DE3303793A1

DE3303793A1 - Immunoassay fuer klassenspezifische immunoglobulinantikoerper

Info

Publication number: DE3303793A1
Application number: DE19833303793
Authority: DE
Inventors: John Thomas 60046 Lindenhurst Ill. Unger
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1982-02-08
Filing date: 1983-02-04
Publication date: 1983-08-18
Also published as: JPS58147653A; BE895848A; DE3303793C2; GB8300371D0; CA1215644A; FR2521303A1; JPH0381099B2; IT1163083B; JPH0540120A; GB2114289A; US4434227A; IT8319454A0; GB2114289B; JP2599058B2; FR2521303B1

Description

Das Immunoglobulinmolekül besteht aus einem oder mehreren Sätzen von U Polypeptidketten, nämlich 2 schweren Ketten mit einem Molekulargewicht von etwa 53 000 Dal ton und 2 leichten Ketten mit einem Molekulargewicht von etwa 22 000 Dalton, die durch Disulfidbrücken verbunden sind.

Die Immunoglobuline werden im allgemeinen in 5 Klassen unterteilt: G, M, A, D und E. Immunoglobuline dieser Klassen werden im allgemeinen durch die Symbole IgG, IgM, IgA, IgD und IgE wiedergegeben.

Die 5 Immunoglobulinklassen unterscheiden sich durch die Anwesenheit von antigenen Determinanten der schweren Kette, die durch kleine griechische Buchstaben entsprechend den römischen Buchstaben für die Immunoglobuline bezeichnet werden.

Immunoglobulin antigene Determinante

der schweren Kette

IgG	r	(Gamma)
IgA	OC	(Alpha)
IgM	M	(my)
IgD	6	(Delta)
IgE	£	(Epsilon)

Bei IgG, IgA und IgM gibt es ferner Unterklassen, die auf anderen antigenen Determinanten, die durch Zahlen gekennzeichnet werden, basieren, beispielsweise /Ί, ot1 und p"\. Bei IgG kennt man 4, bei IgA 2 und bei IgM 2 Unterklassen. Sämtliche Unterklassen treten in den Seren bei allen normalen Personen auf.

- 9

303(' - 10 -

Das am stärksten vertretene Immunoglobulin im Serum von normalen Personen ist IgG. Es tritt auch in Gewebeflüssigkeiten auf und kann durch die Plazenta aus dem mütterlichen in den fötalen Kreislauf gelangen. Es besitzt in vivo und in vitro antibakterielle, antivirale und antitoxische Eigenschaften. Es handelt sich um einen spät auftretenden Antikörper.

IgM ist durch das Vorhandensein von schweren Ketten mit der Aminosäuresequenz, die die antigene Determinante ^u bestimmt, charakterisiert. Ein unterscheidendes Merkmal für die IgM-Funktion besteht in der starken zytolytischen und Komplement fixierenden Aktivität, die die von IgG weit übersteigt. IgM ist im allgemeinen bei Tieren oder Menschen der im Anschluss an die Immunisierung zuerst auftretende Antikörper. Er wird sodann allmählich durch IgG ersetzt.

IgA ist das im Humanserum am zweitstärksten vertretene Immunoglobulin und stellt das hauptsächliche sekretorische Immunoglobulin dar. Es ist wertvoll bei der antibakteriellen und respiratorischen viralen Abwehr.

IgE ist das in den geringsten Mengen vorkommende Immunoglobulin. Es hat hautsensibilisierende Eigenschaften und ist für eine Reihe von bronchialen, gastrointestinalen,dermalen und anderen allergischen Reaktionen verantwortlich.

Über die Struktur und die biologische Funktion von IgD ist sehr wenig bekannt. IgD-Antikörper wurden bei Autoimmunerkrankungen und bei gegenüber Kuhmilch empfindlichen Patienten sowie bei Patienten mit systemischem Lupus erythematodes gefunden.

Verfahren zur Isolierung der vorgenannten Immunoglobulinklassen sind bekannt. Ferner sind Verfahren zur Erzeugung von Antikörpern gegen Immunoglobuline und Verfahren zur Bindung von

- 10 -

Imrriunoglobulinen an festf= ^Träger bekannt. Ebenfalls bekannt sind Verfahren zur Isolierung von Antikörpern und Markierung von Antikörpern mit fluoreszierenden Molekülen, radioaktiven Molekülen oder Enzymen, um eine Messung von gebundenen Antikörpern zu ermöglichen. Schliesslich gibt es indirekte Verfahren zur Messung von gebundenen Antikörpern, beispielsweise durch Umsetzung des gebundenen Antikörpers mit einem markierten (radioaktiv, fluoreszierend oder mit einem Enzym markiert) Antikörper, der für den Antikörper spezifisch ist.

