DE3887124T2 - VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON IgM-ANTIKÖRPERN. - Google Patents

VERFAHREN ZUR BESTIMMUNG VON IgM-ANTIKÖRPERN.

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Description

  • Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von IgM-Antikörpern in einer Probe, die ein Gemisch aus Immunglobulinen enthält. Derartige Bestimmungen (Assays) sind schwierig, weil eine Klasse von Antikörpern in einer Bestimmung für eine andere Klasse stören kann.
  • Wenn jemand durch Bakterien, Viren oder Pilze infiziert wird, entwickelt der Körper rasch eine Immunantwort, d.h., der Körper erzeugt Macroproteine, die Immunglobuline (Ig) genannt werden, die sich an das infizierende Agens anheften, um es nach einem bestimmten Mechanismus schließlich zu zerstören.
  • Von Wichtigkeit sind drei Immunglobuline, nämlich IgM, IgA und IgG. Beim Beginn der Infektion sind die ersten Immunglobuline, die in vivo erzeugt werden, diejenigen der IgM-Klasse. Nach Erreichen eines Maximums fällt die Konzentration an IgM während einer verhältnismäßig kurzen Zeit ab, während die Konzentration an IgG ansteigt, ein Plateau erreicht und gelegentlich über eine Zeitdauer von vielen Jahren langsam abnimmt. Wenn daher eine hohe Konzentration an IgM festgestellt wird, ist die Infektion frisch. Wenn ausschließlich eine IgG-Konzentration vorliegt, ist die Infektion alt, und wenn die IgG- Konzentration hoch ist, besitzt die befallene Person eine gute Immunität gegenüber der Infektion. In vielen Fällen muß der Arzt wissen, ob die Infektion frisch oder alt ist, und, wenn sie alt ist, daß der Patient eine Widerstandsfähigkeit gegenüber einem erneuten Auftreten besitzt, wobei das Ausmaß für diese Widerstandsfähigkeit durch die Konzentration an Ig-G bestimmt wird.
  • Eine sehr wichtige Infektion sowohl von Tieren als auch von Menschen, die Toxoplasmose, wird durch einen Parasiten, ein Protozoon, Toxoplasma gondii verursacht, das Tiere, wie Katzen, haben. Es wird angenommen, daß zwischen 20 und 40% der erwachsenen Bevölkerung in Großbritannien schon einmal oder mehrmals mit diesem Parasiten infiziert worden sind, und in einigen Teilen der Welt kann diese Zahl bis 95% betragen. Bei Kindern und Erwachsenen ähneln die Symptome dieser Krankheit dem Drüsenfieber, und die Krankheit nimmt gewöhnlich einen gutartigen Verlauf. Jedoch sind schon Fälle von Nephritis, Lungenentzündung und Ausschlägen mitgeteilt worden.
  • In der Schwangerschaft können die Folgen, davon daß eine Mutter eine akute (frische) Infektion von Toxoplasmose hat, darin bestehen, daß der Fötus und selbst bereits geborene Kinder geschädigt werden, wobei Encephalitis, Hydrocephalitis, cerebrale Verkalkung sowie Augen- und 0hrenschädigungen auftreten können.
  • Immer mehr Ärzte untersuchen daher ihre Patienten auf mögliche Toxoplasmose. Es gibt zwei Fragen. Hat die Patientin:
  • 1. eine akute Toxoplasmose, d.h. eine hohe IgM- Konzentration oder
  • 2. eine alte Infektion, und wenn sie eine alte Infektion hat, besitzt sie einen guten Schutz gegen eine Toxoplasmose-Infektion während der Schwangerschaft, d.h. eine hohe IgG-Konzentration?
  • Es gibt derzeit viele Verfahren, um die Gesamtkonzentration an Immunglobulin-Antikörpern, d.h. von IgG und IgM zu bestimmen. Bei einigen dieser Verfahren wird das infizierende Agens zerstört und auf cellulärem Niveau in Fragmente aufgebrochen, die das Antigen oder das Molekül enthalten, an das IgM- oder IgG-Antikörper binden. Diese Fragmente werden dann an die Wand eines Kunststoff-Reagenzröhrchens adsorbiert, und es wird eine Probe des Serums, das IgG- oder IgM-Antikörper enthalten kann, in das Röhrchen hinzugegeben. Nach einer Bebrütungszeit, die mehrere Stunden dauern kann, wird das Serum ausgegossen, das Röhrchen sorgfältig gewaschen und anschliefßend eine Lösung zugesetzt, die markierte Antikörper gegenüber menschlichem IgM- oder IgG enthält.
