NO172264B

NO172264B - Immunokjemisk ettrinns-fremgangsmaate for bestemmelse av et av immunoglobulinantistoffene a, m, d eller e samt reagens for utfoerelse av fremgangsmaate

Info

Publication number: NO172264B
Application number: NO882204A
Authority: NO
Inventors: Robert Ziegelmaier
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1987-05-23
Filing date: 1988-05-20
Publication date: 1993-03-15
Also published as: US6632682B1; NO172264C; NO882204D0; CA1336063C; NO882204L; EP0292810B1; FI882356A; ES2059434T3; FI89984B; FI882356A0; DK173687B1; AU619183B2; DK277588A; EP0292810A2; EP0292810A3; DE3883073D1; DE3717401A1; JPH01118769A; DK277588D0; FI89984C

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en immunokjemisk ettrinns-fremgangsmåte for bestemmelse av et av immunoglobulinantistoffene Å, M, D eller E i en væske. Videre vedrører den en reagens for utførelse av fremgangsmåten.

Immunoglobuliner er antistoffer som dannes av organismens immunsystem mot fremmede stoffer (antigener) (f.eks. proteiner av sykdomsfremkallere, bakterielle polysakkarider, serumproteiner, vevsproteiner eller andre immunoglobuliner). Immunoglobulinmolekylet består av ett eller flere sett av fine polypeptidkjeder, to tunge kjeder med en molekylvekt på ca. 53.000 dalton og to lette kjeder på ca. 22.000 dalton som er forbundet ved disulfidbroer.

Immunoglobuliner inndeles generelt i klassene G, A, M, D og E og betegnes tilsvarende med IgG, IgA, IgM, IgD og IgE. Disse fem immunoglobul inkl as sene skiller seg fra hverandre ved de antigeniske determinantene i den tunge kjeden som betegnes som gamma—, alfa—, my—, delta— og epsilon—kjede; videre finnes det ved IgG, IgA og IgM også immunoglobulin-under-klasser.

Immunoglobuliner kan spaltes i fragmenter som også beholder den antigenbindende egenskapen, eller fragmenter uten antigenbindende egenskaper. Antigenbindende fragmenter er f.eks. Fab—, Fab'— og F(ab'fragmenter. Fragmenter uten antigenbindende egenskap er f.eks. Fc— og Fc'-fragmenter. Konsentrasjonen av immunoglobuliner i normalt menneskelige serum er (i mg/ml): IgG 8-16, IgA 1,4-4, IgM 0,5-2, IgD 0,0-0,4 og IgE 0,000017-0,00045.

Kvantitativt er immunoglobuliner av IgG-klassen sterkest representert i humant serum. Immunoglobuliner av IgM-klassen opptrer meget tidlig etter en infeksjon, deres bestemmelse er derfor av betydning for en tidlig diagnostisering av en infeksjonssykdom, eller for diagnosen av en akutt infeksjon. Immunoglobuliner av klassen IgA er det nest sterkest representerte immunoglobulinet og utgjør det viktigste sekretoriske antistoffet.

Immunoglobuliner av klassene IgD og IgE kan finnes i forhøyet konsentrasjon ved bestemte patologiske prosesser; IgE har eksempelvis mastcelle-sensibiliserende egenskaper og spiller en betydelig patogen rolle ved en rekke allergiske reak-sjoner. IgD-antistoffer finnes ved autoimmunsykdommer.

Bestemmelsen av antigenspesifikke immunoglobuliner, spesielt av en bestemt klasse, er av spesiell betydning for påvisningen av bestemte sykdommer forårsaket av parasitter, bakterier eller vira, hvorved det her er mulig å skille mellom akutte og helbredede infeksjoner, og eventuelt kan prognostiske uttalelser muliggjøres.

For bestemmelse av immunoglobuliner er en rekke immunologiske fremgangsmåter kjente. Fremgangsmåter for fysikalsk adskil-lelse av immunoglobuliner ifølge klasser, f.eks. immunodif-fusjon, immunoelektroforese eller tetthetsgradient-sentrifugering er omstendelige, unøyaktige og lett utsatt for forstyrrelser.

