SE466623B - Saett och testsats foer diagnosticering av en aktiv infektion - Google Patents

Description

466 625 10 15 20 25 30 35 2 karakteriserade epitoper pá en mikroorganism som är av intresse gör det möjligt att detektera mikroorga- nismen antingen direkt fràn ett patientprov eller efter föregående amplifiering genom odling.

DNA-hybridiseringsteknologi har nyligen blivit till- gänglig för detektering av ett antal infektiösa sjukdomar. Denna teknologi kan tillämpas både på direkta prover och pà odlade mikroorganismer.

Ett gemensamt särdrag hos de ovannämnda teknikerna är att de inte skiljer mellan aktiv infektion och infektion som är överstànden. Därtill är de ofta arbetsdryga och omfattar många arbetssteg, och när odlingsmetoder används är tiden mellan provtagning och en fastställd diagnos när det gäller vissa mikroorganismer (virus, parasiter, vissa bakterier) mycket lang.

Behovet av en snabb och känslig diagnos av en aktiv infektion förorsakad av en mikroorganism är särskilt viktig när man har att göra med t ex patienter som givits immunosuppressiv behandling och som har odiagnosticerad feber. En feber kan förorsakas av bl a olika typer av mikroorganismer som kräver totalt olika behandlingsstrate- gier, vilka kan vara mer eller mindre toxiska för patienten.

Nyligen publicerade W. van der Bij, et al. en artikel med titeln 'Rapid Immunodiagnosis of Active Cytomegalo- virus Infection by Monoclonal Antibody Staining of Blood Leucocytes' (Journal of Medical Virology 25:l79-188 (1988)). I likhet med sättet enligt föreliggande uppfin- ning utnyttjas detektion av infekterade lymfocyter i ett ljusmikroskop. Analysstegen skiljer sig emellertid signi- fikant från dem som används i föreliggande uppfinning, huvudsakligen beroende på det faktum att enzymmärkta anti- antikroppar, som erfordrar färgning för detektion, an- vänds. Den beskrivna analysen kan, om så är nödvändigt, utföras pà 3 h. 10 15 20 25 30 35 466 625 3 skulle vara användbar för ändamålet att fastställa grun- derna för effektiv övervakning och behandling av en infek- tion.

Beskrivning_av uppfinningen Föreliggande uppfinning åstadkommer ett sätt att diagnosticera in vitro en aktiv infektion förorsakad av en mikroorganism, vilket sätt är snabbt och lätt att utföra utan behov av någon sofistikerad utrustning. Sättet är därtill känsligt och tillåter detektion av en annalkande infektion i ett tidigt stadium och tillhandahåller ett verktyg som gör det möjligt att följa patienten från början till slutet av en specifik mikrobiell infektion, eftersom det återspeglar en aktiv infektion. Dessutom kan den valda behandlingens effektivitet övervakas med använd- ning av sättet enligt uppfinningen. Tiden mellan provtag- ning och svar är jämförelsevis kort, i en utföringsform av uppfinningen ungefär 2 h, och i en annan utföringsform av uppfinningen ungefär l l/2 h.

I en aspekt av uppfinningen åstadkoms ett sätt att diagnosticera in vitro en aktiv infektion förorsakad av en mikroorganism, vid vilket närvaron av nämnda mikroorga- nism, och/eller fagocyterade delar därav, exponerad på vita blodkroppar bestäms i ett prov av vita blodkroppar som separerats från helblod, varvid nämnda prov av vita blodkroppar i ett vätskemedium inkuberas med antingen a) en överskottsmängd antikroppar riktade mot nämnda mikroorganism, följt av inkubering av blandningen med en överskottsmängd anti-antikroppar belagda på en bärare med en partikelstorlek som är detekterbar i ett ljusmikroskop, eller b) en överskottsmängd antikroppar riktade mot nämnda mikroorganism och belagda på en bärare med en partikelstorlek som är detekterbar i ett ljusmikro- skop, följt av placering av en droppe av den inkuberade bland- 466 623 4 ningen som resulterar från a) eller b) på ett mikroskop- objektglas och bestämning, med hjälp av ett ljusmikroskop, av närvaron av nämnda mikroorganism, och/eller fago- cyterade delar därav, exponerade på vita blodkroppar som 5 s k rosetter bildade av nämnda bärarpartiklar fästa på infekterade vita blodkroppar, vilket indikerar en aktiv infektion förorsakad av nämnda mikroorganism.