Die Bestimmung von antigenspezifischen Immunoglobulinen einer speziellen Klasse ist von besonderer klinischer Bedeutung. Die US-PS 4 020 151 beschreibt einen Immunoassay für IgG-, IgA- und IgM-Konzentrationen im Serum, bei dem zunächst ein fester Träger mit der Testprobe zur Absorption von IgG, IgA und IgM umgesetzt wird und anschliessend ein markierter Antikörper gegen IgG, IgA und IgM umgesetzt wird und der gebundene Antikörper gemessen wird. Antigenspezifische Immunoglobuline können auch unter Anwendung von Immunoassay-Techniken bestimmt-werden, indem man Immunkomponenten mit einer bindenden Affinität für den zu bestimmenden und/oder nachzuweisenden Antikörper verwendet. Bei diesen Techniken wird ' eine Immunkomponente mit bindender Affinität für den zu bestimmenden Antikörper an einen festen Träger gekoppelt und eine weitere spezifische Immunkomponente wird beispielsweise mit einer fluoreszierenden, chromophoren oder radioaktiven Gruppe oder mit einem Enzym markiert.

Ein Nachteil derartiger Techniken besteht jedoch darin, dass, wenn rheumatoider Faktor, der im Serum auftreten kann, in der Probe vorhanden ist, falsche positive Ergebnisse erhalten werden. Der rheumatoide Faktor (RF) weist im allgemeinen eine Affinität für Antikörper der IgG-Klasse auf. RF geht eine Bindung mit den konstanten Bereichen der schweren Ketten des . IgG-Moleküls ein. Beispielsweise stellt bei einer Bestimmung

11 -

3936 - 12 -

eines für Rötelnvirus klassenspezifischen Immunoglobulins der IgM-Klasse der rheumatoide Faktor selbst ein Immunoglobulin ' der IgM-Klasse dar. Da der rheumatoide Faktor im allgemeinen der IgM-Klasse angehört, wird er auch durch anti-IgM-Immunöglobuline gebunden, was zu falschen positiven Ergebnissen führt. Bei einem Verfahren zur Vermeidung dieser Störung durch den rheumatoiden Faktor ist es erforderlich, die verschiedenen Immunoglobulinklassen-Antikörper vor der Analyse abzutrennen. Jedoch sind die Verfahren zur Abtrennung von Immunoglobulinen unterschiedlicher Klassen und insbesondere von antigenspezifischen Immunoglobulinen verschiedener Klassen im allgemeinen sehr aufwendig und zeitraubend. Diese Verfahren umfassen die Chromatographie, Elektrophorese und Dichtegradienten-Zentrifugation.

Die US-PS 4 273 756 beschreibt einen Immunoassay zur Bestimmung der klassenspezifischen Antikörper IgG, IgM, IgA, IgE und IgD, bei dem zunächst ein fester Träger, auf den ein Antikörper für eine spezifische Immunoglobulinklasse aufgebracht ist, mit einer Probe mit einem Gehalt an einem klassenspezifischen Antikörper in Kontakt gebracht wird und anschliessend der gebildete Komplex mit einem markierten Antigen umgesetzt und das gebundene, markierte Antigen gemessen werden.

Die US-PS 4 292 403 beschreibt einen Immunoassay zur Bestimmung eines antigenspezifischen Immunoglobulins der Klassen IgM, IgA, IgD und IgE, bei dem das spezielle antigenspezifische Immunoglobulin mit einem unlöslich gemachten Antikörper gegen das antigenspezifische Immunoglobulin oder ein antigenbindendes Fragment dieses anti-Immunoglobulins in Kontakt gebracht wird, anschliessend das Gemisch mit einem Antigen, für das das Immunoglobulin eine spezifische Affinität aufweist, behandelt wird und schliesslich das Gemisch mit einem markierten, antigenbindenden Fragment eines Antikörpers gegen das

- 12 -

393c - 13 -

Antigen behandelt wird und anschliessend das markierte Fragment gemessen ward. Diese Druckschrift lässt darauf schliessen, dass die Störung durch den rheumatoiden Faktor beseitigt wird.

