DE3232955A1 - Mit antikoerper sensibilisierte mikrokapseln und ein verfahren zur messung von lymphozyten unter verwendung derselben auf der grundlage zellvermittelter immunitaet - Google Patents

Mit antikoerper sensibilisierte mikrokapseln und ein verfahren zur messung von lymphozyten unter verwendung derselben auf der grundlage zellvermittelter immunitaet

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Nobuo Asaka Saitama Hiratsuka
Tatsuo Mitaka Tokyo Suzuta
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Description

Mit Antikörper sensibilisierte Mikrokapseln und ein · Verfahren zur Messung von Lymphozyten unter Verwendung derselben auf der Grundlage zellvermittelter Immunität.
Die vorliegende Erfindung betrifft mit Antikörper sensibilisierte Mikrokapseln und ein Verfahren zur Messung von Lymphozyten auf der Grundlage zellvermittelter Immunität unter Verwendung solcher Mikrokapseln. Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere mit Antikörper gegen Lymphozyten sensibilisierte Mikrokapseln und ein Verfahren zur Messung von Lymphozyten auf der Grundlage zellvermittelter Immunität unter Verwendung der vorgenannten Mikrokapseln und von Schaf-Erythrozyten, ein Verfahren zur Messung von Lymphozyten, die voneinander unterscheidbar sind, auf der Grundlage zellvermittelter Immunität unter Verwendung von mindestens zwei Arten der vorgenannten Mikrokapseln sowie weiterhin ein Verfahren zur Messung von B-Lymphozyten unter Verwendung von Mikrokapseln, die mit Antikörper gegen Antigen von B-Lymphozyten sensibilisiert sind.
Der Begriff "zellvermittelte Immunität" ist in der Fachwelt wohleingeführt und bezeichnet eine spezifische Immunität, die durch kleine Lymphozyten (Zellen von 6 bis 8 μπι Durchmesser mit einem tiefgefärbten Kern und einer schmalen Randzone aus Zytoplasma) vermittelt wird und von der Anwesenheit der Thymusdrüse bei der Geburt abhängt. Die zellvermittelte Immunität ist verantwortlich für solche Reaktionen wie verzögerte Hypersensitivität, Tuberkulin-Test-Reaktionen, Immunmangel etc. und spielt eine wichtige Rolle bei der Abwehr von Virus-Infektionen und einigen Bakterien.
Die immunologische Identifizierung oder Messung von Human-T-Lymphozyten (T-Zellen; von der Thymusdrüse abhängige Zellen, auch als lymphoide Zellen bezeichnet, von denen gezeigt wurde, daß sie von der Thymusdrüse *5 geprägt sind) und von B-Lymphozyten (B-Zellen; ebenfalls vom Knochenmark abgeleitete Zellen; Lymphozyten, die in den peripheren lymphoiden Organen, d.h. der Milz und den Lymphknoten gefunden werden, von denen bekannt ist, daß sie dem Knochenmark entstammen, jedoch nicht dem Einfluß der Thymusdrüse unterliegen) wurde bisher im allgemeinen mittels der E-Rosetten-Technik durchgeführt; B-Lymphozyten (B-Zellen) werden durch Nachweis des Fc-Rezeptors (Rezeptor für das Fc-Fragment oder kristallisierbare Fragment, das durch Papain-Hydrolyse von Immunglobulin-Molekülen erhalten wird, oder des C3-Rezeptors (Rezeptor für die dritte Komponente des Komplements) mit Hilfe der EA-Rosetten-Technik (EA kurz für aus dem Vogelei erhaltenes Ovalbumin) oder der EAC-Rosetten-Technik (EAC kurz für Erythrozyten-Antikörper-Komplement) oder durch den Nachweis der Immunglobuline an der Oberfläche der Zellmembran mit Hilfe der Fluoreszenz-Antikörper-Technik identifiziert oder gemessen. Diese Methoden beruhen auf den wichtigsten grundlegenden Reaktionen der zeilvermittelten Immunität. In den letzten Jahren haben diese Methoden weit verbreitete Anwendung bei Routine-Tests zur Bestimmung des Verhältnisses der T-Zellen zu den B-Zellen gefunden, die zur indizierenden Beobachtung der Immunfunktion eines Patienten unerläßlich sind. Bei Einsatz dieser Methoden gemäß dem Stand der Technik müssen jedoch T- und B-Zellen getrennt voneinander auf separaten Platten identifiziert oder bestimmt werden. Außerdem erfordert die Identifizierung der B-Zellen komplizierte Arbeitsgänge.
Schaf-Erythrozyten binden sich nämlich so, wie sie sind, an T-Zellen; dementsprechend müssen sie gegen T-Zellen inaktiviert werden und chemisch so verändert werden, daß sie ein bindendes Zentrum für B-Zellen besitzen. Diese Arbeitsgänge bedingen auch eine schlechte Nachweisempfindlichkeit. Weiterhin werden bei Anwendung der Fluoreszenz-Antikörper-Technik relativ große Mengen einer zu untersuchenden Probe benötigt, so daß der Patient eine ernsthafte physische Belastung erleidet, und es sind nicht nur spezielle Apparaturen und Geräte erforderlich sondern auch ein hohes technisches Können bei der praktischen Durchführung der entsprechenden Arbeitsgänge. Aus diesen einschränkenden Erfordernissen ergeben sich für die Anwendung dieser Methoden gewisse
Probleme.
