DE3343695A1

DE3343695A1 - Biologische reaktionsschicht und ein verfahren zu ihrer herstellung

Info

Publication number: DE3343695A1
Application number: DE19833343695
Authority: DE
Inventors: Hajime Makiuchi; Nobuhito Masuda; Shigeru Nagatomo; Yukio Asaka Saitama Yasuda
Original assignee: Fuji Photo Film Co Ltd
Current assignee: Fujifilm Holdings Corp
Priority date: 1982-12-03
Filing date: 1983-12-02
Publication date: 1984-06-07
Also published as: JPS59102388A; US4861552A

Description

BESCHREIBUNG

Die Erfindung betrifft eine biologische Reaktionsschicht und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.

Eine Reihe von analytischen Systemen für den Nachweis und die quantitative Analyse von Spurenkomponenten in einer flüssigen Probe, beispielsweise von biochemisch aktiven Komponenten und anderen aus Organismen stammenden Komponenten, die in biologischen Fluiden, wie in Körperflüssigkeit, enthalten sind, unter Verwendung eines analytischen EIements (eines analytischen Trockenelements), das in Form einer Schicht (oder einer Folie bzw. eines Blattes) vorliegt, sind gut bekannt. Das analytische Element wird im allgemeinen auf solche Weise verwendet, daß ein Material, das gegenüber der zu analysierenden Substanz (Analyt) beim Kontakt damit chemisch oder physikalisch reaktiv ist, zuvor in das analytische Element eingearbeitet wird und dieses mit dem Analyt in einer flüssigen Probe, die zu dem Element zugegeben wird, in Kontakt gebracht wird, wobei bei dem Analysevorgang bestimmte chemische Reaktionen in der biologisehen Reaktionsschicht ablaufen. Die Menge an Reaktionsprodukt oder nichtumgesetzter Substanz wird mittels Spektrophotometrie oder Fluorometrie oder mittels Radioisotopen bestimmt, um dadurch die Menge an Analyt festzustellen.

Da das oben erwähnte analytische Verfahren, bei dem ein analytisches Element verwendet wird, bei dem Analysevorgang relativ einfach zu handhaben ist, wurde das Verfahren für viele Zwecke angewendet, beispielsweise bei dem Immunoassay, bei dem eine Antigen-Antikörper-Reaktion verwendet wird, bei der Analyse von Enzymen oder eines Substrats, bei dem eine enzymatische Reaktion verwendet wird, oder bei ähnlichen Reaktionen. Jedoch besitzt das einfache Verfahren, bei dem ein analytische Element verwendet wird, den Nachteil, daß seine analytische Genauigkeit nicht ausreicht.

Beispielsweise ist der oben erwähnte Nachteil besonders bei einem Immunoassay sehr störend. Um analytische Ergebnisse mit hoher Empfindlichkeit und Genauigkeit zu erhalten, ist es bei dem Immunoassay erforderlich, daß eine Flüssigkeitsprobe in einem ausreichenden Volumen in das analytische Ele ment gegeben wird und während kurzer Zeit dort verbleibt, damit die Antigen-Antikörper-Reaktion zu Ende geführt wird. Jedoch verbleibt eine flüssige Probe mit einem ausreichenden Volumen pro Einheitsfläche im allgemeinen nicht dem bekannten analytischen Element zurück, und daher kann eine ausreichende Empfindlichkeit bzw. Genauigkeit nicht erhalten werden. Zur Beseitigung dieser Nachteile bei dem Immuno assay wurde eine Reihe von analytischen Elementen vorgeschlagen. Jedoch wurden durch diese Elemente die oben erwähnten Nachteile nur ungenügend überwunden.

Der oben erwähnte Nachteil gilt weiterhin in gewissem Ausmaß auch für andere analytische Verfahren, bei denen analytische Elemente verwendet werden, wo Enzymreaktionen ablaufen oder verschiedene andere Reaktionsteilnehmer teilnehmen.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine biologische Reaktionsschicht zur Verfügung zu stellen, die als Teil eines analytischen Elements oder als ganzes analytisches Element verwendet werden kann, während der oben erwähnte Nachteil beseitigt oder verringert wird.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine biologische Reaktionsschicht eines trockenen analytischen Elements in Form einer porösen Verbundschicht, wobei ein teilchenförmiges Material ein daran fixiertes biologisch aktives Material trägt und in einer faserförmigen porösen Matrix dispergiert ist. Die Schicht ist dadurch gekennzeichnet, daß das Verhältnis des Trockengewichts des teilchenförmigen Materials zu dem des faserförmigen Materials, das in der porösen Schicht enthalten ist, im Bereich von 1 : 20 bis

1 : 0,3 liegt und daß das teilchenförmige Material in der Schicht in einer Menge von 1 bis 60 g/m² vorhanden ist.

