DE3782282T2

DE3782282T2 - Festphasensystem mit tetrazoliumsalzen zum gebrauch in liganden-rezeptor assays.

Info

Publication number: DE3782282T2
Application number: DE8787306087T
Authority: DE
Inventors: Richard R Anderson
Original assignee: Hybritech Inc
Current assignee: Hybritech Inc
Priority date: 1986-07-15
Filing date: 1987-07-09
Publication date: 1993-03-18
Anticipated expiration: 2007-07-10
Also published as: ES2035067T3; DE3782282D1; AU7557087A; GR3006185T3; ATE81723T1; AU589021B2; CA1289876C; EP0253578B1; JPS6330767A; EP0253578A2; EP0253578A3

Description

Die Erfindung betrifft Liganden-Rezeptor-Assay-Verfahren. In anderer Hinsicht betrifft sie ein Festphasensystem zur Verwendung in Liganden-Rezeptor-Assays insbesondere Immunoassays unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern. In anderer Hinsicht betrifft sie ein festes Trägersystem, das Tetrazoliumsalze beinhaltet, was zu einer verstärkten Farbentwicklung führt.
Liganden-Rezeptor-Assays, insbesondere Immunoassays, liefern ein empfindliches diagnostisches Mittel für den in vitro Nachweis von Analyten, die mit Krankheiten und anderen physiologischen Bedingungen von klinischer Signifikanz in Zuammenhang stehen, in Serum und anderen Körperflüssigkeiten.
In der Vergangenheit wurden für Immunoassays typischerweise polyklonale Antikörperpräparate, die an eine Festphase gebunden waren, verwendet. In solchen Tests läßt man eine Lösung von Antigen, das markiert ist, um es nachweisen zu können, mit einem Antigen in einer Probe um den Festphasenantikörper konkurrieren. Das Ausmaß, in dem markiertes Antigen an der Festphase gebunden wird oder in der Flüssigphase nachgewiesen wird, kann als Maß für die Gegenwart und Menge eines Antigens in der zu analysierenden Probe verwendet werden.
Danach waren nicht-kompetitive immunometrische Assays erhältlich. Bei diesen Tests wird auch ein an eine Festphase gebundenes polyklonales Antikörperpräparat verwendet. Die Probe, die das gesuchte Antigen enthält, wird mit der Festphase in Kontakt gebracht, damit das Antigen an die Antikörper der Festphase bindet. Typischerweise wird nach einem Inkubationsschritt die Probe von der Festphase getrennt, die dann gewaschen wird und mit einer Lösung eines weiteren polyklonalen Antikörpers, der markiert ist, zum Beispiel mit einem Radionuklid, einem Enzym oder einem fluoreszierenden Anteil zur Detektion inkubiert.
Nach dieser zweiten Inkubation wird nicht-gebundener markierter Antikörper von der Festphase getrennt und die Menge an markiertem Antikörper wird entweder in der flüssigen Phase oder gebunden an die Festphase in einem Antikörper:Antigen: Antikörper-Sandwich bestimmt als Maß der Gegenwart und/oder Konzentration eines Antigens in der getesteten Probe.
Kürzlich wurden Immunoassay-Verfahren modifiziert durch die Verwendung von monoklonalen Antikörpern. Zum Beispiel beschreibt US-Patent Nr. 4 376 110 einen zweiseitigen immunometrischen Assay unter Verwendung von Paaren monoklonaler Antikörper, von denen einer an eine Festphase gebunden ist und der andere zum Nachweis markiert ist. Die Verwendung von monoklonalen Antikörper-Paaren, die verschiedene Epitope an einem Antigen erkennen, hat es möglich gemacht, simultane immunometrische Assays durchzuführen, bei denen die Inkubation mit Antigen und markiertem Antikörper keine Zwischenschritte erfordert wie bei früheren Verfahren.
Bei den früheren Immunoassay-Verfahren umfaßt das Festphasensystem typischerweise einen Antikörper, der an ein Kügelchen gebunden ist, oder alternativ ein mit Antikörper beschichtetes Material wie eine Membran oder ein Filter, das geeignet ist, das interessierende Antigen einzufangen. Das Festphasensystem kann auch eine poröse Matrix umfassen, in der mit Antikörper beschichtete Mikrokügelchen gebunden sind. Verfahren zum Binden von Rezeptoren an Festphasenträger sind auf diesem Gebiet wohlbekannt. Zum Beispiel können Antikörper an Polysaccharidpolymere gebunden werden unter Verwendung des in US-Patent Nr. 3 645 090 beschriebenen Verfahrens. Der zweite Antikörper wird mit einem Enzym markiert, zum Beispiel alkalischer Phosphatase, die die Umwandlung eines zugegebenen Substrats, zum Beispiel Indoxylphosphat, zu einem nachweisbaren gefärbten Niederschlag, zum Beispiel Indigoblau, katalysiert. Es wurde gefunden, daß diese indigobildenden Reaktionen nützlich sind zur Sichtbarmachung der Gegenwart von Enzymen wie alkalischer Phosphatase sowohl beim histologischen Färben von Zellmaterial als auch bei der kolorimetrischen Bestimmung von Analyten in Immunoassays.
