"Procédé de dosage immunologique d'anticorps de diverses classes dans un échantillon liquide".
"Procédé de dosage immunologique d'anticorps de diverses classes dans un échantillon liquide"
La présente invention est relative à un procédé de dosage immunologique d'anticorps de diverses classes et plus particulièrement d'anticorps IgM dans un échantillon liquide contenant des anticorps IgM, IgG et éventuellement d'autres classes, telles que IgA, IgD, IgE, tel qu'un fluide biologique.
Lorsqu'une personne est infectée par une bactérie ou un virus, elle développe des anticorps généralement de diverses classes pour détruire les agents infectueux. Initialement, les anticorps sont principalement de classe IgM mais progressivement les IgG prédominent et peuvent persister pendant plusieurs années. Par conséquent, le fait de déterminer simplement si des anticorps existent est peu pratique dans le diagnostic d'une infection bien que cela puisse être utile pour déterminer si la personne présente une immunité ou une résistance à un type particulier d'infection. Si, toutefois, on détecte l'anticorps qui s'est formé le premier, c'est-à-dire IgM et que l'on estime sa concentration relative comparativement à IgG, on peut savoir si l'infection est récente ou ancienne.
Ces estimations sont extrêmement importantes pendant les premiers temps de la grossesse lorsque, par exemple, diverses infections dues à des bactéries, des protozoaires ou des virus peuvent avoir atteint le foetus.
Une difficulté en ce qui concerne cette estimation est la différence entre la concentration en IgG et IgM. en termes de concentration moléculaire, on peut s'attendre à ce qu'il y ait,par exemple, 10 fois plus d'IgG présents dans le sérum humain que
d'IgM. On peut s'attendre à ce que la proportion d'anticorps IgM <EMI ID=1.1>
soient les mêmes pour les deux immunoglobulines.
Un grand nombre de procédés décrits dans la littérature
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Grande-Bretagne].
Tous les procédés à l'exception du procédé d'agglutination
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sur la liaison d'un antigène ou d'un anticorps aux parois d'un tube ou puits d'une plaque de microtitrage pour absorber sélectivement l'anticorps choisi. Les tubes ou puits sont lavés pour éliminer toute interférence provoquée par les immunoglobulines non désirées ou d'autres substances susceptibles d'interférence éventuelles et l'on
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IgG) pour quantifier l'anticorps à mesurer [voir, par exemple, la description d'Organon Teknika, Oss, Hollande , de leur
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Ces procédés requièrent un grand nombre d'étapes manuelles, une séparation physique des anticorps liés à ceux qui ne sont pas liés, des lavages et de longues durées d'incubation. Une substance d'interférence majeure dans la plupart des essais est l'anticorps appelé "facteur rhumatoïde" ou "RF", qui est une IgM qui se lie à n'importe quelle IgG qui a réagi avec un antigène polyvalent ou qui a été agrégée par des procédés physiques ou chimiques, et qui apparaît dans des proportions importantes dans tous les échantillons. De plus, un grand nombre d'essais ne sont que semi-quantitatifs, c'est-àdire qu'on ne peut pas exprimer les résultats en quantités pondérales.
L'objet de la présente invention consiste, par conséquent, à palier les inconvénients susmentionnés des procédés de dosage <EMI ID=6.1>
gique d'anticorps IgM dans un échantillon liquide contenant des anticorps IgM, IgG et éventuellement d'autres classes, telles que IgA, IgD, IgE, tel qu'un fluide biologique, extrêmement rapide, ne requérant pas plus de 45 minutes et qui est quantitatif. Le procédé de l'invention ne requiert aucune séparation physique des anticorps IgM des anticorps IgG ou du sérum ou du fluide corporel dans lequel on effectue la mesure. De plus, la même technique permet de mesurer, par exemple, la quantité d'anticorps non-IgM dans un échantillon liquide contenant des anticorps IgM et d'autres classes. A l'inverse des autres techniques, le procédé de la présente invention est également totalement automatisable.
A cet effet, suivant l'invention, on fait réagir l'échantillon liquide contenant les anticorps IgM, IgG et éventuellement d'autres classes, telles que IgA, IgD, IgE, avec des anticorps dirigés contre les anticorps IgG et des anticorps dirigés contre les anticorps IgA dans le cas où l'échantillon contient des anticorps IgA ( les anticorps IgD et IgE sont généralement en quantité négligeable), on ajoute au produit de réaction ainsi obtenu un antigène lié à des particules finement divisées, telles que, par exemple, des particules de latex ou des globules rouges, et un antigène libre du même type que l'antigène lié, et on détermine le degré d'agglutination ou de non agglutination de ces particules finement divisées, la quantité d'anticorps IgM étant inversément proportionnelle à la quantité de ces particules finement divisées non agglutinées.