Die erfindungsgemäßo biologische Reaktionsschicht enthält als Grundstruktur eine poröse Verbundschicht, in der ein teilchenförmiges Material bzw. ein aus Einzelteilchen bestehendes Material, welches daran fixiert ein biologisch aktives Material aufweist, in einer faserförmigen porösen Matrix dispergiert ist. Genauer gesagt, besteht die erfindungsgemäße biologische Reaktionsschicht grundsätzlich aus einer Kombination aus einer Matrix aus faserförmigem Material, welches so zusammengeballt ist, daß eine poröse Struktur entsteht, und einem teilchenförmigen Material, welches einheitlich in Hohlräumen, die in der Matrix aus faserförmigem Material vorhanden sind bzw. definiert sind, verteilt ist. An das teilchenförmige Material ist ein biologisch aktives Material fixiert bzw. haftet daran, d.h. ein Material, welches daran aktiv erhalten bleibt und an der gewünschten biologischen Reaktion teilnimmt.

Hinsichtlich des faserförmigen Materials, welches bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, gibt es keine besondere Beschränkung, so lange es im wesentlichen gegenüber der flüssigen Probe und dem Analyten, die in das analytische Element eingeführt werden, inert ist. Beispiele für verwendbare faserförmige Materialien sind anorganische Fasern, wie Glasfasern und Asbestfasern, natürliche organische Fasern, wie Baumwolle, Hanf, Pulpe und Seide, semisynthetische oder synthetische Fasern, wie Viskoserayon, Cuprammoniumrayon, Celluloseacetat, teilweise formalisierter (mit Formaldehyd umgesetzter) Polyvinylalkohol, Polyethylen, Polypropylen, Polyvinylchlorid, Polystyrol und Polyester (beispielsweise Polyethylenterephthalat etc.).

Die Dicke des faserförmigen Materials liegt bevorzugt im Bereich von 0,1 bis 5 μΐη, und die Länge beträgt bevorzugt 500 bis 4000 μΐη.

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Hinsichtlich des teilchenförmigen Materials, das bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, gibt es keine besondere Beschränkung, so lange es im wesentlichen gegenüber der flüssigen Probe und dem Analyten, die in das ana-Iytische Element eingeführt werden, inert ist. Beispiele für verwendbares teilchenförmiges Material sind nichtfaserförmige Materialien, wie beispielsweise Polysaccharid, wie Agar, Agarose_r Sepharose, Sephadex und Dextran; Polyacrylamid und Latex, der durch Polymerisation (oder Copolymerisation) von polymerisierbaren ethylenischen Monomeren hergestellt worden ist; und Cellulosepulver. Unter diesen Mate rialien sind nichtfaserförmige Materialien, wie Agar, Agaro se und Sepharose besonders bevorzugt, da durch die Verwendung dieser Materialien die Menge an flüssiger Probe, die darin pro Dickeneinheit der biologischen Reaktionsschicht zurückgehalten wird, erhöht werden kann.

Das teilchenförmige Material liegt bevorzugt in Form von Stäbchen bzw. Plättchen vor, bei denen das Verhältnis der kleineren Achse (Breite oder Dicke) zur größeren Achse (Län ge) im Bereich von 1 : 1 bis 1 : 20 liegt. Es gibt jedoch keine besondere Beschränkung hinsichtlich der Form des teilchenförmigen Materials. Beispielsweise kann ein Material beliebiger Form, wie kugelförmiges, kreisförmiges, kegelförmiges, pyramidenförmiges, prismenförmiges oder zylinderförmiges Material, einschließlich der modifizierten oder kombinierten Formen verwendet werden. Ein weiches faserförmiges Material mit langer Faserlänge ist nicht als teilchenf örmiges Material günstig, da ein solches faserfÖrmiges Material leicht mit dem oben erwähnten faserförmigen Material verknäult und eine weniger einheitliche biologische Reaktionsschicht ergibt.

Der mittlere Durchmesser des oben erwähnten teilchenförmigen Materials liegt bevorzugt im Bereich von 10 bis 200 um.

