JPH03500575A - 抗体の定量 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 抗体の定量 本発明は免疫グロブリン混合物を含む試料の中のＩｇＭ抗体を定量する方法に関 する。このような定量は、１つのクラスの抗体が他の抗体の定量を干渉するため むずかしい。

人がａＩ菌、ウィルスあるいは真直の媒介物（ａｇｅｎ　ｔ　）によって感染状 態になると、人体はすみやかに免疫応答を展開する。即ち、人体は感染作因と結 合しそれを最終的に破壊する機構とし最初にインビボ（ｉｎ　ｖｉｖ□）が作ら れる免疫グロブリンは１ｇＭクラスの免疫グロブリンである。Ｉｇ＆がピークに 達した後、ＩｇＭｉ度は比較的短時間の間に減少するが、これに対してＩｇＭの レベルは上昇し、プラトー（ｐｌａｔｅａｕ）に達し、さらに時として長年にわ たってゆっくりとレベルが減少する。それ故、もし高濃度のＩｇＭが存在すると 、その感染は最近である。もし濃度が全くＩｇＧのみであるならば感染は古く、 また、ＩｇＧの濃度が高ければその人はを染に対して良好な免疫を保持している 。多くの場合、医者はその感染が最近のものであるかあるいは過去のものである か、また過去の場合その愚者が再発にす４する耐性を持っているかを知る必要が あり、その耐性の程度はＬｇＧの濃麿による。

動物および人の両方に非常に重要な８染症の１つであるトキソプラズマ症は猫の ような動物によって運ばれる寄生虫である原生動物のトキソプラズマ　ゴンジイ （Ｔｏｘｏｐｌａｓ＋＊ａ　ｇｏｎｄｉｉ）によって引き起こされる。英国の成 人人口の２０％〜４０％が１度あるいはさらにもう１度この寄生虫に感染してお り、さらに地球上のある地域ではその値は９５％の高さであろうと見積もられて いる。子供および成人の場合、この病気の症状は伝染性腺熱（ｇｌａｎｄｕｌａ ｒ　ｆｅｖｅｒ）に似ており、一般的には良好な経過をたどる。しかしながら、 腎炎、肺炎および発疹の病状も報告されている。

妊婦の場合、母親が急性のトキソプラズマ症（ｔｏｘｏｐｌａｓｍｏｓｉｓ）に かかると当然の結果と°して胎児に害を与え、唱眠性脳炎（ｅｎｃｅｐｈａｌｉ ｔｉｓ）　、脳水腫症（ｈｙｄｒｏｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ）、脳の石灰化（ｃｅ ｒｅｂｒａｌ　ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ）　、目および耳の損傷（ｌｅｓｉ ｏｎ）を引き起こす可能性があるか、あるいは死産児を出産することがある。

それ故、自分の愚者がトキソプラズマ症にかかつているか否かを調べる医者が増 えている。チェック項目は次の２つである。

すなわち、患者は、 １、　急性トキソプラズマ症であるか、即ちＩｇＦＯ値が高いか、あるいは ２、過去の感染であるか、そしてもし過去に８染したものであるならば患者は妊 娠中のトキソプラズマ症の罹患に対して良好な耐性をもつか、即ちＩｇＧが高い か？今日、全１ｇ抗体、即ちＩｇＧおよびＩｇ？Ｉを測定する方法は数多くある 。これらの方法のうちのあるものでは８染因子（ｉｎｆｅＣｔｉｎｇａｇｅｎ　 ｔ）を細胞レベルで破壊かつ粉砕し、抗原また／：　Ｉ　ｇ　ＦあるいはＩｇＧ 抗体が結合する分子を含有するフラグメントにする。そうした後、得られたフラ グメントをプラスチック試験管の璧に吸着させ、さらに抗体ＩｇＧあるいはＩｇ Ｍを含有する血清の試料を快→→→目−−抗１ｇ？ｌあるいは抗１ｇＧ抗体は、 測定システムに適切な標識、蛍光あるいはアイソトープあるいは酵素、のうちの １つで標識した。さらに保温した後、試験管内容物を再びからにして試験管を洗 う、この方法が酵素で標識した抗−１ｇを含む方法である場合には、さらにこれ に基質溶液を加え、再保温の後、発色を測定する。光学濃度は壁に付着したＩｇ ＭあるいはＩｇＧ抗体の量に比例する。それ故、この方法は原則としてＩｇＧあ るいはＩｇＭのどちらかの存在量を測定できるばずである。