Weiterhin werden bei der E-Rosetten-Technik und der EA-Rosetten-Technik oder der EAC-Rosetten-Technik Erythrozyten von Tieren eingesetzt, und daraus ergeben sich Probleme dahingehend, daß außerordentlich komplizierte
Operationen für die Herstellung einer Erythrocyten-Suspension erforderlich sind und es darüber hinaus unmöglich ist, Erythrozyten über längere Zeiträume hinweg aufzubewahren.
Nunmehr wurde gefunden, daß T-Lymphozyten und B-Lympho~ zyten sowie andere Zellen in einem einzigen, einfach durchzuführenden Arbeitsgang gleichzeitig und unter Verwendung einer im Vergleich zu den Methoden des Standes der Technik geringen Probemenge des zu untersuchenden Materials identifiziert oder gemessen werden können; dies geschieht in der Weise, daß durch Verwendung einer oder mehrerer Arten von Mikrokapseln, die mit
Antikörper gegen Antigen von Lymphozyten sensibilisiert sind, alternativ zusammen mit Schaf-Erythrozyten, eine Immunantwort erzeugt wird oder daß solche Mikrokapseln mit an einer Mikroplatte haftenden Lymphozyten etc. in Berührung gebracht werden; dieser Befund liegt der vorliegenden Erfindung zugrunde.
Mikrokapseln, die an ihrer Oberfläche gebunden ein Antigen oder einen Antikörper aufweisen, sind in der US-PS 4 342 739 offenbart. Diese Mikrokapseln werden jedoch verwendet für die Bestimmung der Serum-Komponenten auf der Grundlage der Zeil-Agglutination, nicht für die Bestimmung von Lymphozyten.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Messung verschiedener Arten von Lymphozyten in einem einzigen Arbeitsgang.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur genauen Messung verschiedener Arten von Lymphozyten in einfacher Weise unter Verwendung eines üblichen optischen Mikroskops, ohne daß dafür eine Dunkelkammer oder ein aufwendiges Fluoreszenz-Mikroskop erforderlich ist.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren zur Messung verschiedenartiger Lymphozyten, bei dem ein Schritt der Entfernung von Makrophagen von den Lymphozyten entfällt, weil die Makrophagen aufgrund der Aufnahme der Mikrokapseln durch Phagozytose visuell unterscheidbar sind.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin ein Verfahren z"ur Messung verschiedenartiger Lymphozyten mit hoher Genauigkeit und guter Reproduzierbarkeit aufgrund der Verwendung von Mikrokapseln, die so synthetisiert wurden, daß sie mit Antikörpern gegen Antigene verschiedenartiger Lymphozyten sensibilisiert sind, da die Antikörper über lange Zeiträume hinweg außerordentlich beständig gelagert werden können.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind außerdem
Mikrokapseln, die mit Antikörper gegen Antigen von Lymphozyten sensibilisiert sind und mit Vorteil für die verschiedenen vorerwähnten Verfahren eingesetzt werden.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind schließlich Mikrokapseln, die in ihrem Kern eingearbeitet ein Färbemittel enthalten und an ihrer äußeren Wandung mit Antikörper gegen Antigen von Lymphozyten sensibilisiert sind.
Die vorliegende Erfindung ist durch folgende Merkmale gekennzeichnet:
(1) Eine mit Antikörper gegen Antigen von Lymphozyten
sensibilisierte Mikrokapsel;
(2) Ein Verfahren zur Messung von T-Zellen und/oder
B-Zellen auf der Grundlage zellvermittelter Immunität, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine mit
Antikörper gegen Antigen von Lymphozyten sensibilisierte Mikrokapsel und Schaf-Erythrozyten gleichzeitig auf Lymphozyten zur Einwirkung gebracht werden und dann unabhängig voneinander unterscheidbare Zellen gemessen werden;
(3) Ein Verfahren zur Messung von T-Zellen und/oder B-Zellen auf der Grundlage zellvermittelter Immunität, das dadurch gekennzeichnet ist, daß mindestens zwei Arten von Mikrokapseln, die mit mindestens zwei Arten von Antikörpern gegen die entsprechenden Antigene von Lymphozyten, die optisch voneinander unterscheidbar sind, sensibiliert sind, gleichzeitig auf Lymphozyten zur Einwirkung gebracht werden und dann unabhängig optisch voneinander unterscheidbare Zellen gemessen
werden; und
(4) Ein Verfahren zur Messung von B-Zellen auf der Grundlage zellvermittelter Immunität, das dadurch gekennzeichnet ist, daß mit Antikörper gegen Antigen von B-Lymphozyten sensibilisierte Mikrokapseln auf Lymphozyten zur Einwirkung gebracht werden und dann unterscheidbare B-Zellen gemessen werden.