  • Die Anti-IgM- oder -IgG-Antikörper sind mit einer der Markierungen versehen, auf die das Bestimmungssystem eingerichtet ist, nämlich Fluoreszenz, Isotope oder Enzyme. Nach einer weiteren Bebrütung wird der Inhalt des Röhrchens erneut entleert und das Röhrchen gewaschen. Wenn das Verfahren mit einem durch ein Enzym markierten Anti-Immunglobulin durchgeführt wurde, wird nunmehr eine Substratlösung zugesetzt und nach weiterem Bebrüten die entwickelte Färbung gemessen, wobei die optische Dichte proportional zu der Menge an IgM- oder IgG-Antikörpern ist, die sich an die Wand angeheftet haben. Im Prinzip sollte man daher in der Lage sein, die Menge von anwesendem IgG oder IgM abzuschätzen.
  • Obwohl dieses Verfahren derzeit weitverbreitete Anwendung findet, leidet es an zwei großen Fehlerquellen. IgG- Antikörper können in Konzentrationen auftreten, die 100 mal und noch größer sind als die der IgM-Antikörper, und auf diese Weise können hohe IgG-Antikörper-Konzentrationen die Antigene an der Oberfläche des Röhrchens daran hindern, die IgM-Antikörper zu binden, woraus irrtümlich zu niedrige Werte für IgM und eine Diagnose, daß die Infektion alt ist, resultieren.
  • Eine weitere Komplizierung besteht darin, daß C1q (ein Komplementprotein, das in sämtlichen Serumproben vorhanden ist) und der Rheumafaktor RF (der in Proben von manchen Patienten mit Autoimmunkrankheiten vorhanden ist) an Immunkomplexe gebildet werden, die zwischen Antikörpern und Antigenen gebildet worden sind. Nachdem der IgG-Antikörper an der Wand des Röhrchens oder an einem Latexteilchen bei einer Bestimmung reagiert hat, reagiert RF oder C1q mit dem IgG. Wenn daher markierter Anti-IgG-Antikörper zugesetzt wird, kann eine große Menge dieses markierten Materials nicht reagieren, und die Bestimmung der IgG-Antikörper gegen die Infektion wird irrtümlicherweise zu niedrig sein.
  • Auf der Grundlage der oben beschriebenen Bestimmung sind mehrere Methoden entwickelt worden, um diese Störungen oder Fehlerquellen zu verringern oder ganz zu eliminieren (siehe beispielsweise Naot Y und Remington J.S.; J. Infect, Dis . 142, No. 5,757-766, 1980 oder Wielaard F. et al. J. clin. Microbiology, 17, No. 6, 981-87, 1983 oder Cesbron Y.J. et al. J. of Immun. Methods, 83, 151-58, 1985. Da diese Verfahren sämtlich ein Enzym als Markierungsmittel verwenden, werden sie ELISA-Tests (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) genannt. Das in diesen Veröffentlichungen beschriebene Verfahren wurde unter der Handelsbezeichnung Toxonostika durch 0rganon Teknika N.Y., Viedijk 58, 2300 Turnhout, Belgien in den Handel gebracht. Die Bestimmung ist jedoch kompliziert, arbeitsintensiv und daher fehleranfällig. Im Gegensatz dazu ist das Verfahren, das wir nunmehr beschreiben, einfach, schnell, frei von Störungen durch RF oder C1q sowie spezifisch und beruht darauf, daß man das aus dem infizierenden Mittel stammende Antigen identifiziert und gegenüber IgM-Antikörpern spezifisch macht.