Antigenspesifikke immunoglobuliner kan bestemmes i såkalte direkte fremgangsmåter med immunoanalyseteknikker; for dette formålet kobles en immunkomponent med bindende affinitet for den antistoffklassen som skal bestemmes til en fast bærer, f.eks. antistoff mot jj-kjeden av humant IgM og den antigen-spesifikke immunoglobulin-andelen detekteres enten ved hjelp av merket antigen eller som kombinasjon av umerket antigen og antigenspesifikt merket antistoff. Kvantitativt bestemmes den til den faste fasen bundne andelen av de merkede immunkomponentene som er direkte proporsjonal med konsentrasjonen av antistoffet som skal påvises.

For merking anvendes eksempelvis fluorescerende og kromofore stoffer eller radioaktive isotoper, enzymer eller med immunkomponenter belagte partikler som erytrocytter eller latekspartikler; for synliggjørelse av den avsluttede reaksjonen kan det også anvendes en biologisk funksjon for det anvendte antigenet, f.eks. hemolyse.

En ulempe ved fremgangsmåten ifølge teknikkens stand består i at den ikkeantigen-spesifikke immunoglobulindelen av en antatt immunoglobulinklasse konkurrerer med den antigen-spesifikke andelen om det aktuelle fastfase-antistoffet (competition). Derved kan det avhengig av denne mengde-relasjonen komme til forskjellige resultater, selv når den antigen-spesifikke antistoffandelen er uforandret (den ikke-antigen-spesif ikke immunoglobulinandelen kan derved variere med en faktor 5 eller mer).

I alle hittil omtalte og siterte, såkalte direkte og indirekte fremgangsmåter er det vesentlig å fjerne ubundet materiale ved vasking etter omsetning (inkubering) av prøven med immunkomponentene på den faste bæreren og før omsetning med påvisningsimmunkomponentene. Denne fremgangsmåten betegnes derfor som "totrinnsfremgangsmåte".

Derfor krever en test med en ferdig bærerbundet komponent minst tre reaksjonstrinn (prøve/andre immunkomponent/påvisningsreaksjon), som er adskilt fra hverandre ved minst to vasketrinn, hvorved hvert reaksjonstrinn tar en viss reaksjonstid, slik at den samlede forsøkstiden finnes som summen av trinnene.

Hensikten med foreliggende oppfinnelse besto i å forkorte og forenkle den direkte testen og å unngå konkurransen mellom ikke-antigen-spesifikke og antigen-spesifikke immunoglobuliner for å muliggjøre en pålitelig kvantitativ bestemmelse av den antigen-spesifikke antistoffandelen.

Overraskende er det nå funnet at dette er mulig ved at bærer-bundne immunkomponenter, analyttholdig prøve og merkede påvisningsimmunkomponenter bringes sammen, uten å vaske mellom tilsatsen av prøven og tilsatsen av de merkede påvisningsimmunkomponentene.

Denne "ettrinnsfremgangsmåten" ble mulig etter at man hadde lykkes i å overvinne to uheldige påvirkningsmuligheter: For det første måtte innvirkningen av det antigen-spesifikke IgG-antistoffet overvinnes, slik at det ikke lenger, eller bare i uvesentlig grad, reagerte med antigenet, hvorved den egentlige påvisningsfremgangsmåten ville blitt forstyrret. Denne forstyrrelsen er prinsippielt gitt fordi ved bestemmelsen av antigen-spesifikke antistoffer fra en av immunoglobulinklassene IgA, IgM, IgE eller IgD i pasientprøven er det som regel samtidig tilstede antigen-spesifikke IgG-antistoffer, og generelt i en høyere konsentrasjon.

For det andre må aktiviteten av reumafaktoren (RF), dvs. antistoffer mot IgG, som tilhører forskjellige immunoglobu-linklasser, overvinnes idet disse kan føre til feilaktige resultater. Denne feilen muliggjøres ved at RF bindes til fast fase-antistoffet og bindes via det av RF bundne antigen-spesifikke IgG-antigenet og det oppnås derved en falsk positiv påvisningsreaksjon.

Begge disse forstyrrelsesmulighetene kunne eksempelvis unngås ved tilsats av anti-human-IgG, gamma-kjede, ("RF-absorbens" fra Behringwerke AG) til prøven (f.eks. serum).

