DE3316451A1

DE3316451A1 - Assay zur gleichzeitigen bestimmung von t- und b-lymphozyten-populationen und -subpopulationen

Info

Publication number: DE3316451A1
Application number: DE3316451A
Authority: DE
Inventors: Madelyn Margaret Novato Calif. Baran; Dennis Mark Emeryville Calif. Bleile
Original assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Current assignee: Bio Rad Laboratories Inc
Priority date: 1982-06-18
Filing date: 1983-05-05
Publication date: 1983-12-22
Also published as: US4511662A; JPS597265A; GB8316113D0; GB2122345B; GB2122345A

Description

Beschreibung

Die Erfindung betrifft allgemein einen Assay (eine Nachweis- bzw. Bestimmungsmethode) zur gleichzeitigen Bestimmung der Anwesenheit von T-Zellen und B-Zellen in einer biologischen Probe/ sie betrifft insbesondere einen Immunoassay zur Bestimmung der relativen Mengen an T- und B-Zellen und ihren Subpopulationen durch spezifisches Markieren (Indizieren) dieser Zellen mit differenzierbaren Teilchen und Auszählen der Teilchen unter einem Mikroskop.

Bei Wirbeltieren einschließlich der Menschen bilden die T- und B-Zellen die beiden hauptsächlichen Lymphozyten-Populationen. Bei der Stimulierung mit einem Antigen differenzieren sich die B-Zellen zu Plasmazellen, die für das AMN|MMpt£pezifische Antikörper absondern. Die Rolle der T-Zellen ist weniger gut definiert, obgleich klar ist, daß sie zelluläre Immunreaktionen, wie z.B. eine verzögerte Hypersensibilität, die Immunüberwachung und die Transplantat-Abstoßung vermitteln bzw. hervorrufen. Bestimmte T-Zellen-Subpopulationen spielen auch eine Rolle bei der Regulierung der B-Zellen-Reaktion auf Antigene.

Bei normalen Individuen umfaßt die Lymphozytenpopulation in dem peripheren Blut etwa 70 bis etwa 80 % T-Zellen und etwa 10 bis etwa 20 % B-Zellen, wobei die übrigen Zellen als "Null-Zellen" bezeichnet werden. Die Bestimmung der relativen Anzahl der T- und B-Zellen ist klinisch wichtig für die Diagnose einer großen Vielzahl von immunologisch bedingten Erkrankungen einschließlich der Lymphoma, der lymphozytischen Leukämien und verschiedener Immunodefiziterkrankungen, wie z.B. der kongenitalen (angeborenen), geschlechtsgebundenen Agammaglobulinämie. Die Bestimmung eignet sich auch zur Beurteilung der Immunokompetenz und der Mechanismen der Gewebezerstörung bei Autoimmun-

ORIGINAL INSPECTED _{ßAD 0RjQINA}L

-δι erkrankungen, wie z.B. der systemischen Lupuserythematose.

Die T- und B-Zellen-Populationen können weiter unterteilt werden in Subpopulationen, die sich durch die Anwesenheit von charakteristischen Antigenen an der Zeiloberflächenmembran voneinander unterscheiden. Die primären Subpopulationen der T-Zellen sind die Helfer-Zellen (T„) und die

Supressor-Zellen (T ), die an der humoralen Immunreaktion teilnehmen. Die primären B-Zellen-Subpopulationen ent-2Q sprechen den Klassen des Immunoglobulins (Ig), das auf der Zelloberfläche vorhanden ist und nach der Stimulierung von der Plasmazelle gebildet wird. Die Bestimmung der relativen Mengen der Subpopulationen sowohl der B-Zellen als auch der T-Zellen verspricht auch klinisch bedeutsam zu sein.

Es ist daher nützlich und erwünscht, ein bequemes und genaues Verfahren zur Bestimmung der relativen Mengen an T-Zellen und B-Zellen und ihrer Subpopulationen in einer biologischen Probe, beispielsweise in Humanblut, zur Verfü-

2Q gung zu haben.

Bisher wurden Human-B-Zellen identifiziert aufgrund der Anwesenheit von Membran-gebundenem Immunoglobulin. In der Regel wird ein markierter Anti-(Humanimmunoglobulin)-Anti-

2g körper dazu verwendet, die B-Zellenpopulation abzutrennen oder anderweitig zu identifizieren. Die Verwendung eines polyclonalen Anti-(Humanimmunoglobulin)-Antikörpers, der an Polyacrylamid-Perlen gebunden ist, wird von Jabs et al. in "Identifying Human Lymphocyte Subpopulations", Lab.

O₀ Manag. (Januar 1980), diskutiert. Derartige Perlen sind von Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californien/USA, erhältlich. Ein durch ein Enzym markierter Ziegen-Anti-(Humanimmunoglobulin)-Antikörper ist im Technical Bulletin Nr. 95 der Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri/ USA, beschrieben.