この方法は、現在も一般的に使われているが、主に２つの誤差原因に悩まされて いる。　ＩｇＧ抗体はＩｇＭ抗体の１００倍濃度以上存在するので、高濃度のＩ ｇＧ抗体が試験管表面の抗原をＩｇＭ抗体から遮断し、それ故１ｇＦｌ値が誤っ て低くなり、感染は過去のものであるとの診断力ζ下される。

さらなる複雑化は、“Ｃ１ｑ″（すべての血清試料中に存在する補体蛋白質）お よびリウマトイド因子（ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ　ｆａｃｔｏｒ）“ｉ’ｌＦ”（ 自己免疫疾患の患者から得た試料に存在する）が、抗体と抗原との間に形成され る免疫複合体に結合することである。　ＴｇＧ抗体が試験管壁の抗原あるいは分 析中の乳濁液粒子と反応した後、Ｉ？Ｆあるいはｃｔ４が１．Ｇと反応する。従 って、抗１ｇＧ標識抗体を加えた場合、加えた標識物質の多くは反応できず感染 に対抗して働＜ＩｇＧ抗体の定量は誤って低くなる。

い（つかの方法が上述の定量法を基本として、これらの干渉あるいは誤った結果 を導く原因を減少あるいは排除するために開発された〔ナオト（Ｎａｏｔ　Ｙ） およびレミングトン（Ｒｅａ＋ｉｒ＋ｇｔｏｎＪ、Ｓ、）、ジャーナル・オブ・ インフエクシャス・ディシーズ（Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、）　、第１４２ 巻、第５号、　７５７−７６６頁（１９８０）　、あるいはライエラアルド（Ｗ ｉｅｌａａｒｄ　Ｆ）ら、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジ ー（Ｊ、Ｃｌ１ｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）。

第１７巻、第６号、　９８１−８７頁（１９８３）あるいはセスプロン（Ｃｅｓ ｂｒｏｎ　Ｙ、Ｊ、）ら、ジャーナル・オプ・イミュノロジカルメソッド（Ｊ、 ｏｆ　Ｉ＋ｅｍｕｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ）　、第８３巻、第１５１−５８頁（１９ ８５）ンクド・イミニノソルベント・アッセイ（Ｅｎｚｙｍｅ　ＬｉｎｋｅｄＩ ｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ　Ａｓ５ａｙ）と呼ぶ、これらの文献に記載されてい る方法はオルガノン・テクニカ（Ｏｒｇａｎｏｎ　Ｔｅｋｎｉｋａ　Ｎ、Ｖ、） ＋ビーシック（Ｖｉｅｄｉｊｋ）５８．２３００　テニーンホウト（Ｔｕｒｎｈ ｏｕ　ｔ）　＋ベルギーによって商品名トキソノステイカ（Ｔｏｘｏｎｏｓｔｉ ｋａ）として商品化されている。しかしながらその定量法は複雑で操作集約型で あるため、誤差を生じやすい、これに対して本発明の方法は簡単かつ迅速でＲＦ あるいはＣ１ｑの干渉がなく特異的であり、ＩｇＭ抗体に特異的な感染作因から 抗原を単離かつ作成することを基本としている。

すべての抗原はその詳細な構造が異なっているが、それら抗原は、４種類の分子 構造、糖量白質、蛋白質、リポ蛋白質（脂肪蛋白質）あるいはリポ多糖（脂肪− 塘）、のうちの１１類以上からなると言うことができる。トキソプラズマ　ゴン ジイ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ　ｇｏｎｄｉｉ）かうの抗原とＩｇＭ抗体が抗原の 多発オよび蛋白質部分を介して反応するのに対してＩｇＧ抗体は選択的に（Ｉｎ ｆｅｃｔ、Ｉ＋ｍｍｕｎ、）、第２７巻、　２８３−２８７頁（１９８０）およ びカマルゴ（Ｃａｍａｒｇｏ　Ｍ、Ｅ、）ら、同上、第２１巻、　５５−５８頁 （１９７８）　３　。

