DE2912173A1

DE2912173A1 - Reaktor/separator-vorrichtung

Info

Publication number: DE2912173A1
Application number: DE19792912173
Authority: DE
Inventors: Peter Rocco Farina; Kathy Plamer Ordonez; Iris Johnston Siewers
Original assignee: Union Carbide Corp
Current assignee: Union Carbide Corp
Priority date: 1978-03-31
Filing date: 1979-03-28
Publication date: 1979-10-04
Also published as: CA1134172A; AU529435B2; US4244694A; CH631016A5; AU4564479A; JPS54154397A; DE2912173C2; GB2017910A; SE7902859L; GB2017910B; JPS5918663B2; FR2421382A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reaktor/Separator-Vorrichtung zur Verwendung in der automatisierten Festphasen-Immunoanalyse. Weiterhin ist die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zur Durchführung von Radioimmunoanalysen gerichtet, wobei eine Säule verwendet wird, die eine Scheibe enthält, die für Flüssigkeiten bei niedrigen Drücken undurchlässig ist, jedoch für Flüssigkeiten bei höheren Drücken in einem Zentrifugalfeld durchlässig i'st.

Die Einführung der Radioimmunoanalyse (RIA) im Jahre 1959 durch Yalow und Berson (Nature, 184, 1648, 1959) als eine diagnostische Indikatonnethode (tracer technique) zum Ersatz der damals verwendeten langsamen bioanalytischen Methoden hat infolge ihrer Spezifität und extremen Empfindlichkeit viele Gebiete der klinischen Prüfung und Forschung revolutioniert.

Die RIA-Technik basiert auf der Fähigkeit eines Antikörpers und eines spezifischen Antigens, einen reversiblen Antigen-Antikörper-Kornplex zu bilden. Die Analyse wird durchgeführt, indem eine bestimmte Menge eines radiomarkierten Antigens zu Proben hinzugegeben wird, die Antiserum und bekannte Mengen eines."Standards-Antigens enthalten. Während der Inkubation konkurrieren radiomarkiertes Antigen und nicht markiertes Antigen um eine begrenzte Zahl von Bindungsstellen an dem Antikörper. Nach der Inkubation wird das an den Antikörper gebundene Antigen vom freien Antigen abgetrennt und das Verhältnis des freien zum gebundenen kann in eine Dosis-Empfindlichkeitskurve (doseresponse curve) eingetragen werden. Eine unbekannte Serumprobe kann dann nach dem gleichen Verfahren gemessen werden und die Konzentration des Antigens durch Vergleich mit der Standard-Dosis-Empfindlichkeitskurve bestimmt werden.

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Häufig sind die klassischen RIA-Methoden mühsam, zeitraubend und enthalten Fehler verursachende Schritte, da sie vielfache Pipettierungen und Teströhrchen, doppelte Analysen, verlängerte Inkubationszeiten und schwierige, ineffiziente Trennungsverfahren erfordern.

Vor dem Zeitpunkt der vorliegoüen Anmeldung gab es im bekannten Stand der Technik verschiedene Vorrichtungen zur Durchführung der Sättigungsanalyse. Beispielsweise beschreibt die US-PS 3 918 909 eine Vorrichtung, die ein röhrenförmiges Bauteil enthält, das an beiden Enden offen ist und am oberen Ende eine Reaktionskammer enthält. Ein hydrophobes Filter befindet sich am Boden der Reaktionskammer und ist oberhalb einer Abscheidungskammer gelegen. Bei der Durchführung der Analyse werden die Reaktanten vermischt und in der oberen Kammer inkubiert, und dann durch das Filter durch Schütteln oder Anlegen einer Druckdifferenz zwischen der oberen und unteren Kammer in die untere Kammer überführt. In der unteren Kammer trennt das Trennmittel eine radioaktive Substanz, die an einem konkurrierenden Bindemittel gebunden ist, von deren nicht gebundener Form. Im Gegensatz zu der vorliegenden Erfindung ist die Vorrichtung nicht direkt auf die automatisierte Festphasen-Immunoanalyse anwendbar und sie verwendet auch keine Zentrifugalkräfte. Weiterhin werden die Reaktion und die Abtrennung in verschiedenen Kammern durchgeführt.

Die US-PS 3 961 894 und die US-PS 4 039 652 beschreiben eine Methode zur Bestimmung von Substanzen in Flüssigkeitsproben unter Verwendung einer Vorrichtung, die aus einer Säule besteht, die eine unlösliche poröse Matrix enthält, in der sich immobilisierte Bindungspartner für die zu analysierenden Substanzen befinden.

