DE3645090C2 - - Google Patents

Description

Die Erfindung betrift das im Anspruch 1 angegebene Verfahren zur Herstellung einer porösen Festphase. Die Ansprüche 2 und 4 betreffen Ausge­ staltungen dieses Verfahrens. Die Erfindung betrifft gemäß Anspruch 3 die Verwendung von derart hergestellten porösen Festphasen.

Es sind poröse Festphasen, an die Bindungspartner von bioaffinen Bindungssystemen gebunden sind, in ei­ ner Vielzahl bekannt, wobei die Bindungspartner Enzy­ me, Lectine, Antigene, Antikörper oder Partner anderer bioaffiner Systeme sind.

Beispielsweise sind poröse Festphasen mit bioaffinen Bindungspartner in EPA 00 63 810 und in USP 43 66 241 beschrieben, bei denen die Bindungspartner adsorptiv oder kovalent mit dem Material der porösen Festpha­ sen verbunden sind.

Weiterhin gibt es poröse Festphasen, die bioaffine Bindungspartner enthalten, bei denen Latexpartikel, an die Bindungspartner gekuppelt sind, in Filmschichten inkorporiert sind (EPA 97 952 und DE-OS 33 29 728).

Aus der DE 33 43 695 A1 ist ein Verfahren zur Herstellung einer biologischen Reaktionsschicht in Form einer porösen Verbundschicht bekannt, wobei ein Gemisch aus teilchen­ förmigem Material, das ein darin fixiertes biologisch aktives Material trägt und einem faserförmigen Material ausgeformt wird und das Dispersionsmedium z. B. durch Trocknen entfernt wird.

Es wurde überraschenderweise gefunden, daß das Einbringen von Partikeln, an die ein oder mehrere verschiedene bio­ affine Bindungspartner gekuppelt sind, in ein vorgeformtes poröses Material möglich ist in einer Weise, daß die Par­ tikel in diesen Materialien fixiert werden.

Gegenstand der Erfindung ist nun ein Verfahren zur Herstel­ lung einer porösen Festphase enthaltend einen oder mehrere bioaffine Bindungspartner, dadurch gekennzeichnet, daß man in ein vorgeformtes poröses Material eine Dispersion oder Suspension von Partikeln an die ein oder mehrere bioaffine Bindungspartner gebunden sind durch Auftragen oder Eintau­ chen einbringt und anschließend das Dispergierungs- oder Suspendierungsmittel entfernt.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin die Verwendung einer solchen bioaffinen Festphase in Vorrichtungen zur Abtrennung und zum Nachweis des entsprechenden bioaffinen Bindungspart­ ners in gelöster Form.

Das poröse Material kann in verschiedenen Formen ausgebildet sein. Beispielhaft sind Kugeln, Zylinder und flächenförmige Gebilde, wie Membranen.

Die porösen Strukturen können erzeugt werden durch Verschäumen oder durch Ausfällen mittels eines Fällbades von Lösungen oder Dispersionen syntheti­ scher oder halbsynthetischer sowie natürlicher Polyme­ re oder durch Verdunsten des Lösungsmittels aus Lö­ sungen von membranbildenden Polymeren, hergestellt aus den im folgenden genannten Polymeren.

Für die Herstellung der porösen Festphasen für dia­ gnostische Mittel werden Zellulose oder Zellulosederivaten sowie Mem­ branen aus Zellulosederivaten aus Polyamiden bevor­ zugt.

Die Partikel können Latexpartikel sein, die ganz aus einem harten Polymeren oder im Kern aus einem harten Polymeren bestehen. Beispiele für solche Polymere sind durch Suspensions- oder Emulsionspolymerisation her­ stellbare Polymere wie Polystyrole oder Polyacrylate.

Bevorzugt sind Latices, die einen Kern-Schale-Auf­ bau mit hydrophiler Schale haben.

An der Oberfläche der Latices sind die bioaffinen Bindungspartner adsorptiv oder bevorzugt kovalent ge­ bunden, wobei die Bindungspartner Rezeptoren, Lecti­ ne, Protein A von Staphylococcus aureus, Protein G von Streptococcus, Antigene, Haptene, Antikörper, Enzyme oder deren Inhibitoren sein können.