In der Histologie ist zum Beispiel die Bildung unlöslicher Teilchen von Indigoblau nützlich für die präzise visuelle Sichtbarmachung zellulärer Organellen. Die unlöslichen Teilchen lokalisieren sich in der Nachbarschaft von Organellen, die enzymatische Aktivität besitzen, und zeigen somit Gegenwart oder Abwesenheit alkalischer Phosphatase in spezifischen Gewebekomponenten. Um die beste Bildgebung zu erreichen, muß die Bildungsrate des gefärbten Niederschlags so groß sein, daß der gebildete Niederschlag tatsächlich in der Nachbarschaft der enzymatischen Aktivität lokalisiert ist. Unglücklicherweise ist die Bildung von Indigoblau aus Indoxylphosphat eine vielstufige Reaktion, die unter den meisten Reaktionsbedingungen nicht einer einfachen Kinetik erster Ordnung folgt. Dies führt zu langsameren Reaktionszeiten und einer verminderten Empfindlichkeit.
Eine kinetische Verbesserung eines Anfärbungsverfahrens unter Anwendung von Indoxylphosphat als Substrat kann erreicht werden mit einem zweiten Farbstoff, der mit dephosphoryliertem Indoxyl reagiert unter Bildung eines anderen gefärbten Niederschlags statt Indigoblau. Tetrazoliumsalze sind eine Klasse von Verbindungen, von der gezeigt wurde, daß sie das Färben von Phosphatase enthaltenden Organellen im Anschluß an den Kontakt mit indigobildenden Reagenzien erleichtern. Tetrazoliumsalze können chemisch mit dephosphoryliertem Indoxyl reagieren, was die reduzierte Form des Tetrazoliums (Formazan) im allgemeinen als intensiv gefärbten Niederschlag liefert. Da das Tetrazoliumsalz in großem Überschuß bezüglich des dephosphorylierten Indoxyls als Zwischenprodukt zugegeben werden kann, folgt die Bildungsrate des gefärbten Niederschlags eher einer Kinetik erster Ordnung. Als Konsequenz wird der Grad, in dem der gefärbte Niederschlag in der Nachbarschaft der Enzymaktivität lokalisiert ist, bei zellulären Komponenten verbessert und eine verbesserte Information bezüglich der gefärbten Probe wird somit erreicht.
Eine Beschränkung dieser Zwei-Farbstoff-Technik liegt darin, daß die Reaktionsbedingungen, d. h. Lösungen mit alkalischem pH, die am günstigsten für den Nachweis der alkalischen Phosphatase sind, für eine Langzeitstabilität von Tetrazoliumsalzen in der Lösungsphase nicht günstig sind. Deshalb ist die Mischung von indigobildenden oder indigogenen Substraten und Tetrazoliumsalzen in einer einzigen alkalischen Lösung aus Stabilitätsgründen nicht anwendbar. Außerdem wurde gefunden, daß Tetrazoliumsalze und indigogene Farbstoffe allgemein, wenn sie in der gleichen Lösung vorhanden sind, eine langsame chemische Kupplung eingehen, auch in Abwesenheit von Enzym, zum Beispiel alkalischer Phosphatase. In der Praxis machen diese Beschränkungen es erforderlich, daß entweder die Lösungen, die beide Farbstoffe enthalten, direkt vor der Verwendung hergestellt werden, oder daß zwei getrennte Lösungen, von denen eine das Enzymsubstrat und die andere das Tetrazoliumsalz enthält, verwendet werden, um die zwei Reaktanten zur Verfügung zu stellen.
Die Technik der Farbverstärkung mit Tetrazoliumsalz wurde auch in enzymetrischen Immunoassays verwendet, um die Kinetik und Nachweisempfindlichkeit bei kolorimetrischen Assays, die alkalische Phosphatase als Enzymmarkierung anwenden, zu verbessern. Diese Tests leiden auch unter den gleichen Beschränkungen, wie sie mit der Verwendung von Tetrazoliumsalzen bei der histologischen Färbung einhergehen. Eine einzige Lösung, die sowohl indigogene Farbstoffe als auch Tetrazoliumsalze enthält, weist im allgemeinen nämlich nicht eine kommerziell annehmbare Langzeitstabilität auf. Wiederum ist eine Lösung des Problems, Enzymsubstrat und Tetrazoliumsalz in Form von zwei separaten Lösungen abzupacken. Eine alternative Lösung dieses Problems ist es, die Konzentration des Enzymsubstrats und/oder Tetrazoliumsalzes wesentlich zu vermindern, wenn sie in einer einzigen Lösung, die beide Komponenten enthält, vereinigt sind. Die verminderte Konzentration verlangsamt die nicht-enzymatische chemische Kupplung des indigogenen Enzymsubstrats mit dem Tetrazoliumsalz und verlängert somit die Stabilität der beide Komponenten enthaltenden Lösung. Jedoch führt eine verminderte Konzentration des Enzymsubstrats zu einer verminderten Testempfindlichkeit oder zu erhöhten Testinkubationszeiten, was beides nicht kommerziell wünschenswert ist. Somit wird jeglicher Gewinn bezüglich der Testempfindlichkeit durch die Kinetik pseudo-erster Ordnung durch die verminderte Empfindlichkeit, die aus der niedrigeren Konzentration des Enzymsubstrats in der Lösung resuliert, aufgehoben. Als Konsequenz dieser Probleme, die mit der Implementierung von Tetrazoliumsalzen einhergehen, wurde diese Technik zur Verbesserung enzymetrischer Immunoassays nicht häufig angewendet, trotz einer wesentlichen Verbesserung der Testempfindlichkeit, die potentiell möglich ist.
Somit besteht ein Bedarf für ein geeigneteres Verfahren zur Anwendung von Tetrazoliumsalzen, um die Empfindlichkeit von enzymetrischen Immunoassays, die indigogene Enzyme als Enzymmarkierung verwenden, zu verbessern.