Wenn als quantitative Analyse eine Antigen-Antikörper-Reaktion durchgeführt wird, kann das biologisch aktive Material, das an das teilchenförmige Material fixiert ist und seine biologische Aktivität beibehält, ein Antikörper des Analyten, wie ein Immunoglobulin, etc. sein. Weiterhin kann das biologisch aktive Material ein Antigen (einschließlich Hapten und dessen Analogen) in dem Fall sein, in dem der Analyt ein Antikörper ist. Wenn eine Enzym-Substrat-Reaktion bei • der Analyse verwendet wird, kann Glucoseoxidase oder Meerrettichperoxidase oder ihre Kombination für den quantitativen Nachweis von Glucose verwendet werden, und ein Substrat, welches eine farbstoffbildende Gruppe aufweist, wie Stärke, die einen Farbstoff oder einen Kuppler trägt, kann für den Nachweis von Amylase verwendet werden. In diesen Fällen kann eine bestimmte Verbindung erforderlich sein, um ein nachweisbares Signal zu ergeben (beispielsweise ist o-Phenylendiamin für den oben erwähnten Glucosenachweis erforderlich, und ein Kuppler ist für den Nachweis von Amylase erforderlich).

Das Verfahren, mit dem das biologisch aktive Material an das teilchenförmige Material, dessen Aktivität erhalten bleibt, fixiert wird, kann ein an sich bekanntes Verfahren oder ein entsprechend abgewandeltes Verfahren sein. Das aktive Material kann mit einem fluoreszierenden Mittel oder einem radioaktiven Stoff markiert sein, so daß das aktive Material selbst oder seine Zersetzungsprodukte oder irgendwelche Kombinationsprodukte des aktiven Materials und des Analyten nachweisbar sind. Das Verfahren zur Markierung des aktiven Materials ist bekannt und wird daher in der vorliegenden Anmeldung nicht näher erläutert.

Die Reaktion, die man anwenden kann, um das biologisch aktive Material zu fixieren, und das Markierungsverfahren werden beispielsweise in Einzelheiten in den folgenden Literaturstellen beschrieben: TEXT FOR BIOLOGICAL EXPERIMENTS, Bd. 1 (Chemistry of Proteins), Bd. 2 (Chemistry of Nucleic

Acids), Bd. 3 (Chemistry of Fats) und Bd. 4 (Chemistry of Saccharides) (zusammengestellt von der Society of Biochemistry, Japan, herausgegeben von Tokyo Kagaku Dozin, 1977); METHOD FOR SYNTHESIS OF PEPTIDES (von Izumiya u.a., herausgegeben von Maruzen, 1975); ENZYMEIMMONOASSAY (von Kiyoshi Miyai, Rinsho Kensa, Bd. 22, Nr. 11, 1978, Extraausgabe); METHOD FOR ENZYMEIMMONOASSAY (zusammengestellt von Ishikawa u.a., herausgegeben von Igaku Shoin, 1978).

Gegebenenfalls kann auch der Analyt markiert werden. Wenn eine konkurrierende Reaktion zwischen einem Antigen und seinem markierten Antigen gegenüber ihrem gemeinsamen Antikörper in der erfindungsgemäßen biologischen Reaktionsschicht abläuft, kann ein Antikörper zuvor in die Reaktionsschicht eingearbeitet werden und als biologisch aktive Substanz dienen. In der Reaktionsschicht wird der Antikörper dann in Kontakt mit dem Analyten (Antigen) und einer markierten Substanz, wie dem markierten Analyten oder einem markierten Homologen, gebracht, und die konkurrierende Reaktion kann ablaufen.

Die erfindungsgemäße biologische Reaktionsschicht liegt in Form einer porösen Verbundschicht bzw. zusammengesetzten Schicht vor, die den Vorteil hat, daß eine flüssige Probe, die einen Analyten enthält, leicht eintreten und diffundieren kann und daß die flüssige Probe während recht langer Zeit innerhalb der Schicht verbleiben kann bzw. von der Schicht zurückgehalten werden kann. Damit diese Vorteile erhalten werden, ist es erforderlich, daß das Verhältnis des Trockengewichts des teilchenförmigen Materials zu dem des faserförmigen Materials, welches in der porösen Verbundschicht enthalten ist, im Bereich von 1 : 20 bis 1 : 0,3 liegt und daß das teilchenförmige Material in einer Menge von 1 bis 6 0 g/m² vorhanden ist.

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Wenn eine oder beide dieser beiden Bedingungen, d.h. daß das Verhältnis des Trockengewichts des teilchenförmigen Materials zu dem des faserförmigen Materials und der Gehalt an teilchenförmigem Material in der porösen Verbundschicht, nicht erfüllt werden, d.h. wenn die oben erwähnten Bereiche nicht eingehalten werden, sind entweder der Eintritt und die Diffusion der flüssigen Probe oder die Retention der flüssigen Probe in die biologische Reaktionsschicht ungenügend, oder beide.Nachteile treten auf, und das Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik zu erzielen, wird nicht erreicht.