Voller et al., British Journal of Experimental Pathology, Bd. 56 (1975), S. 338, Gravell et al., The Journal of Infectious Disease, Bd. 136, Ergänzung, 1977, S. 5300 und Cleary et al., Research Communication in Chemical Pathology and Pharmacology, Bd. 19, 1978, S-. 281 beschreiben mit Enzymen arbeitende Immunoassays zum Nachweis von Antikörpern gegen Rötelnvirus.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Immunoglobulinantikörpers einer IgX-Klasse in einer Probe, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe M, A, D und E, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man die Probe mit einer wirksamen Menge eines für IgG spezifischen Immunoreagens behandelt, wobei diese Menge ausreicht, die Bindung des rheumatoiden Faktors an IgG zu verhindern. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Bestimmung eines Immunoglobulinantikörpers einer IgX-Klasse in einer Probe, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe M, A, D und E, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man

a) die Probe mit einer wirksamen Menge an anti-IgG behandelt,

b) die behandelte Probe mit einem auf einem festen Träger aufgebrachten, klassenspezifischen Antikörperreagens mit einem Gehalt an einem Antigen, für das der IgX-Antikörper spezifisch ist, in Kontakt bringt, wodurch ein Äntigen-lgX Komplex auf dem festen Träger gebildet wird,

c) die ungebundene Probe entfernt,

d) den Antigen-IgX-Komplex mit anti-IgX behandelt und

e) das an den Antigen-IgX-Komplex gebundene anti-IgX als Mass für IgX in der Probe bestimmt.

- 13 -

te * * to * *

3926 -IH-

Der hier verwendete Ausdruck "Immunoreagens¹¹ bezieht sich auf ein Antigen, vorzugsweise einen Antikörper, für den ein Immunoglobulin einer IgG-Klasse spezifisch ist und der IgG in ausreichendem Masse komplexiert, so dass eine Bindung des rheumatoiden Faktors an IgG verhindert wird. Vorzugsweise wird in den erfindungsgemässen Verfahren anti-IgG als Immunoreagens verwendet. Ferner ist es bevorzugt, die den in Frage stehenden Iramunoglobulinantikörper IgX enthaltende Probe vor der Durchführung eines Immunoassays auf IgX einer Behandlung zu unterziehen. Es können verschiedenartige Typen von Immunoassays auf IgX zur Anwendung kommen. Vorzugsweise wird ein Immunoassay angewendet, bei dem ein Antigen, für das der Immunoglobulinantikörper IgX spezifisch ist, unter Bildung eines Antigen-IgX-Komplexes eingesetzt wird. Der auf diese Weise gebildete Antigen-IgX-Komplex kann dann bestimmt werden, indem man beispielsweise eine Immunopräzipitation, Sandwichtechnik oder kompetitive Technik anwendet.

Das Immunoreagens kann entweder vor, nach oder gleichzeitig mit dem Antigen unter Bildung eines anti-IgX-Komplexes eingesetzt werden. Bevorzugt ist jedoch die Verwendung des Immunoreagens vor der Behandlung der Probe mit dem Antigen.

Der hier verwendete Ausdruck "Antigen" bezieht sich auf biologisch aktive Moleküle, die in der Lage sind, beim Menschen oder bei nicht-humanen Spezies eine Immunreaktion zu induzieren. Beispiele für derartige Antigene sind Serumproteine, Gewebeproteine, Antikörper, virale Proteine, bakterielle Lipopolysaccharide und dergleichen.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird eine Probe mit einem Gehalt an Immunoglobulinantikörper einer IgX-Klasse mit einer wirksamen Menge an anti-IgG in einer gepufferten Lösung behandelt. Das erhaltene Gemisch wird aus-

3936 . - 15 -

reichend lange inkubiert, uass im wesentlichen das gesamte Immunoglobulin der IgG-Klasse in der Probe mit dem anti-IgG komplexiert wird. Im Anschluss an die Inkubation wird die behandelte Probe in Kontakt mit einem auf einem festen Träger aufgebrachten klassenspezifischen Antikörperreagens, das ein für den in Frage stehenden IgX-Antikörper spezifisches Antigen enthält, gebracht. Das erhaltene Gemisch wird ausreichend lange inkubiert, dass die Bildung eines Antigen-IgX-Komplexes auf dem festen Träger ermöglicht wird. Der Antigen-IgX-Komplex auf dem festen Träger wird mit Wasser gewaschen, um ungebundene Probe zu entfernen und anschliessend mit anti-IgX behandelt. Das erhaltene Gemisch wird sodann ausreichend lange inkubiert, um die Bildung eines Antigen-IgX-anti-IgX-Komplexes auf dem festen Träger zu ermöglichen. Der mit dem Antigen-IgX-anti-IgX-Komplex beschichtete feste Träger wird mit Wasser gewaschen. Die Menge des an den Antigen-IgX-Komplex gebundenen anti-IgX wird als Mass für das spezielle IgX in der Probe bestimmt.