Im allgemeinen liefert die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Einführung von Tetrazoliumsalzen in Liganden-Rezeptor-Assays, wobei die Assays ein enzymmarkiertes Rezeptorkonjugat und indigogene Farbstoffsubstrate anwenden für die Bestimmung von mindestens einem Zielliganden in einer Probe. Die Einführung des Tetrazoliumsalzes verstärkt die Farbentwicklung der indigogenen Substrate und verbessert die Empfindlichkeit des Tests.
Insbesondere liefert die vorliegende Erfindung ein Festphasensystem zur Verwendung für Liganden-Rezeptor-Assays, insbesondere Immunoassays, zum Nachweis eines ausgewählten Analyten in einer Probeflüssigkeit. Der Ausdruck "Liganden-Rezeptor- Assay", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf einen Test für einen Analyten, der nachgewiesen wird durch Bildung eines Komplexes zwischen einem Liganden und einer anderen Substanz, die eine spezifische Wechselwirkung mit dem Liganden eingehen kann, d. h. einem Rezeptor. Der Ligand kann der Analyt selbst sein oder eine Substanz, aus der, wenn sie nachgewiesen wird, auf die Gegenwart des Analyten in der Probe geschlossen werden kann. Der Fachmann auf diesem Gebiet erkennt, daß, abhängig von dem interessierenden Analyten, ein Mitglied eines spezifischen Bindungspaares entweder der Rezeptor oder der Ligand sein kann, abhängig von der Testart. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann der Ausdruck "Ligand" Antigene, Haptene, Antikörper, Deoxyribonukleinsäure (DNA), Ribonukleinsäure (RNA), Hormone, Metaboliten oder andere natürlich vorkommende Substanzen von diagnostischem Interesse mit einem spezifischen Bindungspartner, d. h. dem Rezeptor des Liganden-Rezeptor-Assays, umfassen. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung schließt der Ausdruck "lokalisiert" die Assoziierung des Liganden, Rezeptors oder Tetrazoliumsalzes durch kovalente Bindung, nicht-kovalente Bindung, chemische Kupplung, Einschluß beschichteter Mikrokügelchen und Adsorption durch hydrophobe/hydrophobe oder hydrophile/hydrophile Wechselwirkungen ein.
Somit umfaßt das erfindungsgemäße Festphasensystem einen festen Träger, auf dem (a) ein Rezeptor, der mit einem Zielliganden binden kann, lokalisiert ist und (b) ein Tetrazoliumsalz, das die enzymatische Farbentwicklung verstärken kann, ein. Der feste Träger kann eine poröse Matrix, ein Kügelchen, eine Membran oder ein Filter sein, denen entweder die Eigenschaft innewohnt, daß sie ausreichend hydrophob sind, um das hydrophobe Tetrazoliumsalz zu adsorbieren, und ausreichend hydrophil sind, um ein Benetzen mit wäßrigen Lösungen zuzulassen oder die mit einer anderen Substanz, zum Beispiel einem organischen Bindemittel, das hydrophobe Stellen für die Adsorption des Tetrazoliumsalzes liefert, behandelt wurden. Der Rezeptor kann an den festen Träger chemisch gekuppelt werden, zum Beispiel nicht-kovalent gebunden werden. Alternativ kann der feste Träger eine poröse Matrix sein, in der mit Rezeptor beschichtete Mikrokügelchen und mit Tetrazoliumsalz beschichtete Mikrokügelchen eingeschlossen sind. Ebenso kann das Festphasensystem einen inneren Standard einschließen, wobei Rezeptor, Referenzrezeptor und Tetrazoliumsalz auf dem festen Träger in diskreten Test- und Referenzzonen lokalisiert sind.
Die vorliegende Erfindung ist weiterhin auf eine Vorrichtung gerichtet, die als erstes Glied ein poröses Festphasensystem, wie oben beschrieben, umfaßt. Die bevorzugte Vorrichtung umfaßt weiterhin als zweites Glied ein Absorptionsglied, das mit dem Festphasensystem in Verbindung steht, um das Fließen einer flüssigen Probe durch das Festphasensystem und in das zweite Glied zu erleichtern. (Die Ausdrücke "Festphasensystem" und "erstes poröses Glied" werden austauschbar verwendet.) Eine besonders bevorzugte Vorrichtung umfaßt weiterhin den Einbau eines inneren Standards auf dem ersten porösen Glied, wobei Rezeptor, Referenzrezeptor und Tetrazoliumsalz auf dem festen Träger in diskreten Test- und Referenzzonen lokalisiert sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Liganden-Rezeptor-Assay-Verfahren, das als ersten Schritt umfaßt, daß man eine flüssige Probe, von der angenommen wird, daß sie einen Zielliganden enthält, auf das erste poröse Glied der oben beschriebenen Vorrichtung bringt. Das erste poröse Glied schließt einen festen Träger ein, auf dem im gleichen Bereich ein Rezeptor, der mit dem Zielliganden binden kann, und ein Tetrazoliumsalz, das die indigogene Farbstoffentwicklung verstärken kann, lokalisiert sind. Im Anschluß an die Zugabe der Probe und nach Ablauf eines Zeitraumes, der ausreicht, daß der lokalisierte Rezeptor irgendeinen vorhandenen Zielliganden binden kann, wird eine Lösung eines markierten Rezeptorkonjugats, das mit dem Zielliganden binden kann, zu dem Festphasensystem zugegeben. Die Markierung des Rezeptorkonjugats ist ein indigogenes Enzym, das mit einem indigogenen Farbstoff reagieren kann. Nachdem nichtgebundenes Rezeptorkonjugat von dem Festphasensystem mit der Waschlösung gewaschen wurde, wird ein Substrat, das einen indigogenen Farbstoff enthält, zugegeben. Der indigogene Farbstoff wird durch das Enzym umgewandelt, das Produkt durchläuft eine Reaktion mit dem lokalisierten Tetrazoliumsalz unter Bildung eines gefärbten Niederschlags. Das Rezeptorkonjugat wird dann durch visuelle oder instrumentelle Messung der Farbentwicklung nachgewiesen.