引用文献の著者は、多糖および蛋白質のそれぞれに対する１１ＭおよびＩｇＧの 選択的反応性はＥＩＪＳＡ技術を用いて決定され、それ故このＥＬＩＳＡ法はＩ ｇＭ抗体とＩｇＧ抗体とを分離する能力があることを暗示していると主張した。

彼らはトキソプラスマ　ゴンジイの表面抗原を分離しかつ物理的に蛋白質を変性 させて、彼らが主張するところのＩｇＭのみが結合する多糖部分のみを遊離させ た。

この仕事の追試が、１９８３年、蛋白質を破壊する手段としてプロテアーゼを用 いることによって、約１５年間この分野で文献を発表しトキソブラスマ寄生虫の 試験法を開発した研究者であるナオトおよびレミングトンによって行なわれた〔 ナオト（ＮａｏｔＹ）、グブチル（Ｇｕｐｔｉｌｌ　Ｄ、に、）　、ムルレナク ス（Ｍｕｌｌｅｎａｘ　Ｊ、）３３１−３３８頁（１９８３）　）が、彼らはＴ ｇＭあるいはＩｇＧの特異反応を認めることができなかった。シャルマ（Ｓｈａ ｒｍａ）ら、ジャーナル・オフ゛・イミ二ノロジー（Ｊ、ｏｆ　Ｉａ＋ｗｕｎｏ ｌｏｇｙ：１．第１３１巻、第２号、９７７〜９８３頁（１９８３）は、トキソ ブラスマ抗原をさらに徹底的に研究したが、ＩｇＭに特異的；抗原を見い出すこ とはできなかった。我々もまた、ミふオらのグループの仕事の追試を試みたが、 ＥＬＩＳＡ試験法を用いてさらにトキソプラスマ　ゴンジイの抗原を消化する手 段としてプロテアーゼを用いることによってＩｇＭの特異反応を認めることには 再度失敗した。

慣用的なＥＬＩＳＡ分析法は全免疫グロブリン濃度を測定するたｔ−み有効であ り、いずれかのクラスの抗体を他クラスの抗体共存下で個別的に測定するために 使用するには不十分である。

本発明はこのような困難さの解決法を探求すると共に、抗原の酵素処理が、ある クラスの抗体と抗原との反応性を他のクラスのそれと比較して強めることができ るという結果に起因している。

本発明は、他の抗体と比較して、定量しようとする抗体と抗原の反応性を強める ために酵素修飾した抗原を、定量しようとする抗体に対して用いることによって 、免疫グロブリン混合物を含有する試料中のＩｇＭ抗体を定量する方法を提供し 、この方法は試料混合物を酵素で修飾した抗原と共にインキュベージジンするこ とおよび定量しようとする抗体と酵素修飾抗原との結合程度を測定することから なる。

特に、本発明はＩｇＧ抗体共存下でのＩｇＭ抗体の定量に通している。

本発明は、ある１つの抗体と比較して、測定しようとする抗体と抗原との反応性 を高めるために酵素と反応させた抗原の使用を含む。好適な酵素は、例えばトリ プシンのようなプロテアーゼ、プロナーゼおよびプロテイナーゼＫを含む０反応 条件はあまり重要ではない０例えば、培地中でもｐＨ溶液中でも両方共安定であ り、３７°Ｃで数分から数時間の間、抗原そ酵素と１°ンキユベーシテンする。

抗原の酵素修飾は、あるクラスの抗体と比較して、定量しようとする抗体と抗原 との反応性を強める。このことは、定量しようとする抗体と抗原との反応性を絶 対的な意味で高めることによって、あるいは別の抗体と抗原の反応性を低下させ ることによって、あるいはその両方の効果によって、達成できるであろう、抗体 と抗原との反応性はそれぞれの結合部位の数およびそれぞれの結合部位の他成分 に対する結合親和性による。抗原と抗体との反応性の変化は、結合部位数の変化 、または１つ以上の部位の結合親和性の変化、またはその両方の効果を含むで応 条件はそれぞれの生物体により異なるだろう。本発明の方法が価値あることを証 明するのに過当な悪染性には、風疹、トキソプラスマ症、シトメガロウィルスお よび単純性庖疹が含まれる。