Separation av ett prov av vita blodkroppar från hel- blod kan utföras genom vilken som helst metod som är känd 10 på området, t ex genom gradientcentrifugering med använd- ning av en blandning av natriummetrizoat och Ficoll i enlighet med metoden enligt Bøyum, A. (Scand. J. Clin.

Lab. Invest. 21, Suppl. 97 (1968)).

Uttrycket ”vätskemedium“, som används i föreliggande 15 beskrivning och patentkrav, anger vilket som helst lämp- ligt vätskemedium som inte lyserar de vita blodkropparna.

Exempel på sådana medier är fysiologisk koksaltlösning eller ett odlingsmedium, såsom RPMI 1640 medium.

Antikroppar riktade mot en mikroorganism som är av 20 intresse kan antingen väljas från kommersiellt tillgäng- liga antikroppar eller framställas genom standardförfaran- den. (Se t ex Fazekas de St Groth, Scheidegger D., Produc- tion of monoclonal antibodies: Strategy and tactics. J.

Immunol. Meth. 35:l, 1980). 25 Både monoklonala och polyklonala antikroppar kan användas vid sättet.

De bärarpartiklar som används vid sättet enligt upp- finningen bör ha en partikelstorlek som är detekterbar i ett ljusmikroskop, och i en föredragen utföringsform av 30 uppfinningen är bärarpartiklarna mikrosfärer med en medel- diameter av 3-5 um. Bärarmaterialet bör vara sådant att antikroppar kan beläggas på partiklarna. Det finns flera kommersiellt tillgängliga bärarpartiklar, och i en ut- föringsform av uppfinningen används latexpartiklar. 35 I en föredragen utföringsform av uppfinningen utförs inkubationerna vid sättet enligt uppfinningen vid ungefär 4°C. 10 15 20 25 30 35 466 623 5 I en föredragen utföringsform av sättet enligt upp- finningens alternativ a) utföres tvättning av den först inkuberade blandningen med t ex fosfatbuffrad salin, följt av separation av en blandning av fria och antikropp-bundna vita blodkroppar. Den separerade blandningen av vita blodkroppar spädes sedan med ett vätskemedium före inkubation med anti-antikroppar belagda pà en bärare.

Denna mellanliggande tvättningsprocedur, som avlägsnar icke bundna antikroppar, underlättar detektion av rosetter pà mikroskopobjektglaset.

S k rosetter (i föreliggande uppfinning infekterade vita blodkroppar pà vilka anti-antikroppsbundna bärar- partiklar är fästa) är välkända för fackmannen på området (se t ex Jondahl M., Holm G., wigzell H., J. Exp. Med., 136; sid 207, 1972).

Sättet enligt uppfinningen kan tillämpas pá diagnos- ticering in vitro av en aktiv infektion förorsakad av vilken som helst specifik mikroorganism, förutsatt att antikroppar riktade mot nämnda mikroorganism är, eller kan göras, tillgängliga. Särskilt viktiga mikroorganismer som förorsakar aktiva infektioner är Cytomegalovirus (CMV), Candida, Aspergillus, Human immunodeficiency virus (HIV), Hepatitis virus, Toxoplasma, Epstein-Barr-virus (EBV), Pneumocytis carinii och Herpes virus. I en föredragen ut- föringsform av uppfinningen är mikroorganismen Cytomegalo- virus, och i en annan föredragen utföringsform av uppfin- ningen är mikroorganismen Candida.

När sättet enligt uppfinningen används är det möjligt att beräkna procentsatsen infekterade vita blodkroppar i utgängsprovet av vita blodkroppar genom kalibrering av utgàngsprovet av vita blodkroppar till ett förutbestämt antal celler per ml vätskemedium, och sedan, efter den sista inkubationen, avsöka ett lämpligt antal celler för antalet rosetter.