Der Ausdruck "Rezeptorkonjugat", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf einen Komplex, der einen Rezeptor und eine Markierung, die nachgewiesen werden kann, umfaßt. Im Fall eines immunometrischen Assays für ein Zielantigen kann das Rezeptorkonjugat ein markierter Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, sein. Alternativ kann, wenn der Zielligand ein Antikörper ist, ein markiertes Antigen als Rezeptorkonjugat verwendet werden. Die Gegenwart des gebundenen Rezeptorkonjugats an dem Festphasensystem ist ein Hinweis auf die Gegenwart des Analyten in der Probe.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung des Festphasensystems zur Verwendung bei Liganden-Rezeptor-Assays, bei denen das Festphasensystem zu einer Verstärkung der indigogenen Farbstoffentwicklung führt. Ein bevorzugtes Verfahren umfaßt das Lokalisieren eines Tetrazoliumsalzes an dem Festphasenträger gleichzeitig mit der Lokalisierung des Festphasenrezeptors, insbesondere während des Einschlusses von Mikrokügelchen, die mit Rezeptor beschichtet sind. Dies wird erreicht, indem ein Tetrazoliumsalz in der Flüssigkeit gelöst wird, die verwendet wird, um die rezeptorbeschichteten Mikrokügelchen zu suspendieren. Das Tetrazoliumsalz wird aus der Flüssigkeit auf die Oberfläche des einschließenden festen Trägers adsorbiert und ist für spätere chemische Reaktionen mit indigogenen Reagenzien verfügbar. Ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Herstellung des Festphasensystems der vorliegenden Erfindung umfaßt, daß man das Tetrazoliumsalz auf die Oberfläche synthetischer Mikrokügelchen adsorbiert und diese Mikrokügelchen in eine Suspension rezeptorbeschichteter Mikrokügelchen gibt und anschließend beide Arten von Teilchen in eine poröse feste Matrix einschließt.
Die Erfindung wurde zusammengefaßt, um die detaillierte Beschreibung, die nun folgt, besser verständlich zu machen.
Wie oben angegeben, liefert die vorliegende Erfindung ein Festphasensystem zur Verwendung bei Liganden-Rezeptor-Assays, insbesondere Immunoassays, für den Nachweis eines ausgewählten Analyten in einer Probeflüssigkeit.
Gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt das Festphasensystem einen festen Träger, auf dem im gleichen Bereich ein Rezeptor und das Tetrazoliumsalz lokalisiert sind. Eine Vielzahl von festen Trägern, einschließlich einer porösen Matrix, Kügelchen, Membran oder Filter, können verwendet werden bei der vorliegenden Erfindung, vorausgesetzt, daß sie ausreichend hydrophob sind, um Tetrazoliumsalze zu adsorbieren, und ausreichend hydrophil, um ein Benetzen mit wäßriger Lösung zu ermöglichen. Die duale hydrophobe/hydrophile Natur des festen Trägers kann dem Material inhärent sein oder kann dem Material als Ergebnis einer Behandlung des Materials vermittelt werden, zum Beispiel Glasfasern gemischt mit organischen Bindemitteln oder keramische Materialien, die behandelt wurden, um hydrophobe Bindungsstellen zu schaffen. Unter den zur Verwendung als fester Träger bevorzugten Materialien sind Nylon, Polystyrol, Latex, Polyethylen und Polypropylen.
Die Lokalisierung des Rezeptors und des Tetrazoliumsalzes auf dem festen Träger des Festphasensystems der vorliegenden Erfindung kann auf einer Vielzahl von Wegen erreicht werden. Der Rezeptor kann auf dem festen Träger durch chemische Kupplung lokalisiert werden, zum Beispiel kovalente Bindung und nichtkovalente Bindung. Techniken zur Bindung von Rezeptoren an einen festen Träger sind auf diesem Gebiet wohlbekannt. Siehe zum Beispiel US-Patent Nr. 3 645 090, das das Verfahren zur Bindung von Antikörpern an Polysaccharidpolymere lehrt. Alternativ umfaßt ein besonders bevorzugtes Verfahren zur Lokalisierung des Rezeptors auf dem festen Träger, bei dem der feste Träger eine poröse Matrix ist, das Einschließen der mit Rezeptor beschichteten Mikrokügelchen in der Matrix. Verfahren zur Beschichtung von Mikrokügelchen und das Einführen dieser Mikrokügelchen in eine poröse Matrix sind dem Fachmann jetzt wohlbekannt und erfordern keine weitere Erläuterung. Das Tetrazoliumsalz kann auf dem festen Träger lokalisiert werden, indem ein fester Träger ausgewählt wird, der ausreichend hydrophob ist, um das hydrophobe Tetrazoliumsalz zu adsorbieren, und dennoch ausreichend hydrophil ist, um mit wäßrigen Lösungen benetzt werden zu können. Ein besonders bevorzugtes Mittel zur Lokalisierung des Tetrazoliumsalzes umfaßt das Beschichten hydrophober Mikrokügelchen mit dem Tetrazoliumsalz und das Einführen in eine poröse Matrix als festen Träger, wo sie eingeschlossen werden. Das am meisten bevorzugte Mittel zur Lokalisierung des Rezeptors und des Tetrazoliumsalzes ist durch Einschluß beschichteter Mikrokügelchen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das zur Verwendung ausgewählte Tetrazoliumsalz zum Beispiel p-Nitroblautetrazoliumchlorid, m-Nitroneotetrazoliumchlorid und Tetranitroblau-Tetrazoliumchlorid sein. Alle diese Tetrazoliumsalze unterliegen einer schnellen Reaktion mit einem dephosphorylierten Indoxyl unter Bildung eines leuchtend gefärbten Niederschlags. Liganden- Rezeptor-Assays, für die die vorliegende Erfindung nützlich ist, sind Immunoassays, insbesondere immunometrische Assays, und Nukleinsäuresondentests. Der Rezeptor der vorliegenden Erfindung kann eine Nukleinsäuresequenz als Sonde für den Zielliganden sein oder ein Antigen oder ein Antikörper, das/der einen Zielliganden einfangen kann. Ein besonders bevorzugter Antikörper ist ein monoklonaler Antikörper.