Die Dicke der porösen Verbundschicht gemäß der vorliegenden Erfindung, d.h. der biologischen Reaktionsschicht, liegt bevorzugt im Bereich von 100 bis 2000 um und besonders bevorzugt im Bereich von 200 bis 1000 um.

Die erfindungsgemäße biologische Reaktionsschicht, die oben beschrieben wurde, wird bevorzugt nach dem folgenden Verfahren hergestellt. Dieses Verfahren umfaßt die Einstellung der Dicke einer nassen Schicht aus einem Gemisch, welches ein teilchenförmiges Material, welches daran fixiert ein biologisch aktives Material trägt, faserförmiges Material und ein flüssiges Dispersionsmedium enthält, wobei das Verhältnis des Trockengewichts des teilchenförmigen Materials zu dem des faserförmigen Materials im Bereich von 1 : 20 bis 1 : 0,3 liegt und das teilchenförmige Material in einer Menge von 1 bis 6 0 g/m² vorhanden ist, mittels einer Einrichtung oder Einrichtungen mit einem vorbestimmten Abstand bzw. vorbestimmtem Spiel; und Trocknen der Schicht ohne wesentliche Änderung der vorbestimmten Dicke, wobei die poröse Verbundschicht erhalten wird.

Das oben erwähnte Verfahren wird beispielsweise nach folgendem Verfahren durchgeführt, welches die Stufen umfaßt: Herstellung einer Aufschlämmung aus dem teilchenförmigen Mate-

rial, welches daran fixiert ein biologisch aktives Material aufweist, und faserförmigem Material, dispergiert in einem flüssigen Dispersionsmedium (zum Beispiel Wasser oder einem Gemisch aus Wasser und einem mit Wasser mischbaren organisehen Lösungsmittel) in einem Verhältnis innerhalb des oben angegebenen Bereichs; Bildung einer Schicht, welche ein nasses Gemisch enthält, das das teilchenförmige Material in einer Menge von 1 bis 60 g/m² enthält, indem man die Aufschlämmung mittels einer bekannten Papierherstellungsvorrichtung verarbeitet; Einstellung der Schichtdicke unter Verwendung der Einrichtung oder Einrichtungen mit vorbestimmtem Abstand (Spiel) (die Oberfläche der Einrichtung oder Einrichtungen ist bevorzugt glatt); und Trocknen der Schicht, wobei im wesentlichen keine Änderung in der vorbestimmten Dicke auftritt (das Trocknungsverfahren wird bevorzugt bei niedriger Temperatur durchgeführt, und die Gefriertrocknung wird bevorzugt angewendet).

Bei der Herstellung der oben erwähnten Aufschlämmung können verschiedene Mittel, die normalerweise bei Papierherstellungsverfahren verwendet werden, mit eingesetzt werden, wie Dispersionsmittel, Verdickungsmittel und Konservierungsmittel, vorausgesetzt, daß die Funktion der entstehenden biologischen Reaktionsschicht durch diese Mittel nicht beeinträchtigt wird. Hinsichtlich des Verfahrens zur Herstellung der Aufschlämmung gibt es keine besondere Beschränkung. Beispielsweise kann man verschiedene Verfahren unter Verwendung üblicher Mischvorrichtungen, wie Homogenisierungsvorrichtungen und Kugelmühlen, einsetzen, oder man kann eine Vorrichtung verwenden, die allgemein zur Herstellung einer Papierauf schlämmung verwendet wird, wie Einrichtungen mit einem Rührwerk mit Flügel bzw. einen Holländer.

Für das Verfahren zur Herstellung der Schicht aus dem nas-5 sen Gemisch (voluminöse Schicht) gibt es keine besondere Beschränkung. Beispielsweise können verschiedene Verfahren,

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bei denen bekannte Fourdrinier-Vorrichtungen und Zylindervorrichtungen verwendet werden, angewendet werden, oder man kann ein statisches Sieb für die Papierherstellung verwenden, durch das die wäßrige Dispersion filtriert wird. 5

Die Schicht aus nassem Gemisch, die das flüssige Dispersionsmedium und das teilchenförmige Material und das faserförmige Material enthält, in der das Gewichtsverhältnis „ (erstere zu letzterer, auf Trockenbasis) im Bereich von 1 : 20 bis 1 : 0,3 liegt und in der das teilchenförmige Material in einer Menge von 1 bis 60 g/m² enthalten ist, wird dann auf die entsprechende Dicke eingestellt. Das Verfahren, das man zum Einstellen der Schichtdicke anwendet, wird mittels einer Einrichtung oder Einrichtungen mit vorbestimmtem Abstand durchgeführt. Man kann zum Einstellen der Dicke verschiedene Verfahren anwenden. Beispiele für Verfahren sind ein Verfahren, bei dem die Schicht zwischen zwei Filzplatten so gepreßt wird, daß die vorbestimmte Dicke erreicht wird, und ein Verfahren, bei dem die Schicht zwischen WaI-zen mit vorbestimmten! Abstand (Schlitz) hindurchgeht. Die Dicke der Schicht wird bevorzugt so eingestellt, daß sie innerhalb eines Bereichs von 100 bis 2000 um liegt, und dann wird die Schicht mit eingestellter Dicke getrocknet, ohne daß eine wesentliche Änderung der Dicke auftritt.