Suivant une forme de réalisation particulière du procédé de l'invention, après avoir ajouté les anticorps dirigés contre les anticorps IgG et éventuellement les anticorps dirigés contre les anticorps IgA et incubé la solution ainsi obtenue, on ajoute à celle-ci des immunoglobulines IgG agrégées pour neutraliser l'effet provoqué par le facteur rhumatoïde et éviter ainsi un renforcement de l'agglutination par les anticorps IgG qui n'auraient pas été complètement neutralisés par les anticorps anti-IgG et par l'antigène libre.
Suivant une autre forme de réalisation particulière de l'invention, on détermine la quantité de particules finement divisées agglutinées ou non agglutinées dans la suspension résultante en mesurant l'effet néphélémétrique ou turbidimétrique de celle-ci.
L'invention se rapporte également à un procédé de dosage immunologique d'anticorps IgG + IgA dans un échantillon liquide contenant des anticorps IgM, IgG et IgA, tel qu'un fluide biologique, dans lequel on détermine tout d'abord la quantité d'anticorps IgM dans l'échantillon liquide par le procédé susmentionné, et dans lequel on soustrait ensuite la quantité d'anticorps IgM ainsi obtenue de la quantité d'anticorps totale IgM + IgG + IgA de manière à obtenir la quantité d'anticorps IgG + IgA, la quantité d'activité d'anticorps totale étant basée, par exemple, sur le principe d'agglutination par les anticorps de latex recouvert de l'antigène et de comptage des particules non agglutinées, tel qu'il a été décrit dans un grand nombre de publications [par exemple Masson et col., Particle Counting Immunoassay (PACIA) dans Methods in Enzymology (1981) 74;
106 Academic Press].
La caractéristique du procédé de la présente invention est de limiter l'activité agglutinante aux anticorps IgM et d'utiliser, par conséquent, la technique d'agglutination bien établie pour estimer de façon précise la présence de ces anticorps IgM en présence des autres anticorps, c'est-à-dire IgG et éventuellement IgA. Ainsi que cela est bien connu, lorsque du latex "Lx" est recouvert d'un antigène "Ag" (provenant, par exemple, de la bactérie ou du virus provoquant la maladie donnant lieu à l'anticorps) et que l'on fait passer le LxAg dans un compteur de cellules, il donnera un pic propor-tionnel à la concentration en particules de LxAg isolées.
Lorsque des anticorps de la classe IgM (IgMAc) sont amenés en contact avec LxAg, ces anticorps entraîneront une certaine agglutination de LxAg, en diminuant le nombre de particules libres LxAg et en diminuant, par conséquent, leur concentration. Cette diminution est directement proportionnelle à la quantité d'anticorps totale (IgGAc, IgMAc et éventuellement IgAAc) présente dans l'échantillon mesuré.
Il semblait logique que l'on puisse éliminer la réaction par les IgGAc en ajoutant une substance qui agrégerait les IgGAc et, par conséquent,qui les éliminerait de la réaction avec le latex, en laissant simplement la réaction avec les IgMAc, ainsi que cela a été décrit par Gispen et coll. [Clin.
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Clin. Microbiol. (1975), 1, 132]. Dans le cas où l'échantillon liquide examiné contient également des anticorps IgA (IgAAc), ceux-ci pourraient également être éliminés de la réaction avec le latex en leur ajoutant une substance qui les agrégerait. On choisit, suivant la présente invention, comme réactif spécifique pour séparer les IgG totalement, un antisérum provenant de chèvre, dirigé vers ce que l'on appelle la région Fc de l'IgG humaine (anti-Fc) et connu pour agréger sélectivement les anticorps IgG humains. Lorsque la totalité des anticorps IgM est inactivée par traitement avec du dithiothréitol (DTT), qui n'inactive pas les anticorps IgG, on obtient encore une agglutination de LxAg mais nettement moindre. Si l'on ajoute à cette suspension des anticorps anti-Fc pour agréger. les anticorps IgG, on ne remarque plus aucune agglutination de LxAg.