Die vorliegende Erfindung ist auch nützlich, wenn das Festphasensystem ein Verfahren zum Einbau eines inneren Standards liefert, der die quantitative Bestimmung von Ligandenkonzentrationen in der Probe oder die qualitative Bestätigung eines richtigen Testverlaufs zuläßt. Das Festphasensystem der vorliegenden Erfindung unter Einschluß eines inneren Standards schließt einen festen Träger ein, der mindestens eine diskrete Testzone und mindestens eine diskrete Referenzzone umfaßt, auf denen der Rezeptor und das Tetrazoliumsalz bzw. ein Referenzrezeptor und ein Tetrazoliumsalz lokalisiert sind. Das Verfahren zum Einschluß des inneren Standards in einem Analyt-Rezeptor- Assay ist Gegenstand der schwebenden europäischen Anmeldung Nr. 87 302 403.8, eingereicht am 20. März 1987. Die vorliegende Erfindung kann eine verstärkte Farbentwicklung liefern sowohl in der Testzone als auch in der Referenzzone. Außerdem ist es ein besonderer Vorteil der Verwendung der Tetrazoliumsalze zur Verstärkung der Farbentwicklung, daß die erreichte erhöhte Empfindlichkeit des Tests die Notwendigkeit, einen Referenzrezeptor so auszuwählen, daß die Geschwindigkeitskonstanten für die Bindung des Rezeptorkonjugats an den Referenzrezeptor und an den Zielliganden im wesentlichen gleich sind, vermindert.
Allgemein müssen bei der Herstellung des Festphasensystems der vorliegenden Erfindung die folgenden Faktoren beachtet werden. Eine Lösung eines Tetrazoliumsalzes (eine organische Verbindung mit begrenzter Wasserlöslichkeit, d. h. eine etwas hydrophobe Verbindung) wird auf einen synthetischen Festphasenträger aufgebracht, der sowohl hydrophile als auch hydrophobe Oberflächeneigenschaften aufweist. Da Tetrazoliumsalze signifikante hydrophobe Eigenschaften besitzen, werden sie leicht an Oberflächen adsorbiert, die hydrophobe Eigenschaften haben, wie sie manche synthetische Polymermaterialien besitzen, zum Beispiel eine poröse Nylonmembran oder Latexmikrokügelchen. Die Adhäsion eines Tetrazoliumsalzes an einem synthetischen Polymer über hydrophobe Wechselwirkungen besitzt eine ausreichende Stärke, so daß das Tetrazoliumsalz nicht leicht entfernt wird, wenn es wesentlichen Volumina an wäßriger Lösung ausgesetzt wird. Nichtsdestotrotz behält das Tetrazoliumsalz eine ausreichende chemische Verfügbarkeit, so daß es fähig bleibt, eine chemische Reaktion mit geeigneten Reagenzien wie den Reaktionsprodukten der enzymatischen Dephosphorylierung von Indoxylphosphat durch alkalische Phosphatase einzugehen.
Somit besteht ein Verfahren, das Tetrazoliumsalz auf die Oberfläche des festen Trägers aufzubringen, darin, das Tetrazoliumsalz in einer Lösung mit neutralem pH zu lösen, die angewendet wird für einen heterogenen enzymetrischen Immunoassay, um die Trennung zwischen Lösungsphase und an der festen Phase immobilisiertem Rezeptorkonjugat zu bewirken (d. h. Trennung freigebunden). Dieses Verfahren des Aufbringens des Tetrazoliumsalzes hat den Vorteil, daß eine getrennte Lösung, deren einzige Funktion das Aufbringen des Tetrazoliumsalzes ist, nicht erforderlich ist. Die indigogenen Reagenzien, die als Enzymsubstrate verwendet werden, werden allgemein als Lösungen eingeführt, deren pH im wesentlichen alkalisch ist, da die maximale Enzymaktivität bei alkalischem pH erreicht wird. Alkalische Lösungen von Tetrazoliumsalzen erwiesen sich jedoch im allgemeinen als instabil, da unter den Bedingungen des alkalischen pH die spontane Reduktion des Tetrazoliumsalzes in die reduzierte Form des Farbstoffs (d. h. die Formazanform) gefördert wird. Die Verwendung einer Lösung mit neutralem pH verhindert im wesentlichen diese Beschränkung. Die nachfolgende chemische Reaktion zwischen den enzymatisch gespaltenen indigogenen Substraten der alkalischen Phosphatase und dem Tetrazoliumsalz, das an der festen Phase adsorbiert ist, ist einfach.