Die immunoglobuline in der"IgX-Klasse, die sich nach dem erfindungsgemässen Verfahren bestimmen lassen, umfassen IgM, IgA, IgE und IgD.

Unter festen Trägern ist ein unlösliches polymeres Material zu verstehen, das als Sorptionsmittel für das Antigen wirkt. Zu den bekannten Materialien dieser Art gehören Kohlenwasserstoff polymerisate, wie Polystyrol, Polyäthylen, Polypropylen, Polybutylen, Butylkautschuk und andere synthetische Kautschukarten. Weitere geeignete organische Polymerisate sind Siliconkautschuk (silastic rubber), Polyester, Polyamide, Cellulose und Cellulosederivate, Acrylate, Methacrylate, Vinylpolymerisate, beispielsweise abgeleitet von Vinylchlorid und Polyvinylchlorid. Copolymerisate, zum Beispiel Pfropfcopolymerisate von Polystyrol, sind ebenfalls geeignet. Neben

- 15 -

3936 - 16 -

den vorgenannten Materialien kann die feste Trägeroberfläche Kieselgel, Siliconwafers, Glas, unlösliches Protein und Metalle enthalten. Der feste Träger kann in Form von Kugeln, Rohren, Streifen, Scheiben, Mikrotiterplatten und dergleichen vorliegen.

Die im klassenspezifischen Antikörperreagens verwendeten Antigene umfassen Antigene, die zur Bindung von klassenspezifischen Antikörpern IgG, IgM, IgA, IgD und IgE in der Lage sind und die aus humanen oder nicht-humanen Quellen erhalten werden können.' Zur Vermehrung des Antigens können Gewebekulturtechniken angewendet werden. Die Antigene werden in Form eines Überzugs auf einen festen Träger und vorzugsweise auf Polystyrolkugeln aufgebracht. Zum Aufbringen der Antigene auf den festen Träger können verschiedene Techniken angewendet werden. Um eine einfache Arbeitsweise zu gewährleisten, wird das Antigen vorzugsweise auf den festen Träger aufgebracht, indem man den zu beschichtenden festen Träger für eine bestimmte Zeitspanne in eine Lösung, die das Antigen enthält, bringt und den festen Träger anschliessend wäscht und an der Luft trocknet.

Der Ausdruck "anti-IgG" bezieht sich auf einen für humanes IgG spezifischen Antikörper, der in nicht-humanen Spezies, wie Kaninchen, Ziegen, Pferden, Schafen, Meerschweinchen und dergleichen, erzeugt wird. Durch Zugabe einer wirksamen Menge an anti-IgG zur Probe werden alle in der Probe vorhandenen IgG-Immunoglobuline gebunden. Die Bindung von IgG durch anti-IgG vor dem Kontakt der Probe mit einem klassenspezifischen Antikörperreagens komplexiert die Bindungsstellen für den rheumatoiden Faktor am IgG, wodurch eine Bindung des rheumatoiden Faktors an IgG verhindert wird. Daher können nur IgM-, IgA-, IgD oder IgE-Immunoglobuline in der Probe sowie der IgG-anti-IgG-Komplex eine Bindung mit dem Antigen auf dem festen Träger eingehen. Die behandelte Probe und das klassenspezifische Antikörperreagens werden inkubiert und anschliessend mit Wasser

- 16 -

3936 - 17 -

gewaschen, um ungebundene Immunoglobuline in der Testprobe zu entfernen. Somit bilden die klasnenspezifischen Immunoglobuline IgX (einschliesslich der im Serum aufgrund einer Infektion vorhandenen), die Antikörper gegen das infizierende Agens enthalten, einen Antigen-IgX-Komplex und haften am festen Träger, Ferner kann der vorher gebildete IgG-anti-IgG-Komplex einen Antigen-IgG-anti-IgG-Komplex bilden und dabei am festen Träger haften.