Gjenstand for oppfinnelsen er en immunokjemisk ettrinns-fremgangsmåte for bestemmelse av et av immunoglobulinantistoffene A, M, D eller E i en væske, hvorved en fast fase, hvortil antistoffer mot denne immunoglobulin-klassen eller et fragment av et slikt antistoff er bundet, bringes i kontakt med denne væsken hvorved immunoglobulinet fra denne klassen bindes til den faste fasen, og denne faste fasen bringes i kontakt med et antigen som eventuelt bærer et merkemiddel og et merket antistoff eller et merket fragment av et antistoff mot antigenet, dersom antigenet ikke er merket, og fra mengden av det til den faste fasen bundne merkemidlet bestemmes mengden av immunoglobulinantistoffet. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at den faste fasen samtidig står i kontakt med væsken som inneholder immuno-globulinantistof f et som skal bestemmes og det eventuelt merkede antigenet, hvorved det til væsken er tilsatt antihumant IgG (-y-kjede) for fjerning av antigen-spesif ikt IgG-antistoff og reumatoidfaktoraktivitet.

Anti-humant-IgG, gamma-kjede, ("RF-absorbens" fra Behringwerke AG) kan eksempelvis tilsettes til prøvefortynnings-bufferen, fortrinnsvis i en mengde slik at i middel 50 mg/ml IgG kompleks bindes i serum (beregnet på basis av den ufortynnede prøven).

Ved disse forholdsregler muliggjøres en ettrinnsfremgangs-måte, hvorved prøven kan testes i en faktor 3 til 8 større fortynning (f.eks. 1:700) sammenliknet med totrinnsfremgangsmåten ifølge teknikkens stand (forsøksfortynning 1:100 til 1:200).

Samtidig unngås den nevnte konkurransen (competition) praktisk talt fullstendig, hvorved det er mulig korrekt og reproduserbart å oppnå mengdebestemmeIse og en høyere påvisningsfølsomhet (se tabell 2).

Foretrukket er en utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen hvori det anvendes merket antigen.

Det kan imidlertid også anvendes umerket antigen og et mot dette antigenet rettet merket antistoff eller et merket fragment av et slikt antistoff.

For merking anvendes eksempelvis fluorescerende og kromofore stoffer eller radioaktive isotoper, enzymer eller partikler belagt med immunkomponenter som erytrocytter eller latekspartikler; for synliggjørelse av den avsluttede reaksjonen kan det også anvendes en biologisk funksjon av det anvendte antigenet, f.eks. hemolyse.

Fortrinnsvis anvendes et enzym.

Fortrinnsvis bindes til den faste fasen antistoffer mot immunoglobulinklassen M eller fragmenter av slike antistoffer som har beholdt reaktiviteten med disse immunoglobulinene.

Fortrinnsvis anvendes fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for bestemmelse av antistoffer som er rettet mot hepatitt B-kjerneprotein, mot antigener av hepatitt A—, humant immun-svikt— (HIV), røde hunder— eller cytomegali—virus eller antigener av treponema pallidum eller toksoplasma gondii.

Gjenstand for oppfinnelsen er videre en reagens for utførelse av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, som er kjennetegnet ved at den minst består av antihumant IgG (-y-kjede), en bærer, hvortil det er bundet antistoffer spesifikke for humant IgM, merket antigen, som er spesifikt for dette IgM, og reagenser for påvisning eller til bestemmelse av merkingen.

Fortrinnsvis består en slik reagens minst av en bærer, hvortil de for humant IgM spesifikke antistoffene er bundet, antigen, merkede antigen-spesifikke antistoffer og reagenser for påvisning av merkingen.

Foretrukket er også et slikt middel som består av et eneste element hvori alle for fremgangsmåten påkrevde reagenser finnes i tørr form.

Som bærermateriale for den faste fasen er plaster egnede som polystyren, polyvinylklorid, polyamid eller andre syntetiske polymerer, naturlige polymerer som cellulose, samt avledede naturlige polymerer som celluloseacetat eller nitrocellulose og også glass, spesielt glassfibrer.

Bæreren kan ha form av kuler, staver, små rør og mikrotestplater. Flateformige strukturer som riflet papir, plater og membraner er også egnede. Overflaten av bæreren kan både være gjennomtrengelig og ugjennomtrengelig for vandige opp-løsninger .

Foretrukkede bærere er mikrotestplater.

En for fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen egnet fast fase fremstilles ved at et antistoff-preparat irreversibelt bindes til en bærer. Uttrykket "fastfase" brukes i foreliggende beskrivelse både for bæreren selv og også for bæreren med dertil bundne immunokjemiske reaktanter.