Um den oben erwähnten Zweck zu erreichen, wird die Schicht bevorzugt bei einer relativ niedrigen Temperatur getrocknet, und besonders bevorzugt wird sie gefriergetrocknet. Das Trocknen bei niedriger Temperatur und insbesondere das Gefriertrocknen sind auch bevorzugt, weil das biologisch aktive Material, das in der wie oben hergestellten Schicht enthalten ist, getrocknet werden kann, ohne daß eine wesentliche Verschlechterung seiner Aktivität stattfindet.

Alternativ kann die Einstellung der Dicke der Schicht, die wie oben hergestellt worden ist, nach anderen Verfahren er-

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folgen. Beispielsweise kann die erfindungsgemäße biologische Reaktionsschicht hergestellt werden, indem man die Dikke der Schicht mit einer Einrichtung oder Einrichtungen mit vorbestimmten! Abstand (die Oberfläche der Einrichtung oder Einrichtungen ist bevorzugt glatt) nach dem Trocknen der Schicht einstellt. Das oben beschriebene Einstellungsverfahren, bei dem glatte Platten und Walzen verwendet werden, kann bei dieser Ausführungsform ebenfalls eingesetzt werden, und die Dicke der getrockneten Schicht auf gleiche Weise unter Verwendung dieser Einrichtungen eingestellt werden.

Die erfindungsgemäße biologische Reaktionsschicht besitzt eine glatte Oberfläche und eine erhöhte Porosität, und eine Flüssigkeitsprobe, die gemäß einem Verfahren, wie einem Ausbreiten (Auftragen eines Fleckens), auf die Oberfläche aufgebracht wird, wird im Inneren der Schicht innerhalb kurzer Zeit einheitlich verteilt. Die poröse Struktur, die das faserförmige Material der biologischen Reaktionsschicht gemäß der Erfindung enthält und sich von den bekannten blattförmigen biologischen Reaktionsschichten unterscheidet, besitzt eine hohe Porosität, und die biologi-. sehe Reaktionsschicht nach der Erfindung kann eine große Menge an Flüssigkeitsprobe während der Zugabe und Verteilung der flüssigen Probe aufnehmen. Durch die erfindungsge-5 mäße biologische Reaktionsschicht werden die vorerwähnten Nachteile nach dem Stand der Technik beseitigt, d.h. sowohl die schnelle Verteilung der Flüssigkeit als auch die Retention einer großen Menge an Flüssigkeit während längerer Zeit werden durch die vorliegende Erfindung ermöglicht.

Aus den obigen Gründen ist die erfindungsgemäße biologische Reaktionsschicht als Reaktionsschicht eines analytischen Elements für den Immunoassay von Wert, bei dem eine schnelle Verteilung der Flüssigkeit und die Retention einer großen Menge an Flüssigkeit während längerer Zeit besonders erwünscht sind.

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Die erfindungsgemäßo biologische Reaktionsschicht kann als solche in einem analytischen Element verwendet werden. Sie wird jedoch bevorzugt in Form eines analytischen Elements mit mehreren Schichten verwendet, das eine laminierte Struktür einer Vielzahl von Schichten aufweist, so daß die Genauigkeit der Analyse erhöht wird.

Was den Immunoassay betrifft, so kann ein analytisches Element mit mehreren Schichten der folgenden Struktur verwendet werden: eine Schichtstruktur, die in folgender Reihenfolge aufweist:

(a) eine biologische Reaktionsschicht gemäß der Erfindung, in der das teilchenförmige Material eine bestimmte Menge eines Proteins enthält, welches spezifisch an einen daran fixierten Analyten gebunden werden kann, einheitlich in einer porösen Struktur aus Glasfasern in einem bestimmten Verhältnis dispergiert ist; und

(b) ein poröses ausgestrichenes Blatt (Schicht), welches eine bestimmte Menge eines mit einem fluoreszierenden Mittel markierten Analyten oder Analytanalogen davon innerhalb einer Matrix aus faserförmigem Material oder nichtfaserformigem Material aufweist.