本発明は試料混合物を酵素で修飾した抗原とインキユベーシヨンすることからな る。定量条件は、定量しようとする抗体と酵素修飾抗原との結合程度を測定する ための手段と、同様に慣用的である。しかしながら、酵素修飾抗原は面体の表面 に結合した形で使用するのが通しており、この表面）よ定量用容器の壁でも良い 、好適には、酵素修飾抗原をインキュベージジン中には悲濁状態を維持でき必要 な時には後に遠心分層あるいは磁気手段によって沈降させることのできる小さな 固体粒子と結合させる。固体物質の種類は重要ではなく、ガラス球、ゴールドゾ ル（ｇｏｌｄ　５ｏｌ）あるいは特にラテックス（ポリスチレン）粒子を用いる ことができる。このような粒子は商品として入手可能であり、また抗原のような 試薬をそのような粒子に結合させる技術はこの分野で熟知されている。

酵素修飾抗原と定量しようとする抗体との結合程度は凝集技術によって測定する と好都合である。凝集の程度は濁度測定（ｔｕｒｂｉｄｉｍｅｔｒｙ）により測 定できるが、我々が発明したＩＭＰＡＣ？（登録商標）診断システムのような粒 子計数技術で測定すると好都合である。このシステムは一定容量の液体中の粒子 数の計数からなる０粒子は既知の均一サイズであり、また計器はほぼそのサイズ の粒子のみを計数し校正するので、凝集によって形成される２つ以上の粒子の集 合体は除かれ数えられない、そのようなシステムを使うことによって、別の抗体 と比較して定量しようとする抗体に対する酵素修飾抗原の選択性が著しく増大し 、そのために時として別の抗体が全く干渉原因とならないことが見出されたのは 驚きである。

本発明は結果に関するものであって、理論に関するものでは径０．８ミクロンの ラテックス球ｂｒＯ，ｏ１ミクロン級の直径をもつ２コから３コの抗体を介して 互いに結合する。熱運動および測定システムを通過する流れによって、せん断力 はラテックス凝集体をばらばらに引き裂くように働く、抗原と抗体との間を互ぃ に結合する免疫結合力が十分に強い凝藁体だけがこ０よう；せん断力に逆うこと ができる。

ＥＬＩＳＡ法（下記実施例１を参照されたい）を用いた我々の観察によると、プ ロテイナーゼにでトキソプラスマ　ゴンジイ（τｏｘｏｐｌａｓｍａ　ｇｏｎｄ ｉｉ）抗原を処理してもＩｇＨに対して完全に特異的な抗原はできない、　Ｉｇ Ｇの反応程度がより小さくなるとはイウモノのＩｇＧは処理後も反応し続けるの で、プロテイナーゼにで抗原を処理してもそれだけではＩｇＭ抗体に対する完全 に特異的な定量法は得られない。

しかしながら、ＩｇＧと酵素修飾抗原との結合はＩｇＭのそれと比べて著しく減 少する。　ＩｇＧの結合が元の値の約１八。に減少するのに対して、ＩｇＭのそ れは’／ａ〜１八に減少する。これに対して、凝集定量法ではＩｇＧと酵素修飾 抗原との結合はほぼ完璧に阻害される。このことを我々は次のように考える、即 ち、酵素修飾抗原に対するＩｇＧの結合親和性は非常に低い（これに対してＩｇ ？１のそれは低くない）ので凝集粒子は上述のせん断力によってばらばらに引き 裂かれ、このため粒子計測システムでは非凝集として数えられる。

次の実施例は本発明を例示するものである。

皇施■上 キソ　−スマ　、キｔ　のζ制 トキソブラスマ症の抗原ば、２日前シこトキソブラスマ　ゴンジイ（Ｔ、ｇｏｎ ｄｉｉ）栄養体に感染したマウスの腹膜浸出液より調製した。

ａ腹腔を３〜５ｄの殺菌生理食塩水で洗條した。こうして得た懸濁液の試料１ｉ に対して、０．０１３ｍの抗生物質ベントレキシル（Ｐｅｎｔｒｅｘｙｌ）およ び１０単位のヘパリンを加え、底部が円錐形になったチューブに入れて３０分間 室温に立てて置いた０次いでチューブを４分間６００ｒｐ■で遠心分離し残渣を 捨てた。上澄液を再び４°ＣＣ１４０００ｒｐで３０分間遠心分離し、上澄液を 捨てた。