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Die Vorrichtung ist ein zylindrischer Körper mit einer bestimmten Gestalt, die an einem Ende in einer sich verjüngenden Spitze ausläuft. Im unteren Teil der Säule befindet sich eine poröse Polyäthylenscheibe, die die Matrix stützt. In der US-PS 4 039 ist ausgeführt, daß die Fließcharakteristiken der festen Phase vorzugsweise so sain sollen, daß sie unter dem Einfluß der Schwerkraft schwammähnliche FIuJ ^.-Retentionseigenschaften zeigen. Die in der Matrix zurückgehaltene Flüssigkeit kann dann durch Zugabe weiterer Flüssigkeit zu der Vorrichtung verdrängt werden. Wenn einmal eine Flüssigkeitsphase zu der festen Phase hinzugefügt worden ist und darin festgehalten wird, sind die Phasen in einem wirksamen Zustand der Inkubation, bis eine weitere Flüssigkeit, wie z.B. ein Puffer, hinzugefügt wird, um die festgehaltene Flüssigkeit zu verdrängen. Wenn auch diese Vorrichtungen geeignet sind zur Durchführung der Inkubation und Abtrennung in einer einzigenKammer, so verwenden sie doch keine wasserundurchlässige Scheibe oder Zentrifugalkomponenten.

Somit werden durch die Anwendung der vorliegenden Erfindung eines oder mehrere der folgenden Ziele erreicht. Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer Reaktor/Separator-Vorrichtung zur Verwendung in Immunoanalysensystemen. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer Vorrichtung zur Verwendung in analytischen Systemen, worin zum Mischen, Überführen und Abtrennen der Reaktanten Zentrifugalkräfte verwendet v/erden. Ein weiteres Ziel ist die Schaffung einer Reaktor/Separator-Vorrichtung, die an ihrem Boden mit einer wasserundurchlässigen Scheibe ausgerüstet ist. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung einer Vorrichtung zur Verwendung in automatisierten Festphasen-Radio-

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immunoanalysen, wobei die Reaktion und Abtrennung in der gleichen Kammer durchgeführt wird. Ein weiteres Ziel ist die Schaffung einer Vorrichtung, in der die wasserundurchlässige Rückhaltescheibe durch Steigerung der Zentrifugalkraft durchlässig gemacht wird. Ein weiteres Ziel ist die Schaffung einer Reaktor/ Separator-Vorrichtung, die sicher transportiert und gelagert werden kann, bis sie eingesetzt viird. Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Schaffung eines Verfahrens zur Durchführung von Immunoanalysen unter Verwendung der Separator/ Reaktor-Vorrichtungen. Diese und weitere Ziele werden dem Fachmann im Lichte der folgenden Offenbarung leicht offenbar.

Die Ziele und Gegenstände der Erfindung sowie ihre bevorzugten Ausfülirungsformen werden am besten unter Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen erläutert:

Fig. 1 "ist die Ansicht eines Querschnittes der erfindungsgemäßen Reaktor/Separator-Vorrichtung.

Fig. 2 ist die Ansicht eines Querschnittes, die von oben nach unten die aufeinanderfolgenden Reaktions-jlnkubations- und Abtrennungsfunktionen einer Reaktor/Separator-Vorrichtung zeigt, die an einem handelsüblichen Instrument zur Analyse flüssiger Materialien angebracht ist.

Fig. 1 zeigt unter weiterer Bezugnahme auf die Zeichnungen die Ansicht eines Querschnittes einer erfindungsgemäßen Reaktor/ Separator-Vorrichtung. Die Säule 10 kann aus nahezu jedem inerten Material bestehen, wie z.B. Glas, Plastik und dergleichen. Ein bevorzugtes Material ist Polystyrol, das durchscheinend hell ist und nicht leicht bricht. Die Säule 10 ist etwa 10 cm (4 inches) lang und hat einen äußeren Säulendurchmesser von

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etwa 10 mm (0,4 inches). Sie kann etwa 2,5 ml Flüssigkeit enthalten. Die Spitze 12 hat einen inneren Durchmesser von etwa 1 mm (0,04 inches) und der obere Vorratsbehälter 14 hat einen äußeren Durchmesser von etwa 20 mm (0,8 inches). Der Stopfen verschließt die Spitze der Säule. Die. Rückhaltescheibe 18 ist ein Filter, das für Flüssigkeiten bei atmosphärischen und niedrigen Zentrifugalkräften undurchlässig ist, jedoch bei hohen Zentrifugalkräften für Flüssigkeiten durchlässig ist. Die Reaktionskammer 20 enthält das immobilisierte Reagens und Inkubat.