Wenn die erfindungsgemäße biologische Reaktionsschicht in einem analytischen Element mit mehreren Schichten für eine enzymatische Reaktion verwendet wird, kann die folgende Struktur verwendet werden:

eine Struktur, welche eine ausgestrichene Schicht aufweist, die in den JA-OS'en 49(1974)-53888, 55(1980)-90859, 55(1980)-164356 etc. beschrieben wird, eine biologische Reaktionsschicht (Enzym oder Substrat, welches eine Gruppe aufweist, die einen Farbstoff bildet, oder welches eine daran fixierte Kupplergruppe aufweist) und eine Reaktionsschicht, die eine Farbe bildet, oder

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eine Struktur, die eine Lichtabschirmschicht zusätzlich zu der oben erwähnten Struktur besitzt.

Das analytische Element aus mehreren Schichten, das die oben erwähnten Strukturen aufweist, ist als analytisches Element für verschiedene Zwecke und in Form verschiedener Strukturen bekannt. Dementsprechend kann die erfindungsgemäße biologische Reaktionsschicht auch zu beliebigen Strukturen verarbeitet werden und für verschiedene Zwecke eingesetzt werden.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

BEISPIELE

1-1 Herstellung einer Agarose, die darauf einen Antithyroxin-(anti-T.)-Antikörper trägt

Zu 0,2 ml gesättigter wäßriger Ammoniumsulfatlösung gibt man 0,3 ml Antithyroxinantiserum und mischt unter Eiskühlung. Das entstehende Gemisch wird 10 min stehen gelassen, wobei man einen Niederschlag erhält. Dieser wird dann einer Zentrifugentrennung (3000 Upm, 10 min) unterworfen, und man erhält eine IgG-Fraktion des Anti-T.-Antikörpers.

15 g CNBr-aktivierte Sepharose 4B (hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals) werden mit 100 ml Wasser angequollen und auf einem Glasfilter mit 2 110 Chlorwasserstoffsäure 0 gewaschen.

Die Anti-T₄-Antikörper-IgG-Fraktion wird in 30 ml 0,1 M Bicarbonatpufforlösung (pH 8,5, 0,5 M Natriumchlorid waren enthalten) gelöst, und die Fraktion wird zu der gewaschenen 5 CNBr-aktivierten Sepharose 4B zugegeben. Das entstehende Gemisch wird bei 4⁰C 16 h lang gehalten, damit die Reaktion

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abläuft. Nach Beendigung der Reaktion wird das Reaktionslösungsmittel auf einem Glasfilter entfernt. Danach werden 50 ml 1 M Ethanolamin (mit auf 8 bis 8,5 eingestelltem pH-Wert mit Chlorwasserstoffsäure) zugegeben, und das Gemisch wird bei 4⁰C während 2 bis 5 h gehalten, damit die Reaktion abläuft. Das Reaktionsgemisch wird auf einem Glasfilter dreimal alternativ mit 0,1 M Essigsäurepufferlösung (pH 4,0,

1 M Natriumchlorid waren enthalten) und 0,1 M Borsäurepufferlösung (pH 8,0, 1 M Natriumchlorid waren enthalten) gewaschen. Nach Beendigung des Waschens wird das Produkt in 0,1 M Glycinpufferlösung (pH 9,0, 0,1 M Natriumchlorid und 0,1% Natriumazid waren enthalten) bei 4⁰C konserviert.

1-2 Herstellung einer Reaktionsschicht für die Messung bzw. Bestimmung von Thyroxin

2 g Glasfaserfilterpapier GA-100 (hergestellt von Toyo Filter Paper Co. Ltd., Japan) werden in Stücke von ungefähr

3 mm χ 3 mm geschnitten und in 400 ml Wasser mit einer Homogenisierungsvorrichtung (hergestellt von Nippon Seiki Co., Ltd., Japan) bei 15 000 Upm während 10 min dispergiert. Die Dispersion wird alternativ durch ein Sieb aus rostfreiem Stahl von 2 mm χ 2 mm und 1 mm χ 1 mm gegeben, und man erhält somit Glasfasern entsprechend einer lichten tiaschenweite von 1 mm χ 1 mm, welche in 500 ml 0,1 M Glycinpufferlösung (pH 9,0, 0,5 M Natriumchlorid waren enthalten) dispergiert werden. Ein bestimmtes Volumen dieser Dispersion wird herausgenommen und auf ein Filter filtriert, welches von Millipore Corporation hergestellt wurde, wobei die Glasfasern 0 mit der Länge, die dem Filter entspricht, erhalten werden. Das verbleibende Wasser wird gesammelt und getrocknet, und das Gewicht wird bestimmt, um die Glasfaserkonzentration in der Dispersion (mg/ml) festzustellen.