T-Zellen wurden bisher üblicherweise identifiziert durch ihre Fähigkeit, sich spontan mit roten Schafsblutkörperchen zu verbinden unter Bildung von "Rosetten", die unter

_9-

einem gewöhnlichen Lichtmikroskop sichtbar sind. Eine

Beschreibung dieser Methode ist zu finden in Hudson et al., "Practical Immunology", Blackwell Scientific Publications, Oxford, Seiten 301-302 (1980).
5

Derzeit sind handelsübliche Reagens-Sets für die Bestimmung der B-Zellen- und T-Zellen-Populationen in Humanblut erhältlich. In einem solchen Reagens-Set, der von der Firma Kallestad Laboratories, Inc., Austin, Texas, USA, erhältlich ist, werden ein markierter Anti-(Humanimmunoglobulin)-Antikörper zur Bestimmung bzw. zum Nachweis von B-Zellen und rote Schafs-Blutkörperchen zur Identifizierung von T-Zellen in getrennten Stufen verwendet. In einem anderen Reagens-Set, hergestellt von der Firma Hybritech, Inc., La Jolla, Californien/üSA, und als ; "T & B Cell Reagent Set" bezeichnet, werden ein markierter Anti-T-Zellen-Antikörper (monoclonal) und ein markierter Anti-B-Zellen-Antikörper (monoclonal) miteinander kombiniert zur Auszählung der T- und B-Zellen unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops.

Die vorliegende Erfindung betrifft nun ein Verfahren und ein Reagens-Set zur gleichzeitigen Bestimmung der relativen Mengen an B-Zellen und T-Zellen und ihren Subpopulationen in einer Lymphozyten-Population, die in der Regel aus dem Blut oder aus dem Knochenmark stammt.

Das Reagens-Set umfaßt mindestens zwei Klassen von visuell voneinander unterscheidbaren Markierungssubstanzen (labeis). Die erste Klasse umfaßt in der Regel Bindungsprotein, das für B-Zellen spezifisch ist und das auf unlöslichen Trägerteilchen, in der Regel kleinen Polymerteilchen im Größenbereich von etwa 0,5 bis etwa 20 um, immobilisiert ist. Die zweite Klasse umfaßt in der Regel Bindungsprotein, das für T-Zellen spezifisch ist und das auf Teilchen immobilisiert ist, die in der Regel, jedoch nicht notwendigerweise, denjenigen der ersten Klasse ähneln.vor oder nach der Immobilisierung der

-ιοBindungsproteine wird mindestens eine der beiden Klassen von Markierungssubstanzen "markiert", so daß die Markierungssubstanzen unter einem Mikroskop visuell voneinander unterschieden werden können. In der Regel wird dies dadurch erzielt, daß man die Trägerteilchen einer oder beider Klassen vor oder nach der Bindung an das Bindungsprotein anfärbt.

Dieses Verfahren ist nicht beschränkt auf die Unterscheidung von B-Zellen von T-ZeIlen und es kann auch angewendet werden auf die Unterscheidung der verschiedenen Subpopulationen von B-Zellen und T-Zellen voneinander. Im allgemeinen kann das Verfahren angewendet werden zur Unterscheidung irgendeiner Subpopulation, die charakterisiert ist durch die Anwesenheit eines neuartigen AntigenZentrums auf der Zeiloberflächenmembran und für die ein spezifisches Bindungsprotein existiert oder erhalten werden kann. Visuell voneinander unterscheidbare Markierungssubstanzen können dann auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellt werden.

Bei der Durchführung des Verfahrens muß die Lymphozyten-Population zuerst isoliert werden. Im Falle von Blutlymphozyten erfolgt dies in der Regel durch Zentrifugieren unter Ausnutzung des Dichtegradienten. Nach der Isolierung wird die Lymphozyten-Population gleichzeitig sowohl den B-Zellen- als auch den T-Zellen-Merkierungssubstanzen (einschließlich der für irgendwelche Subpopulationen spezifischen Markierungssubstanzen) für eine ausreichende

oQ Zeitspanne ausgesetzt, so daß mit allen B-Zellen und T-Zellen "Rosetten" entstehen. Die Rosetten können unter einem Mikroskop visuell voneinander unterschieden werden und die Anzahl der B-Zellen-Rosetten und der T-Zellen-Rosetten gibt direkt die relative Anzahl der B-Zellen und

„c der T-Zellen in der Probe an. Macrophagen, eine Verunrei-

nigung des Lymphozyten-Präparats, können durch ihre Fähigkeit, die Polymerperlen, die Teil des Reagens-Sets sind, aufzuzehren, identifiziert werden.

Die Erfindung wird nachstehend an Hand der beispielhaften Situation, in der die relativen Mengen an B-Zellen und T-Zellen bestimmt werden sollen, näher erläutert. In diesem Falle sind nur zwei Markierungssubstanzen, die für B-ZeI-len bzw. für T-Zellen spezifisch sind, erforderlich. Es ist selbstverständlich, daß die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren umfaßt, bei dem eine oder mehr B-Zellenoder T-Zellen-Subpopulationen gleichzeitig bestimmt werden sollen durch Bereitstellung einer Markierungssubstanz, die für die Zellen der jeweiligen Subpopulationen spezifisch ist.

Verwendbare Materialien

1) Teilchenträger

Die Teilchenträger können aus einer großen Vielzahl von Materialien bestehen und sie brauchen nicht aus einem einzigen Material zu bestehen. Das Material muß in der Lage sein, das Bindungsprotein sowie einen Farbstoff zu binden. Ein drittes Kriterium besteht darin, daß das Material in der Lage sein muß, kleine Teilchen mit einer Teilchengröße innerhalb des Bereiches von 0,5 bis 20 μΐη zu bilden, die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens nützlich sind.