I en variant av sättet enligt uppfiningen bestäms närvaron av minst tvâ olika mikroorganismer samtidigt med hjälp av minst två olikt färgade bärarpartiklar. Detta är 466 623 10 15 20 25 30 35 6 möjligt pga det faktum att bärarpartikelns färg är detek- terbar i ett ljusmikroskop. Det finns kommersiellt till- gängliga bärarpartiklar med olika färger, t ex blåa, röda, bruna och vita.

I en annan aspekt av uppfinningen ástadkommes en diagnostisk analystestsats för bestämning av en aktiv infektion förorsakad av en mikroorganism. Testsatsen om- fattar i separata behållare antingen ingredienserna a) en kalibrerad mängd av antikroppar riktade mot en vald mikroorganism i ett vätskemedium, och en kalibrerad mängd av bärarpartiklar förbelagda med anti-antikroppar i ett vätskemedium, eller ingrediensen b) en kalibrerad mängd av bärarpartiklar förbelagda med antikroppar riktade mot en vald mikroorganism, och eventuellt tvättlösningar, medier för separation av vita blodkroppar från helblod och reagens för testning av anti- kropparnas aktivitet.

Testsatsen är anpassad för användning vid sättet enligt uppfinningen. I en utföringsform av analystestsat- sen är de kalibrerade suspensionerna i lyofiliserad form för rekonstitution med en beräknad mängd av ett vätske- medium. Valfritt tillhandahàlles vätskemediet i en separat behållare i testsatsen. Analystestsatsen kan omfatta minst två olika ingredienser som definierats i a) eller b) av denna aspekt av uppfinningen, varvid var och en av nämnda ingredienser omfattar bärarpartiklar som med hänsyn till varandra är olikt färgade.

DIAGNOSTISKT ANALYSFÖRFARANDE Separation av vita blodkroppar från helblod Ett prov av helblod från en patient blandas 1:2 med NaCl, och 8 ml av den resulterande blodsuspensionen skiktas ovanpå 3 ml Lymphoprep i ett centrifugrör (Lympho- prep är ett varumärke från Nycomed AS Diagnostica, Norge, och innehåller natriummetrizoat 9,6% (vikt/vol) och Ficoll 5,6% (vikt/vol)). Blandningen centrifugeras under 20 min I: 10 15 20 25 30 35 466 626 7 vid 2000 varv/min. Skiktet mellan faserna, som innehåller vita blodkroppar, sugs upp med användning av en pasteur- pipett och överförs till ett annat centrifugrör. Cellerna tvättas 3 ggr med fysiologisk NaCl under 6 min vid 1500 varv/min. Cellerna räknas i en Bürker-kammare och späds i ett RPMI 1640 medium (tillverkare Gibco BRL) till ett förutbestämt antal celler per ml vätskemedium, t ex 1o x 106 celler/mi.

Analys 1 enlighet med alternativ a) enligtfuppfinninggn 1. 50 pl av en suspension omfattande 10 x 106 vita blodkroppar per ml RPMI 1640 medium placeras i ett provrör pá is. 2. 5 ul av en suspension av antikroppar riktade mot mikroorganismen som är av intresse sattes till provröret.

Provröret skakas försiktigt för att likformigt blanda rör- innehållet. 3. Provröret inkuberas pà is under 30 min (dvs vid 0-4°C). Provröret skakas försiktigt då och då under inkubationen, för att hålla antikropparna suspenderade i vätskemediet. 4. Provrörets innehåll tvättas 2 ggr med 1 ml portio- ner fosfatbuffrad salin (PBS), pH 7,4, omfattande 2,0% fetalt kalvserum, och centrifugeras vid 1500 varv/min. 5. Den resulterande pelletten suspenderas i 0,9 ml RPMI 1640 medium, och S0 pl av en suspension omfattande 4 x 108 mikrosfärer belagda med anti-antikroppar per nl PBS tillsättes medan man arbetar i ett kylrum. 6. Provröret roteras och inkuberas under 30 min i ett kylrum (vid 4'C). 7. Provrörets innehåll blandas med användning av en pasteurpipett, för att suspendera mikrosfärerna och cellerna till en jämn fördelning. En droppe av den suspen- derade blandningen placeras pá ett mikroskopobjektglas, vilket sedan täckes med ett täckglas, följt av visuell inspektion i ett vanligt ljusmikroskop. 466 625 10 15 20 25 30 35 B 8. Ett lämpligt antal celler, t ex 200 celler, av- sökes för antalet rosetter med hjälp av ett lämpligt för- storingsobjektiv, t ex 40x förstoring. Valfritt beräknas procentsatsen infekterade vita blodkroppar i utgàngsprovet av vita blodkroppar (med hjälp av antalet rosetter).