Fig. 2 ist die Ansicht eines Querschnittes einer der Reaktor/ Separator-Säulen 10, die mit einer wasserundurchlässigen Filterscheibe 18 ausgerüstet sind und mit einer Menge eines immobilisierten Antiserums in einer trockenen Matrix 22 beschickt sind. Die Säulen, die das Reaktans enthalten, werden in Teströhrchen 24 gelagert, die der Reihe nach an ihrem äußeren Rand in Kugelsitzen 26 in einem Plastikring 28 aufgehängt sind. Die Serumproben und anderen Reagenzien 30 v/erden in die Ausnehmungen 32 und 34 einer Transferscheibe 36 gebracht, die der Reihe nach auf einem Drehtisch des Centria-Systems ' angebracht ist, und automatisch befestigt wird, so daß jede Ausnehmung mit der öffnung der entsprechenden Reaktor/Separator-Säule übereinstimmt. Dann wird ein Motor so in Betrieb genommen, daß durch die Beschleunigung der entstandenen Zentrifugalkraft alle Proben und Reagenzien gleichzeitig auf die Reaktor/Separator-Säule, die das immobilisierte Reaktanz 22 enthält, übertragen werden.

*)Handelsmarke für einen von der Union Carbide Corporation vertriebenen Apparat für die Immunoanalyse.

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In dem Fall, daß das immobilisierte Reaktans in einer dehydratisieren Matrix, wie z.B. Polyacrylamid, eingeschlossen ist, findet gleichzeitig mit der Reaktion eine schnelle Rehydratisierung statt. Nachdem eine geeignete Inkubationszeit verstrichen ist, wird der Motor auf eine höhere Geschwindigkeit beschleunigt, worauf ein geeignetes Eluierungsmittel 38 angewendet wird, das einen hinreichenden hydrostatischen Druck ausübt, so daß das wasserundurchlässige Filter nunmehr frei durchlässig wird. Dies wird erreicht, indem ein Strom einer geeigneten Flüssigkeit, z.B. Pufferlösung, aus einem Vorratsbehälter über eine nicht gezeigte Eluierungsmittelpumpe durch eine Leitung 40 und einen Verteiler in die Aushöhlungen 32 und 34 der sich rasch drehenden Transferscheibe geleitet wird. Die Pumpe be\7irkt eine bestimmte Fließrate des Eluierungsmittels über einen bestimmten Zeitraum und die gesamte Menge dos Eluierungsmittels wird automatisch durch die Verteiler auf der Scheibe -geteilt, die den Fluß in die Reaktor/Separatorsäule leiten. Alle Komponenten 42, die wasserlöslich und nicht an das immobilisierte Reaktans gebunden sind, laufen frei durch das Filter und werden in den Teströhrchen gesammelt. In dem Falo.e, daß eines der verwendeten Reagenzien radioaktiv ist, kann jedes Röhrchen von dem Trägerring entfernt werden und die Radioaktivität des Inhalts gemessen werden. Analysen, die die vorliegende Erfindung in Verbindung mit dem Centria-System verwenden, konnten in 7 Minuten durchgeführt werden. Dies erlaubt dem Benutzer die Durchführung kinetischer Festphasenanalysen (Nicht-Gleichgewichtsbedingungen) , was mit anderen konventionellen Methoden bisher extrem schwer war.

Die Erfindung betrifft eine Reaktor/Separator-Vorrichtung und dessen Verwendung in der automatisierten Festphasen-Immuno-Schnellanalyse. Die Vorrichtung besteht aus einer Kombination

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(a) einer Säule, die an beiden Enden offen ist,

(b) in der Säule angeordneten Binde- und Filtervorrichtungen, die bei annähernd atmosphärischem Druck für wässrige Lösungen undurchlässig sind, jedoch für wässrige Lösungen durcnlässig, wenn sie einerZentrifugalkraft ausgesetzt werden, und

(c) einer Reaktions- und Trennkammer, die oberhalb der Binde- und Filtervorrichtungen angeordnet ist, die eine Matrix für die Iiiunobilisierung zumindest eines Antigen-Antikörper-Systems enthalten.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung erlaubt, wenn sie in Verbindung mit analytischen Instrumenten verwendet wird, die Zentrifugalkraft anwenden, die Leistungsfähigkeit der Apparatur auf die automatisierte Festphasen-Immunoanalyse, Affinitätschromatographie und verschiedene Anwendungen auszudehnen, die auf dem Zusanmenbringen oder der Umsetzung von zwei oder mehr Substanzen und der nachfolgenden Abtrennung beruhen.