En irreversibel binding i foreliggende oppfinnelse foreligger eksempelvis ved 1) en adsorptiv binding som ikke spaltes ved de i fremgangsmåten anvendte reagensene som merkede immunreagenser, fortynnings- eller bufferoppløsninger, 2) en over en immunokjemisk (høyaffinitets antistoff) eller ikke immunokjemisk bindende avstandsgiver formidlet bioaffinitets-binding, hvorved avstandsgiveren kan bestå av biotin og avidin eller av andre pardannelser av reseptorer og ligander,

3) en kovalent direkte binding, eller

4) en kovalent, ved en kjemisk bifunksjonell avstandsgiver formidlet binding.

Foretrukket er den kovalente bindingen i tilfelle med anvendelse av vanngjennomtrengelige bærere, eller den adsorptive binding i tilfelle med anvendelse av vanngjennomtrengelige, og også vann-ugjennomtrengelige, bærere.

Spesielt foretrukket er den direkte adsorptive bindingen av antistoff-preparatene til polystyren som er behandlet med gammastråler som bærer.

For antistoff-merkingen kan det anvendes monoklonale eller polyklonale antistoffer samt antigen-bindende fragmenter derav som oppnås ifølge fremgangsmåter som er beskrevet som teknikkens stand.

Som antigen til fremstilling av merket antigen kommer rene proteiner, syntetiske peptider eller genteknisk fremstilte proteiner på tale, hvis fremstilling er beskrevet ifølge teknikkens stand.

Merkingen foregår ved fremgangsmåter som for de nevnte merkene er beskrevet som teknikkens stand.

I tilfelle merking av antistoff med peroksydase som enzym kan periodat-teknikken (J. Histochem. Cytochem. 1974, 22, 1084-1090) anvendes eller en fremgangsmåte ifølge J. Immunoassay

(1983), 4, 209-327, hvori partneren knyttes sammen med en heterobifunksjonell reagens.

Anvendelsesmulighetene for den beskrevne oppfinnelsen i form av en ettrinns-immuntest er prinsipielt identiske med anvendelsen av de tidligere omtalte direkte og indirekte flertrinnstestene. Den foreliggende nye fremgangsmåten adskiller seg fra disse på fordelaktig måte når det gjelder følgende tre punkter: Ved simultaninkuberingen av analyttholdig prøve og merkede immunreagenser bortfaller et inkuberingstrinn og en vaske-prosedyre, hvilket har til følge en betydelig forenkling av forsøksgjennomføringen.

Som det fremgår av de angitte eksemplene tillater ettrinns-fremgangsmåten en betydelig forkortelse av varigheten av testen, hvilket ved siden av den tidligere angitte fordelen har stor betydning for en praktisk håndterbarhet av fremgangsmåten og også muliggjør en rask påvisning av akutte infeksjoner i klinikken.

For det tredje er det ved denne ettrinns-fremgangsmåten mulig å undersøke prøven ved en høy forsøksfortynning, hvilket fører til eliminering av en mulig konkurranse (competition) og dermed tillates en pålitelig, reproduserbar bestemmelse med samtidig høyere påvisningsfølsomhet for antigen-spesifikke immunoglobuliner.

Det følgende eksemplet utgjør et utførelseseksempel av oppfinnelsen.

Eksempel

Bestemmelse av toksoplasma-spesifikt immunoglobulin M i humant serum

A. Preparat av polyklonalt anti-humant-IgM geit-anti-humant-IgM ble fremstilt som i "Methods of Enzymatic Analysis", 3. utgave 1986, bind X, "Antigens and Antibodies 1", redaktør: Hans Ulrich Bergmeyer, side 292-308.

B. Fremstilling av toksoplasma antigen

Toksoplasma gondii parasitter ble formert i bukhulen hos mus i løpet av 3 dager. Etter avlivelse av musene ble parasittene utvunnet ved spyling av bukhulen med fosfatbufret koksaltoppløsning, pH 7,2, ble vasket ved gjentatt sedimentering ved hjelp av sentrifugering og resuspendert. En på denne måten fremstilt suspensjon ble ultralyd-behandlet under avkjøling, frasentrifugert og overvæsken ble anvendt som antigen for enzymmerkingen.