ペレットに２ｉのＩＭ　ＮＨ，Ｃ１を加え赤血球を溶血し、さらに４０００ｒｐ ｍ、４℃で再び遠心分離した後、ペレットを３回生理食塩水で洗い再び４°Ｃ， ４０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。

ペレットを２ｍの蒸留水に再懸濁し、次いでドライアイス−アセトンで凍結・溶 解をくり返し、その１回ごとに溶液を超音波混合した。１０分間３０００ｒｐａ ＋で遠心分離した後、懸濁液を除去して一２０°Ｃで保存した。

主ｉ方五 ＩｇＧおよびＩｇ１１抗体の両方を含む血清試料を、上述の方法で調製した１０ ０Ｊ１１のトキソプラスマ　ゴンジイ抗原で表面を処理したミクロタイタープレ ート（＋ａｉｃｒｏｔｉｔｒｅ　ｐｌａｔｅ）を用いて試験した。

プレートを抗原と共に４℃で一晩インキュベーションし、次いで０．０５％ツウ ィーン（７ｗ６ｅｎ）２０を含む生理食塩水で５回洗條した。プレートの２にプ ロテイナーゼＫを１■／ＨＩｌ緩衝液の濃度で含む１００Ｉｉ／ｗｅｌｌ　（プ レートのくぼみ）のトリス（Ｔｒｉｓ）塩酸緩衝液（０，ＯＩＭ、　ｐＨ７，５ ，０，０２Ｍ　ＣａＣ１ｚ）を加え、プレートを３７“Ｃで２時間インキュベー ションした。残りの冬プレートはトリス緩衝液のみで処理し、同時間インキュベ ーションした。インキユベーションの後、全プレートを生理食塩水１０．０５％ ツウイー７２０で５回洗條した。患者９血清をＩｇ：１定量用−二は濃度を１１ ５００、　ｌ／１０００．１／２０００．１／４０００および１／８０００に一 連の希釈を行ない、これに対しテＩｇＧ定量用のそれは１１５０．１／１００． １／２００゜１／４００．１／８００に希釈した。ミクロタイタープレート（ｍ ｉｃ’ｒｏｔｉ　ｔｒｅｐｌａｔｅ　）のそれぞれのくぼみ（ｗｅｌｌ）に５０ ．ｉの希釈血清を加え、プレートを室温で１時間インキュベーションした後、生 理食塩水１０．０５％ツウィーン２０で５回洗條した。それぞれのくぼみに適切 ４社４ミーペルオキシダーゼで標識した抗ＩｇＭ（２■／ｄ）を１００Ａｔ！、 あるいはペルオキシダーゼで標識した抗ＩｇＧ　（２，５■／Ｍ１）を１００Ｉ ！！、ｐＨ５、過酸化水素存在下で加えた。室温テ２０分子１１１！ｌインキュ ベーションの後、２５ｍの０．ＩＮ硫酸溶液を加え、光学濃度を測定した。第１ 図に結果を示す、光学濃度が高い程、血清中に存在する抗体濃度が大きい、ミク ロタイタープレートのくぼみに吸着させる前に抗原をプロティナーゼにで処理し た場合にも同様の結果が得られた。

これから分力・るように、ブロティナーゼＫによる抗原の酵素的加水分解（ｄ　 ｉｇａｓ　ｔｉｏｎ＞はＩｇＭおよびＩｇＧのいずれに対する反応性をも実ｉ上 弱める。しカルながらそれらの抗原との反応性の減少度合いはＩｇＭよりＩｇＧ の方がより大きい。換言すれば、酵素修飾はＩｇＧと比較してＩｇＭと抗原の反 応性を相対的に高めたと言える。

！施ｆｌ −−゛　スートキ゛　Ｌｘｔｏｘｏ）のｆ′＋２５０Ｉのカルボキシル化ラテッ クス（ｌＯ％ｗ／ν）　（Ｌｘ）に２ｄのバルビタール緩衝食塩水（ＢＢＳ）　 （０，０２Ｍ、　ｐＨ８，１）を加え、１０．００Ｏｒｐｍで１０分間遠心分離 した。上澄液を除去し、２５０ＡｔｌのＢＢＳを加え、４℃に冷却した。次いで 、２５■のカルボジイミド（ＣＤＩ）を含ム２５０ＩＪ１のＢＢＳを１０■ＣＤ Ｉ／１００ｔｌｌＬχ混合物となるように加えた。ここで用いるカルボジイミド 溶液は調製したでのものを４℃に冷却し、４℃で１時間うずまき攪拌したもので ある。