Die Partikel können auch aus stabilisierten Zellen oder Zellfragmenten bestehen.

Bevorzugt tragen solche Zellen oder Fragmente zu spezifischer Bindung befähigte Komponente wie etwa Rezeptoren, die Antikörper für den Fe-Teil binden, da­ von beispielsweise Protein A von Staph. aureus oder Protein G von Streptococcus der Gruppe C oder G, Lectine, Antigene, Haptene, Antikörper sowie über Protein A gebundene Antikörper, Enzyme oder deren Inhibitoren. Besonders bevorzugt sind ganze Zellen oder Membranfragmente von Staph. aureus, Stamm COWAN I, an die Antikörper gebunden sind wie von S. W. Kessler (J. Immunol. 1975, 115, 1617-1624) be­ schrieben.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann ausgeführt werden, indem man Dispersionen und Suspensionen der Partikel auf die vorbeschriebenen porösen Materialien aufträgt oder durch Eintauchen einbringt und anschlie­ ßend die dabei eingebrachte Flüssigkeit durch Verdun­ sten entfernt. Die Abstimmung von Poren- und Partikel­ größe sowie Partikelmenge und Volumen der porösen Matrix erfolgt so, daß die für den jeweiligen Testaufbau erforderliche Flüssigkeitsströmung in der Matrix nicht behindert wird.

Bei Membranen werden Porengrößen von 0,1-12 µ und Partikelgrößen von 0,01-1 µ bevorzugt. Die aufge­ brachten Partikeldispersionen oder Suspensionen ha­ ben eine Konzentration von 1-100 g/l. Das Aufgeben der Suspension auf den Träger kann durch Auftropfen, Aufpipettieren oder mit Hilfe von Pumpen und Kanülen punkt- oder strichförmig erfolgen. Das Trocknen kann durch Liegenlassen an der Luft, Überblasen von Luft bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur in offenen oder geschlossenen Systemen bei Normaldruck oder im Vakuum erfolgen. Die Trocknungsbedingungen, insbe­ sondere die erlaubte Thermobelastung werden durch die Stabilität der aktiven am Partikel gekoppelten Kom­ ponente bestimmt.

Die erfindungsgemäß hergestellten Festphasen kön­ nen verwendet werden als biologisch aktive Festphasen wie etwa Enzym-, Antikörper-, Antigen- oder Hapten- Festphasen. Diese werden bevorzugt in diagnostischen Testelementen mit nebeneinander-, übereinander- oder gemischt neben- und übereinanderliegenden Zonen ein­ gesetzt.

In den folgenden Beispielen wird die Herstellung von Latex- und zellulären Festphasen sowie deren Verwen­ dung in diagnostischen Testelementen mit nebeneinan­ derliegenden Funktionszonen gezeigt. Die Festphasen sind dabei sowohl Enzym- als Antikörper-Festphasen.

Die Beispiele sind keineswegs als limitierend zu be­ trachten, sondern dienen lediglich der weiteren Erläute­ rung des Erfindungsgegenstandes.

Beispiel 1 Glucoseoxidase enthaltende poröse Festphase

3 ml einer Dispersion, enthaltend 50 g/l Latex mit Acetalgruppen, hergestellt wie in Beispiel 2b von EPA 00 80 614 beschrieben, wurden mit wäßrigen Lösungen von 300 µl 1 normaler HCl und von 300 µl 200 g/l ®Twe­ en 20 eine Stunde bei 20°C inkubiert. Es wurde dann durch Zugabe von 250 µl 1 normaler NaOH und gesät­ tigter Lösung von Na₂HPO₄ ein pH von 6,5 eingestellt. Anschließend wurden 1,5 ml einer Lösung von 1 g/l Glu­ coseoxidase mit einer Aktivität von 250 U/mg in phosphat-gepufferter physiologischer Kochsalzlösung, pH 7,2 (PBS) und 1,5 ml einer Lösung von 5 g/l Natrium­ cyanoborhydrid in PBS zugegeben und 15 h bei 4°C belassen. Dann wurden 1,2 ml 0,5 mol/l Äthanolamin, eingestellt auf pH 8,5 mit HCl und 0,3 ml einer Lösung von 25 g/l Natriumborhydrid zugegeben und das Ge­ misch eine weitere Stunde bei 4°C belassen. Nach Zen­ trifugation wurde das Sediment mit 2 g/l ®Tween 20 in PBS resuspendiert, wobei ein Volumen von 15 ml der Dispersion von Latex-Glucoseoxidase Konjugat erhal­ ten wurde.