On suppose,par conséquent, que l'agglutination du latex par anticorps IgG est inhibée par les anticorps dirigés contre les IgG. D'une façon inattendue, le LxAg s'agglutine plus faiblement qu'attendu lorsque l'on ajoute des quantités connues, relativement élevées, d'IgMAc (sans traitement au DTT) aux IgGAc qui ont été agrégés par des anticorps anti-Fc;ce qui montre que l'antigène Ag sur le latex est vraisemblablement masqué par les complexes IgGAc-anti-Fc. Pour bloquer la réaction entre les anticorps IgG et l'antigène de LxAg, on ajoute alors de l'antigène libre "Ag" à la suspension. On aurait pu supposer qu'un
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d'agglutiner le latex. D'une façon surprenante, ce bloquage ne se réalise pas dans le cas où la concentration d'antigène libre n'est pas excessive. En utilisant de l'antigène libre Ag avec des anticorps anti-Fc pour agréger la totalité des anticorps IgG, la concentration en particules libres est apparemment la même que dans le cas où l'agglutination est due à des anticorps IgM seuls. Cette constatation, bien que surprenante dans son effet, est conforme aux caractéristiques connues des deux anticorps. Les IgMAc ont habituellement une affinité plus faible que les IgGAc. Toutefois, du fait de leur valence multiple (10 valences) , les IgMAc réagissent préférentiellement avec l'antigène porteur de déterminants antigéniques répétés. Le couplage de 1'. Ag au latex rend l'Ag répétitif et par conséquent fortement réactif avec les IgMAc.
Une faible concentration en antigène libre peut par conséquent saturer la capacité de liaison totale des anticorps IgG tandis qu'une concentration beaucoup plus élevée en Ag, pour autant qu'il ne contienne pas des déterminants antigéniques répétitifs, est requise pour saturer les anticorps IgM.
Le procédé de la présente invention permet, par conséquent, de mesurer l'activité en anticorps IgM en utilisant, par exemple,des anticorps anti-Fc dirigés contre les anticorps IgG et, bien entendu, des anticorps dirigés contre les anticorps IgA dans le cas où l'échantillon liquide à examiner contient des anticorps IgA, les anticorps IgD et IgE se trouvant généralement, ainsi qu'on l'a déjà précisé précédemment, en quantité négligeable,et un antigène libre, les anticorps IgG venant en fait se combiner à l'antigène libre, cette combinaison avec l'antigène venant ainsi compléter l'inactivation des anticorps IgG et éventuellement des anticorps IgA.
Le procédé de l'invention permet également, ainsi qu'on l'a déjà précisé précédemment, de doser les anticorps IgG + IgA dans un échantillon liquide contenant des anticorps IgM, IgG et IgA, en déterminant tout d'abord la quantité d'anticorps IgM dans l'échantillon liquide à examiner par le procédé de l'invention, qui vient d'être décrit, et en soustrayant ensuite la quantité d'anticorps IgM ainsi obtenue de la quantité d'anticorps totale IgM + IgG + IgA de manière à obtenir la quantité d'anticorps IgG + IgA. Pour obtenir la quantité d'anticorps IgG, il suffira bien entendu d'ajouter au mélange de réaction des anticorps anti-IgA et, de la même manière, pour obtenir la quantité d'anticorps IgA, il suffira d'ajouter au mélange de réaction des anticorps anti-IgG.
Un problème qui a amené un grand nombre de procédés de la technique antérieure à faire l'objet de résultats faussement positifs, consiste en l'interférence que provoque le facteur rhumatoïde (FR) qui est un anticorps IgM qui se lie à la plupart des complexes IgGAc-Ag. Suivant l'invention, on a neutralisé l'effet de ce facteur rhumatoïde par addition d'immunoglobulines IgG agrégées. L'efficacité de cette étape a été testée par addition d'un sérum contenant une concentration très élevée en facteur rhumatoïde mais dépourvu d'IgMAc, après l'addition des anticorps dirigés contre les anticorps IgG et éventuellement des anticorps dirigés contre les anticorps IgA et incubation du mélange ainsi obtenu. En aucun cas, on a obtenu un résultat sensiblement différent.