Ein bestimmtes Volumen der Glasfaserdispersion wird entnommen, so daß 30 mg Glasfasern in der entnommenen Dispersion

BAO ORIQfNAL

vorhanden sind- Zu dieser Dispersion gibt man 0,45 ml der Sepharose 4B mit fixiertem Anti-T,-Antikörper, hergestellt gemäß Absatz 1-1. Das entstehende Gemisch wird in einer Filtriervorrichtung, hergestellt von Millipore Corporation (Filter: HAWP, Porengröße 0,45 um, Durchmesser 47 mm), unter Bildung eines voluminösen Papiers ausgestrichen. Das so hergestellte voluminöse Papier wird zusammen mit dem verwen deten Filter auf eine Glasplatte gebracht und mittels Abstandshaltern mit einer Dicke von 500 μΐη zur Einstellung der Dicke zwischen zwei Glasplatten ausgebreitet. Das Papier wird dann, so wie es ist, gefroren, und die Glasplatten werden entfernt, und das Papier wird gefriergetrocknet.

1-3 Bewertung der Reaktionsschicht für die Messung bzw. Be-Stimmung von Antithyroxin

Zehn Stücke von 8 mm χ 8 mm Roaktionsschichten werden aus einer Reaktionsschicht (Durchmesser 36 mm), hergestellt gemäß Absatz 1-2, geschnitten, und diese werden als Proben Üer Gruppe A bezeichnet. Eine Reaktionsschicht wird auf gleiche Weise, wie in Absatz 1-2 beschrieben, hergestellt, ausgenommen, daß die Sepharose 4B mit dem daran fixierten Anti-T.-Antikörper durch eine einfache Probe aus Sepharose 4B ersetzt wird, und Stücke von 8 mm χ 8 mm werden auf gleiehe Weise geschnitten, und diese werden als Proben der Gruppe B bezeichnet.

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I-markiertes T., hergestellt von New England Nuclear Corporation, wird mit 0,1 M Barbitalpufferlösung (welche 0,1% 0 BSA, Rinderserumalbumin, enthält, pH 8,6) verdünnt, wobei man eine Lösung von 15 000 cpm pro 100 μΐ enthält.

Die Proben der Gruppe A und der Gruppe B werden getrennt

1 25 auf ein Teflonblatt gegeben. 100 μΐ der verdünnten I-5 markierten T.-Lösung werden auf jedes Stück gegossen, und dann läßt man die Reaktion bei 4⁰C während 2 Stunden ablau-

BAu ORiQWAL

fen. Jede Probe wird dann auf ο Ln Mikrofliter zur Entfernung der Flüssigkeit gegeben und mit 100 μΐ 0,1 M Barbitalpuff erlösung (pH 8,6) dreimal gewaschen. Nach Beendigung des Waschens wird die Probe in ein kleines Reagenzglas gegeben, und die Radioaktivität wird bestimmt.

Die Proben der Gruppe Λ ergeben Werte von 11552 *_ 232 cpm, und die Proben der Gruppe B ergeben Werte von 29J <· 50 cpm. Diese Werte zeigen, daß die Reaktionsschichten, die gemäß Absatz 1-2 hergestellt wurden, nämlich die Proben der Gruppe A, eine sehr einheitliche Reaktivität aufweisen.

Zehn Stücke von 8 mm χ 8 mm werden aus den fünf Reaktionsschichten, hergestellt gemäß Absatz 1-2, geschnitten. Drei Stücke werden von jeder Schicht ausgewählt, und man erhält insgesamt 15 Proben, die als Proben der Gruppe C bezeichnet werden.

Bei den Proben der Gruppe C wird die Reaktivität gegenüber

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I-markiertem T. bei den gleichen Bedingungen, wie oben beschrieben, bestimmt, und man erhält Werte von 11703 _^ cpm. Aus diesem Ergebnis folgt, daß das in Absatz 1-2 beschriebene Verfahren sehr gut reproduzierbar ist.