Zu Materialien der Wahl gehören eine große Vielzahl von polymeren Materialien, wie z.B. Polyethylen, Polypropylen, Polyviny!verbindungen, wie Polyvinylchlorid, Polyacrylnitril, Polyacrylat, Polymethacrylat und Copolymere davon, Polystyrol, Nylon, Polyterephthalat, Cellulose und dgl. Die Gruppe umfaßt in der Natur vorkommende Polymere, insbesondere modifizierte, in der Natur vorkommende Polymere und synthetische Additions- und Kondensationspolymere. Geeignet sind auch vernetzte Dextran-Teilchen und anorganisehe Materialien, wie z.B. verschiedene Gläser, die in Derivate überführt werden können, so daß sie ein Konjugat mit dem Bindungsprotein sowie dem Farbstoff bilden.

^ Bevorzugt sind hydrolysierte vernetzte Polyacrylamid-Teilchen, die in der hydrolysieren Form eine Teilchengröße von 0,5 bis 20 μΐη, vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 15 μίτι, haben. Es ist erwünscht, daß die Größe der

c Teilchen im allgemeinen der Größe der Lymphozyten, d.h. etwa 7 bis etwa 10 μΐη, entspricht, die vorzugsweise eine Teilchengrößenverteilung (90 %) aufweisen, die um etwa 8 bis etwa 9 μΐη konzentriert ist. Geeignete Perlen werden als P-6 Microbeads^ bezeichnet, erhältlich von der

Firma Bio-Rad Laboratories, Richmond, Californien/USA. Die P-6 Microbeads^ sollten vor ihrer Verwendung nach ihrer Größe sortiert sein, so daß die gewünschte Teilchen-.größenverteilung erhalten ird.

Die Immobilisierung des Bindungsproteins kann unter An-15

Wendung der verschiedensten bekannten Methoden erfolgen. Je nach dem verwendeten Material und je nach dem verwendeten spezifischen Bindungsprotein kann die physikalische Absorption oder Adsorption angewendet werden. Vorzugsweise

ist das Bindungsprotein jedoch kovalent an das Teilchen 20

gebunden. So können beispielsweise Carboxylgruppen an der Teilchenoberfläche mit den verfügbaren Aminogruppen an dem Bindungsprotein reaktiv gemacht werden. Dies ist insbesondere von Vorteil, wenn der Farbstoff auch über Aminogruppen, wie dies erfindungsgemäß bevorzugt ist, an die Perle gebunden wird. Bezüglich der Bindung von Proteinen und anderen Molekülen an Oberflächen unter Verwendung von aktivierten Carbonsäuren, Carbodiimiden, Imidoestern, aktiven Alkylhalogeniden und dgl. unter Ausbildung von

Amido-, Amidin- oder Amino-Brückenbindungen gibt es eine 30

umfangreiche Literatur.

Die bevorzugten P-6 Microbeads^ können aktiviert werden durch Hydrolysieren in 2 η Natriumhydroxid. Wenn die

Perlen angefärbt werden sollen, sollten sie hydrolysiert 35

werden bis zur Erzielung einer Bindungskapazität von mindestens 6 Milliäquivalenten (meq)/g, wozu in der Regel drei Tage bei Raumtemperatur erforderlich sind. Wenn die

Perlen nicht angefärbt werden sollen, reicht eine Bindungskapazität von 3 meq/g aus, wozu eine Hydrolyse bei Raumtemperatur von nur 18 bis 2 4 Stunden erforderlich ist. Die hydrolysieren P-6 Microbeads® werden dann vor der Inkubation mit dem Bindungsprotein und dem Anfärben, wie nachstehend beschrieben, gegenüber einem Kupplungspuffer äquilibriert.

2) Herstellung von B-Zellen-Markierungssubstanzen Erfindungsgemäß muß das B-Zellen-Bindungsprotein (d.h. die Proteine, die in der Lage sind, sich spezifisch an B-Zellen zu binden) an Festphasen-Teilchen, die in der Regel unlösliche Perlen, wie sie vorstehend beschrieben wurden, umfassen, immobilisiert werden. Bei dem B-Zellen-Bindungsprotein handelt es sich in der Regel entweder um einen monoclonalen oder einen polyclonalen Anti-(Humanimmunoglobulin)-Antikörper. Der polyclonale Anti-(Humanimmunoglobul in) -Antikörper ist aus einer Reihe von Quellen erhältlich, beispielsweise von Accurate Chemical and Scientific Corporation, Westbury, New York/USA /kaninchen-Anti-(Humanimmunoglobulin)-Antiserum, hergestellt von Dako, Dänemark/ und von Miles Laboratories, Elkhart, Indiana/USA /Ziegen-Anti-(Humanimmunoglobulin)-Antiserum/. Wenn es erwünscht ist, zwischen speziellen B-Zellen-Subpopulationen weiter zu unterscheiden, ist es natürlich erforderlich, einen Antikörper zu verwenden, der spezifisch ist für die jeweilige Immunoglobulin-Klasse, d.h. IgG, IgM, IgA, IgD und IgE, das auf der B-Zellen-Oberflächenmembran vorliegt.

Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen aktivierten P-6 Microbeads Kann ^_er Antikörper wie nachstehend angegeben kovalent gebunden werden: eine Immunoglobulin-Fraktion von Kaninchen-Anti-(Humanimmunoglobulin)-Antiserum wird über Nacht in der Kälte gegen einen Kupplungspuffer (beispielsweise 0,003 M Na-Phosphat, pH 6,3) dialysiert und dann wird eine vorgegebene Menge Immunoglobulin den aktivierten Perlen zugesetzt und der

pH-Wert wird auf den Bereich von 6,2 bis 6,4 eingestellt. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wird EDAC /i-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid-HCl7 zugegeben und die Kupplungsreaktion wird etwa 5 bis etwa 5 Stunden lang in der Kälte ablaufen gelassen. Die umgesetzte Imitiunoglobulin-Menge ist nicht kritisch, obgleich es erforderlich ist, daß genügend Anti-Ig-Antikörper an die Perlen gekuppelt werden, um ihre Fähigkeit, B-Zellen zu binden, zu gewährleisten. In dem vorstehend beschriebenen Verfahren hat sich eine Immunoglobulin-Konzentration von 8 bis mg Immunoglobulin pro Gramm Perlen als geeignet erwiesen.

3) Herstellung von T-Zellen-Markierungssubstanzen Bei dem bevorzugten T-Zellen-Bindungsprotein (d.h. dem Protein, das spezifisch an T-Zellen gebunden werden kann) handelt es sich um einen monoclonalen Anti-(T-Zellen)-Antikörper, wie z.B. T101, wie er von der Firma Murine Hybridoma Cell Line, ATCC-Hinterlegungsnummer CRL-802 3, erhältlich ist. Frisch isolierte Hybridoma-Kulturen können in vitro gezüchtet werden und der monoclonale Antikörper kann aus der überstehenden Flüssigkeit daraus gewonnen werden.

Alternativ können große Mengen an aus Hybridoma stammendem Antikörper hergestellt werden durch Injizieren der tumorbildenden Hybridoma-Linie in gewebsverträgliche (oder immunoinkompetente) Mäuse. Das Verfahren ist an sich bekannt und von Hudson et al. in Id auf den Seiten 320-321 beschrieben.

Die aus den Mäusen gewonnene Ascites-Flüssigkeit enthält häufig bis zu 10 mg/ml Antikörper, sie enthält aber auch andere Proteine. Die Antikörper können durch Affinitätschromatographie an immobilisiertem Protein A, wie z.B. Protein A-Sepharose^VEy C14B (von der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey/USA) gereinigt werden. Eine Ammoniumsulfat-Fraktion der Ascites-Flüssigkeit wird gegen den Puffer (pH 8,0) dialysiert und auf

die Säule aufgegeben. Nach dem Waschen mit einem 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0) wird der monoclonale Antikörper mit 0,1 M Na-Citrat (pH 3,0) eluiert und über Nacht in der Kälte gegen eine mit Phosphat abgepufferte Kochsalzlösung (PBs) bei pH 7,2 dialysiert.

Der gereinigte monoclonale Antikörper kann mit den wie vorstehend beschrieben hergestellten hydrolysierten P-6 Microbeads gekuppelt werden. Nach dem Dialysieren ig gegen den Kupplungspuffer wird der gereinigte monoclonale Antikörper den hydrolysierten P-6 Microbeads*^ in einer Konzentration von 5 bis 40, vorzugsweise von 10 mg Antikörper/g Mikroperlen zugesetzt und der pH-Wert wird auf den Bereich von 6,2 bis 6,4 eingestellt. Nach 30 Minuten bei Raumtemperatur wird EDAC der Mischung bis zu einer Endkonzentration in dem Bereich von 0,2 bis 0,5 mg/g zugegeben. Der pH-Wert wird auf den Bereich von 6>2 bis 6,4 eingestellt und die Reaktion wird etwa 5 bis etwa 15 Stunden lang in der Kälte ablaufen gelassen. Die Perlen werden in Suspension gehalten, in der Regel unter Verwendung eines aufrechtstehenden Schüttlers oder einer Überkopf-Rühreinrichtung .

Nach der Inkubation werden die Perlen dreimal mit einer _oc Lösung von 0,1 % Rinderserumalbumin (BSA) in PBS, dreimal mit einer Lösung von 1,4 M NaCl und 0,1 % BSA in PBS und dreimal mit 0,1 % BSA in PBS gewaschen.

4) Anfärben der Markierungssubstanzen Die Markierungssubstanzen müssen auf eine bequeme Weise markiert werden, so daß die B-Zellen-Perlen visuell zu j unterscheiden sind von den T-Zellen-Perlen, wenn sie unter einem Mikroskop betrachtet werden. Am zweckmäßigsten wird dies dadurch erzielt, daß man eine oder beide B-Zellen- und T-Zellen-Markierungssubstanzen anfärbt, indem man in der Regel einen Farbstoff, der unter einem Lichtmikroskop sichtbar ist, kovalent daran bindet. Bisher war es schwierig, unter einem Lichtmikroskop zu unter-

! scheiden, ob ein kleines Teilchen, wie z.B. die erfindungsgemäß verwendeten Polymerteilchen, angefärbt ist oder nicht. Mit dem nachstehend beschriebenen spezifischen Verfahren wird dieses Problem beseitigt.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden die B-Zellen-Markierungssubstanzen angefärbt, nachdem die Teilchen in ein Konjugat mit Anti-(Humanimmunoglobulin)-Antiserum überführt worden sind. Das Verfahren

-,Q ist auch anwendbar, wenn die T-Zellen-Markierungssubstanzen angefärbt wurden. Darüber hinaus können die Markierungssubstanz-Teilchen vor der Kupplung des Bindungsproteins angefärbt werden, so lange genügend aktivierte Zentren an dem spezifischen Teilchen für die Kupplung des Bin-

,j- dungsproteins verbleiben. Wenn die Markierungssubstanzen nach der Bindungsprotein-Konjugation angefärbt werden, ist es zweckmäßig, die Konzentration des Farbstoffes so zu begrenzen, daß eine Inaktivierung des Bindungsproteins verhindert wird.