Mehrteilige (multistation) analytische Vorrichtungen, die ein Zentrifugalfeld verwenden, sind kürzlich für die schnelle Mikroanalyse einer großen Vielzahl von Flüssigkeiten, wie z.B. Körperflüssigkeiten, z.B. Blutserum, von Nahrungsmittelprodukten und dergl. verfügbar geworden. Ein solches Instrument, das für die automatisierte Radiοimmunoanalyse entwickelt wurde, wird beispielsweise durch die Union Carbide Corporation unter der Handelsmarke "Centria" vertrieben. Das Centria-System bietet verschiedene interessante Merkmale zur Durchführung von Iinmuno-

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analysen in gelöster Phase. Das System besteht aus:

a) einer automatischen Pipettiervorrichtung, die die Proben und Reagenzien verteilt,

b) dem .rccilüsselbauteil (key module),' einem Inkubator/Separator, in dem mtrifugalkraft verxi?endet wird, um gleichzeitig mehrfache radioanalytische Inkubationen und Trennoperationen zu initiieren und zu beenden, und

c) einem Gammazähler/Computer, der drei Teströhrchen gleichzeitig zählt und die Zählungen in Konzentrationseinheiten umwandelt.

Das Centria-System und dessen Verwendung ist in der US-PS 3 953 172 von S.I.Shapiro und G.Ertingshausen beschrieben. Wie in dieser Druckschrift angegeben ist, verwendet das System Adsorptionssäulen, um die zu analysierenden Komponenten voneinander zu trennen.

Wie bereits vorher erwähnt, besteht die Reaktor/Separator-Vorrichtung der vorliegenden Erfindung aus einer Säule, die mit einer wasserundurchlässigen Binde- und Filtervorrichtung ausgerüstet ist, die Reagenzien, wie immobilisierte Antisera,-Enzyme, Immunosorbenzien, Ionenaustauscher und dergl_o festhalten kann. Die Inhaltsbestandteile der Säule können miteinander in Kontakt gebracht werden durch Zentrifugalkraft oder manuelle Zugabe der eine wässrige Phase enthaltenden Reagenzien oder Reaktanten. Nach einer geeigneten Inkubationszeit wird eine Zentrifugalkraft auf die Säule ausgeübt, die die wässrige Phase, durch die Filtervorrichtung, die wasserdurchlässig gemacht ist, preßt. Bei dieser überführung wird die wasserunlösliche Phase von der löslichen Phase abgetrennt, von denen jede anschließend gesammelt und analysiert werden kann.

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BAD ORIGINAL .

In der Praxis ist die Binde- und Filtervorrichtung in Form einer Scheibe ausgeführt, die aus einer Vielzahl poröser Folien hergestellt sein kann. Solche Materialien können Polyäthylen, Polypropylen, Teflon oder ähnliches sein. Außerdem können anorganische Materialien, wie Glas und Keramik ebenso in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. In den Beispielen wird Polyäthylenfolie mit einer Dicke von etwa 1,6 mm (1/16 inch) und einer Porosität von 25 +, 3 Mikron verwendet. Es können Porositäten von etwa 25 bis etwa 150 und vorzugsweise von 25 bis 40 Mikron verwendet werden. Aus den Folien werden Scheiben von etwa 0,310 bis 0,316 (inches) äußerem Durchmesser geschnitten und Befestigungswerkzeug im tiefsten Abschnitt des Säulenrohrs befestigt.

Die Säule selbst kann aus nahezu jedem Material bestehen, z.B. Glas, Plastik und dergl.. Ein bevorzugtes Material ist Polystyrol, das durchscheinend, hell und beständig ist und das, falls erwünscht, zweckmäßig verwendet wird, um Antisera, Enzyme und Affinitätsliganden durch physikalische Adsorption oder kovalente Metiiodologien zu immobilisieren. Eine Säule, die zur Verwendung im Centria-System gedacht ist, hat eine Länge von etwa 100 mm (4 inches) und einen äußeren Rohrdurchmesser von etwa 10 mm (0,4 inches). Sie kann etwa 2,5 ml Flüssigkeit enthalten. Die Spitze hat einen äußeren Durchmesser von etwa 1 mm (0,04 inches) und der obere Vorratsbehälter einen äußeren Durchmesser von 20 mm (0,8 inches). Andere Säulen als die oben beschriebenen können leicht in kleinereroder größerer Ausführung hergestellt werden.

Wie bereits erwähnt, ist die Binde- und Filtervorrichtung bei atmosphärischem Druck für wässrige Lösungen undurchlässig. Sie ist ebenso bei niedrigen Drücken in einem Zentrifugalfeld für

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Lösungen undurchlässig. Somit ist es möglich, Proben und Reagenzien durch Zentrifugalkraft auf die Säule zu überführen und dort zu vermischen, ohne daß Flüssigkeit durch die Filterscheibe hin&urclitritt. Erst bei Steigerung der Zentrifugalkraft wird die Scheibe durchlässig.

Beispielsweise wurde gefunden, daß bei verwendung der Reaktor/ Separator-Vorrichtungen mit einer Transferseheibe des Centria-Systems mit einem Radius von 13 cm die Filterscheibe bei Geschwindigkeiten von 100 U/Min o'der weniger für Flüssigkeiten undurchlässig ist. daß sie jedoch bei der Zugabe von Eluierungsmitteln bei einer gesteigerten Geschwindigkeit von 200 U/Min oder mehr durchlässig wird. Die angewendete Zentrifugalkraft, die die Scheibe durchlässig macht, ist selbstverständlich eine Funktion der Geschwindigkeit des Instruments und der Entfernung der Vorrichtung vom Rotationszentrum.