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Claims

KRAUS &

PATENTANWÄLTE

UND ZUGELASSENE VERTRETER VOR DEM EUROPÄISCHEN PATENTAMT

DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-IN S. ANN EKÄTE WEISERT DIPL-INQ. FACHRICHTUNG CHEI IRMGARDSTRASSE 15 ■ D-BOOO MÜNCHEN 71 · TELEFON Ο89/797Ο 77-79 7O 78 · TELEX Ο5-212 15 6 kp

TELEGRAMM KRAUSPATENT

4234 AW/an

FUJI PHOTO FILM CO., LTD.
Minami-ashigara-shi, Japan

Biologische Reaktionsschicht und ein Verfahren zu

ihrer Herstellung

PATENTANSPRÜCHE

1/ Biologische Reaktionsschicht eines trockenen analytischen Elements in Form einer porösen Verbundschicht, in der ein teilchenförmiges Material, welches ein biologisch aktives Material, das daran fixiert ist, trägt, in einer faserförmigen porösen Matrix dispergiert ist, dadurch gekennzeichnet , daß das Verhältnis der Trockengewichte des teilchenförmigen Materials zu dem in der porösen Verbundschicht enthaltenen faserförmigen Material im Bereich von 1 : 20 bis 1 : 0,3 liegt und daß das teilchenförmige Material in einer Menge im Bereich von 1 bis 60 g/m² darin enthalten ist.
2. Biologische Reaktionsschicht nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß die biologische Reaktionsschicht gemäß einem Papierherstellungsverfahren hergestellt worden ist, bei dem eine das teilchenförmige Material und
das faserförmige Material enthaltende Aufschlämmung verwen-

det wurde, in der das Verhältnis der Trockengewichte des teilchenförmigen Materials zu dem des faserförmigen Materials im Bereich von 1 : 20 bis 1 : 0,3 liegt, wobei auf solche Weise vorgegangen worden ist, daß das teilchenförmige Material in der biologischen Reaktionsschicht in einer Menge im Bereich von 1 bis 60 g/m² vorhanden ist.
3. Biologische Reaktionsschicht nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , daß das teilchenförmige Material in Form von Stäbchen vorliegt, bei denen das Verhält nis der kleineren Achse zu der größeren Achse im Bereich von 1 : 1 bis 1 : 20 liegt.
4. Biologische Reaktionsschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß der mittlere Durchmesser des teilchenförmigen Materials im Bereich von 10 bis 200 μπ\ liegt.
5. Biologische Reaktionsschicht nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dicke und Länge des faserförmigen Materials im Bereich von 0,1 bis 5 \xm bzw. von 500 bis 4000 um liegt.
6. Biologische Reaktionsschicht nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß die Dicke der porösen Verbundschicht im Bereich von 100 bis 2000 um liegt.
7. Verfahren zur Herstellung einer biologischen Reaktions-0 schicht, dadurch gekennzeichnet , daß man die Dicke einer nassen Schicht aus einem Gemisch, welches ein teilchenförmiges Material, das ein biologisch aktives Material darauf fixiert trägt, faserförmiges Material und ein flüssiges Dispersionsmedium enthält, wobei das Verhältnis des Trockengewichts des teilchenförmigen Materials zu dem des faserförmigen Materials im Bereich von 1 : 20 bis

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1 : 0,3 liegt und worin das teilchenförmige Material in einer Menge von 1 bis 60 g/m² enthalten ist, mittels einer Einrichtung oder Einrichtungen mit vorbestimmtem Abstand einstellt; und die Schicht unter Bildung der porösen Verbundschicht so trocknet, daß die vorbestimmte Dicke im wesentlichen nicht verändert wird.
8. Verfahren zur Herstellung einer biologischen Reaktionsschicht nach Anspruch 7, dadurch g e k e η η zeichnet, daß das Trocknen durch Gefriertrocknen erfolgt.
9. Verfahren zur Herstellung einer biologischen Reaktionsschicht nach Anspruch 7 oder 8, dadurch g e k e η η zeichnet, daß die Dicke der porösen Verbundschicht im Bereich von 100 bis 2000 um liegt.
10. Verfahren zur Herstellung einer biologischen Reaktionsschicht, dadurch gekennzeichnet , daß man eine nasse Schicht aus einem Gemisch, welches teilchenförmiges Material, das darauf fixiert ein biologisch aktives Material trägt, faserförmiges Material und ein flüssiges Dispersionsmedium enthält, trocknet, wobei das Verhältnis des Trockengewichts des teilchenförmigen Materials zu dem des faserförmigen Materials im Bereich von 1 : 20 bis 1 : 0,3 liegt und das teilchenförmige Material in einer Mengen von 1 bis 60 g/m² enthalten ist; und die Dicke der Schicht mittels einer Einrichtung oder Einrichtungen mit vorbestimmtem Abstand unter Bildung einer porösen Verbundschicht einstellt.
11. Verfahren zur Herstellung einer biologischen Reaktionsschicht nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet , daß das Trocknen durch Gefriertrocknen erfolgt.

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12. Verfahren zur Herstellung einer biologischen Reaktionsschicht nach Anspruch 10 oder 11, dadurch g e k e η η zeichnet , daß die Dicke der porösen Verbundschicht im Bereich von 100 bis 2000 um liegt.

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