Wenn nur B-Zellen und T-Zellen (und keine Subpopulationen) voneinander unterschieden werden sollen, wird vorzugsweise nur eine der beiden Markierungssubstanzen angefärbt, da es leichter ist, zu unterscheiden zwischen "gefärbten Substanzen" und "nicht gefärbten Substanzen" als zwischen Substanzen mit zwei verschiedenen Farben. Wenn auch die Subpopulationen bestimmt werden sollen, ist es jedoch erforderlich, mehr als eine der Markierungssubstanzen anzufärben, so daß jede spezielle Markierungssubstanz unter-

_₀ scheidbar ist.

Die Teilchen können nach der Konjugation des Rezeptors direkt angefärbt werden durch Zentrifugieren der Perlen, Dekantieren der überstehenden Flüssigkeit und erneutes _(. Suspendieren der Perlen in einer Lösung von 0,2 Gew.-% Bismark Brown Y (vgl. Welcher, "Organic Analytical Reagents", Van Norstrand Co., New York, 1948) in dem Kupplungspuffer mit 1 Volumenteil Perlen auf etwa

Volumenteile Farbstoff. Nach 30 Minuten wird EDAC (250 mg/g Perlen) zugegeben und die Reaktion wird 5 bis 15 Stunden lang in der Kälte ablaufen gelassen. Dann werden die Perlen mit PBS (0,1 % BSA) und PBS (1,4 M NaCl, 1 % BSA) wie vorstehend angegeben gewaschen.

Das vorstehend beschriebene Verfahren, in dem EDAC zum Kuppeln des Farbstoffes an hydrolysierte Perlen verwendet wird, ist auf jeden beliebigen Farbstoff mit freien Aminogruppen anwendbar. Der Farbstoff hat vorzugsweise ein Molekulargewicht unter 5000, in der Regel unter 1000, so daß er mit hydrolysierten Gruppen im Innern der Perle, die für die Bindungsproteine nicht verfügbar sind, reagieren kann.

Obgleich in der vorstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung Markierungssubstanzen verwendet werden, die angefärbt sind, so daß sie unter einem sichtbaren Lichtmikroskop unterscheidbar sind, erstreckt sich die vorliegende Erfindung auch auf Fluoreszenzfarbstoffe, die unter einem Fluoreszenzmikroskop visuell voneinander unterschieden werden können, sowie auf Enzymsysteme, die Chromogene an der oder in der Nähe der Oberfläche der Perlen erzeugen, und dgl.

5) Herstellung der Reagentien

Um sicherzustellen, daß genügend Markierungssubstanzen zur Verfügung stehen für die Umsetzung mit jeder B- und T-Zelle in der Probe ist_#es erforderlich, daß das Verhältnis von Markierungssubstanz zu Zelle bei > 1, in der Regel innerhalb des Bereiches von etwa 50 bis etwa 100 Markierungssubstanzen auf jede B- und T-Zelle, gehalten wird. Die absolute Konzentration der Markierungssubstanzen in der Reagenslösung, die der Probe zugegeben wird, hängt natürlich von der Größe der Probe sowie von der Konzentration der B- und T-Zellen in der Probe ab.

Durchführung des Verfahrens

1) Isolierung der Lymphozyten-Population Das erfindungsgemäße Verfahren kann in der Praxis mit jeder beliebigen Lymphozyten-Population durchgeführt werden, die aus einem Wirbeltier isoliert wurde. So können beispielsweise Lymphozyten-Suspensionen aus verschiedenen Organen, wie der Milz, den Lymphknoten, der Bursa (dem Schleimbeutel) oder der Thymusdrüse, durch Zerlegen der Organe mit

-^q Pinzetten hergestellt werden, so daß Zellen in das Gewebekuiturniedium gedrückt werden, oder durch Zerlegen des Organs mit feinen Pinzetten auf einem feinen Drahtgitter oder einem Teesieb. Spezifische Verfahren zur Herstellung solcher Suspensionen werden von Hudson et al, Id,'Seite 19,

,e diskutiert. Die vorstehend beschriebenen jeweiligen B-Zellen- und T-Zellen-Bindungsproteine sind natürlich spezifisch für die Human-Lymphozyten-Population und für andere Species als solche des Menschen ist ein anderes Bindungsprotein erforderlich.

In der Regel wird das erfindungsgemäße Verfahren angewendet auf die Humanblut-Lymphozyten-Population, die aus einer Blutprobe gewonnen werden kann. In diesem Falle müssen die roten Blutkörperchen vor Durchführung des Assays von dem

nc Blut abgetrennt oder daraus entfernt werden. Zur Durchführung dieser Trennung stehen viele verschiedene Verfahren zur Verfügung. Bevorzugt ist die differentielle Zentrifugierung auf einem Dichtegradienten, die schnell durchgeführt werden kann und ein hochreines Lymphozyten-

_QQ Präparat ergibt.