Die Mikrokapseln gemäß der vorliegenden Erfindung sind wirksam zur Messung von T-Lymphozyten oder B-Lymphozyten in einem einzigen Arbeitsgang unter Anwendung der Rosettenbildungs-Technik. Die Rosettenbildungs-Technik wird auch als Immunozyten-Haftung (immunocyto-adherence) bezeichnet. Dabei handelt es sich um eine Technik, vermittels derer Zellen nachgewiesen werden können, die Immunglobulin auf ihrer Oberfläche tragen (entweder weil sie das Immunglobulin gebildet haben, oder weil dieses an die Zelle gebunden wurde). Mit Antigen überzogene Erythrozyten, z.B. Schaf-Erythrozyten, werden mit den Zellen gemischt und binden sich an die den Antikörper tragenden Mikrokapseln unter Bildung einer Rosette. Die Rosetten werden mit einer Zytozentrifuge
auf einen mikroskopischen Objektträger gegeben, und die Zelle im Zentrum (d.h. die T-Zelle, wenn Schaf-Erythrozyten oder Mikrokapseln, die z.B. mit Anti-IgG sensibilisiert sind, verwendet werden) wird gefärbt und identifiziert. Einzelheiten der Rosettenbildungs-Technik wurden von Van Oers et al., Eur. J. Immunology 1_, 143 (1977), beschrieben, worauf hier verwiesen wird.
Die Bezeichnung "zur Einwirkung gebracht wird" beschreibt einen Vorgang, bei dem die Mikrokapseln gemäß
der vorliegenden Erfindung mit Lymphozyten in Berührung gebracht werden, besonders typisch durch Vermischen der Mikrokapseln mit Lymphozyten.
Der Begriff "sensibilisiert", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet einen Zustand, zu dessen Erreichung in einem vorhergehenden Schritt ein in einer immunologischen Reaktion gebildeter Antikörper gebunden wurde; der Begriff "sensibilisierte Mikrokapseln" bezeichnet Mikrokapseln, an die ein Antikörper gegen Antigen von Lymphozyten gebunden ist und die durch Verabreichung
eines Antigens von Lymphozyten immunologisch aktiviert oder vorbehandelt (primed) worden sind. Die sensibilisierten Mikrokapseln sind solche, die in bezug auf ein gegebenes Antigen spezifisch aktiviert worden sind, und vermögen auch mehr Zellen zu erzeugen, die die Reaktionen der zellvermittelten Immunität vermitteln.
Zu typischen Beispielen für Antikörper, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, zählen Anti-IgG, Anti-IgM, Anti-IgA, Anti-T-Antikörper sowie andere Antikörper gegen das gewöhnliche Gehirn-Antigen
(brain common antigen), das gewöhnliche Thymus-Antigen
.. .. J^ ^y ö 5
- 12 -
(thynius common antigen) etc. wie Oberflächen-Antigene der Lymphozyten. Von diesen besitzen Anti-IgG, Anti-IgM und Anti-IgA Rezeptoren für B-Lymphozyten, so daß die mit diesen Antikörpern sensibilisierten Mikrokapseln mit B-Zellen Rosetten zu bilden vermögen. Wenn andererseits mit Anti-T-Antikörper und Antikörpern gegen das gewöhnliche Gehirn-Antigen und das gewöhnliche Thymus-Antigen sensibilxsierte Mikrokapseln eingesetzt werden, können diese Mikrokapseln selektiv mit T-Zellen Rosetten bilden, da diese Antikörper Rezeptoren für T-Zellen besitzen.
Färbemittel, die vorzugsweise für die Färbung der Mikrokapseln gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, können jeden beliebigen Farbton aufweisen, jedoch bedarf es keiner besonderen Erwähnung, daß im Falle der Durchführung der Messung in Anwesenheit der Schaf-Erythrozyten der Farbton ein solcher sein sollte, der eine leichtere Unterscheidung ermöglicht, und nicht ein Farbton, der demjenigen der Schaf-Erythrozyten ähnelt. Weiterhin erübrigt sich eigentlich der Hinweis, daß auch bei der Anwendung von zwei oder mehr Arten von Mikrokapseln Farbtönungen gewählt werden können, die voneinander unterscheidbar sind.
In der vorliegenden Erfindung können ein oder mehrere Färbemittel, die die leichtere Messung oder Bestimmung bewirken, in das Kernmaterial der Mikrokapseln eingearbeitet werden. Synthetisierte gepackte feine Teilchen, die herkömmlicherweise nach dem Stand der Technik verwendet wurden und mit Färbemitteln gefärbt waren, waren für den praktischen Einsatz' nur schlecht geeignet, da die Färbemittel in unmittelbare Berührung mit
dem Antikörper gegen Antigen von Lymphozyten gelangten, so daß sie den Antikörper in den meisten Fällen nachteilig beeinflußten. Im Gegensatz dazu können die Färbemittel in das in den Mikrokapseln befindliche Kernmaterial eingearbeitet werden; das Material der Wandungen besteht allein aus Harzen. Das heißt, daß die Oberfläche jeder Mikrokapsel von Harz bedeckt ist und es durch passende Wahl der Harze möglich ist, die nachteilige Beeinflussung der Antikörper zu vermeiden.
Färbemittel, die in der vorliegenden Erfindung zur Verbesserung des Kontrastes bei der Unterscheidung der einzelnen Zellen eingesetzt werden können, sind lipophile (oleophile) Farbstoffe, und spezielle Beispiele für diese sind
Colour Index Solvent Red Nr. 1, 3, 8, 23, 24, 25, 27, 30, 49, 81, 82, 84, 100, 109 und 121,
Colour Index Solvent Violet Nr. 8, 13, 14, 21 und 27;
Colour Index Solvent Blue Nr. 2, 11, 12, 25, 35, 36, 55 und 73;
Colour Index Solvent Green Nr. 3;
Colour Index Solvent Brown Nr. 3, 5, 20 und 37;
Colour Index Solvent Black Nr. 3, 5, 7, 22, 23 und 123
CI. Solvent Blue (CI. # 61525) etc..
Diese Färbemittel werden je nach dem Anwendungszweck
ausgewählt und gemäß der vorliegenden Erfindung in das Kernmaterial eingearbeitet, so daß die Gefahr einer Beeinträchtigung der zellvermxttelten Immunität durch sie auf ein Minimum herabgesetzt wird.