Ein einzigartiges Merkmal des erfindungsgemäßen Reaktor/Separators ist, daß es auf νerschiedene nützliche Art und Weisen verwendet werden kann«, Beispielsweise kann die Vorrichtung als Reaktionskammer verwendet werden, wobei eine oder mehrere der Reaktanten, wie z.B. Antikörper, Enzyme, Proteine, Affinitätsliganden, Ionenaustauscher oder Zellen an den Wänden der Säule befestigt werden. Sie kann auch als Reaktionskammer verwendet werden, die eine oder mehrere immobilisierte Reaktanten in oder auf der Matrix oder dem Träger, wie z.B. Polyacrylamid, Sepharose, Agarose oder andere natürliche Materialien, synthetische Polymere, oder anorganische Materialien wie z.B. Glas oder Keramiken enthält. Die Matrix kann beispielsweise in Form eines dehydrati si erteil Gels, einer festen Matrix, Perlen oder Pulver ausgeführt sein. Zusätzlich kann sie als Reaktionskammer für

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Reaktionen unter Einschluß von Mikroorganismen, Viren, roten Blutkomponenten, Geweben und dergl. verwendet werden. Die Vorrichtung ist ebenfalls brauchbar als Reaktionskammer, wenn sich bei der Vermischung von zwei oder mehr Lösungen eine unlösliche Phase ergibt und von einer von ihnen darauf abfiltriert werden muß. Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann, sowohl für die Festphasen-Immunoanalyse von kurzer ^.Is auch von langer Dauer verwendet werden. Jedoch ist sie besonders vorteilhaft für Reaktionszeiten von sehr kurzer Dauer, d_th. weniger als 5 Minuten und insbesondere, wenn zwei Phasen schnell getrennt werden müssen. Gerade bei diesen kurzen Reaktionszeiten sind manuelle Methoden nicht schnell genug, um mehrfache Proben zu verarbeiten.

Die neue Reaktor/Separator-Vorrichtung kann zweckmäßig verwendet werden, um mit frei gebundenem Analyt aus Serumproteinen einen enzymatischen Vorbehandlungsschritt durchzuführen und gleichzeitig eine Immunoanalyse durchzuführen. Ein solches Verfahren kann auf folgende Weise durchgeführt werden: Der Reaktor/Separator wird vorzugsweise mit einem Teil von Antiserum beschickt, das von dehydratisiertem Polyacrylamid eingeschlossen ist, das Poren aufweist, die im hydratisierten Zustand genügend klein sind, um Enzyme oder Proteine mit mittlerem und niedrigem Molekulargewicht auszuschließen. Mit dem immobilisierten Antiserum ist eine genügende Menge eines proteolytischen Enzyms vermischt, das das Serumprotein, das das interessierende Analyt bindet, denaturieren oder hydrolysieren (hydrolyze) kann. Die Serumproben und Radiomarkierungen werden zentrifugal in den Reaktor/

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Separator überführt. Nach der Hydratation des Gels und Solubilisierung des Enzyms beginnen zwei Prozesse: die Freisetzung des proteingebundenen Analyts und dessen Diffusion und Bindung an das Antiserum in der Gelmatrix. Nach einer vorbestimmten Zeit wird die Elution des Enzyms, ungebundenen Analyts und der Radioin arkierung durchgeführt. Wenn andererseits das proteolytische Enzym in der wässrigen Lösung am stabilsten ist, kann der Vorbehandlungsschritt erfolgreich dadurch durchgeführt werden, daß das Enzym und die Serumproben in die inneren und äußeren Ausnehmungen auf der Transferscheibe gebracht werden. Wenn der Motor in Betrieb genommen wird, werden die Reagenzien gleichzeitig gemischt und in die Reaktor/Separator-Säule überführt, wo die Inkubation stattfindet.

Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäß hergestellten Reaktor/ Separator-Vorrichtungen ideal zur Anwendung mit dem Centria-System bei radioimmunoanalytischen Versuchen für das thyreoidstimulierende Hormon (TSH) geeignet sind. Der TSH-Test verwendet eine immunologische Reaktion, bei der markierte und nicht markierte TSH-Holeküle um die Bindungsstellen auf einem spezifischen Antikörpermolekül konkurrieren. Das Centria-System verwendet Zentrifugalkraft zur gleichzeitigen Vermischung der verschiedenen Reagenzien und zur Abtrennung des gebundenen und freien Antigens in den Säulen nach der Inkubation, die einen zweiten Antikörper auf den erfindungsgemäßen Festphasenträgern enthalten. Die Bindevorrichtung oder Scheibe am Boden der Säule hat eine solche Porosität und Zusammensetzung, daß die gesamte überführte Flüssigkeit in der Säule zur Absorption zurückbleibt. Nur nach Vergrößern der obigen Zentrifugalkraft, die zur Überführung der Flüssigkeiten von der Scheibe benötigt werden, kommt Flüssigkeit aus der Säule heraus.