Das Verfahren zur Zentrifugierung auf dem Dichtegradienten wird wie folgt durchgeführt: In geeigneter Weise verdünntes Blut (3 bis 5 ml) wird in Form einer «e Schicht auf einen Dichtegradienten aufgebracht, der so formuliert ist, daß nur die roten Zellen und die Granulozyten ein Pellet bilden. Zu geeigneten Dichtegradienten-Präparaten gehören Ficoll-Paque^ (der Firma Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey/USA) und Histopaque^-1077

(der Firma Sigma Chemical Company, St. Louis, Missouri/USA) Dann wird die Probe 20 Minuten lang bei 18 bis 2Q⁹Q mit 400.g zentrifugiert. Die Lymphpgyten mit den als Verunreinigung darin enthaltenen Makrophagen erseheinen an der Piasma/Diqhtegradienten-Granzfläehe. Dann werden die Lympho« zyten 1 bis 3 mal mit einer ausgewogenen Salzlösung gewa^ sehen und durch 5 bis 10 Minuten dauerndes Zentrifugieren bei 18 biß 20^QC mit 100 bis. 15Q*g pelletisier-t. Die abgetrennten Zellen enthalten die Lymphoziyten (B'Zellen, T=- Zellen und "Null-Zellen") sowie Makrophagen, die alle unter einem Lightmikroskop voneinander untergeheidbar sind,

Alternativ gu der Diehtegradienten^Zentrifugierung können die r©ten Blutkörperchen aus der Blutprobe dadurch entfernt werden, daß man zuerst die roten Blutkörperchen in d@m gegamtbliit lysiert und dann die lysierten Zellen herauswäscht. Obgleich dieses Verfahren funktioniert, sind die kymphozyten dabei durch Granulozyten (einem anderen Typ von weißen Blutkörperchen) verunreinigt. Obgleich die meisten Qranulpzyten Phagozyten sind und das

hältnis nicht signifikant verändern, wird durch ihre An

Wesenheit die absolute Konzentration der Lymphozyfeen abgesetzt, so daß zum Auszählen einer ausreichenden Anzahl IiymphQzyten, um ein statistisch zuverlässiges Maß für Verhältnis zu erhalten, ein längerer Zeitraum

jjö I4e.ntifizierung vpn B-2ellen,. T-'Zellen und Macrephagen Nac?h der Isolierung kann die Lymphozyten^Population mit den B^Zellen·* und T^zellen-Markierungssubstanzen in einer

Konzentration (Markierungssubstanzen/Zelle) von 1Q;1 ohne obere Grenze, vorzugsweise von mindestens SOs1 mit einer Obergrenze vpn 5QQH inkubiert werden. Die Mar k ie rung ssub«< stangen bilden durch Bindung um die Peripherie der homolO" " gen Zellen (B»Zellen oder T^Zellen oder einer speziellen

Subpopulation davon« je nach Spezifität der Mark ie rungs sub«·

herum Rosetten auf ähnliche Weise wie die Rosetten, die von roten Sehafs-Blutkörperehen um T-»Zellen herum

gebildet werden. Die Markierungssubstanzen, die Rosetten bilden, können dann unter einem sichtbaren Lichtmikroskop ausgezählt werden, wobei die B-Zellen-Rosetten an ihrer dunkleren Farbe, die aus dem Farbstoff resultiert, erkenn-

_ bar sind. Zur Bestimmung des Verhältnisses von B-Zellen ö

und T-Zellen zur gesamten Zellenpopulation werden mindestens 100, vorzugsweise 200 Rosetten gezählt.

Die Inkubation wird für einen Zeitraum von mindestens 5 Minuten, vorzugsweise von 30 Minuten oder länger bei Raumtemperatur durchgeführt. Die längere Inkubationsdauer erlaubt es den Macrophagen, sowohl die B-Zellen- als auch die T-Zellen-Markierungssubstanze.. zu verzehren. Die Verzehrung durch die Macrophagen ist unter dem Mikroskop deutlich erkennbar, und erlaubt eine Differenzierung der übrigen Lymphozyten-Population ("Null-Zellen") und der Macrophagen, die anderweitig unterscheidbar sind.

Versuchsergebnisse

Die B-Zellen- und T-Zellen-Markierungssubstanzen wurden

®

hergestellt unter Verwendung P-6 Microbeads , des T-I01 monoclonalen Anti(T-Zellen)-Antikörpers und des polyclonalen Anti-(Humanimmunoglobulin)-Antikörpers (Dako), wie vorstehend beschrieben.

Eine Probe von normalem Blut (4 ml) wurde mit PBS im Verhältnis 1:1 verdünnt, in Form einer Schicht auf Ficoll-Paque^ (3 ml) aufgebracht und 20 Minuten lang bei 400 . g zentrifugiert. Die Schicht von weißen Blutkörperchen

wurde entfernt und einmal mit PBS (0,1 % BSA) gewaschen und 30

30 Minuten lang bei 37⁰C inkubiert, um cytophiles Ig

aus den Lymphozyten freizusetzen. Nach zweimaligem Waschen mit PBS wurde die Zellenkonzentration auf etwa 10 Zellen/ ml eingestellt. Die Zellen (100 μΐ) und die Markierungssubstanzen (200 μΐ für beide Markierungssubstanzen, jeweils 35

in etwa der gleichen Konzentration) wurden in ein Reagensglas eingeführt und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Nach 3-minütigem Zentrifugieren wurden die

Zellen erneut in PBS suspendiert, es wurden 100 μΐ 0,03 % Trypan blue in PBS zugegeben und ein Tropfen der Suspension wurde auf einen Mikroskop-Objektträger gegeben. Die Rosetten (200) wurden statistisch ausgezählt und die Anzahl der B-Zellen-Rosetten und der T-Zellen-Rosetten wurden aufgezeichnet. Es wurden nur lebensfähige Zellen (d.h. solche, die den Trypan blue-Farbstoff ausschlossen) gezählt. Die Ergebnisse zeigten 75,8 % T-Zellen, 13,3 % B-Zellen und 7,7 % Nullzellen. Diese Ergebnis-._ se liegen innerhalb des Bereiches der erwarteten Ergebnisse. Macrophagen mit intrazellulären Perlen waren ebenfalls eindeutig identifizierbar.