Die in der vorliegenden Erfindung einsetzbaren Mikrokapseln umfassen ein öliges Kernmaterial und ein Wandmaterial und sind mit einem Antikörper gegen Antigen
von Lymphozyten sensibilisiert, d.h. sie sind immunologisch aktiviert worden. Der Antikörper ist im allgemeinen an die Mikrokapseln mittels kovalenter Bindungen zwischen Wandmaterial und Antikörper gebunden.
Zur Bindung des Antikörpers an die Mikrokapseln können verschiedene herkömmliche Verfahren eingesetzt werden, z.B. ein Aldehyd-Vernetzungsverfahren, ein Alkylierungsverfahren, ein Isocyanat-Vernetzungsverfahren, ein Maleinimid-Vernetzungsverfahren, ein Benzophenon-Vernetzungsverfahren, ein Periodat-Vernetzungsverfahren etc.; Einzelheiten hierzu sind beschrieben in Ichiro Chihata, "Koteika Koso" (Immobilisierte Enzyme), Kodansha Publishing Company, Ltd. (1975), und Eiji Ishikawa, "Enzyme Immunoassay", Seiten 34-44. Wiewohl die Angabe der genannten Verfahren zur Bindung keine Einschränkung bedeutet, so ist jedoch wichtig, daß die Antikörper in solcher Weise gebunden werden, daß sie nicht inaktiviert werden. Das typischste Verfahren ist die Herbeiführung der Bindung vermittels Aldehyden wie Glutaraldehyd, Formaldehyd, Glyoxal etc.. Entsprechend diesem Verfahren werden die Mikrokapseln mit 0,2 bis 2 % beispielsweise Glutaraldehyd bei Temperaturen von 150C bis 4O0C, vorzugsweise bei Umgebungstemperatur, 1 bis 2 h unter normalem Druck vermischt, und die Mischung wird dann zur Entfernung des unumgesetzten Aldehyds mit destilliertem Wasser gewaschen. Anschließend werden die mit Glutaraldehyd behandelten Mikrokapseln mit 0,1 bis 5 % Antikörper vermischt und 1 bis 2 h bei Raumtemperatur reagieren gelassen. Spezielle Beispiele für andere, nicht-aldehydische Vernetzungsmittel sind Toluol-2,4-diisocyanat, N,N1-o-Phenylendimaleinimid, m-Maleinimidobenzoyl, N-Hydroxysuccinimid-Ester etc..
Zur Prüfung, ob zwischen den Mikrokapseln und dem Antikörper eine Bindung ausgebildet wurde, kann im allgemeinen ein einfacher Test mittels einer Immunofluoreszenz-Technik durchgeführt werden ("A Dictionary of Immunology", Seite 128 (1979), erschienen bei der Hirokawa Publishing Co., Ltd.)/ bei der ein Antikörper mit einem Fluorochrom konjugiert wird und dann mit dem entsprechenden Antigen in einem Gewebeschnitt oder -ausstrich reagieren gelassen wird; die Stellen der Gewebe-Antigene lassen sich auf diese Weise aufgrund der Beobachtung der Fluoreszenz-Muster unter dem Mikroskop bestimmen .
Für die Wandungen der Mikrokapseln gemäß der vorliegenden Erfindung kann jedes beliebige Material verwendet
werden, vorausgesetzt, dciß das Material einen Antikörper zu binden vermag, ohne ihn zu inaktivieren. Repräsentative Beispiele für Wandmaterialien sind solche Stoffe, die eine Amino-, Imino-, Hydroxy- oder SuIfhydryl-Gruppe besitzen, wie Proteine (z.B. Kollagen, Ge-
latine, Casein etc.), Harze wie Polyaminosäure, Polyacrylamid, Polyamid, Polyurethan, Polyharnstoff, Polyurethan-Harnstoff, Melamin-Harz, Phenol-Harz, Epoxy-Harz, Silicon-Harz und deren Derivate, Cellulose und deren Derivate (z.B. Methylcellulose, Ethylcellulose,
Carboxymethylcellulose, Nitrocellulose, Celluloseacetat, Cellulosesulfat etc.), Gummi arabicum, Stärke, Alginsäure und dergleichen.
Unter dem Gesichtspunkt der leichteren Unterscheidbarkeit und der Erleichterung der Messung ist es in der
Praxis von Vorteil, daß die mittlere Größe der Mikrokapseln derjenigen der Lymphozyten (im allgemeinen 7
bis 12 μΐη) ähnlich ist; das heißt, daß die mittlere Größe der Mikrokapseln vorzugsweise in einem Bereich von 1 bis 10 μΐη liegt. Falls die mittlere Größe der Mikrokapseln außerhalb des im Vorstehenden angegebenen Bereichs liegt, würde eine Bildung von Rosetten und deren Beobachtung schwierig werden.
Einzelheiten über verschiedenartige Wandmaterialien und Verfahren der Mikroverkapselung sind z.B. in Asaji Kondo, "Microcapsules", Nikkan Kogyo Press, Tokyo (1970), Tamotsu Kondo und Masumi Koishi, "Microcapsules", Sankyo Publishing Co., Ltd., Tokyo (1972) etc. beschrieben.