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Die folgenden Beispiele sind lediglich Erläuterungen:

Beispiel 1

Wäßrige Standardkurve mit durch Polyacrylamid immobilisiertem Angiotensin-I-Antiserum

Trockenes von Polyacrylamid umhülltes Angiotensin I~Antiserum in einer Menge, die hinreicht, um etwa 50 % des markierten Antigens zu binden, wurde in eine Polystyrolsäule überführt, die am Boden mit einer wasserundurchlässigen Polyäthylenscheibe ausgerüstet war. Ein 100 ul Anteil des Angiotensins I-( I), verdünnt in Trisacetat-Puffer (0,1 M, pH 7,4, enthaltend 0,1 % Rinderserumalbumin), das etwa 20 000 cpm pro 100 ul ergab, wurde manuell in die äußere Aushöhlung der Centria-System-Transferscheibe pipettiert. Es wurden Standardlösungen von Angiotensin I hergestellt, die 100 bis 0 ng/ml in Trisacetat-Puffer enthielten und ein 300 pl Anteil jeder Standardkonzentration wurde doppelt in die entsprechenden äußeren Ausnehmungen der Transferscheibe pipettiert. Die Säulen, die das gelumhüllte Antiserum enthielten, wurden in Teströhrchen gegeben und gleichzeitig mit der Transferscheibe in den Inkubator/ Separator-Bauteil des Centria-Systems gegeben. Eine Zentrifugation auf dem System von 15 Sekunden Dauer überführte die 400 pl der Lösung in die Säulen.

Nach einer 15-minütigen Inkubation wurde eine Zentrifugation bei hoher Geschwindigkeit begonnen und 4 ml/Röhrchen Trisacetat-Puffer zu der Transferscheibe hinzugefügt, und eine schnelle gleichzeitige Elution des nicht gebundenen Tracers vom Gel begonnen. Die Elutionslösung, die das ungebundene Angiotensin I-(i) enthielt, wurde in Röhrchen unter jeder Säule gesam-

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melt und in dem Dreikammer (tri-well) Gammazählerbauteil des Centria-Systems gezählt. Die Säulen wurden ebenfalls gezählt, um die gebundene Fraktion zu bestimmen.

Die Ergebnisse wurden wie folgt berechnet:

B/m Zählungen in der Säule (gebunden) __

' Zählungen in der Säule (gebunden) + Zählungen,eluiert

% gebunden = B/T X 100 %

_Ώ/„ __ % gebunden,, ,jeder Standard «_____„ _»______>_>_„

' ο ⁼ % gebunden, wenn die Standard-Konzentration im Inkubal· = 0 ng/ml

Aus den Daten wurde eine Dosis-Empfindlichkeitskurve (doseresponse curve) gebildet und auf halblogarithmisehern Papier aufgetragen. Die nicht spezifische Bindung des Antigens am Gel und der Säule wurde durch Einschließen von normalem Kaninchenserum in der Polyacrylamidmatrix und Inkubation und EIution in ähnlicher Weise bestimmt. Es wurde gefunden, daß sie weniger als 4 % betrug.

Beispiel 2

Automatisierte Analyse für Cortisol unter Verwendung eines Wärme-Vorbehandlungsschrittes

Es wurden Cortisol-Standards hergestellt, indem zunächst Cortisol in 95 Soigem Äthanol und dann in 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4, 0,05 % Tween 20) verdünnt wurde. Diese Standards wurden nacheinander mit Serum verdünnt, das mit Kohle vorbehandelt worden war, um endogenes Cortisol, zu entfernen. Die klinischen Proben wurden mit den Standards auf Serumbasis mit einem

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Denaturationspuffer (90 % 0,1 M Natriumphosphat bei pH 7,4,. enthaltend 0,05 % Tween 20, 10 % Methanol) verdünnt und 30 Minuten auf 60° erhitzt, um das Cortisol bindende Globulin (CBG) zu zerstören.