Die vorliegende Erfindung liefert weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Festphasensystems, das ein Mittel darstellt, um die indigogene Farbstoffentwicklung zu verstärken. Ein Verfahren zur Herstellung des Festphasensystems umfaßt die Lokalisierung des Tetrazoliumsalzes durch Lösung des Tetrazoliumsalzes in der wäßrigen Flüssigkeit, die verwendet wird, um die Suspension mit rezeptorbeschichteten Mikrokügelchen zu bilden, vor dem Aufbringen auf einen porösen festen Träger. Der poröse feste Träger muß sowohl hydrophobe als auch hydrophile Oberflächeneigenschaften aufweisen. Das Tetrazoliumsalz teilt sich zwischen der wäßrigen Suspensionsflüssigkeit und den hydrophoben Anteilen des porösen festen Trägers auf. Bei einem sorgfältig vorbereiteten porösen festen Träger haftet ein wesentlicher Anteil des gelösten Tetrazoliumsalzes an dem porösen Träger und wird ausschließlich in der Nachbarschaft der eingeschlossenen Mikrokügelchen lokalisiert. Die wäßrige Suspensionsflüssigkeit wird durch Verdampfen entfernt, wobei sowohl adsorbiertes Tetrazoliumsalz als auch eingeschlossene proteinbeschichtete Mikrokügelchen zurückbleiben. Wie vorher angegeben, sind die hydrophoben Bindungskräfte zwischen dem Tetrazoliumsalz und dem Festphasenträger ausreichend stark, daß der nachfolgende Kontakt des mit Tetrazoliumsalz behandelten Trägers mit wäßrigen Lösungen, die allgemein bei Durchführung von immunoenzymetrischen Assays verwendet werden, nicht zu einem wesentlichen Ablösen des Tetrazoliumsalzes von der Oberfläche des porösen Festphasenträgers führt. Das mit diesem Verfahren an den porösen Festphasenträger adsorbierte Tetrazoliumsalz kann leicht mit den Produkten der enzymatischen Spaltung des indigogenen Farbstoffs reagieren. Probleme, die mit der Stabilität der Lösungsphase von Tetrazoliumsalzen einhergehen, werden durch die vorliegende Erfindung vermieden, da das Tetrazolium in dem trockenen Festphasensystem gelagert wird, bis es während des immunoenzymetrischen Liganden-Rezeptor-Assays rehydratisiert wird.
Besonders bevorzugt als Verfahren zur Lokalisierung des Tetrazoliumsalzes ist ein Beschichten von Tetrazoliumsalz auf synthetische polymere Mikrokügelchen. Bei diesem Verfahren wird Tetrazoliumsalz auf unbehandelte Mikrokügelchen adsorbiert über hydrophobe Wechselwirkungen zwischen dem Tetrazoliumfarbstoff und den polymeren Mikrokügelchen. Die in Gegenwart von Tetrazoliumsalz hergestellten Mikrokügelchen werden mit Mikrokügelchen, die mit Rezeptor beschichtet sind, wie zum Beispiel monoklonalen Antikörpern, gemischt und eine einheitlich vermischte Suspension dieser zwei Arten beschichteter Mikrokügelchen wird auf eine poröse Matrix als festen Träger aufgebracht, wobei die Teilchen in den porösen Träger eingeschlossen werden. Wie vorher ausgeführt, ist das Tetrazoliumsalz, das auf den in geeigneter Weise beschichteten Mikrokügelchen vorhanden ist, für die Reaktion mit den enzymatisch gespaltenen Produkten der indigogenen Substrate zugänglich. Bei diesem Verfahren der vorliegenden Erfindung weist das Tetrazoliumsalz dieselben Vorteile auf, die erhalten werden, wenn das Tetrazoliumsalz in der Flüssigkeit, in der die rezeptorbeschichteten Mikrokügelchen suspendiert sind, gelöst wird. Ein zusätzlicher Vorteil bei Verwendung von mit Tetrazoliumsalz beschichteten Mikrokügelchen ist es, daß die hydrophoben/hydrophilen Eigenschaften des Adsorptionsmediums durch die Oberflächeneigenschaften der Mikrokügelchen definiert werden. Als solche sind diese Eigenschaften unabhängig von den Oberflächeneigenschaften des porösen Festphasenträgers, was die Beschränkungen in der Auswahl des porösen festen Trägers aufhebt.
Ebenso bevorzugt zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist das folgende Verfahren zur Lokalisierung von Tetrazoliumsalz auf dem Festphasenträger. Ein gegen ein ausgewähltes Antigen gerichteter Antikörper wird entweder kovalent oder nicht-kovalent an den Festphasenträger in einer ausgewählten Reaktionszone gekuppelt. Ein Volumen einer wäßrigen Lösung, die ein Tetrazoliumsalz enthält, wird auf dem Festphasenträger in dem Bereich, der verwendet wird, um den Antikörper zu lokalisieren, verteilt. Nach Entfernung des Hauptteils der Flüssigkeit durch Verdampfen, wird der Festphasenträger verwendet, um den Test durchzuführen. Das adsorbierte Tetrazoliumsalz ist, wie oben angegeben, für die chemische Reaktion mit den enzymatisch gespaltenen indigogenen Reagenzien zugänglich. Dieses erfindungsgemäße Verfahren weist dieselben Vorteile auf, die bereits für die Verfahren aufgelistet wurden, bei denen das Tetrazoliumsalz vor dem Immunoassay aufgebracht wird und in der trockenen Phase gelagert wird in der Zeit zwischen Auftragen auf die feste Phase und Verwendung in einem Immunoassay.