Spezielle Beispiele für die Mineralöle sind Erdöl, Kerosin, Benzin, Naphtha, Paraffinöl etc.. Zu den typisehen tierischen ölen zählen Fischöl, Schmalz etc.. Zu den typischen Beispielen für pflanzliche öle zählen Erdnußöl, Leinöl, Sojabohnenöl, Rizinusöl, Maisöl etc.. Spezielle Beispiele für synthetische Öle sind Biphenyl-Verbindungen (z.B. Isopropylbiphenyl, Isoamylbiphenyl), Terphenyl-Verbindungen (z.B. Terphenyle des Typs, wie sie in der DE-OS 21 53 635 beschrieben sind), Naphthalin-Verbindungen (z.B. Diisopropy!naphthalin, Verbindungen des Typs, wie sie in der US-PS 4 003 589 beschrieben sind), alkylierte Diphenylalkane (z.B. 2,4-Dimethyldiphenylmethan, Verbindungen des Typs, wie sie in der US-PS 3 836 383 beschrieben sind), Phthalsäure-Verbindungen (z.B. Diethylphthalat, Dibutylphthalat, Dioctylphthalate) etc..
Unter Verwendung der so hergestellten Mikrokapseln können T-Zellen und B-Zellen unabhängig voneinander oder
beide gleichzeitig in sehr einfacher Weise bestimmt werden. Wenn eine Identifizierung allein der B-Zellen gewünscht wird, werden Mikrokapseln mit einem Antikörper, der einen Rezeptor für B-Zellen besitzt, z.B.
Anti-IgG, sensibilisiert, und die so sensibilisierten Mikrokapseln werden auf eine zu untersuchende, Lymphozyten enthaltende Probe zur Einwirkung gebracht (d.h. mit diesen vermischt). Dann werden die von B-Zellen und den Mikrokapseln gebildeten Rosetten mit Hilfe der mikroskopischen Beobachtung bestimmt. Im Fall der Bestimmung von T-Zellen werden die Mikrokapseln mit einem Antikörper, der einen Rezeptor für T-Zellen besitzt, sensibilisiert, und der beschriebene Arbeitsgang wird wiederholt.
T-Zellen und B-Zellen können beide gleichzeitig in einem einzigen Arbeitsgang bestimmt werden, wenn Mikrokapseln, die mit einem Antikörper, der einen Rezeptor für B-Zellen besitzt, sensibilisiert sind, in Kombination mit Schaf-Erythrozyten eingesetzt werden, da
Schaf-Erythrozyten mit T-Zellen selektiv Rosetten bilden. Bei diesem Arbeitsschritt der Simultan-Messung können auch Mikrokapseln mit einem Rezeptor für T-Zellen an Stelle der Schaf-Erythrozyten eingesetzt werden. Wenn zwei Arten von Mikrokapseln, eine mit einem Anti-
körper, der einen Rezeptor für B-Zellen besitzt, sensibilisierte und eine andere mit einem Antikörper, der einen Rezeptor für B-Zellen besitzt, sensibilisierte für den Arbeitsgang der Simultan-Bestimmung verwendet werden, bilden die Mikrokapseln zwei Arten von Rosetten jeweils mit den B-Zellen und den T-Zellen. Diese Rosetten können bei der mikroskopischen Betrachtung voneinander unterschieden werden.
Die Bedingungen für die Einwirkung der Mikrokapseln gemäß der vorliegenden Erfindung auf Lymphozyten, d.h. die Bedingungen für die Rosettenbildung, sind nicht übermäßig begrenzt, jedoch wird im allgemeinen bei Temperaturen von etwa 1O0C bis etwa 4O0C, vorzugsweise von Raumtemperatur (etwa 180C) bis 370C, und mit Zeiten von etwa 10 min bis etwa 24 h, vorzugsweise 1 h bis 3 h, gearbeitet.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können in einfacher
Weise
(1) B-Zellen und/oder T-Zellen unter Verwendung der
Mikrokapseln der vorliegenden Erfindung mit hoher Nachweisempfindlichkeit und hoher Genauigkeit bestimmt werden;
(2) insbesondere B-Zellen mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens identifiziert werden, ohne daß ein komplizierter Arbeitsgang und ein kostspieliges Fluoreszenz-Mikroskop benötigt werden; und
(3) B-Zellen und T-Zellen simultan in einem einzigen
Arbeitsgang bestimmt werden.
Die vorliegende Erfindung nunmehr wird anhand der folgenden Beispiele ausführlicher erläutert.
- 19 Beispiel 1
(1) Mikrokapseln (MC):
Mikrokapseln (mittlere Teilchengröße 5,0 um) mit Harnstoff-Harz als Wandung an ihrer Oberfläche und in ihrem Kern eingearbeiteten CI. Solvent Blue Il (Colour Index # 61525), die infolgedessen blau gefärbt waren, wurden verwendet. Die Mikrokapseln besaßen ein spezifisches Gewicht von 1,15 und waren negativ geladen. Die Mikrokapseln wurden in Wasser suspendiert, so daß der Feststoff-Gehalt 10 % betrug. Diese Suspension stellte die MC-Originalsuspension dar.