  • Wenngleich in ihrer Einzelstruktur sämtliche Antigene unterschiedlich sind, kann man doch sagen, daß sie eine oder mehrere von vier molekularen Strukturen aufweisen, nämlich Glycoprotein (Zuckerprotein), Protein, Lipoprotein (Fettprotein) oder Lipopolysaccharid (Fettzucker). Es ist vorgeschlagen worden, daß bei bestimmten Antigenen von Toxoplasmagondii die IgM-Antikörper mit den Polysaccharid- und Proteinresten reagieren, während die IgG- Antikörper vorzugsweise mit dem Protein reagieren sollen (Mineo J.R. et al, Infect. Immun. 27, 283-287, 1980 und Camargo M.E. et al ibid 21, 55-58, 1978).
  • Die genannten Autoren behaupteten, daß die selektive Umsetzung von IgM- und IgG-Antikörpern mit dem Polysaccharid bzw. dem Protein unter Anwendung einer ELISA-Technik bestimmt wurde, wobei sie demgemäß davon ausgingen, daß das Verfahren in der Lage sei, IgM- von IgG-Antikörpern zu trennen. Sie hatten das 0berflächenantigen von Toxoplasmagondii abgetrennt und das Protein physikalisch denaturiert, wobei lediglich der Polysaccharidrest übrigbliebt, an den, wie sie behaupteten, lediglich IgM gebunden wurde.
  • Die Arbeit wurde 1983 von Naot und Remington, Forschern mit während etwa 15 Jahren herausgebrachten Veröffentlichungen auf dem Gebiet der Entwicklung von Tests für den Toxoplasmoseparasiten, wobei Protease verwendet wurde, um das Protein zu zerstören (Naot Y, Guptill D.R., Mullenax J. und Remington J.S. Infect. I=un. 41 No. 1, 331-338, 1983), diese Forscher waren jedoch nicht in der Lage, eine IgM- oder IgG-spezifische Reaktion zu erhalten.
  • Bei einer weiter vertieften Forschung über das Toxoplasmoseantigen konnten Sharma et al J. of Immunology 131, No. 2, 977-983, 1983 keine Antigene finden, die für IgM spezifisch gewesen wären. Wir haben ebenfalls versucht, die Arbeit der Mineo-Gruppe zu wiederholen, jedoch sind unsere Versuche unter Anwendung der ELISA-Tests zur Erzielung einer spezifischen IgM-Reaktion mit dem von Protease verdauten Antigen von Toxoplasmagondii ebenfalls fehlgeschlagen.
  • Aus EP-A-0189389 ist die Anwendung einer Agglutinations-Bestimmungstechnik zur Bestimmung von IgM-Antikörpern in einem Gemisch aus IgM- und IgG-Antikörpern bekannt. Die IgM-Antikörper werden von den IgG-Antikörpern durch Zugabe von Anti-IgG-Antikörpern unterschieden.
  • Herkömmliche ELISA-Assays eignen sich nur zur Bestimmung der Konzentration an Gesamtimmunoglobulin und können nicht zufriedenstellend zur Bestiininung jeder einzelnen Antikörper-Klasse in Gegenwart der anderen angewandt werden. Die vorliegende Erfindung versucht, diese Schwierigkeit zu überwinden, und fußt auf der Beobachtung, daß die enzymatische Behandlung des Antigens seine Reaktionsfähigkeit mit einer Klasse von Antikörpern im Verhältnis zu der anderen Klasse erhöhen kann.
  • Die Erfindung besteht in einem Verfahren zur Bestimmung von IgM-Antikörpern gegen Toxoplasmose in einer eine Mischung aus Immunglobulinen enthaltenden Probe durch Verwendung eines Toxoplasma-Antigens, das zur Erhöhung seiner Reaktionsfähigkeit mit dem IgM-Antikörper im Vergleich zum anderen Antikörper durch Reaktion mit einem proteolytischen Enzym modifiziert worden ist, wobei man bei dem Verfahren eine Mischung aus Probe und dem enzymmodifizierten Antigen inkubiert und die Bindung des IgM-Antikörpers an das enzymmodifizierte Antigen mittels eines Agglutinationsverfahrens bestimmt.
  • Die Erfindung eignet sich insbesondere zur Bestimmung von IgM-Antikörpern in Anwesenheit von IgG-Antikörpern.