１０、００Ｏｒｐｍ　４℃で１０分間遠心分離した後、超音波振動にかけ、ＢＢ Ｓに溶解したトキソ抗原（５■）溶液、４℃（液量的０．５ｍ）に加えた。

次いで懸濁液をうずまき撹拌条件下４℃で２〜４時間あるいはローラー上で１６ 時間インキニベーションした。

ラテックス懸濁液をトリス（Ｔｒｉｓ）塩酸緩衝液（０，ＩＮ）ＩＣＲ，ｐ）１ ７．５および２０ＩＩＭのＣａＣ１ｚ）で３回洗條し、遠心分離・超音波攪拌を くり返した。これはｐＨ７，５で酵素処理するためのしχの調製である。ペプシ ン処理のためにはＬｘを０．１５Ｍ　）ＩＩＪに懸濁する。

Ｌｘｔｏｘｏを第２表に示した条件下で種々のプロテアーゼ酵素とインキ二ベー シヨンした。

酵素　酵素濃度　ｐＨインキュベーション　温度リパーゼ　１ｍｇ／ｄ　７．５ 　２時間　３７°Ｃペプシン　５ｍｇ／ｄ　１．５　１０分間　３７°Ｃトリプ シン１ｍｇ、／ｄ　７．５　２時間　３７”Ｃプロナーゼ　ｌ＠／ｍｌ！　７． ５　２時間　３７°Ｃ熱凝集１ｇＧヒトＩｇＧ　（１０■／ｄ）は３０分間６３ °Ｃに加熱し１：Ｉ　ＧＢＳで希釈した。

立捉去史 ＣＢＳ／　１％ＢＳＡで１１５０に希釈した愚者の血清３０１１１を、６０Ｉ／ 雌のヒトＩｇＭに対するマウスＩｇＧモノクローナル抗体および５■／ｉの熱凝 集したヒ）ＴｇＧを含む溶液３０ｍに加え、血清中に含まれるＣ１ｑおよびＲＦ を吸着させた。次いでこの溶液に０．０５％Ｗ／ν濃度のラテックスＬｘ　ｔｏ ｘｏを３０１！ｌ加えた。

この混合物をうす巻き撹拌条件下で３０分間インキニベーションした０反応を２ ｄのＧＢＳ添加によって停止させ、非凝集粒子のみを数えるように改造した血液 細胞計数装置を用いて非凝集粒子のみを計数した。

思いがけなくマウスのモノクローナル抗ヒトＩｇｆ１抗体がＩｇＧ抗体による凝 集を４倍以上に強めることがわかったので、マウスのモノクローナル抗ヒトＩｇ Ｍ抗体を反応混合物中に含ませた。

二のことはＩｇＧの干渉を最小限二ことどめるのに役に立った。熱凝集したＩｇ Ｇは、試料が高レベルのＩｇＧ抗体およびリウマトイト′因子（ＲＦ）を含む場 合に生ずるそれ以外の干渉を排除するために、溶液中に存在している。

■ 第３表に示すように、抗原でおおったラテックスをプロナーゼおよびプロティナ ーゼにで処理すると、ＩｇＧ抗体による凝集は完全に破壊され、ＩｇＭ抗体の凝 集は強化された。この強化に対する可能な説明は次の通りである。即ち、蛋白質 分解は粒子のまわりに存在する蛋白質シェル（ｓｈｅｌｌ）がらｒＩｇ？’ｌ抗 原」をより多く遊離させ、それらの遊離抗原とＩｇＭ抗体との反応を可能にする ためと考えられる。

ラテックス対照標準　凝集　凝集 ラテックスリパーゼ　凝集減少　凝集減少ラテックスペプシン　凝集減少　凝集 減少ラテックストリプシン　凝集増加　凝集増加ラテックスプロナーゼ　非凝集 　強度の凝集増加ラテックスプロティナーゼＫ　非凝集　強度の凝集増加１里■ 主 この結果を確かめるために、４０種類の１ｇＭ陽性血清を実施例２に記載したプ ロティナーゼにラテノクストキソ抗原で試験した。すべての血清がラテックスを 凝集した。同様に２１種類の高力ｇｎＸ、ｇ（、血清を試験し二が、ラテックス の凝集は認めろれなかっ　ン一に：。