Ebenso geeignet für die vorliegende Erfindung ist das folgende Verfahren zum Aufbringen eines Tetrazoliumsalzes auf einen Festphasenträger. Ein gegen ein ausgewähltes Antigen gerichteter Antikörper wird nicht-kovalent an Latexmikrokügelchen gekuppelt und dann wird ein Volumen der antikörperbeschichteten Mikrokügelchen auf dem Festphasenträger in einer ausgewählten Reaktionszone lokalisiert. Ein Volumen einer wäßrigen Lösung, die ein Tetrazoliumsalz enthält, wird auf dem Festphasenträger in dem Bereich, der verwendet wird, um die Mikrokügelchen zu lokalisieren, verteilt. Wie vorher wird der Hauptteil der Flüssigkeit durch Verdampfen entfernt und der vorbereitete Festphasenträger wird verwendet zur Durchführung eines immunoenzymetrischen Tests. Das adsorbierte Tetrazolium ist für die chemische Reaktion mit dem enzymatisch gespaltenen indigogenen Substrat zugänglich. Dieses erfindungsgemäße Verfahren weist auch die Vorteile auf, die für Verfahren, bei denen Tetrazolium vor dem Immunoassay aufgebracht wird und in der Trockenphase gelagert wird in der Zeit zwischen Auftragen auf die Festphase und Anwendung in einem Immunoassay, aufgelistet wurden.
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung umfaßt als erstes poröses Glied ein Festphasensystem wie oben beschrieben. Die Vorrichtung umfaßt weiterhin zusätzliche Mittel, die mit dem ersten porösen Glied zusammenarbeiten, um das Fließen einer flüssigen Probe und flüssiger Reagenzien durch das erste Glied zu erleichtern. Unter den Mitteln, die geeigneterweise verwendet werden können, sind Mittel, um eine Vakuumquelle oder Kapillarkraft unterhalb des porösen Glieds anzulegen, um Flüssigkeit durch das poröse Glied zu ziehen. Alternativ kann das zusätzliche Mittel eine Einrichtung zur Anwendung eines positiven Drucks oberhalb des porösen Glieds umfassen, um die Probeflüssigkeit oder die Reagenzien durch das Glied zu drücken. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein zweites absorbierendes Glied mit dem Festphasensystem in Verbindung, damit eine flüssige Probe durch das Festphasensystem und in das absorbierende Material fließen kann. Das zweite absorbierende Glied, das eine Oberfläche hat, über der die feste Phase angeordnet werden kann, hat Kapillaren in einer Richtung, die im wesentlichen diagonal zur Oberfläche, über der das Festphasensystem angeordnet ist, ist, so daß die Kapillaren in Verbindung stehen mit den Poren des Festphasensystems. Eine Vielzahl von Materialien kann für das absorbierende Glied verwendet werden, wie Celluloseacetatfasern oder Polyester.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt das erste poröse Glied weiterhin einen festen Träger mit mindestens einer diskreten Testzone und mindestens einer diskreten Referenzzone, auf der Rezeptor und Tetrazoliumsalz bzw. Referenzrezeptor und Tetrazoliumsalz angeordnet sind. Die Test- und Referenzzonen liefern ein Mittel für die quantitative Bestimmung der Analytkonzentrationen in einer Probe oder für die qualitative Bestätigung der exakten Testdurchführung im wesentlichen unabhängig von üblichen Abweichungen bei den Testbedingungen.
Wie vorher angegeben, sind das Festphasensystem und die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung von wesentlichem Nutzen bei der Durchführung von Liganden-Rezeptor-Assays, insbesondere für multiple Liganden-Rezeptor-Assays für den Nachweis von mindestens zwei interessierenden Analyten und/oder Liganden-Rezeptor-Assays, die ein internes Kontrollsystem einschließen. Obwohl die vorliegende Erfindung besonders nützlich ist für die Durchführung von Immunoassays, erkennt der Fachmann natürlich, daß mit geeigneten Modifikationen das erfindungsgemäß zur Verfügung gestellte Festphasensystem für andere Liganden-Rezeptor-Assays, einschließlich Assays auf dem Gebiet der Nukleinsäuresondentechnik, angewendet werden kann.
Gemäß den Liganden-Rezeptor-Assay-Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Probeflüssigkeit, von der angenommen wird, daß sie den interessierenden Analyt oder die interessierenden Analyten enthält, auf ein Festphasensystem einer oben beschriebenen Vorrichtung geleitet. Im Fall eines Immunoassays umfaßt das Festphasensystem einen festen Träger, auf dem im selben Bereich ein Rezeptor und ein Tetrazoliumsalz lokalisiert sind. Nachdem die Probeflüssigkeit durch das Festphasensystem und in das absorbierende Glied geflossen ist, wird eine Lösung eines Rezeptorkonjugats, das mit dem Zielliganden binden kann und mit einem indigogenen Enzym markiert ist, um einen Nachweis zuzulassen, zugegeben. Im Fall von Immunoassays kann das Rezeptorkonjugat ein Antikörper, vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper, oder ein Antigen, das mit dem interessierenden Liganden binden kann, sein. Die Zugabe des Rezeptorkonjugats läßt geeigneterweise die Bildung eines Komplexes mit dem Liganden, der durch dieses Festphasensystem eingefangen wird, zu. Im Fall eines Immunoassays werden die zwei Antikörper, wenn der feste Träger, der das Festphasensystem umfaßt, mit monoklonalem Antikörper versehen ist und das enzymmarkierte Rezeptorkonjugat auch ein monoklonaler Antikörper ist, so ausgewählt, daß sie an sich gegenseitig nicht beeinflussenden Bindungsstellen des Antigens binden, im wesentlichen wie es in den US-Patenten Nr. 4 376 110 und 4 486 530 beschrieben ist. In den derzeit bevorzugten Ausführungsformen ist das Rezeptorkonjugat mit einem indigogenen Enzym markiert. Nachdem die Lösung des Rezeptorkonjugats durch das Festphasensystem geflossen ist, kann eine Waschlösung zugegeben werden, um ungebundenes Rezeptorkonjugat zu entfernen. Danach wird das Rezeptorkonjugat, das mit dem interessierenden Liganden komplexiert ist, nachgewiesen. Wenn ein Enzym als Markierungskomponente ausgewählt wurde, wird der gebundene Rezeptor bestimmt durch Zugabe eines indigogenen Enzymsubstrats zu dem Festphasensystem. Nach Reaktion mit dem Substrat erzeugt das Enzym, falls es richtig ausgewählt wurde, ein dephosphoryliertes Indoxyl, das mit dem lokalisierten Tetrazoliumsalz reagiert unter Bildung eines leuchtend gefärbten Niederschlags.