Analys i enlighet med alternativ b) enligt uppfinningen 1. 50 pl av en suspension omfattande 10 x 106 vita blodkroppar per ml RPMI 1640 medium placeras i ett provrör på is. 50 pl av en suspension omfattande 4 x 108 mikro- sfärer med en medeldiameter av 3-S pm belagda med anti- kroppar riktade mot en mikroorganism som är av intresse per ml PBS tillsättes, tillsammans med 0,9 ml RPMI 1640 medium. 2. Provröret roteras och inkuberas under 30 min i ett kylrum (vid 4°C). 3. Provrörets innehåll blandas med användning av en pasteurpipett för att suspendera mikrosfärerna och cellerna till en jämn fördelning. En droppe av den suspenderade blandningen placeras på ett mikroskop- objektglas, vilket sedan täcks med ett täckglas, följt av visuell inspektion i ett vanligt ljusmikroskop. 4. Ett lämpligt antal celler, t ex 200 celler, av- sökes för antalet rosetter med hjälp av ett lämpligt för- storingsobjektiv, t ex 40x förstoring. Valfritt beräknas procentsatsen infekterade vita blodkroppar i utgángsprovet av vita blodkroppar (med hjälp av antalet rosetter).

EXEMPEL 1 Sättet enligt uppfinningens alternativ a) användes för bestämning av procentsatsen Cytomegalovirus-infek- terade vita blodkroppar i blodprover tagna från nio pa- tienter, vilka hade erhållit transplantat vid Huddinge universitetssjukhus, Sverige.

Mikrosfärerna som uppbar anti-antikroppar var får- anti-mus IgG l (FC) belagda pà aktiverade mikrosfärer, Dynabeds, från Dynal AS, Norge. 10 15 20 25 30 35 466 623 9 Två olika antikroppar riktade mot Cytomegalovirus användes, nämligen MAS 127, monoklonal antikropp mot Cytomegalovirus med specificitet för humant Cytomegalovirus tidigt antigen, en produkt från Sera-lab, Storbritan- nien, inköpt fràn AB Kemila Preparat, Sollentuna, Sverige.

CH 16, monoklonala antikroppar riktade mot Cytomegalo- virus med specificitet för DNA-bindande protein, inköpt från dr Lenore Pereira, the University of California, USA.

Resultaten ges i tabell I.

I tabell I var patient l. en pancreastransplanta- tionspatient; patienterna 2., 3., 4. och 9. var njurtrans- plantationspatienter; och patienterna 5., 6., 7. och 8. var benmärgstransplantationspatienter. M betecknar man och F betecknar kvinna.

Serologi hade utförts av Stockholms landstings mikro- biologiska centrallaboratorium, Sverige, + betecknar ökning av IgM eller IgG titrar; - betecknar oförändrade IgM eller IgG titrar.

Odling i fibroblaster och virusdetektion hade utförts av Stockholms landstings mikrobiologiska centrallaborato- rium, Sverige, och B betecknar blod, U betecknar urin och Bal betecknar lungalveoltvåttning (broncoalveolar lavage). 466 625 10 TABELL I % infekterade vita blod- Patient kroppar: antikroppar 5 (kön/ålder) Serologi Odling MAS 127 CH 16 1. 14/32 + + (B, U) 5 5 2. F/4? + - 13 3. M/37 + + (B, U, Bal) 4 10 4. H/1 + + (U) 4 ll 5. F/2 - - 0 6. M/21 - - O 7. M/S8 - + (U) 2 8. M/32 + (B, U) 3 15 9. M/24 + + (B, Bal) 9 8 Av data som givits i tabell I kan man dra den slut- satsen att det är god korrelation mellan serologi + od- 20 lingsresultat och de resultat som erhållits när sättet enligt uppfinningens alternativ a) används: skillnaden är- den tid som erfordras från provtagning till resultat, vilken är ungefär 2 h när sättet enligt uppfinningen an- vänds, och det faktum att sättet enligt uppfinningen all- 25 tid återspeglar en aktiv infektion.