Der Antigen-IgX-Komplex wird mit einem bekannten anti-IgX unter Bildung eines Antigen-IgX-anti-IgX-Komplexes am festen Träger umgesetzt. Das an den Antigen-IgX-Komplex gebundene anti-IgX wird als Mass für das in der Probe vorhandene IgX bestimmt. Das anti-IgX kann direkt durch herkömmliche fluoreszierende Farbstoffe, Enzyme oder radioaktive Markierungsmittel markiert werden, wodurch eine Bestimmung der gebundenen Menge ermöglicht wird. Es kann aber auch eine indirekte Markierung durch weitere Umsetzung erfolgen, beispielsweise mit einem für das anti-IgX spezifischen Antikörper, der nach herkömmlichen Verfahren mit fluoreszierenden Farbstoffen, Enzymen oder radioaktiven Markierungsraitteln markiert ist. Das verwendete anti-IgX ist im allgemeinen ein für das zu bestimmende IgX spezifisches IgG-Immunoglobulin und wird in nicht-humanen Spezies erzeugt.

Vorzugsweise wird die direkte Enzymmarkierung von anti-IgX angewendet. Beispiele für entsprechende Enzyme sind Katalase, Peroxidase, Urease, Glucoseoxidase, Phosphatase und dergleichen. Wird die direkte Markierung von anti-IgX im Anschluss an die Bildung des Antigen-IgX-anti-IgX*-Komplexes (wobei anti-IgX* markiertes anti-IgX bedeutet), angewendet, wird ein Enzymsubstrat der Flüssigkeit und/oder der festen Phase des Reaktionsgc?misches zugesetzt und eine Enzymbestimmung nach herkömmlichen Verfahren, beispielsweise kolorimetrisch, fluorimetrisch oder

- 17 -

»m *♦*-

www-« <(·■ "·■·

3936 - 18 -

spektrophotometrisch, zur Messung des gebundenen, markierten anti-IgX durchgeführt. Im Fall einer indirekten Markierung, d.h. das anti-IgX ist unmarkiert, wird der Antigen-IgX-anti-IgX-Komplex zur Entfernung von ungebundenem anti-IgX gewaschen und anschliessend mit einem markierten Antikörper für anti-IgX umgesetzt. Der gebundene, markierte Antikörper wird sodann gemessen.

Ferner wird erfindungsgemäss ein Verfahren zur Bestimmung von IgG in einer Probe mit einem Gehalt an rheumatoidem Faktor zur Verfügung gestellt. Es wurde festgestellt, dass der auf dem festen Träger gemäss dem vorstehend beschriebenen Verfahren gebildete Antigen-IgG-anti-IgG-Komplex anschliessend mit markiertem anti-IgG*, das für das am anti-IgG-anti-IgG-Komplex gebundene anti-IgG spezifisch ist, behandelt werden kann und das gebundene, markierte anti-IgG* anschliessend als Mass für das in der Probe vorhandene IgG bestimmt werden kann.

Der Ausdruck "wirksame Menge an anti-IgG" bezieht sich auf eine Menge an anti-IgG, die zur Bindung des gesamten, in der zu bestimmenden Probe vorhandenen IgG ausreicht, wobei jegliche Bindung von IgG und RF verhindert wird.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung von mit Rötelnvirus-Antigen beschichteten Kügelchen

Rötelnvirus vom Gilchrest-Stamm werden in BHK 21-Klon 13-Zellen in einem Nährmedium gezüchtet. Die viralen Antigene werden durch Ultrazentrifugation des Mediums isoliert. Die Suspension wird 1:50 mit 0,1m Tris-Puffer vom pH-Wert 8,6 verdünnt. Mit dieser verdünnten Lösung werden 6 mm-Polystyrolkügelchen über Nacht bei Raumtemperatur beschichtet. Die Kügelchen werden gewaschen und an der Luft getrocknet.

- 18 -

mm »■«» ·

Bestimmung von IgM-Antikör^crn gegen Rötelnvirus

1. Eine Serumprobe und eine negative, eine stark positive und 3 schwach positive Kontrollproben werden 1:2 1 in einer Lösung mit einem Gehalt an 0,1 m Tris, 0,5 m Natriumchlorid, 0,01 Prozent Tween 20 und 1 mg/ml Rinderserumalbumin vom pH-Wert 7,6 verdünnt.

2. Jeweils 20 ul eines Aliquotanteils der verdünnten Probe und der verdünnten Kontrollproben werden in entsprechende Vertiefungen einer Reaktionsplatte gegeben.

3- In die Vertiefungen, die die verdünnten Proben oder Kontrollproben enthalten, werden jeweils 200 ^l eines Gemisches mit einem Gehalt an 1,5 Prozent Ziegen-antihuman-IgG, 53,5 Prozent Kälberserum, 0,01 Prozent Tween 20 und 44,99 Prozent eines Gemisches an 0,1 m Tris und 0,5 m Natriumchlorid gegeben, wobei der endgültige pH-Wert auf 7,6 eingestellt ist.