(2) Bindung von Anti-Human-IgG-Antikörper an MC:
Die MC-Originalsuspension wurde zweimal mit Saline gewaschen. Der erhaltene Rückstand wurde in einem zwan-
zigfach verdünnten 0,1M Tris-HCl-Puffer mit einem pH 8,6 suspendiert. Zu der Suspension wurden in äquimolarer Menge 3,125 % Glutaraldehyd hinzugegeben. Nachdem die Komponenten 30 min bei 370C zur Reaktion gebracht worden waren, wurde die Reaktionsmischung zweimal mit
dem gleichen Lösungsmittel (0,1M Tris-HCl-Puffer) gewaschen, und der Niederschlag wurde im doppelten Volumen des Lösungsmittels suspendiert. Zu der Suspension wurden 5 mg des Antikörpers (Anti-Human-IgG-Kaninchen-IgG) gegeben, und die Reaktion wurde 1 h bei 370C
durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde dreimal mit dem gleichen Lösungsmittel gewaschen und in einer 0,2 % Glycin enthaltenden Tris-HCl-Puffer-Lösung suspendiert, wodurch mit Anti-Human-IgG-Antikörper sensibilisierte Mikrokapseln erhalten wurden. Die auf diese Weise her-
gestellten Mikrokapseln hatten einen mittleren Durchmesser von etwa 5 um.
- 20 Beispiel 2
(1) Mikrokapseln (MC):
In 25 g einer Öl-Mischung aus 11,8 g Diisopropylnaphthalin und 13,2 g chloriertem Paraffin (Chlorierungsgrad 50 %) wurden 0,1 g eines Ethylendiamin-Propylenoxid-Additionsprodukts aufgelöst. Die Lösung wurde dann eisgekühlt. In dieser Lösung wurden 4 g einer 50-proz. Lösung von Desmodur-L (Handelsbezeichnung, hergestellt von der Bayer AG, 1:4-Additionsprodukt aus Tolylendi-
isocyanat und Trimethylolpropan) in Methylethylketon gelöst. Die erhaltene ölige Lösung wurde in 65 g einer 5-proz. wäßrigen Lösung von Polyvinylalkohol (Verseifungsgrad 88 %; Polymerisationsgrad 500) gegossen, und die erhaltene Mischung wurde durch Rühren emulgiert.
Nachdem die mittlere Tröpfchengröße etwa 7 μΐη erreicht hatte, wurde die Emuslion mit 100 g Wasser verdünnt, und die erhaltene Mischung wurde 1 h bei 750C zur Reaktion gebracht, um das System zu mikroverkapseln. Die auf diese Weise erhaltenen Mikrokapseln mit Wandungen
0 aus Polyurethan wurden in Wasser in einem Anteil von 10 Gew.-% suspendiert und als MC-Originalsuspension verwendet.
(2) Bindung von Anti-Human-IgG-Antikörper an MC:
In ähnlicher Weise wie in Beispiel 1 (2), jedoch mit
der Abweichung, daß Anti-Human-IgG-Schaf-IgG anstelle von Anti-Human-IgG-Kaninchen-IgG verwendet wurde, wurden mit Anti-Human-IgG-Antikörper sensibilisierte MC hergestellt.
- 21 Beispiel 3
(1) Behandlung mit PoIy-L-Lysin:
Jede der Zellen einer Mikroplcitte (# 3034, tiergestellt von der Falcon Co., Ltd.) wurde mit 40 ug/ml PoIy-L-Lysin (PLL, hergestellt von der Sigma Co., Ltd.) in einer Menge von 1 μ.1 gefüllt. Nachdem die Mikroplatte 60 min bei Raumtemperatur stehen gelassen worden war, wurde sie mit destilliertem Wasser gewaschen und dann getrocknet, so daß sie gebrauchsfertig war.
(2) Abtrennung der Lymphozyten:
Aus peripherem Blut, das der Ellenbogenvene einer freiwilligen Versuchsperson entnommen worden war, wurden nach Heparin-Zusatz Lymphozyten mit Hilfe des Zentrifugierverfahrens mittels des spezifischen Gewichts unter
Verwendung von Ficoll-Isopaque nach der Boyum-Methode abgetrennt. Die auf diese Weise abgetrennten Lymphozyten wurden dreimal mit destilliertem Wasser gewaschen. Danach wurde ihre Konzentration auf 1 χ 10 /ml eingestellt.
(3) Messung unter Verwendung von Mikrokapseln
Auf die wie oben in (1) beschrieben mit PLL behandelten Mikroplatte wurde 1,0 μΐ der Lymphozyten-Lösung aus (5) aufgestrichen. Das unumgesetzte PLL wurde mit fötalem Kalbsserum (FCS) behandelt. In jede der Zellen der Mikroplatte wurden 25 μΐ einer Mikrokapsel-Suspension, die wie im vorstehenden Beispiel 1 (2) beschrieben erhalten worden war, gegeben, um eine Reaktion herbeizu-
führen. Die Mikrokapseln wurden an die B-Lymphozyten gebunden und bildeten eine Rosette. Danach wurde die Mikroplatte zur Entfernung nicht gebundener Mikrokapseln mittels eines Abschleuderrohres (flicking tube) auf dieses umgesetzt und dort befestigt. Anschließend erfolgte die Färbung mit der Fixier-Färbelösung; als diese wurde eine durch Auflösen von 0,25 % Glutaraldehyd und 0,05 % Brilliant-Cresylblau (CI. # 51010) in PBS erhaltene Lösung verwendet. Die Lymphozyten wurden mikroskopisch auf der Mikroplatte gezählt und die Rosetten-Bildungsrate wurde in üblicher Weise mit 200 Lymphozyten bestimmt. Die Zählung wurde insgesamt dreimal durchgeführt, und die Rosetten-Bildungsrate wurde in Form des Mittelwertes angegeben. Der B-Zellen-Anteil der Lymphozyten in dem der Ellenbogenvene der freiwilligen Versuchsperson entnommen Blut betrug im Mittel 19 %.