C. Enzymmerking av antigenet

a) 20 mg peroksydase (POD) ble opptatt i 0,5 ml fosfatbufret koksaltoppløsning (PBS), pH 7,0 og aktivert ved tilsats av

0,6 ml natriumperjodat. Etter ca. 30 minutter ved romtemperatur ble perjodatoverskuddet fjernet ved kromatografi ("G25 Sephadex") og det brungule eluatet (aktivert POD) ble fanget opp.

b) Kobling av peroksydasen til antigenet

Til to vektdeler aktivert peroksydase ble det tilsatt 1

vektdel toksoplasma-antigen med koksalt-karbonatbuffer, pH 9,5, og dette ble blandet. Etter inkubering i 2 timer ved romtemperatur ble den dannede schiff-basen redusert ved tilsats av natriumborhydrid ( 1 mg/l mg POD). Det fargede konjugatet ble stabilisert ved tilsats av 1 mg/ml fenol og 2% > okseserumalbumin. Den optimale bruks for tynn i ngen ved testen ble bestemt ved sjakkbrett-titrering, hvorved toksoplasma-IgM-positive og —negative sera, som angitt i avsnitt E, ble vurdert i ettrinns-testen med forskjellige konsentrasjoner av antigen-peroksydase-konjugatet. Som optimal konsentrasjon ble den konsentrasjonen valgt hvorved signalforskjellen mellom positiv og negativ prøve var størst.

D. Belegging av polystyren-mikrotiterplater med anti-humant IgM

Bestrålte polystyren-mikrotiterplater (ifølge europeisk patentskrift 0 061 167) ble pr. fordypning inkubert med 100 pl av en oppløsning av anti-humant IgM i fosfatbufret koksaltoppløsning, pH 7,5, i flere timer ved romtemperatur. Den optimale konsentrasjonen av antistoffoppløsningen ble på forhånd bestemt ved serievis fortynning og uteksperimentering av disse prøvebelegningene. Deretter ble platene suget tomme, vasket med fosfatbufret koksalt-oppløsning, tørket ved hjelp av silikagel og pakket luft-og vanndamptett.

E. Bestemmelse av toksoplasma IgM-antistoffer ved ettrinns-fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen

a) En serumprøve samt en av hver av en toksoplasma IgM-positiv og toksoplasma IgM-negativ kontrollprøve ble

fortynnet 1:350 med 0,3 mol/l trisbufferoppløsning, pH 7,5, inneholdende 5 ml/100 ml toksoplasma-antistoff fritt okseserum, 0,1 ml/100 ml "Tween 20" (polyoksyetylen-sorbitanmonolaurat) og antistoff mot humant IgG (gamma-kjede) i en slik konsentrasjon at 15 mg/ml IgG, beregnet på basis av den ufortynnede prøven, bindes;

b) i ethvert tilfelle 50 pl derav ble plassert pr. fordypning på den belagte mikrotiterplaten hvor det på forhånd pr. fordypning var anbrakt 50 pl peroksydase-merket toksoplasma-antigen i på forhånd, ved sjakkbrett-titrering bestemt optimal konsentrasjon i den samme bufferen. c) forsøksplaten ble dekket og inkubert i 2 timer ved 47°C; d) deretter ble innholdet frasugd og vasket 3 ganger med PBS, inneholdende 0,1 ml/100 ml "Tween 20"; e) det ble så pr. fordypning tilsatt 100 pl kromogen (o-fenylendiamin-HCl) i citrat-fosfatbuffer, pH 5,5, og inkubert ved romtemperatur i 30 minutter; f) deretter ble det pr. fordypning tilsatt 10 pl 1 normal svovelsyre for avslutning av den enzymatiske substrat-omsetningen og oppløsningene ble målt i et fotometer ved 492 nm. g) Eksempler på oppnådde resultater:

En prøve betegnes som positiv når den ligger over en verdi

som fremkommer fra ekstinksjonen av negativ-kontrollen pluss 100 mE (i eksemplet 158 mE).

F. Bestemmelse av IgM-antistoffer ved totrinnsfremgangsmåten ifølge teknikkens stand

Det ble anvendt det samme peroksydase-merkede toksoplasma-antigenet hvis fremstilling er beskrevet i avsnitt Cb) av eksemplet, og den samme mikrotestplaten, hvis fremstilling er beskrevet i avsnitt D av eksemplet. a) De i tabell 2 oppførte serumprøvene ble fortynnet, alle 1:200 med 0,3 mol/l trisbufferoppløsning, pH 7,5, inneholdende 5 ml/100 ml toksoplasma-antistoff-fritt okseserum og 0,1 ml/100 ml "Tween 20" (polyoksyetylen-sorbitanmonolaurat); b) 50 pl derav ble tilsatt i hver fordypning på den belagte mikrotestplaten; c) testplaten ble dekket og inkubert i 1 time ved 37°C; d) innholdet ble frasugd og 3 ganger vasket med PBS inneholdende 0,1 ml/100 ml "Tween 20"; e) deretter ble det pr. fordypning tilsatt 50 pl peroksydase-merket toksoplasma-antigen; f) forsøksplaten ble igjen dekket og inkubert i 2 timer ved 37°C; g) deretter ble innholdet frasugd og vasket 3 ganger med PBS inneholdende 0,1 ml/100 ml "Tween 20"; h) nå ble det pr. fordypning tilsatt 100 pl kromogen (o-fenylendiamin-HCl) i citrat-fosfatbuffer, pH 5,5, og