4. Die Reaktionsplatten werden abgedeckt und 60 Minuten bei 45°C inkubiert.

5. Nach der Inkubation wird in jede Vertiefung, die eine Probe oder Kontrollprobe enthält, ein mit dem Rötelnvirus-Antigen beschichtetes Kügelchen gegeben. Die Reaktionsplatten werden wiederum abgedeckt und sodann 90 Minuten bei 45 C inkubiert.

6. Nach der zweiten Inkubation werden ungebundene Probe oder Kontrollprobe aus den Vertiefungen entfernt. Die Kügelchen werden 2 mal mit Wasser gewaschen.

7. Die die gewaschenen Kügelchen enthaltenden Vertiefungen werden mit 200 ^l einer Lösung mit einem Gehalt an 0,05 bis

- 20 -

3 ug/ml Ziegen-antihuman-IgM, das kovalent mit Meerrettiehperoxidase gebunden ist, 10 Prozent Rinderserum in 0,1 m Tris und 0,15 m Natriumchlorid versetzt.

8. Die Reaktionsplatten werden abgedeckt und 90 Minuten bei 45°C inkubiert.

9. Nach der Inkubation wird ungebundene Ziegen-antihuman-IgM-Meerrettichperoxidase entfernt und die Kügelchen werden 2 mal mit 5 ml Wasser gewaschen.

10. Die Kügelchen werden aus den Vertiefungen, in denen ursprünglich die Proben und Kontrollproben enthalten waren, in Reagensgläser übertragen, in die sodann 300^1 einer frisch hergestellten Substratlösung mit einem Gehalt an etwa 27 mg o-Phenylendiamin χ 2 HCl in 5 ml Citrat-Phosphat-Puffer vom pH-Wert 5,5 gegeben werden. Die Reagensgläser werden 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.

u. Nach der Inkubation werden jeweils 2 ml 1 η "Salzsäure in die Reagensgläser gegeben. Die Absorption der erhaltenen Proben- und Kontrollprobenlösungen wird an einem Spektrophotometer bei 492 nm abgelesen.

12. Ein Absorptionswert für die Probe, der 1,09-fach grosser oder 0,91-fach kleiner als der Durchschnittswert der 3 Kontrollproben mit niedrigem Gehalt ist, werden als Grenzwerte zwischen positiven und negativen Ergebnissen angenommen. Ein Absorptionswert der zwischen dem 1,09- und 0,91-fachen des Durchschnittswerts der 3 Kontrollproben mit geringem Gehalt liegt, lässt den Verdacht auf eine Rötelninfektion zu, bestätigt diese aber nicht.

3936 - ; ■■ -

Die Empfindlichkeit des ir. Beispiel 1 beschriebenen Tests wird durch den Gehalt der verwen^tni Kontmllprobe mit geringem Gehalt bestimmt. Im vorstehenden Verbuch wurde eine geringfügig positive Kontrollprobe mit einem Wert für IgM gewählt, der mit dem Wert der Empfindlichkeitsgrenze zusammenfällt, die beim Hämagglutinatioris-Hemmtest im Saccharosedichtegradienten gemäss D.F. Palmer et al., Rubella Hemagglutination-Inhibition Tests, Immunology Series, Nr. 2 (revised) Center For Disease Control, Atlanta, 1977, beschrieben wurde.

Beispiel 2

Verschiedene Proben von Patienten mit von Röteln unterschiedlichen Virusinfektionen sowie von Patienten mit multiplem Myelom und Proben, die in bezug auf antinuklearen Antikörper und/oder rheumatoiden Faktor positiv sind, werden nach dem erfindungsgemässen Verfahren getestet. Es werden keine falschen positiven Ergebnisse aufgrund von viralen Infektionen, multiplem Myelom, antinuklearen Antikörpern oder rheumatoidem Faktor beobachtet.

Wie bei den vorstehend beschriebenen Verfahren festgestellt, wird erfindungsgemäss ein Immunoassay zur Bestimmung von klassenspezifischen Immunoglobulinen in Proben mit einem Gehalt an rheumatoidem Faktor bereitgestellt. Erfindungsgemäss wird ferner ein Immunoassay zur Bestimmung von klassenspezifischen Immunoglobulinen in Proben mit einem Gehalt an rheumatoidem Faktor zur Verfügung gestellt, wobei keine Abtrennung der verschiedenen Immunoglobuline oder eine Entfernung des rheumatoiden Faktors von der Probe vor der Bindung der Immunoglobuline an das klassenspezifische Antikörperreagens erforderlich ist.