On notera qu'un test d'agglutination de latex pour la détermination spécifique des IgMAc a récemment été décrit [J.S. Remington et coll., Détection of Immunoglobulin M Antibodies with antigen tagged latex particles in an immunosorbent assay, 3. Clin. Microbiololgy (1983), volume
17, n[deg.] 5, page 939]. Comme avec presque tous les essais
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humains sont liés aux parois du puits d'une plaque de microtitrage. Lorsque l'on ajoute du sérum, une certaine proportion de la totalité des IgM adhère aux parois, y compris les anticorps IgM. Une fois cette réaction réalisée, on ajoute des particules de latex recouvertes d'antigène. Après plusieurs heures, on note la quantité de latex lié à la microplaque et l'on compare celle-ci aux résultats obtenus par des concentrations connues en anticorps IgM et on effectue ainsi une estimation de la quantité d'anticorps présents. Les limitations de ce procédé résident dans le fait que l'estimation n'est que semi-quantitative. Le procédé ne tient compte que des anticorps IgM, comporte de longues périodes d'incubation, requiert un lavage pour séparer les substances interférentes et demande beaucoup de travail.
De plus, lorsque le patient a un taux d'immunoglobulines IgM élevé, la proportion d'IgMAc liés diminuera, en réduisant ainsi la sensibilité avec le danger que l'on puisse rater des résultats positifs.
On notera, à cet effet, que les périodes d'incubation utilisées dans le procédé de la présente invention sont de courte durée. C'est ainsi qu'après avoir ajouté les anticorps dirigés contre les anticorps IgG et éventuellement les anticorps dirigés contre les anticorps IgA, on incube la solution ainsi obtenue sous agitation à une température d'environ 37[deg.]C pendant une durée de l'ordre de 1 à 15 minutes. D'autre part, après avoir ajouté l'antigène lié à des particules finement divisées et l'antigène libre, on incube également la suspension ainsi obtenue sous agitation à une température d'environ 37[deg.]C pendant une durée de l'ordre de 5 à 15 ninutes, une incubation similaire s'avérant nécessaire après l'addition éventuelle des immunoglobulines IgG agrégées utilisées pour neutraliser l'effet provoqué par le facteur rhumatoïde.
Bien que le procédé de l'invention puisse être appliqué à n'importe quelle infection, par exemple du type toxoplasmose, cytomégalovirus, herpès, rubéole, etc., on décrira une forme de réalisation se rapportant à la détermination d'anticorps IgG et IgM chez un patient qui a contacté une infection provoquée par Brucella abortus lors de la manipulation de bétail infecté. L'antigène est dans ce cas un lipopolysaccharide provenant de Brucella (LPS). Exemple.
Préparation de LPS.
Du LPS de Brucella est extrait au moyen du procédé à l'eau-phénol de Westphal et coll. [Methods in Carbohydrate Chemistry, volume 5 (1965), page 83, Académie Press, N.Y.]. La phase phénolique est ensuite précipitée par trois volumes de "réactif méthanolique" et traitée par
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par Moreno et coll., [3. Bacteriology (1979), 361, 138, n[deg.]2]. On dialyse ensuite le lipopolysaccharide (LPS) contre de l'eau désionisée et on le lyophilise.
Préparation du latex-antigène (LxLPS).
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dilué 5 fois (dGBS) (GBS : solution saline tamponnée à base
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poids/volume) (K109 - Rhône-Poulenc, Courbevoie, France) et on soumet le mélange aux ultrasons pendant 1 minute à 30 watts (appareil à ultrasons modèle B12, Branson, Danbu- <EMI ID=13.1>
mine de sérum humain (HSA, Behringwerke, Marburg/Lahn, FRG) dans du GBS, et on soumet à nouveau la suspension aux ultrasons. Après 20 minutes d'incubation à la température ambiante et centrifugation pendant 10 minutes à 10.000 tours/minute dans un rotor SS 34 d'une centrifugeuse Sorvall R5 CB, le latex est remis en suspension dans 1 ml de solution aqueuse de dodécyl sulfate de sodium, soumis aux ultrasons et incubé pendant 1 heure à 37[deg.]C. On lave ensuite le latex deux fois avec 1 ml de dGBS et on le remet en suspension dans 1 ml d'EDTA (éthylène diaminetétraacétate)-GBS-BSA
(albumine de sérum bovin). On constate que le latex stocké congelé à -20[deg.]C ou lyophilisé est stable pendant au moins 6 mois. On soumet aux ultrasons pendant 15 secondes à
30 watts du LxLPS qui a été dégelé ou resuspendu après lyophilisation.
Avant utilisation, on dilue le LxLPS 100 fois dans du EDTA-GBS-BSA.
Anticorps anti-Fc.
On prépare le fragment Fc d'IgG humaine par digestion à la papaïne d'après le procédé de Cerottini et coll., [3. Immunology (1968) 101, page 433]. On injecte
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par voie intradermique chez une chèvre à des intervalles de 3 semaines. On recueille le sérum 15 jours après l'injection finale, on extrait les immunoglobulines et on les utilise diluées dans du GBS ( lmg/ml) après avoir vérifié leur spécificité anti-Fc.