Streifen von Membranen aus Zellulosemischester wurden mit 10 µl/cm² der Dispersion von Latex-Glucoseoxidase Konjugat getränkt und anschlie­ ßend bei 20-50°C getrocknet.

Beispiel 2 Antikörper gegen humanes Myoglobin enthaltende poröse Festphase

2.1 ein Konjugat von Latex und Kaninchen IgG mit Antikörpern gegen humanes Myoglobin wurde hergestellt, indem gemäß Beispiel 1 verfahren wur­ de, mit der Veränderung, daß anstelle der Lösung von Glucoseoxidase 1,5 ml einer Lösung von 0,2 mg/ml Kaninchen IgG mit Antikörpern gegen humanes Myoglobin verwandt wurde. Poröse Fest­ phasen wurden hergestellt, wie in Beispiel 1 be­ schrieben.

2.2 Ein Konjugat von Zellen von Staphylococcus aureus (Stamm COWAN I) und Antikörper gegen humanes Myglobon wurde wie folgt hergestellt:

Zu 50 ml einer 100 g/l Suspension von Staphylococ­ cus aureus-Zellen in einer 9 g/l Natriumchlorid ent­ haltenden 0,05 mol/l wäßrigen Natriumphosphat­ pufferlösung vom pH 7,4 wurden 16 ml einer Lö­ sung von 2 g/l IgG vom Kaninchen, das Antikörper gegen humanes Myoglobin enthält, gegeben. Die Suspension wurde eine Stunde gerührt. Anschlie­ ßend wurden die mit Antikörpern beladenen Zellen durch Zentrifugieren und Dekantieren vom Über­ stand abgetrennt. Die Zellen wurden in 45 ml des obengenannten Puffers resuspendiert und zur ko­ valenten Bindung des Antikörpers an den Zellen unter ständigem Rühren mit 50 ml einer Lösung von 2 g/l Glutardialdehyd in obengenanntem Puf­ fer und nach einstündigem Rühren mit 50 ml einer Lösung von 50 g/l Natriumsulfit in dem obenge­ nannten Puffer versetzt.

Nach einer weiteren Stunde Rühren wurden die Zellen durch Zentrifugieren und Dekantieren vom Überstand abgetrennt. Die Zellen wurden gewa­ schen, indem sie in 200 ml 0,05 mol/l wäßrigen Na­ triumphosphatpuffer von pH 7,4 resuspendiert wurden und durch Zentrifugieren und Dekantieren vom Waschpuffer abgetrennt wurden.

Die Festphasen wurden hergestellt, indem die so behandelten Zellen in PBS zu 20 g/l resuspendiert und wie in Beispiel 1 aufgetragen und eingetrocknet wurden.

Claims (4)

1. Verfahren zur Herstellung einer porösen Festphase enthaltend einen oder mehrere bioaffine Bindungs­ partner, dadurch gekennzeichnet, daß man in ein vorgeformtes poröses Material ausgenommen aus porösen Fasern bestehendes Material, eine Dispersion oder Suspension von Partikeln, an die ein oder mehrere bioaffine Bindungspartner gebunden sind, durch Auftragen oder Eintauchen einbringt und anschließend das Dispergierungs- oder Suspendie­ rungsmittel entfernt.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeich­ net, daß die Partikel eine Größe von 0,01 bis 1 µm und die Poren eine Größe von 0,1 -12 µm haben.

3. Verwendung einer gemäß dem Verfahren nach An­ spruch 1 hergestellten bioaffinen Festphase in Vorrichtungen zur Abtrennung und zum Nachweis des entsprechenden bioaffinen Bindungspartners in gelöster Form.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeich­ net, daß die Partikel Latexpartikel sind, die bevorzugterweise ganz aus einem harten Polymeren oder im Kern aus einem harten Polymeren bestehen.