ａＩ± １３９人の患者の血清のＩｇＭ定量を実施例２の方法に基づいてプロテイナーゼ にで処理したラテックストキソ抗原を用いて行なった。結果を第４表に示し、ま た２種類の商品として入手可能な分析法を用いて得た結果も比較のため同表に示 す。第５表にこの方法によって得られた結果を示す。表中には次の言葉を使用し た。

先行技術Ａ、これはミクロタイタープレート法である。プラスチックのくぼみ（ ｗｅｌｌ）はヒトＩｇＭ抗体に特異的な抗体を含んでいる。？ｇＭ抗体を愚者の 試料から取り出す。くぼみを洗條しゾイトの存在の有無を調べる。

先行技術Ｂ、これは先行技術Ａを基本としたエンザイムラベルド・イミニソルベ ント・アッセイ（ｅｎｚｙｍｅ−１ａｂｅＬＩｅｄｉａ＋ｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎ ｔ　ａｓｓａｙ）である、完全なトロフォゾイトの代わりに、可溶化抗原および 抗原に特異的な酵素標識第二抗体を検出方法として使用する。

陰性・陽性・不明は分析の定性結果を示している。

非免疫血清とはトキソブラスマに感染していない患者からの血清であり、低いＩ ｇＭおよび低いＩｇＧを保持しているはずである。

免疫血清は高いＴｇＧおよび低いＴＩ、Ｍを保持しているはずである。

５染血清とは愚者からの血清であり、Ｉ　ｇ　Ｍ　’ｆ４度が上昇中かあるい二 よ下降中である。感染がごく最近のものであるかある乞、′弓よＩｇＧ免疫の段 階に向かっているものかを決定するためには、追跡試験が必要であろう。

最近５染とは、ＩｇＭ濃度がまだそのピークを過ぎて６ｓなし、段階の愚者から の血清を指す。

先天的血清とは先天的トキソブラスマ症愚者からの血清である。

第５表から明らかなように、本発明は非常に識別力が高くかつ高感度な試験方法 を提供する。多数の陽性結果が以前免疫を持っていないとされていた愚者からも 得られたことは〜　トキソブラスマ症が人口の相当数に存在する可能性のあるこ とを示し＝Ｌ−≦Ｌ−ｊ＆ 国際調査報告 国際調査報告　ＰＣτ／Ｇ３８８１１００６１５ＳＡ　２３４７６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 反応性 １．定量しようとする抗体と抗原の反応性を他の抗体のと比較して強めるために 酵素修飾した抗体を、定量しようとする抗体に対して使用することによって、免 疫グロブリン混合物を含む試料中の１８Ｍ抗体を定量する方法であって、試料混 合物を酵素修飾した抗原とインキニベーションすること、および定量しようとす る抗体と酵素で修飾した抗原との結合程度を測定することからなる上記の定量方 法。 ２．定量しようとする抗体が１ｇＭおよびＩｇＧ免疫グロブリンの混合物を含む 試料の中のＩｇＭ抗体である、請求項１記載の方法。 ３．抗原をプロテアーゼとの反応によって修飾する、請求項１又は２記載の方法 。 ４．プロテアーゼがプロテイナーゼＫである、請求項３記載の方法。 ５．プロテアーゼがプロナーゼである、請求項３記載の方法。 ６．抗原がトキソプラズマ抗原である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方 法。 ７．酵素修飾抗原を固体表面に結合した形で使用する、請求項１〜６のいずれか １項に記載の方法。 ８．酵素修飾抗原をラテックス粒子に結合した形で使用する、請求項７記載の方 法。 ９．抗原を粒子に結合させる前に酵素修飾する、請求項８記載の方法。 １０．抗原を粒子に結合させた後に酵素修飾する、請求項８記載の方法。 １１．抗原と抗体との結合の程度を凝集技術によって測定する、請求項８〜１０ のいずれか１項に記載の方法。 １２．凝集技術が非凝集粒子を計数することを含む、請求項１１記載の方法。 １３．凝集を濁度測定によって定量する、請求項１１記載の方法。 １４．凝集を比濁分析法によって定量する、請求項１１記載の方法。 １５．凝集を目測する、請求項１１記載の方法。