Das gleiche Versuchsverfahren wurde auf eine Probe von

, _ Blut eines Patienten angewendet, bei dem eine chronische - '

Ijymphozytenleukämie diagnostiziert worden war. In diesem Falle wurden die folgenden Ergebnisse erhalten: 21 % T-Zellen, 71 % B-Zellen und 8 % Nullzellen.

_ Die Erfindung wurde zwar vorstehend an Hand bevorzugter spezifischer Ausführungsförmen näher erläutert, es ist jedoch für den Fachmann selbstverständlich, daß sie darauf keineswegs beschränkt ist, sondern daß diese in vielfacher Hinsicht abgeändert und modifiziert werden __ können, ohne daß dadurch der Rahmen der vorliegenden

Erfindung verlassen wird.

Claims

DiPL-ΐΝβ. R. SPLANEMANN dipu-chem. dr. B. REITZNER

ZUQEL. VERTRETER BEIM EPA PROFESSIONAL REPRESENTATIVES BEPORE EfC) MAIMDATAIRES AGREES PRES LOEB

Bio-Rad Laboratories, Inc. eooomunchen2 5. Mai 1983

2200 Wright Avenue ^Tal13

Telefon (089) 22 62 07/22 620? Telegramme- Inventiut München Richmond, CaI., USA Telex- S28418.nlutd

unMr._Akta. 1325-1-12.183

Ihr Zeichen ·

Patentanmeldung

Assay zur gleichzeitigen Bestimmung von T- und B-Lymphozyten-Populationen und -Subpopulationen

Patentansprüche

. 1./ Verfahren zur gleichzeitigen Bestimmung der relativen Mengen an B-Zellen und T-Zellen in einer Lymphozytenpopulation eines Wirbeltieres, bei dem verwendet werden:

(a) B-Zellen-Markierungssubstanzen aus Teilchen, die in einer wäßrigen Lösung unlöslich sind und an B-Zellen-Bindungsproteine gebunden sind, und

(b) T-Zellen-Markierungssubstanzen aus Teilchen, die in wäßriger Lösung unlöslich sind und an T-Zellen-Bindungsproteine gebunden sind,

wobei die B-Zellen- und T-Zellen-Markierungssubstanzen unter einem Mikroskop voneinander unterscheidbar sind, dadurch gekennzeichnet , daß man · die Lymphozyten-Population gleichzeitig mit den B-Zellen-Markierungssubstanzen und den T-Zellen-Markierungssubstanzen inkubiert für einen Zeitraum, der für alle B-Zellen und

Konten ι Deutsche Bonk AG, München, KoMo-Nr. 2014 009 ■ Posischeck: München 600 60-807

T-Zellen ausreicht, um mit der entsprechenden Markierungssubstanz spezifisch Rosetten zu bilden, und die Anzahl der B-Zellen-Rosetten und der T-Zellen-Rosetten unter einem Mikroskop auszählt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lymphozyten-Population durch Dichtegradienten-Zentrifugierung aus Blut isoliert.
^q 3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lymphozyten-Population aus Blut isoliert durch Lysieren der roten Blutkörperchen und Entfernen der lysierten Blutkörperchen.
jg 4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Lymphozyten-Population aus Knochenmark isoliert.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als unlösliche Teilchen polymere Teilchen mit einer Teilchengröße innerhalb des Bereiches von etwa 0,5 bis etwa 20 μ,ΐη verwendet.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die B-Zellen-Markierungssubstanz einen Anti-(Humanimmunoglobulin)-Antikörper aufweist, der kovalent an das polymere Teilchen gebunden ist.
7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die T-Zellen-Markierungssubstanz einen monoclona-

QQ len Anti-(T-Zellen)-Antikörper aufweist, der kovalent an das polymere Teilchen gebunden ist.
8. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß die T-Zellen-Markierungssubstanz den T101-mono-

gg clonalen Antikörper von der Firma Murine Hybridoma Cell Line, ATCC Nr. CRL-8023 enthält.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch

gekennzeichnet, daß die polymeren Teilchen aus Polyacrylamid bestehen.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß außerdem die Macrophagen ausgezählt werden durch Beobachten der Anzahl der Zellen, die Perlen aufgezehrt haben.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß die B-Zellen-Markierungssubstanzen