  • Die Erfindung bedient sich der Verwendung eines Antigens, das mit einem proteolytischen Enzym umgesetzt worden ist, um seine Reaktionsfähigkeit mit dem zu bestimmenden Antikörper im Verhältnis zu dem anderen Antikörper zu erhöhen. Geeignete Enzyme sind beispielsweise Proteasen, wie beispielsweise Pronase und Proteinase K. Die Umsetzungsbedingungen sind nicht von ausschlaggebender Bedeutung. Beispielsweise kann das Antigen mit dem Enzym in einem Medium und bei einem pH-Wert, bei dem beide stabil sind, bei 37 ºC während einer Zeitdauer von wenigen Minuten bis einigen Stunden inkubiert werden.
  • Die Modifizierung des Antigens mit einem Enzym erhöht seine Reaktionsfähigkeit mit dem zu bestimmenden Antikörper im Verhältnis zu dem anderen Antikörper. Das kann dadurch erreicht werden, daß man die Reaktionsfähigkeit des Antigens mit dem zu bestimmenden Antikörper tatsächlich erhöht, oder dadurch, daß man die Reaktionsfähigkeit des Antigens mit dem anderen Antikörper verringert, oder dadurch, daß man beide Wirkungen auslöst. Die Reaktionsfähigkeit eines Antikörpers mit seinem Antigen hängt von der Zahl der Bindungsstellen auf jedem der beiden sowie der Bindungsaffinität jeder Bindungsstelle für die andere Komponente ab. Eine Veränderung der Reaktionsfähigkeit des Antigens mit einem Antikörper kann darin bestehen, daß man die Zahl der Bindungsstellen verändert oder die Bindungsaffinität einer oder mehrerer der Bindungsstellen oder beides verändert.
  • Die Erfindung umfaßt das Inkubieren eines Gemisches der Probe mit dem enzymmodifizierten Antigen. Die Bestimmungsbedingungen können herkömmlicher Art sein wie auch die Mittel zum Messen des Ausmaßes der Bindung des Antikörpers, der bestimmt werden soll, an das enzymmodifizierte Antigen. Jedoch wird das enzymmodifizierte Antigen vorzugsweise in einer Form verwendet, in der es an eine feste Oberfläche gebunden ist, und diese Oberfläche kann die Wand eines Bestimmungsgefäßes sein. Vorzugsweise wird das enzymmodifizierte Antigen an kleine Festteilchen gebunden, die während der Dauer der Inkubation in Suspension gehalten und erforderlichenfalls anschließend durch Zentrifugieren oder mittels magnetischer Wirkung absetzen gelassen werden können. Die Art des teilchenförmigen Materials ist nicht von ausschlaggebender Bedeutung; so können Glaskugeln, Goldsohle oder insbesondere Latexteilchen (Polystyrol) verwendet werden. Derartige Teilchen sind im Handel erhältlich, und Verfahren zur Bindung von Reagenzien, wie beispielsweise Antigene, an sie sind in der Fachwelt wohlbekannt.
  • Das Ausmaß der Bindung des enzymmodifizierten Antigens an den zu bestimmenden Antikörper wird durch eine Agglutinationstechnik gemessen. Das Ausmaß der Agglutination kann turbidimetrisch bestimmt werden, wird jedoch vorzugsweise mit Hilfe einer Teilchenzähltechnik, wie beispielsweise unserem diagnostischen System IMPACT (Warenzeichen) ermittelt. Bei diesem System werden Teilchenzahlen in einem definierten Flüssigkeitsvolumen ausgezählt. Die Teilchen sind von bekannter, gleichmäßiger Größe, und das Instrument wird so geeicht, daß es lediglich Teilchen von etwa dieser Größe zählt, so daß Vergesellschaftungen von zwei oder mehr Teilchen, die durch Agglutination gebildet worden sind, zurückgewiesen und nicht gezählt werden. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß durch Anwendung eines derartigen Systems die Selektivität des enzymmodifizierten Antigens für den zu bestimmenden Antikörper im Verhältnis zu dem anderen Antikörper stark erhöht wird, so daß der andere Antikörper praktisch nicht stört.