Procédé.
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dilué 50 fois dans du GBS. On incube le mélange à 37[deg.]C pendant 2 minutes tout en agitant. On ajoute ensuite 25
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tion de 25 mg/ml et on incube à nouveau le mélange pendant <EMI ID=17.1>
on fait ensuite passer le mélange résultant dans un compteur de cellules optiques où l'on détermine la concentration de LxLPS non agglutiné, en mesurant la diffusion lumineuse de ce mélange. La concentration en anticorps IgM est inversement proportionnelle à la concentration de particules de latex libres. On pourrait évidemment également mesurer directement la quantité de LxLPS agglutiné ou utiliser pour le comptage une autre méthode optique que la diffusion lumineuse, par exemple le comptage de particules par résistance électrique. Pour éviter les erreurs dues à une concentration excessive en anticorps IgM, on répète le processus avec du sérum dilué 100 fois et 200 fois.
Suivant une variante, on peut mesurer l'agglutination du latex par turbidimétrie dans le cas où les concentrations d'anticorps IgM et IgG sont relativement élevées. Les mêmes quantités de sérum humain dans le GBS et d'anti-Fc sont incubées pendant 2 minutes à 37[deg.]C avec agitation. On ajoute
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née et on laisse le mélange incuber pendant 1 heure, a p r è s quoi i
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rapidement le mélange et on mesure la turbidité à 620 nm et à 405 nm, la longueur d'onde de 620 nm constituant la ligne de base. On laisse ensuite le mélange incuber pendant 2 heures, après quoi on mesure l'effet turbidimétrique de celui-ci une seconde fois aux deux longueurs d'onde susmentionnées. La diminution de la différence entre les mesures prises initialement à 620 nm et 405 nm et celles prises après l'incubation de 2 heures est inversément proportionnelle aux particules libres restantes. On pourrait également déterminer la quantité de particules finement divisées agglutinées ou non agglutinées dans la suspension résultante par d'autres mesures de densité optique que la turbidi-métrie, telles que la colorimétrie.
Pour ce qui est du dosage de l'activité d'anticorps totale, c'est-à-dire de l'activité des anticorps IgM + IgG (le sérum exemplifié ci-dessus ne contenant pas d'anticorps IgA) on utilise du tampon GBS seul à la place des anticorps anti-Fc et on utilise du LxLPS à la place du LxLPS + LPS.
Pour déterminer la concentration en anticorps IgG seule, on utilise le même procédé que pour la détermination de l'activité d'anticorps totale, à l'exception que l'on détruit les anticorps IgM de l'échantillon en traitant préalablement l'échantillon par du dithio-
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l'eau à une concentration de 10 mg/ml et on incube ensuite le mélange entier à 37[deg.]C pendant 30 minutes, après quoi on arrête la réaction
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à 0,2%. On procède ensuite comme décrit ci-dessus et on dilue
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susmentionnées.
La figure annexée montre les concentrations en anticorps IgM du même sérum d'un patient qui a contacté une infection à Brucella abortus, obtenues par un procédé de radioimmunoessai (RIA)
(en coups par minute) et par le procédé de l'invention (en unités d'agglutination arbitraires) sur une période d'un an.
Comme on pourra le noter, les deux courbes sont similaires, ce qui démontre que le procédé de dosage de l'invention est fiable .
Il doit être entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisation ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre du présent brevet.
Ainsi qu'on l'a déjà précisé précédemment, on pourrait bien entendu utiliser comme particules finement divisées, à la place des particules de latex, des globules rouges.
REVENDICATIONS.
1. Procédé de dosage immunologique d'anticorps IgM dans un échantillon liquide contenant au moins des anticorps IgM et IgG, tel qu'un fluide biologique, caractérisé en ce qu'il comprend la mise en réaction dudit échantillon liquide contenant les anticorps IgM, IgG et éventuellement des anticorps IgA, d'anticorps dirigés contre les anticorps IgG et d'anticorps dirigés contre les anticorps IgA dans le cas où l'échantillon susdit contient des anticorps IgA, l'addition au produit de réaction ainsi obtenu d'un antigène lié à des particules finement divisées et d'un antigène libre du même type que l'antigène lié et la détermination du degré d'agglutination ou de non agglutination de ces particules finement divisées, la quantité d'anticorps IgM étant inversement proportionnelle à la quantité de ces particules finement divisées non agglutinées.