Nach dem Wärmevorbehandlungsschritt wurden die Standards und Proben zusammen mit radioinarkier+em Cortisol und Puffer (0,1 M Natriumphosphat, enthaltend 0,05 % Tween 20 bei pH 7,4) auf die Transferscheibe des Centria-Systems mit einem Gesamtvolumen von 350 ul pipettiert. Der Inhalt der Scheibe wurde auf den Ring von Röhrchen übertragen, der die Säulen trug, die von Polyacrylamid umhülltes Cortisol-Antiserum enthielten. Nach der folgenden Inkubation von 15 Minuten wurde die nicht gebundene Fraktion von markiertem Cortisol durch Spülen mit 4 ml/Röhrchen Phosphat/Tween-Puffer wie oben gespült. Die Säulen und Röhrchen wurden im Dreilochzähler des Centria-Systems gezählt und die so erhaltenen Daten zur Aufstellung einer Standardkurve verwendet.

Die mit diesem Verfahren gemessenen klinischen Proben zeigten eine gute Näherung an die erwarteten Werte, insbesondere wenn sie mit Daten verglichen wurden, die durch Lösungsphasenanalyse mit dem gleichen Antiserum erhalten wurden.·

Beispiel 3

Automatisierte Analyse für Cortisol unter Verwendung eines proteolytischen Enzyms zur Zerstörung des CBG

Die Analyse wurde in der gleichen Weise wie in dem obigen Beispiel beschrieben, durchgeführt, außer daß der Wärmevorbehandlungsschritt und der Denaturationspuffer weggelassen xvurde. Die Inaktivierung des Cortisol bindenden Globulins fand in den Aushöhlungen der Transferscheibe statt, indem 150 ul einer

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Pepsinlösimg (4 mg/ml in 0,14 N HCl, 4100 Einheiten/mg), 50 pl Cortisol-Standard auf Serumbasis, 100 pl Tracer und 50 ul 0,1 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,4, 0,05 % Tween 20) etwa 5 Minuten vorkubiert wurden, bevor sie auf die Säulen gegeben wurden, die das Polyacrylamid umhüllte Cortisol-Antiserum enthielt.

Mit dieser Technik gemessene Kontrollsera stimmten mit den erwarteten Werten überein. Die Wiedergewinnung, der Parallelismus und Analyse der Studien der Proteinabhängigkeit gaben ebenfalls ausgezeichnete Ergebnisse.

Beispiel 4

SPRIA bei der Säulen-Reaktor/Separator-Entwicklung einer wässrigen Standardkurve für Cortisol .

Eine Polystyrolsäule wird vor der Einführung von 1 ml Cortisol-Antiserum, das mit 0,1 M Natriumphosphatpuffer bei pH 7,4 verdünnt wurde, mit einer porösen semipermeablen Scheibe aus Polyäthylen ausgerüstet. Nach ein- bis zweistündiger Inkubation mit der Antiserumlösung wurde die Säule von nicht absorbiertem Antiserum freigesaugt. Normale Salzlösung (1,5 ml) wird zu der Säule hinzugegeben und unmittelbar abgesaugt. Die Spülprozedur mit Salzlösung wird wiederholt, und die Säule dann mit 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA)-Salzlösung gefüllt. Nach einer kurzen Inkubation mit der BSA-Lösung (10-30 Minuten) wird die Säule freigesaugt und an der Luft getrocknet. Die Säule enthält an ihrer inneren Wand das immobilisierte Antiserum und kann unmittelbar für die Analyse von Cortisol verwendet werden oder kann unter WasserausSchluß bei Umgebungstemperatur gelagert werden und innerhalb 2 bis 3 Monaten verwendet werden.

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Eine Standardkurve für Cortisol wird entweder manuell oder mit Hilfe des Inkubator/Separators des Centria-Systems und dern Pipettierbauteil aufgestellt. Cortisol-( ^DJ.), Markierung, ""bekannte" Standardmengen von Cortisol und 0,1 M Natriumphosphat (pH 7>4)-Puffer werden mit einer Gesamtmenge von 1,0 rnl in die Aushöhlungen der Centria-Transferscheibe pipettiert. Die mit Antikörpar ausgekleideten Säulen werden in die Teströhr dien gesetzt und mit der Transferscheibe in den Inkubator/Separator-Bauteil des Centria-Systems gesetzt. Durch eine Zentrifugati on von 15 Sekunden werden die 1 ml Reaktionskomponenten zu den mit Antikörper überzogenen Säulen überführt, wo die statische Inkubation stattfindet. Nach 1 bis 2 Stunden werden die Säulen zentrifugiert, wobei 2 ml pro Röhrchen 0,1 M Natriumphosphatpuffer zugegeben wird, um die Säule frei von nicht gebundenem Tracer zu spülen. Der Puffer, der den nicht gebundenen Tracer trägt, wird in den Röhrchen, die die Säulen tragen, gesammelt. Der Centria-Gammazähler wird zur Bestimmung des gebundenen

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Cortisol-( I) in den Röhrchen verwendet. Die nicht spezifische Bindung (NSB) des Tracers an die Polystyrolsäulenober« flaehe wird bestimmt, indem die Antiserum-Inkubation aufgehoben wird und eine Säule nur mit BSA behandelt wird.