  • Es wird derzeit angenommen, daß es für diese überraschende Erscheinung folgende Erklärung gibt: Bei einem Agglutinationstest dieser Art werden Kugeln, beispielsweise Latexkugeln von 0,8um Durchmesser, durch zwei oder drei Antikörper, deren Durchmesser von der Größenordnung von 0,01um ist, zusammengehalten. Bei der thermischen Bewegung und durch das Hindurchfließen durch das Meßsystem werden Scherkräfte auf die Latexaggregate ausgeübt, die diese leicht auseinanderbrechen. Andere Aggregate, bei denen die Immunbindungskraft zwischen Antigen und Antikörper, die diese zusammenhält, hinreichend groß ist, können diesen Scherkräften widerstehen.
  • Gemäß unseren Beobachtungen mit dem ELISA-Verfahren (siehe das untenstehende Beispiel 1) wird durch die Behandlung des Antigens von Toxoplasma gondii mit Proteinase K das Antigen nicht vollständig spezifisch für IgM. Nach der Behandlung reagiert IgG weiter, wenngleich in einem geringeren Ausmaß, und somit führt die Behandlung des Antigens mit Proteinase K nicht von sich aus zu einem vollständig spezifischen Assay für IgM-Antikörper.
  • Jedoch wird die Bindung von IgG an das enzymmodifizierte Antigen sehr viel stärker verringert als die von IgM. Die Bindung von IgG wird auf etwa 1/10 des ursprünglichen Wertes verringert, während diejenige von IgM auf 1/4 bis 1/5 verringert wird. Im Gegensatz dazu wird die Bindung von IgG an enzymmodifiziertes Antigen bei Agglutinationsassays fast vollständig inhibiert. Wir glauben, daß die Bindungsaffinität von IgG (jedoch nicht die von IgM) gegenüber dem enzymmodifizierten Antigen so niedrig ist, daß agglutinierte Teilchen durch die oben erörterten Scherkräfte entzweigebrochen werden und daher in einem Teilchenzählsystem als nicht agglutiniert gezählt werden.
  • Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
    • Beispiel 1 Herstellung von Toxoplasmoseantigen (Toxoantigen)
  • Das Toxoplasmoseantigen wurde aus dem Bauchfell-Exsudat von Mäusen hergestellt, die zwei Tage zuvor mit Trophozoiten von T.gondii infiziert worden waren.
  • Die Bauchfellhöhlung wurde mit 3 bis 5 ml steriler physiologischer Kochsalzlösung gewaschen. 1-ml-Proben dieser Suspension wurden mit 0,015 ml des Antibiotikums Pentrexyl und 10 Einheiten Heparin versetzt und das Ganze 30 min bei Raumtemperatur in Röhrchen mit kegelförmigem Boden stehen gelassen. Die Röhrchen wurden danach 4 min lang bei 600U/min zentrifugiert, und der Rückstand wurde verworfen. Die Suspension wurde erneut bei 4ºC und 4000 U/min 30 min lang zentrifugiert und das Überstehende verworfen. Nach Zugabe von 2 ml 1molarer Ammoniumchloridlösung zu dem Pellet, um die roten Blutzellen zu hämolysieren, und erneutem Zentrifugieren bei 4ºC und 4000 U/min wurde das Pellet dreimal mit physiologischer Kochsalzlösung gewaschen und erneut 30 min lang bei 4ºC und 4000 U/min zentrifugiert.
  • Das Pellet wurde in 2 ml destilliertem Wasser erneut suspendiert und anschließend wiederholt mit Trockeneis/Aceton gefroren und wieder aufgetaut, wobei die Lösung jedesmal einer Ultraschallvermischung unterzogen wurde. Nach 10 min Zentrifugieren bei 3000 U/min wurde das Überstehende entfernt und bei 2000 aufbewahrt.
    • Bestimmungsverfahren (Assayverfahren)
  • Serumproben, die sowohl IgG- als auch IgM-Antikörper enthielten, wurden auf Microtiterplatten getestet, deren Oberfläche mit 100ul Antigen von Toxoplasma gondii, das, wie beschrieben, hergestellt worden war, behandelt.