Beispiel 4
Simultan-Messung von T-Zellen und B-Zellen:
Die gemäß der Beschreibung in Beispiel 3 (2) aus dem der Ellenbogenvene der freiwilligen Versuchsperson entnommenen Blut abgetrennten Lymphozyten wurden in einer Menge von 1 μΐ auf eine wie in Beispiel 3 (1) beschrieben erhaltene PLL-behandelte Mikroplatte aufgestrichen.
5 Nachdem das unumgesetzte PLL mit FCS (fötalem Kalbsserum) behandelt worden war, wurden 25 μΐ der in Beispiel 1 (2) erhaltenen Mikrokapsel-Suspension und 10 ml einer Schaf-Erythrozyten-Suspension (die durch dreimaliges Waschen von Schaf-Erythrozyten mit Phosphatpuffer-Saline (PBS) und Suspendieren in einer Konzentration von
2 χ 10 /ml erhalten worden war) in jede Zelle der Mikroplatte gegeben, damit sie sich mit den Lymphozyten vermischte. Der Reaktionsmischung wurde 90 min bei Raumtemperatur und danach über Nacht bei 40C Gelegenheit zur Reaktion gegeben. Danach wurden von der Mikroplatte die überschüssigen und/oder ungebundenen Mikrokapseln und Schaf-Erythrozyten entfernt. Anschließend wurde die Fixier-Färbung unter Verwendung der in Beispiel 3 (2) beschriebenen Fixier-Färbelösung durchge-
führt. Die mikroskopische Untersuchung ergab, daß zwei Arten von Rosetten vorlagen, d.h. Rosetten, die durch von Mikrokapseln umgebene B-Zellen gebildet worden waren, und Rosetten, die durch von Schaf-Erythrozyten umgebene T-Zellen gebildet worden waren. Durch Zählen
von 200 Lymphozyten wurden die Rosetten-Bildungsraten in üblicher Weise bestimmt. Die Mittelwerte dreier Wiederholungen zeigten, daß der B-Zellen-Gehalt 19 % betrug und der T-Zellen-Gehalt 81 % betrug.
Vergleichsbeispiel 1
Membran-Fluoreszenz-Antikörper-Technik:
Zu 0,5 ml von 2 χ 10 /ml Lymphozyten wurden 0,5 ml FITC-markiertes Anti-Human-IgG-Kaninchen-Serum (erhalten dadurch, daß von Boehringer & Co., GmbH, hergestelltes Antiserum 30 min mit 10 000 min" zentrifugiert worden war und das zentrifugierte Antiserum unter Verwendung eines Mikrofilters mit einer mittleren Porengröße von 0,22 μπι filtriert und anschließend das Filtrat mit PBS auf das Zehnfache verdünnt worden war) hinzugefügt. Nachdem beide 30 min bei Raumtemperatur
zur Umsetzung gebracht worden waren, wurde das Reaktionsprodukt dreimal mit PBS, das 5 % FCS enthielt, gewaschen. 200 Lymphozyten wurden mit Hilfe eines Fluoreszenz-Mikroskops gezählt, da die Zählung mit Hilfe
eines gewöhnlichen Mikroskops nicht möglich war. Der Prozentsatz der Fluoreszenz emittierenden Zellen, d.h. der B-Zellen, wurde auf diese Weise bestimmt. Der B-Zellen-Gehalt zeigte eine Verteilung von 13 % bis 25 %, obwohl der Mittelwert 19 % betrug.
Vergleichsbeispiel 2
E-Rosetten-Technik:
Nachdem die in Beispiel 3 (2) abgetrennten Lymphozyten auf die PLL-behandelte Mikroplatte aufgestrichen worden waren, wurden 10 ml einer Schaf-Erythrozyten-Suspension (erhalten dadurch, daß Schaf-Erythrozyten dreimal mit Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS) gewaschen und in fötalem Kalbsserum (FCS) in einer Konzentration von
g
2 χ 10 /ml suspendiert wurden) hinzugegeben, und die Reaktion wurde 90 min bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 40C ermöglicht. Dann wurden die nicht-gebundenen Schaf-Erythrozyten entfernt. Nachdem die von T-Zellen, die von den Schaf-Erythrozyten umgeben waren, gebildeten Rosetten fixiert-gefärbt worden waren, wurde die Rosetten-Bildungsrate bestimmt. Der T-Zellen-Gehalt betrug 81 %.
Mit Hilfe des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ließ sich die Messung in einfacher Weise simultan durchführen, und 81 % T-Zellen und 19 % B-Zellen wurden beständig mit guter Reproduzierbarkeit und Genauigkeit
nachgewiesen (Beispiel 4). Außerdem konnten Makrophagen leicht unterschieden werden, und die Beurteilung wurde in keiner Weise gestört.