Die Ergebnisse werden wie oben beschrieben berechnet.

Aus diesen Werten wird eine Standardkurve aufgestellt, die Prozentgebundenes gegen Konzentration des Cortisols in jedem Standard angibt.

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Beispiel 5

Affinitätschromatographische Abtrennung von Cortisol-Antiserum aus Serumproteinen ₌ .

Eine Menge von Cortisol, das kovalent an Sepharose-4-B gebunden war, wurde in eine Polystyrolsäule gegeL?n, die mit einer PoIyäthylensclieibe ausgerüstet war und in dem Centria-Inkubator/ Separator-System angeordnet war. Rohes Cortisol-Antiserum (100 pl), verdünnt mit 300 pl 0,1 M Natriumphosphatpuffer, pH 7»4, wurde zu der Reaktor/Separator-Säule hinzugegeben, die das immobilisierte Hapten (the immobilized hapten) enthielt. Nach einem geeigneten Zeitraum wurde die Säule zentrifugiert und gleichzeitig mit Puffer eluiert, um die ungebundene Fraktion zu entfernen. Die Serumproteine und nicht gebundenen Komponenten, die in den die Säulen tragenden Röhrchen gesammelt waren, wurden entfernt. Stattdessen wurden saubere Teströhrchen an deren Stelle gesetzt und das Verfahren wiederholt, wobei der Phosphatpuffer durch eine Säure oder eine chaotropische Lösung ersetzt wurde« Nach der Zentrifugal-Elution wurde das Cortisol-Antiserum aus den Teströhrchen gewonnen.

Obwohl die Erfindung durch die obigen Beispiele erläutert wird, soll sie durch die darin verwendeten Materialien nicht beschränkt werden. Die Erfindung umfaßt vielmehr den hierin offenbarten allgemeinen Erfindungsgedanken. Verschiedene Modifikationen und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können durchgeführt werden, ohne den Erfindungsgedanken zu verlassen.

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Claims

SAT="- Γ λ r*'*/-\ LT

27. März 1979 GzHa/Ra.

Union CarMde Corporation, New York, N_eY. 10017 / USA Reaktor/Separator-Vorrichtung

Patentansprüche

1J Reaktor/Separator-Vorrichtung zur Verwendung in der automatisierten Festphasen-Iinmuno-Schnellanalyse, bei der die Komponenten durch Zentrifugalkraft gemischt, überführt und getrennt werden, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus einer Kombination von

(a) einer Säule, die an beiden Enden offen ist,

(b) in der Säule angeordnete Binde- und Filtervorrichtungen, die bei annähernd atmosphärischem Druck für wässrige Lösungen undurchlässig sind, jedoch für wässrige Lösungen durchlässig, wenn sie einer Zentrifugalkraft ausgesetzt werden, und

(c) einer Reaktions- und Trennkammer, die oberhalb der Binde- und Filtervorrichtung angeordnet ist, die zumindest eine Matrix für die Immobilisierung und Abtrennung zumindest einer Komponente eines Antigen-Antikörper-Systems enthält,

besteht.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Säule von zylindrischer Gestalt ist und einen Mittelteil von im wesentlichen gleichförmigem Durchmesser, einem Bodenteil,

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der sich zu einem kleineren Durchmesser als der mittlere Teil verjüngt, und einem oberen Teil, der von größerem Durchmesser ist als der mittlere Teil, aufweist, wobei die Binde- und Filtervorrichtungen in der Säule an einem Punkt angeordnet sind, an dem sich der mittlere Teil zu dem kleineren Durchmesser verengt.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Binde- und Filtervorrichtung die Form einer Scheibe aufweist.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Scheibe aus einem porösen Polj^äthylenmaterial besteht«

5. Vorrichtung nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Scheibe eine Porosität von etwa 25 bis etwa 150 Mikron aufweist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix in der Reaktions- und Abtrennungskammer als Pulver vorliegt.

7· Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix in der Reaktions- und Abtrennungskammer als Tablette vorliegt, die nach Kontakt mit der Lösung quillt und sich der Konfiguration der Säulen anpaßt.

8. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Matrix an der inneren Wand der Reaktions- und Abtrennungskammer enthalten ist.

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Verbesserung einer Immune-analyse, in der die Proben und Reagenzien durch Zentrifugalkraft gemischt und überführt werden, dadurch gekennzeichnet, daß die Proben und Reagenzien in die Reaktor/Separator-Vorrichtung nach Anspruch 1 überführt v/erden, die Proben und Reagenzien auf der Matrix

wenigstens inkubiert werden und schlieMch/eine Komponente des Antigen-Antikörper-Systems daraus entfernt wird.

9 0 9 S 4 Π / 0 R Π 5