  • Die Platten wurden über Nacht bei 4ºC mit dem Antigen bebrütet und anschließend fünfmal mit physiologischer Kochsalzlösung, die 0,05 % Tween 20 enthielt, gewaschen ("Tween" ist ein eingetragenes Warenzeichen.) Eine Hälfte der Platten wurde mit 100ul Tris-HCl-Puffer (0.01M pH 7.5, 0,02M CaCl&sub2;) je Vertiefung versetzt, der Proteinase K in einer Konzentration von 1 mg/ml Puffer enthielt, und die Platten wurden 2 h bei 37ºC bebrütet. Die übrigen Platten wurden lediglich mit Tris-Puffer behandelt und während derselben Zeit bebrütet. Nach der Inkubation wurden sämtliche Platten fünfmal mit physiologischer Kochsalzlösung/0,05% Tweer 20 gewaschen. Patientenseren wurden in einer Reihe für die Bestimmung von IgM auf Konzentrationen von 1/500, 1/1000, 1/2000, 1/4000 und 1/8000 verdünnt, während diejenigen für die IgG-Bestimmung auf 1/50, 1/100, 1/200, 1/400 und 1/800 verdünnt wurden. In jede Vertiefung der Mikrotiterpatten wurden 50ul des verdünnten Serums eingebracht, und die Platte wurde 1 h bei Raumtemperatur bebrütet und fünfmal mit physiologischer Kochsalzlösung/0,05% Tween 20 gewaschen. In jede Vertiefung wurden je nach der Zweckbestimmung 100ul an mit Peroxidase markiertem Anti-IgM (2 mg/ml) oder mit Peroxidase markiertem Anti-IgG (2,5 mg/ml) bei pH 5 in Gegenwart von Wasserstoffperoxid eingebracht. Nach 20 min Bebrütung bei Raumtemperatur wurden 25ul 0,1 N Schwefelsäure zugesetzt und die optische Dichte bestimmt. Tabelle 1 gibt die Ergebnisse wieder. Je höher die optische Dichte war, um so größer war die Konzentration von Antikörper im Serum. Ähnliche Ergebnisse wurden erzielt, indem man das Antigen vor der Adsorption an Vertiefungen von Mikrotiterplatten mit Proteinase K behandelte. Tabelle 1 Optische Dichte von 4 Seren von Patienten, die mit Toxoplasma gondii infiziert waren A = in Vertiefungen fit dem Gesamtantigen von Toxoplasma gondii B = in Vertiefungen mit Antigen von Toxoplasma gondii, das mit Proteinase K behandelt worden war. IgM-Antikörper Titer 1/IgG-Antikörper Titer 1/Probe Leerwert
  • Wie ersichtlich, verringert die Behandlung des Antigens mit Proteinase K seine Reaktionsfähigkeit gegenüber sowohl IgM als auch IgG beträchtlich. Jedoch ist die Verringerung gegenüber IgG wesentlich größer als gegenüber IgM. Mit anderen Worten, die Enzymmodifizierung hat die Reaktionsfähigkeit des Antigens mit IgM im Verhältnis zu derjenigen mit IgG erhöht.
    • Beispiel 2 Herstellung von Latex-Toxoantigen (Lxtoxo)
  • 250ul carboxylierter Latex (10% Gewicht/Volumen) (Lx) wurden mit 2 ml mit Barbital gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (BBS) (0,02 Mol, pH 8,1) versetzt und das Ganze 10 min bei 10000 U/min zentrifugiert. Das Überstehende wurde entfernt, und es wurden 250ul BBS zugesetzt und das Ganze auf 4ºC gekühlt. Danach wurden 250ul BBS mit einem Gehalt von 25 mg Carbodiimid (CDI) zugesetzt, um ein Gemisch aus 10 mg Carbodiimid pro 100ul Lx zu erhalten, wobei die Lösung frisch hergestellt und bei 4ºC gehalten sowie 1 h unter Verwirbeln bei 4ºC bebrütet wurde.
  • Nach Zentrifugieren während 10 min bei 4ºC und 10000 U/min wurde sie einer Ultraschallbehandlung unterworfen und einer Lösung aus Toxoantigen (5 mg) in BBS bei 4ºC (Volumen etwa 0,5 ml) zugesetzt.
  • Die Suspension wurde anschließend 2 bis 4 h unter Verwirbeln oder 16 h auf einer Walze inkubiert.