Die Messung der B-Zellen für sich allein konnte mit Hilfe einer konventionellen mikroskopischen Beobachtung durchgeführt werden (Beispiel 3) . Im Vergleich zu der in Vergleichsbeispiel 1 beschriebenen Technik, die eine fluoreszenzmikroskopische Beobachtung erforderlich machte, wurden die in Beispiel 3 erzielten Ergebnisse in einem außerordentlich einfachen Arbeitsgang mit besserer Reproduzierbarkeit und höherer Genauigkeit erhalten.

Claims (1)

  1. VON KREISLER SCHONWALD EISHOLD FUES VON KREISLER KELLER SELTING WERNER
    Fuji Photo Film Co., Ltd. Kanagawa, Japan
    PATENTANWÄLTE Dr.-Ing. von Kreisler 11973
    Dr.-lng. K. Schönwald, Köln Dr.-Ing. K. W. Eishold, Bad Soden Dr. J. F. Fues, Köln Dipl.-Chem. Alek von Kreisler, Köln Dipl.-Chem. Carola Keller, Köln Dipl.-Ing. G. Selting, Köln Dr. H.-K. Werner, Köln
    DEICHMANNHAUS AM HAUPTBAHNHOF
    D-5000 KÖLN 1
    3. September 198 2
    W/GF 1188 /hg
    Patentansprüche
    1. Mit Antikörper gegen Antigen von Lymphozyten sensibilisierte Mikrokapsel.
    2. Mikrokapsel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Mikrokapsel ein öliges flüssiges Kernmaterial und ein Wandmaterial umfaßt.
    3. Mikrokapsel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Wandmaterial an seiner Oberfläche den Antikörper bindet.
    4. Mikrokapsel nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ausgewählt ist aus der aus Anti-IgG-Antikörper, Anti-IgM-Antikörper, Anti-IgA-Antikörper, Anti-T-Antikörper, Antikörper gegen das gewöhnliche Gehirn-Antigen (brain common antigen) und Antikörper gegen das gewöhnliche Thymus-Antigen (thymus common antigen) bestehenden Gruppe.
    5. Mikrokapsel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Färbemittel in das Kernmaterial eingearbeitet ist.
    6. Mikrokapsel nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Wandmaterial ausgewählt aus der aus Polyurethan, Polyharnstoff, Polyurethan-harnstoff, Melamin und Gelatine bestehenden Gruppe.
    7. Mikrokapsel nach Anspruch 1 bis 6 zur Verwendung für die Messung von Lymphozyten mittels einer Rosettenbildungs-Technik.
    8. Verfahren zur Messung von Zellen auf der Grundlage zellvermittelter Immunität, dadurch gekennzeichnet, daß eine mit Antikörper gegen Antigen von Lymphozyten sensibilisierte Mikrokapsel und Schaf-Erythrozyten gleichzeitig auf Lymphozyten zur Einwirkung gebracht werden und dann unabhängig die voneinander unterscheidbaren Zellen gemessen werden.
    9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ausgewählt ist aus der aus Anti-IgG-Antikörper, Anti-IgM-Antikörper und Anti-IgA-Antikörper bestehenden Gruppe.
    10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen T-Zellen und B-Zellen sind.
    11. Verfahren nach Anspruch 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine Rosettenbildungs-Technik angewandt wird.
    12. Verfahren zur Messung von Zellen auf der Grundlage ze1!vermittelter Immunität, dadurch gekennzeichnet, daß mindestens zwei Arten von Mikrokapseln, die mit mindestens zwei Arten von Antikörpern gegen Antigene von Lymphozyten, die optisch voneinander unterscheidbar sind, sensibilisiert sind, gleichzeitig auf Lymphozyten zur Einwirkung gebracht werden und dann unabhängig optisch voneinander unterscheidbare Zellen gemesr.cn werden.
    13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß einer der Antikörper ausgewählt ist aus der aus Anti-IgG-Antikörper, Anti-IgM-Antikörper und Anti-IgA-Antikörper bestehenden Gruppe und ein anderer ausgewählt ist aus der aus Anti-T-Antikörper, Antikörper gegen das gewöhnliche Gehirn-Antigen und Antikörper gegen das gewöhnliche Thymus-Antigen bestehenden Gruppe.
    14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß B-Zellen durch Verwendung von Mikrokapseln, die mit einem Antikörper sensibilisiert sind, der ausgewählt ist aus der aus Anti-IgG-Antikörper, Anti-IgM-Antikörper und Anti-IgA-Antikörper bestehenden Gruppe, und T-Zellen durch Verwendung von Mikrokapseln, die mit einem Antikörper sensibilisiert sind, der ausgewählt ist aus der aus Anti-T-Antikörper, Antikörper gegen das gewöhnliche Gehirn-Antigen und Antikörper gegen das gewöhnliche Thymus-Antigen bestehenden Gruppe, bestimmt werden.
    15. Verfahren nach Anspruch 12 bit» 14, dadurch gekennzeichnet, daß eine Rosettenbildungs-Technik angewandt wird.
    16. Verfahren zur Messung von B-Zellen auf der Grundlage zellvermittelter Immunität, dadurch gekennzeichnet, daß mit Antikörper gegen Antigen von B-Lymphozyten sensibilisierte Mikrokapseln zur Einwirkung gebracht werden und dann die unterscheidbaren B-Zellen gemessen werden.
    17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß der Antikörper ausgewählt ist aus der aus Anti-IgG-Antikörper, Anti-IgM-Antikörper und Anti-IgA-Antikörper bestehenden Gruppe.
    18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß eine Rosettenbildungs-Technik angewandt wird.
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