EXEMPEL 2 Bestämning av procentsatsen Cytomegalovirus-infek- terade vita blodkroppar i blodprover tagna från fyra patienter, vilka hade underkastats organtransplantation 30 vid Huddinge universitetssjukhus, Sverige, utfördes med användning av både sättsalternativet a) och sättsalterna- tivet b) enligt uppfinningen.

I alternativ a) var mikrosfärerna som uppbar anti- antikroppar samma som de som användes i exempel 1; och 35 antikropparna riktade mot Cytomegalovirus var M 127 såsom i exempel 1. 10 15 20 25 30 35 466 623 ll I alternativ b) var antikropparna MO 53, monoklonala antikroppar riktade mot Cytomegalo- virus-matrisprotein (64-68 kD) från BioInvent International, Lund, Sverige.

Antikropparna belades pá röda karboxylerade mikro- sfärer (Polyscience) med användning av karbodiimidtest- satsen frán Polyscience, Inc., USA, i enlighet med till- verkarens instruktioner.

Resultaten ges i tabell II.

TABELL II Patient % infekterade vita blodkroppar; nr/ålder alternativ a) alternativ b) l./32 0% 0% 2./8 1% 1% 3./19 1% 1% 4./31 0% 0% De i tabell II givna data indikerar att samma resul- tat erhàlles med de båda alternativen a) och b) av sättet enligt uppfinningen.

EXEMPEL 3 Sättet enligt uppfinningens alternativ a) användes för bestämning av procentsatsen Candida-infekterade vita blodkroppar i blodprover tagna från åtta patienter, vilka hade erhållit transplantat vid Huddinge universitetssjuk- hus, Sverige.

Mikrosfärerna som uppbar anti-antikroppar var samma som de som användes i exempel 1.

Antikropparna riktade mot Candida var MAB 806, mus-anti-Candida albicans-monoklonal antikropp som inte har någon korsreaktivitet med andra jäst, Lactobacillus Streptococcus/Pediococcus, frán Chemicon International, USA.

A 66 623 12 Resultaten ges i tabell III.

I tabell III var patienterna 1., 2., 4., 5., och 7. njurtransplantationspatienter; patienten 3. var en lever- transplantationspatient; och patienterna 6. och 8. var 5 njur- plus pancreastransplantationspatienter. M betecknar man och F betecknar kvinna.

Serumprover från var och en av patienterna hade testats av Statens bakteriologiska laboratorium, Sverige, för fastställande av närvaron av Candida-glykoproteinanti- 10 gen. Testet utfördes med användning av Cand-Tece-kit från RAMCO Laboratories Inc., USA. I tabell III betecknar + närvaro av nämnda antigen (Ag).

TABELL III 15 Patient % infekterade (kön/ålder) Ag vita blodkroppar 1. M/58 + 3% 20 2. M/37 + 9% 3. F/S4 + 11% 4. M/54 + 11% 5. M/8 + 16% 6. F/29 + 7% 25 7. M/51 + 13% 8. M/44 + 1,5% Av de data som givits i tabell III kan man se att 30 infekterade vita blodkroppar, och sålunda en aktiv 35 Candide-infektion hos patienten, kunde detekteras med an- vändning av såttsalternativet a) enligt uppfinningen.