  • Die Latexsuspension wurde dreimal mit Tris (0,1N HCl, pH 7,5 und 20 mM in CaCl&sub2;) gewaschen und nach jedem Zentrifugieren durch Ultraschall vermischt. Dies ist die Herstellung von Lx zur Behandlung mit Enzymen beim pH-Wert 7,5. Für die Behandlung mit Pepsin wird Lx in 0,15 M Salzsäure suspendiert. Das Latex-Toxoantigen wurde mit verschiedenen Proteaseenzymen unter den in der folgenden Tabelle 2 angegebenen Bedingungen bebrütet. Tabelle 2 Behandlung von Lx-Ag-Toxo mit spezifischen Enzymen Enzym Enzym-Konz. Inkubation Temp. Lipase Pepsin Trypsin Pronase Proteinasek
  • Durch Hitze aggregiertes menschliches IgG (10 mg/ml) wurde 30 min auf 63ºC erhitzt und im Verhältnis 1:1 mit mit Glycin gepufferter physiologischer Kochsalzlösung (GBS) verdünnt.
    • Bestimmungsverfahren
  • 30ul eines im Verhältnis von 1/50 verdünnten Patientenserums in GBS/1% BSA wurden zu 30 ul einer Lösung hinzugegeben, die 60ug/ml eines monoclonalen IgG-Mäuseantikörpers, der gegen menschliches IgM gerichtet ist, und 5 mg/ml von durch Hitze aggregiertem menschlichem IgG zur Absorption von C1q und RF enthielt. Diese Lösung wurde anschließend mit 30ul Latex Lx Toxo von einer Konzentration von 0,05% (Gewicht/Volumen) versetzt.
  • Das Gemisch wurde 30 min unter Vermischen durch Verwirbeln bebrütet. Die Umsetzung wurde durch Zugabe von 2 ml GBS unterbrochen, und es wurden in einem Blutzellenzählapparat, der derart abgeändert war, daß er nur die nicht agglutinierten Teilchen zählte, nur die nicht agglutinierten Teilchen ausgezählt.
  • Der monoclonale Mäuseantikörper gegen menschliches IgM wurde in das Reaktionsgemisch eingeschlossen, weil man unerwarteterweise gefunden hatte, daß er die IgM-Antikörper- Agglutination um einen Faktor von mehr als vier vergrößerte. Dies trägt dazu bei, eine Störung durch IgG auf ein Minimum herabzudrücken. Das durch Hitze aggregierte IgG ist in Lösung vorhanden, um restliche Störungen zu eliminieren, die von Proben herrühren, die einen hohen Gehalt an IgG-Antikörpern und an Rheumafaktor (RF) enthalten.
    • Ergebnisse
  • Wie in Tabelle 3 dargestellt, wird durch die Behandlung des mit dem Antigen überzogenen Latex mit Pronase und Proteinase K die durch IgG-Antikörper hervorgerufene Agglutination vollständig zerstört und die Agglutination der IgM- Antikörper verstärkt; eine mögliche Erklärung für diese Verstärkung liegt darin, daß die Proteolyse mehr "IgM- Antigene" von der Proteinschale, die die Teilchen umgibt, in Freiheit setzt und sie dadurch für die Umsetzung mit IgM-Antikörpern verfügbar macht. Tabelle 3 Latex-Vergleich Latex-Lipase Latex-Pepsin Latex-Trypsin Latex-Bronase Latex-Proteinasek Antitoxoplasma IgG-Serum Antitoxoplasma IgMSerum Agglutination Verminderte Agglutination Erhöhte Agglutination Keine Agglutination Stark erhöte Agglutination
    • Beispiel 3
  • Um diese Ergebnisse zu bestätigen, wurden 40 IgM- positive Seren mit dem in Beispiel 2 beschriebenen Proteinase-K-Latex-Toxoantigen getestet: Sämtliche Seren agglutinierten an Latex. 21 Seren mit einem hohen Gehalt an IgG wurden in analoger Weise untersucht, und es ergab sich, daß keines von ihnen den Latex agglutinierte.