Ende der Beschreibung

Claims

iilit · KurdjR-an Ιν..η .ι! \Hi<rnc)s ·« · · * *" W. \tiit/ \r I·,, D.F.Morf I); I)ipl -( Item M. Gritschnedcr Dipl.-Phyj A. Frhr. von Wittgenstein Abilz. Morf. Grilschncdtr, vnn Wittgenstein. Postfach fcr. 01 OV, 8000 Müiuhcn 86 Ι>Γ 0T1'"( hcm Posianschrift.'Postal /uklrcs. Postfach 86 01 D-8000 München

1. Februar I983 3936

ABBOTT LABORATORIES
North Chicago, Illinois 60064

Immunoassay für klassenspezifische Immunoglobulin-

antikörper

Patentansprüche

1. "»Verfahren zur Bestimmung eines Imraunoglobulinantikörpers einer IgX-Klasse in einer Probe, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe M, A, D und E, dadurch gekennzeichnet, dass man

a) die Probe mit einer wirksamen Menge an anti-IgG behandelt,

b) die behandelte Probe mit einem auf einen festen Träger aufgebrachten, klassenspezifischen Antikörperreagens mit einem Gehalt an einem Antigen, für das der Irnmunoglobulinantikörper IgX spezifisch ist, in Kontakt bringt,

wodurch ein Antigen-I/iX-Komplex auf dem festen Träger gebildet wird,

c) die ungebundene Probe entfernt,

d) den Antigen-IgX-Komplex mit anti-IgX behandelt und

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an anti-IgG in Stufe (a) immunochemisch grosser ist als die Menge an IgG in der Probe.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das anti-IgX mit einem Enzym markiert ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass ungebundenes, markiertes anti-IgX vor der Bestimmung des an den Antigen-IgX-Komplex gebundenen, markierten anti-IgX entfernt wird.

5. Verfahren nach Anspruch 1 oder 4, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei IgX um einen IgM-Antikörper gegen Rötelnvirus handelt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Stufe (c) durch Absaugen der ungebundenen Probe und Waschen des festen Trägers mit Wasser durchgeführt wird.

7. Verfahren zur Bestimmung eines Immunoglobulinantikörpers einer IgX-Klasse in einer Probe, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe M, A, D und E, dadurch gekennzeichnet, dass man

a) die Probe mit einer wirksamen Menge an anti-IgG behandelt,

b) die behandelte Probe mit einem auf einen festen Träger aufge brachten klassenspezifischen Antikörperreagens mit einem Gehalt an einem Antigen, für das der Irnmuno-.plobulinantikörper IgX spezifisch ist, in Kontakt bringt, wodurch ein Antigen-IgX-Komplex auf dem festen Träger gebildet wird,

c) die ungebundene Probe entfernt,

α,- den Antigen-IgX-Komplex mit markiertem anti-IgX behandelt,

e) ungebundenes, markiertes anti-IgX entfernt und

f) das an den Antigen-IgX-Komplex gebundene, markierte anti-IgX als Mass für IgX in der Probe bestimmt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das markierte anti-IgX mit einem Enzym markiert ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei IgX um einen IgM-Antikörper gegen Rötelnvirus handelt.

10.. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Stufen (c) und (e) durch Absaugen von ungebundener Probe bzw. von markiertem anti-IgX und Waschen des festen Trägers durchgeführt werden.

11. Verfahren zur Bestimmung eines Immunoglobulinantikörpers einer IgX-Klasse in einer Probe, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe M, A, D und E, dadurch gekennzeichnet, dass man

- 3 —

-U-

a) die Probe mit einer wirksamen Menge an anti-IgG behandelt,

b) die behandelte Probe mit einem auf einen festen Träger aufgebrachten, klassenspezifischen Antikörperreagens mit einem Gehalt an einem Antigen, für das der Immunoglobulinantikörper IgX spezifisch ist, in Kontakt bringt, wodurch ein Antigen-IgX-Komplex auf dem festen Träger gebildet wird,

c) die ungebundene Probe entfernt,

d) den Antigen-IgX-Komplex mit anti-IgX behandelt,

e) ungebundenes anti-IgX entfernt,

f) das Antigen-IgX-anti-IgX mit markiertem Antikörper gegen anti-IgX behandelt,

g) ungebundenen, markierten Antikörper gegen Anti-IgX entfernt und

h) den an den Antigen-IgX-anti-IgX-Komplex gebundenen, markierten Antikörper als Mass für IgX in der Probe bestimmt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an anti-IgG in Stufe (a) immunochemisch grosser ist als die Menge an IgG in der Probe.

13- Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass der markierte Antikörper gegen anti-IgX mit einem Enzym markiert ist.

* »β

- 5 -

1.4. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei IgX um einen IgM-Antikörper gegen Rötelnvirus handelt.

15. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Stufen (c), (e) und (g) durch Absaugen von ungebundener Probe, ungebundenem, markiertem anti-IgX baw. ungebundenem, markiertem Antikörper gegen anti-IgX und Waschen des festen Trägers durchgeführt werden.

16. Verfahren zur Bestimmung eines Immunoglobulinantikörpers einer IgG-Klasse in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass man

a) die Probe mit einer wirksamen Menge an anti-IgG behandelt,

b) die behandelte Probe mit einem auf einen festen Träger aufgebrachten, klassenspezifischen Antikörperreagens mit einem Gehalt an einem Antigen, für das der Immunoglobulinantikörper IgG spezifisch ist, in Kontakt bringt_s wodurch ein Antigen-IgG-anti-IgG-Komplex auf dem festen Träger gebildet wird,

c) die ungebundene Probe entfernt,

d) den Antigen-IgG-anti-IgG-Komplex mit Antikörper gegen anti-IgG behandelt und

e) das an den Antigen-IgG-anti-IgG-Komplex gebundene anti-IgG als Mass für IgG in der Probe bestimmt.

17- Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Menge an anti-IgG in Stufe (a) immunochemisch grosser ist als die Menge an IgG in der Probe.

39?>(■ - 6 -

18. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper gegen anti-IgG mit einem Enzym markiert ist.

19. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Stufe (c) durch Absaugen der ungebundenen Probe und Waschen des Trägers durchgeführt wird.

20. Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass in Stufe (e) ungebundener, markierter Antikörper gegen IgG vor der Bestimmung der Menge an gebundenem Antikörper gegen anti-IgG in der Probe entfernt wird.

21. Verfahren nach Anspruch 20, dadurch gekennzeichnet, dass der ungebundene, markierte Antikörper gegen IgG durch Absaugen und Waschen des festen Trägers entfernt wird.

22. Verbesserter Immunoassay zur Bestimmung eines Immunoglobulinantikörpers einer IgX-Klasse in einer Probe, wobei X ausgewählt ist aus der Gruppe M, A, D und E, dadurch gekennzeichnet, dass man .die Probe mit einer wirksamen Menge eines für IgG spezifischen Immunoreagens behandelt, wobei die Menge ausreicht, eine Bindung von rheumatoidem Faktor an IgG zu verhindern.

23- Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Immunoreagens um anti-IgG handelt.

24. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass man

a) die Probe mit einer wirksamen Menge eines Immunoreagens und eines Antigens, für das der IgX-Antikörper spezifisch ist, behandelt, um einen Antigen-IgX-Komplex zu bilden, und

b) den gebildeten Antigen-IgX-Komplex bestimmt.

25. Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass der gebildete Antigen-IgX-Komplex bestimmt wird, indem man sich einer Immunopräzipitation, einer Sandwichtechnik oder einer kompetitiven Technik bedient.

26. Verfahren nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass es sich beim Immunoreagens um anti-IgG handelt.

27. Verfahren nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, dass man in Stufe (a)

1) die Probe mit einer wirksamen Menge eines Immunoreagens behandelt und dann

2) die behandelte Probe mit einem Antigen, für das das IgX spezifisch ist, in Kontakt bringt.

28. Verfahren nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass das Antigen, für das das IgX spezifisch ist, auf einen festen Träger aufgebracht ist.

29. Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass man den Antigen-IgX-Komplex bestimmt, indem man

1) die ungebundene Probe entfernt,

2) den Antigen-IgX-Komplex mit anti-IgX behandelt und

3) das an den Antigen-IgX-Komplex gebundene anti-IgX als Mass für IgX in der Probe bestimmt.

— 7 -

- 8 -

30. Verfahren nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, dass das anti-IgX mit einem Enzym markiert ist.

31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, dass ungebundenes, markiertes anti-IgX vor der Bestimmung des an den Antigen-IgX-Komplex gebundenen, markierten anti-IgX entfernt wird.

32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei IgX um einen IgM-Antikörper gegen Rötelnvirus handelt.