Claims (11)

10 15 20 25 30 35 466 623 13 PATENTKRAV

1. Sätt att diagnosticera in vitro en aktiv infektion förorsakad av en mikroorganism, vid vilket närvaron av nämnda mikroorganism, och/eller fagocyterade delar därav, exponerade pá vita blodkroppar bestäms 1 ett prov av vita blodkroppar som separerats frán helblod, k ä n n e - t e c k n a t därav, att nämnda prov av vita blodkroppar i ett vätskemedium inkuberas med antingen a) en överskottsmängd antikroppar riktade mot nämnda mikroorganism, följt av inkubering av blandningen med en överskottsmängd anti-antikroppar belagda pà en bärare med en partikelstorlek som är detekterbar i ett ljusmikroskop, eller b) en överskottsmängd antikroppar riktade mot nämnda mikroorganism och belagda på en bärare med en partikelstorlek som är detekterbar i ett ljusmikro- skop, följt av placering av en droppe av den inkuberade bland- ningen som resulterar frán a) eller b) på ett mikroskop- objektglas och bestämning, med hjälp av ett ljusmikroskop, av närvaron av nämnda mikroorganism, och/eller fagocyti- cerade delar därav, exponerade på vita blodkroppar som s k rosetter bildade av nämnda bärarpartiklar fästa på infek- terade vita blodkroppar, vilket indikerar en aktiv infek- tion förorsakad av nämnda mikroorganism.

2. Sätt enligt kravet 1, vari följande mellanliggande steg utförs mellan de två inkubationsstegen i alternativ a): tvättning av den inkuberade blandningen, separering av en blandning av fria och antikroppbundna vita blodkroppar och spädning av den separerade blandningen av vita blod- kroppar med ett vätskemedium. 466 625 10 15 20 25 30 35 14

3. Sätt enligt kravet l eller 2, vari mikroorganis- men som förorsakar en aktiv infektion väljes från den grupp som består av Cytomegalovirus (CMV), Candida, Aspergillus, Human immunodeficiency virus (HIV), Hepatitis virus, Toxoplasma, Epstein-Barr-virus (EBV), Pneumocytis carinii och Herpes virus.

4. Sätt enligt kravet 3, vari mikroorganismen är Cytomegalovirus.

5. Sätt enligt kravet 3, vari mikroorganismen är Candida.

6. Sätt enligt något av de föregående kraven, vari utgàngsprovet av vita blodkroppar kalibreras till ett förutbestämt antal celler/ml vätskemedium, och efter den sista inkubationen avsökes ett lämpligt antal celler för antalet rosetter, följt av beräkning av procentsatsen infekterade vita blodkroppar i utgångsprovet av vita blod- kroppar.

7. Sätt enligt något av de föregående kraven, vari antikropparna är monoklonala antikroppar, inkubationerna utföres vid ungefär 4°C och bärarpartiklarna är mikrosfä- rer med en medeldiameter av 3-5 pm.

8. Sätt enligt något av de föregående kraven, vari närvaron av minst två olika mikroorganismer bestämmes sam- tidigt med hjälp av minst två olikt färgade bärarpartik- lar.

9. Diagnostisk analystestsats för bestämning av en aktiv infektion förorsakad av en mikroorganism, k ä n - n e t e c k n a d därav, att den omfattar i separata behållare antingen ingredienserna a) en kalibrerad mängd av antikroppar riktade mot en vald mikroorganism i ett vätskemedium, och en kalibrerad mängd av bärarpartiklar förbelagda med anti-antikroppar i ett vätskemedium, eller ingrediensen b) en kalibrerad mängd av bärarpartiklar förbelagda med antikroppar riktade mot en vald mikroorganism, och eventuellt tvättlösningar, medier för separation av vita 10 15 20 25 30 35 466 623 15 blodkroppar från helblod och reagens för testning av antikropparnas aktivitet.

10. Diagnostisk analystestsats enligt kravet 9, vari de kalibrerade lösningarna är i lyofiliserad form för rekonstitution med en beräknad mängd av ett vätskemedium, valfritt tillhandahàllet i en separat behållare i test- satsen.

11. ll. Diagnostisk analystestsats enligt kravet 9 eller 10, vari testsatsen omfattar minst två olika ingredienser som definierats i a) eller b), varvid var och en av ingre- dienserna omfattar bärarpartiklar som med hänsyn till var- andra är olikt färgade.