inkubert ved romtemperatur i 30 minutter;

i) deretter ble det pr. fordypning tilsatt 100 pl 1 normal svovelsyre for avslutning av den enzymatiske substrat-omsetningen og oppløsningene ble målt i et fotometer ved 492 nm;

de i tabell 2 angitte serumprøvene ble også behandlet ved den i avsnittene Ea) til Ef) angitte ettrinnsfremgangsmåten.

Resultatene fra begge fremgangsmåtene er angitt i tabell 2.

Fra de målte verdiene for ekstinksjonen, som er et mål for innholdet av toksoplasma IgM-antistoffer i sera, fremgår at ettrinnsfremgangsmåten ga positive resultater ved pasientsera 1-6 (mE Ann „ større enn 88 pluss 100), som ved to-492 nm c

trinnsfremgangsmåten ga negative resultater (mE^g nm mindre enn 136 pluss 100).

Utelatelsen av RF-absorbens i ettrinnsfremgangsmåten forårsaker ved mange sera falske negative verdier, eksempelvis ved sera 1-6, eller reduserte verdier eksempelvis ved serum 7, hvilket fremgår av verdiene i parenteser.

Påvisningen av toksoplasma IgM-antistoffer ifølge ettrinns-fremgangsmåten er følgelig mer følsom og påvisningen av de nevnte og andre antistoffer kan gjennomføres raskere og enklere, hvilket fremgår av en sammenlikning av arbeidstiden for begge fremgangsmåtene, hvilket fremgår av avsnittene E og

F.

Claims

1. Immrounokjemisk ettrinns-fremgangsmåte for bestemmelse av et av immunoglobulinantistoffene A, M, D eller E i en væske, hvorved en fast fase, hvortil antistoffer mot denne immunoglobulin-klassen eller et fragment av et slikt antistoff er bundet, bringes i kontakt med denne væsken hvorved immunoglobulinet fra denne klassen bindes til den faste fasen, og denne faste fasen bringes i kontakt med et antigen som eventuelt bærer et merkemiddel og et merket antistoff eller et merket fragment av et antistoff mot antigenet, dersom antigenet ikke er merket, og fra mengden av det til den faste fasen bundne merkemidlet bestemmes mengden av immunoglobulinantistoffet, karakterisert ved at den faste fasen samtidig står i kontakt med væsken som inneholder immunoglobulinantistoffet som skal bestemmes og det eventuelt merkede antigenet, hvorved det til væsken er tilsatt antihumant IgG ('y-kjede) for fjerning av antigen-spesif ikt IgG-antistoff og reumatoidfaktoraktivitet.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det tilsettes anti-humant-IgG, aggregert humant IgG eller et gamma-Fc-fragment.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antistoffene som skal bestemmes er slike fra immunoglobulin-klasse M, som er rettet mot hepatitt B-kjerneprotein, mot antigener av hepatitt A—, humant immun-svikt— (HIV), røde hunder— eller cytomegali—virus eller proteiner av treponema pallidum eller toksoplasma gondi.

4. Reagens for utførelse av fremgangsmåten ifølge krav 1, karakterisert ved at den minst består av antihumant IgG (-y-kjede), en bærer, hvortil det er bundet antistoffer spesifikke for humant IgM, merket antigen, som er spesifikt for dette IgM, og reagenser for påvisning eller til bestemmelse av merkingen.

5. Reagens for utførelse av fremgangsmåten ifølge krav 1, karakterisert ved at den minst består av antihumant IgG (-y-kjede), en bærer hvortil det er bundet antistoff spesifikt for humant IgM, antigen, merket antigen— spesifikt antistoff og reagenser for påvisning av merkingen.

6. Reagens for utførelse av fremgangsmåten ifølge krav 1, karakterisert ved at den minst består av ett eneste element hvori alle for fremgangsmåten påkrevde reagenser finnes i tørr form.