und die T-Zellen-Markierungssubstanzen unter einem sichtbaren Lichtmikroskop voneinander» unterscheidbar sind als Folge davon, daß mindestens eine dieser Markierungssubstanzen angefärbt worden ist.
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12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff kovalent an die gefärbte Markierungssubstanz gebunden ist.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß die B-Zellen-Markierungssubstanz mindestens zwei visuell voneinander unterscheidbare Klassen umfaßt, die für verschiede Subpopulationen von B-Zellen spezifisch sind, und daß außerdem die Anzahl der jeder dieser Subpopulationen zugeordneten Rosetten ausgezählt wird.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Subpopulationen der B-Zellen aus B-Zellen ausgewählt werden, die Oberflächen-IgG, -IgM, -IgA, -IgD und -IgE aufweisen.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß die T-Zellen-Markierungssubstanz mindestens zwei visuell voneinander unterscheidbare Klassen umfaßt, die für verschiedene Subpopulationen von T-Zellen spezifisch sind und daß außerdem die Anzahl der jeder dieser Subpopulationen zugeordneten Rosetten ausge-

zählt wird.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Subpopulationen der
T -Zellen ausgewählt werden,

daß die Subpopulationen der T-Zellen aus T -Zellen und
17. Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 16, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Farbstoff um Bismark Brown Y handelt, der über eine Aminogruppe an dem Farbstoff an die gefärbte Markierungssubstanz gekuppelt ist.
18. Reagens-Set für die Verwendung in einem Immunoassay zur Bestimmung der relativen Mengen an B-Zellen und ΤΙ 5 Zellen, die in einer isolierten Human-Lymphozyten-Population vorhanden sind, dadurch gekennzeichnet, daß es umfaßt:

eine B-Zellen-Markierungssubstanz mit einem Anti-(Humanimmunoglobulin)-Antikörper, der kovalent an Teilchen gebunden ist, die in wäßriger Lösung unlöslich sind und eine Teilchengröße innerhalb des Bereiches von 0,5 bis 20 um aufweisen, und

eine T-Zellen-Markierungssubstanz mit einem Anti-(T-Zellen)*· Antikörper, der kovalent an Teilchen gebunden ist, die in wäßriger Lösung unlöslich sind und eine Teilchengröße innerhalb des Bereiches von 0,5 bis 20 μΐη aufweisen, wobei mindestens eine der B-Zellen- und T-Zellen-Markierungssubstanzen so angefärbt ist, daß die Markierungssubstanzen unter einem Mikroskop voneinander unterscheidbar sind.
19. Reagens-Set nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die B-Zellen-Markierungssubstanz und die T-Zellen-Markierungssubstanz lyophilisiert sind.
20. Reagens-Set nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeichnet, daß die B-Zellen-Markierungssubstanz und die T-Zellen-Markierungssubstanz in einer mit einem Phosphat

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gepufferten Kochsalzlösung vorliegen.
21. Reagens-Set nach einem der Ansprüche 18 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß der Anti-(Humanimmunoglobulin)'-Antikörper polyclonal ist.
22. Reagens-Set nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Anti-(Humanimmunoglobulin)-Antikörper monoclonal ist.
23. Reagens-Set nach einem der Ansprüche 18 bis 22, dadurch gekennzeichnet, daß der Anti-(T-Zellen)-Antikörper polyclonal ist.
24. Reagens-Set nach einem der Ansprüche 18 bis 23, dadurch gekennzeichnet, daß der Anti-(T-Zellen)"Antikörper monoclonal ist.
25. Reagens-Set nach einem der Ansprüche 18 bis 24,

dadurch gekennzeichnet, daß der Anti-(T-Zellen)-Antikörper T101 von der Firma Murine Hybridoma Cell Line, ATCC Nr. CRL-8023 ist.
26. Reagens-Set nach einem der Ansprüche 18 bis 25, dadurch gekennzeichnet, daß die unlöslichen Teilchen polymer sind.
27. Reagens-Set nach einem der Ansprüche 18 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff kovalent an die gefärbte Markierungssubstanz gebunden ist.
28. Reagens-Set nach einem der Ansprüche 18 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei dem Farbstoff um Bismark Brown Y handelt, das über eine Aminogruppe an dem Farbstoff kovalent an die gefärbte Markierungssubstanz gebunden ist.
Ι 29. Reagens-Set nach einem der Ansprüche 18 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß die für die T-Zellen-Markierungssubstanz verwendeten unlöslichen Teilchen aus einem anderen Material hergestellt wurden als diejenigen der B-Zellen-Markierungssubstanz.
30. Reagens-Set nach einem der Ansprüche 18 bis 28, dadurch gekennzeichnet, daß die unlöslichen Teilchen sowohl für die B-Zellen-Markierungssubstanz als auch für die T-Zellen-Markierungssubstanz aus dem gleichen Material hergestellt wurden.
31. Reagens-Set nach Anspruch 30, dadurch, gekennzeichnet, daß die unlöslichen Teilchen"'aifs Polyacrylamid bestehen.
32. Reagens-Set nach einem de^ Ansprüche 18 bis 31, dadurch gekennzeichnet, daß die B-Zellen-Markierungssubstanz mindestens zwei Klassen umfaßt, die für verschiedene Subpopulationen von B-Zellen spezifisch sind, wobei diese Subpopulationen aus B-Zellen ausgewählt werden, die auf der Zelloberfläche IgG, IgA, AgM, IgD und IgE aufweisen.
33. Reagens-Set nach einem der Ansprüche 18 bis 32, dadurch gekennzeichnet, daß die T-Zellen-Markierungssubstanz zwei Klassen umfaßt, die jeweils für die Tg- und T -Subpopulationen spezifisch sind.