdat nauwelijks een kleurontwikkeling werd waargenomen wanneer AFP afwezig was en omdat verder de gradiënten van de standaardkrommen 8302179 12

groot waren. voorbeeld VIII Meting van AFP

125

a) Bereiding van I-AFP

5 Men bracht 20 yUg AFP, geëxtraheerd en gezuiverd uit de ascites van een hepatoma-patiënt volgens de methode van Nishi et al., 125 supra, 1 mCi van Na I en 250 ^,ug chloramine T gedurende 60 sec tot reactie in 0,225 ml 0,05 M fosfaatbufferoplossing (pH 7,2), waarna 600 ^,ug na-triumpyrosulfiet daaraan werd toegevoegd en men gedurende 60 sec liet rea-10 geren. Na toevoeging van 5 mg KI, werd het reactiemengsel onderworpen aan gelfiltratie over Sephadex G-50, en de eerste fractie werd verzameld om 125 met I gemerkt AFP te berexden.

b) Meting van AFP

Men voegde 0,1 ml van elke AFP standaardoplossing, be- 125

15 reid in voorbeeld VI (d) en 0,1 ml van I-AFP, bereid in voorbeeld VIII

(a) en 20.000-voudig verdund met PBS dat 1% BSA bevatte, toe aan elke testbuis volgens de onderhavige uitvinding, vervaardigd in voorbeeld VI

(b) , en aan elke andere glazen testbuis dan volgens de onderhavige uitvinding, die niet met enige synthetische hars was bekleed. Daarna werd 20 0,3 ml PBS dat 1% BSA bevatte, toegevoegd, er werd gedurende 18 uur bij 4°G geroerd en hereageerd. Na de reactie werd elke testbuis gewassen met gedestilleerd water, en werd de radioactiviteit van elke testbuis gemeten. De resultaten voor de standaardkrommen worden gegeven in fig. 2.

Zoals men uit fig. 2 ziet, maakten testbuizen volgens 25 de onderhavige uitvinding een nauwkeurige meting mogelijk vanwege de grotere gradiënten van de standaardkrommen.

8302179

Claims

1. Drager voor immunochemische meting, welke een aan contact met een te meten stof aangepast oppervlak heeft, welk oppervlak bekleed is met een synthetische hars.

2. Drager volgens conclusie 1, waardin de drager een houder 5 omvat en het oppervlak een binnenwand van de houder omvat.

3. Drager volgens conclusie 2, waarin de houder een test-buis is.

4. Drager volgens conclusie 1, waarin de drager glaskorrels omvat.

5. Drager volgens conclusie 1, waarin de drager gemaakt is van glas.

6. Drager volgens conclusie 2, waarin de drager gemaakt is van glas.

7. Drager volgens conclusie 3, waarin de drager gemaakt is 15 van glas.

8. Drager volgens conclusie 1, waarin de synthetische hars gekozen is uit de groep, bestaande uit thermoplastische harsen en thermo-hardende harsen.

9. Drager volgens conclusie 1, waarin de synthetische hars 20 gekozen is uit de groep bestaande uit siliconenhars, polystyreenhars, acrylhars en fluorhars.

10. Drager volgens conclusie 2, waarin de synthetische hars gekozen is uit de groep bestaande uit siliconenhars, polystyreen- . hars, acrylhars en fluorhars.

11. Drager volgens conclusie 3, waarin de synthetische hars gekozen is uit de groep bestaande uit siliconenhars, polystyreenhars, acrylhars en fluorhars.

12. Drager volgens conclusie 4, waarin de synthetische hars gekozen is uit de groep bestaande uit siliconenhars, polystyreenhars, 30 acrylhars en fluorhars.

13. Drager volgens conclusie 5, waarin de synthetische hars gekozen is uit de groep, bestaande uit siliconenhars, polystyreenhars, acrylhars en fluorhars.

14. Drager volgens conclusie 6, waarin de synthetische hars 8302179 gekozen is uit de groep, bestaande uit siliconenhars, polystyreenhars, acrylhars en fluorhars.

15. Drager volgens conclusie 7, waarin de synthetische hars gekozen is uit de groep, bestaande uit siliconenhars, polystyreenhars, 5 acrylhars en fluorhars.

16. Reagens voor immunochemische meting, omvattende a) onoplosbaar gemaakte antilichamen of onoplosbaar gemaakte antigenen, gebonden aan een glazen drageroppervlak-, welk oppervlak bekleed is met synthetische hars, en 10 b) gemerkte antilichamen of gemerkte antigenen.

17. Reagens volgens conclusie 16, waarin de drager een bin-nenwandoppervlak van een houder omvat.

18. Reagens volgens conclusie 17, waarin de houder een testbuis is.

19. Reagens volgens conclusie 16, waarin de drager glaskor rels omvat.

20, Reagens volgens conclusie 16, waarin de synthetische hars gekozen is uit de groep, bestaande uit siliconenhars, polystyreenhars, acrylhars en fluorhars.

21. Reagens volgens conclusie 17, waarin de synthetische hars gekozen is uit de groep, bestaande uit siliconenhars, polystyreenhars, acrylhars en fluorhars.

22. Reagens volgens conclusie 18, waarin de synthetische hars gekozen is uit de groep, bestaande uit siliconenhars, polystyreen- 25 hars, acrylhars en fluorhars.

23. Reagens volgens conclusie 19, waarin de synthetische hars gekozen is uit de.groep, bestaande uit siliconenhars, polystyreenhars, acrylhars en fluorhars.

24. Reagens volgens conclusie 16, waarin tenminste een van 30 de onoplosbaar gemaakte antilichamen of onoplosbaar gemaakte antigenen en genoemde gemerkte antilichamen of gemerkte antigenen in gelyofili-seerde vorm verkeert. 8302179