    • Beispiel 4
  • 139 Patientenseren wurden nach dem Verfahren gemäß Beispiel 2 unter Verwendung des mit Proteinase K behandelten Latextoxoantigens auf IgM untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 4 zusammengefaßt, und die Ergebnisse, die mit zwei im Handel erhältlichen Assays erzielt wurden, sind zum Vergleich ebenfalls aufgeführt. Die weiter unten stehende Tabelle 5 stellt weitere quantitative Ergebnisse dar, die gemäß diesem Verfahren erhalten worden sind. Die folgenden Ausdrücke werden in den Tabellen verwendet:
    • Stand der Technik A:
  • Dies ist ein Mikrotiter- Plattenverfahren. Die Kunststoffvertiefungen enthalten einen Antikörper, der für menschliche IgM-Antikörper spezifisch ist. IgM-Antikörper werden aus Patientenproben gewonnen. Nach dem Waschen der Vertiefungen wird eine Suspension aus gewaschenen Trophozoiten zugesetzt. Nach der Bebrütung werden die Vertiefungen durch Augenschein auf die Anwesenheit von unbeweglich gemachten Trophozoiten untersucht.
    • Stand der Technik B:
  • Dies ist ein enzymmarkierter Immunsorbierungs-Assay, der auf Stand der Technik A beruht. Anstelle intakter Trophozoiten werden löslich gemachtes Antigen und ein enzymmarkierter zweiter Antikörper, der für das Antigen spezifisch ist, als Erfassungssystem verwendet.
  • Neg., Pos. und Unsicher sind Bezeichnungen für negative, positive und unsichere qualitative Ergebnisse des Assays.
  • "Nicht immun"-Seren sind von Patienten, die nicht mit Toxoplasmose infiziert sind, und die einen niedrigen IgM- und einen niedrigen IgG-Wert haben sollten.
  • Immun-Seren sollten einen hohen IgG- und einen niedrigen IgM-Wert aufweisen.
  • Infizierte Seren sind von Patienten, bei denen die IgM-Konzentration steigen oder fallen kann. Eine genaue Verfolgung kann erforderlich sein, um zu bestimmen, ob die Infektion sehr frisch ist oder ob sie sich in Richtung auf einen Immun-IgG-Zustand hinbewegt. Der Ausdruck "frische Infektion" bezieht sich auf Seren von Patienten, die in einem Zustand sind, bei dem die IgM-Konzentration noch nicht ihren Höhepunkt überschritten hat.
  • "Angeboren" bezieht sich auf Seren von Patienten mit angeborener Toxoplasmose.
  • Wie in Tabelle 5 hervorgehoben, führt das Verfahren gemäß der Erfindung zu einem sehr gut unterscheidenden und empfindlichen Test. Die große Anzahl an positiven Ergebnissen, die für Patienten erhalten wurden, von denen man zuvor angenommen hatte, daß sie keine Immunität besitzen, legt den Schluß nahe, daß Toxoplasmose in einem beträchtlichen Teil der Bevölkerung existieren kann. Tabelle 4 Patientenklasse Zahl der Seren ERFINDUNG Stand der Technik Unsicher Nicht immun Immun Infiziert Frische Infektion Angeboren Tabelle 5 Patientenklasse Zahl der Seren Negativ Positiv Mittel Bereich (willkürliche Einheiten) Nicht immun Immun Infiziert Frische Infektion

Claims (7)

1. Verfahren zur Bestimmung von IgM-Antikörpern gegen Toxoplasmose in einer eine Mischung aus Immunglobulinen enthaltenden Probe durch Verwendung eines Toxoplasma-Antigens, das zur Erhöhung seiner Reaktionsfähigkeit mit dem IgM-Antikörper im Vergleich zum anderen Antikörper durch Reaktion mit einem proteolytischen Enzym modifiziert worden ist, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Mischung aus Probe und dem enzymmodifizierten Antigen inkubiert und die Bindung des IgM-Antikörpers an das enzymmodifizierte Antigen mittels eines Agglutinationsverfahrens bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem zu bestimmenden Antikörper um einen IgM-Antikörper in einer Probe, die eine Mischung aus den Immunglobulinen Igm und IgG enthält, handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem proteolytischen Enzym um Proteinase K handelt.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem proteolytischen Enzym um eine Pronase handelt.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Antigen um Toxoplasmagondii handelt.
6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete enzymmodifizierte Antigen an eine feste Oberfläche gebunden ist.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete enzymmodifizierte Antigen an
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