In dem Verfahren der vorliegenden Erfindung schließen Paare von indigogenem Farbstoffsubstrat und indigogenem Enzym Indoxylphosphat/alkalische Phosphatase, Indoxylglucosid/alkalische Glucosidase, Indoxylsulfat/alkalische Sulfatase und Indoxylacetat/alkalische Esterase ein. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist geeignet für Liganden-Rezeptor-Assays, was Immunoassays, insbesondere immunometrische Assays, und Nukleinsäuresondenassays einschließt. Rezeptoren, die für die Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet sind, schließen Antikörper, Antigene, Allergene und Nukleinsäuresequenzen, die komplementär sind zu Anteilen der Nukleinsäuresequenz eines Zielliganden, ein. Vorzugsweise ist der Rezeptor ein monoklonaler Antikörper und das Rezeptorkonjugat ist ein markierter monoklonaler Antikörper, die jeweils so ausgewählt werden, daß sie an sich gegenseitig nicht beeinflussenden Epitopen des Liganden binden.
Ein bevorzugtes Material für die Mikrokügelchen, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ist Latex.
Der Fachmann erkennt, daß Assays für einen breiten Bereich von Analyten gemäß der vorliegenden Erfindung durchgeführt werden können. Mögliche Analyten können zum Beispiel Antigene wie Humanchoriongonadotropin, saure Prostataphosphatase, prostataspezifisches Antigen, Alpha-Fetoprotein, karzinoembryonales Antigen, luteinisierendes Hormon, Creatinkinase-Isoenzyme und andere Antigene in Serum, Plasma, Urin oder anderen biologischen Flüssigkeiten einschließen. Außerdem ist die vorliegende Erfindung geeignet für Tests auf Viren, Bakterien, Parasiten oder Pilze oder Antigene oder Antikörper, die damit in Verbindung stehen einschließlich zum Beispiel Rubella-Virus, Rota-Virus, Adeno-Virus, der Erreger von Infektionen des Respirationstraktes im Kindesalter RS-Virus, HTLV, Hepatitis-Virus, Hepatitis/A, Hepatitis/B, Hepatitis nonA nonB, Influenza-Virus, Cytomegalo- Virus und Herpes-Virus ebenso wie Streptococcen der Gruppe A und der Gruppe B, Neisseria gonorrhea, Trichomonas vaginalis, Candida albicans, Chlamydia trachomatis und Hemophilus influenza.
Natürlich erkennt der Fachmann mit dem Vorteil des Wissens der vorliegenden Erfindung, daß die vorliegende Erfindung anwendbar ist auf Assays, die die Technologie der Nukleinsäuresonden betreffen. Insbesondere kann eine Nukleinsäuresequenz, die komplementär ist zu einem Teil der Nukleinsäuresequenz eines interessierenden Liganden, an Mikrokügelchen gebunden werden, die anschließend in eine poröse Matrix eingeschlossen werden. Ein solches Festphasensystem kann in eine Vorrichtung, wie vorher beschrieben, eingearbeitet werden und in Assay-Verfahren verwendet werden. Um ein solches Assay-Verfahren durchzuführen, wird eine Probeflüssigkeit, von der angenommen wird, daß sie den Zielliganden enthält, auf die feste Phase gebracht und der interessierende Ligand wird von der Festphase eingefangen. Danach wird eine markierte Nukleinsäuresonde mit einer Nukleinsäuresequenz, die komplementär ist zu einem anderen Teil der Nukleinsäuresequenz des Zielliganden, zugegeben, um die Bildung eines Komplexes der markierten Nukleinsäuresonde mit dem Liganden, der auf der Festphase gebunden ist, zuzulassen. Der Nachweis der markierten Nukleinsäuresonde, die an dem Festphasensystem gebunden ist, liefert einen Hinweis auf die Gegenwart des Analyten in einer gegebenen Probe.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern.

Beispiel I

Bindung von Tetrazoliumsalz an einen porösen Festphasenträger über eine Mikrokügelchensuspensionsträgerlösung

Mikrokügelchen wurden mit monoklonalem Antikörper gegen HCG beschichtet mit dem Verfahren der passiven Adsorption von Protein an eine Latexoberfläche. Die mit Antikörper beschichteten Mikrokügelchen wurden dann in einer Lösung, die 10 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, 0,1 Gew.-% Natriumazid, 10 Gew.-% Saccharose und ungefähr 1 g/l p-Nitroblau-tetrazoliumchlorid enthielt, deren pH 7,0 war, suspendiert. Ein Volumen antikörperbeschichtete Mikrokügelchen und die Tetrazolium enthaltende Suspensionslösung wurden auf eine poröse Nylonmembran gebracht und die Membran wurde trocknen gelassen. Ein Immunoassay unter Verwendung einer ICON-Vorrichtung, die die behandelte Membran enthielt, wurde dann durchgeführt auf Serum- HCG unter Verwendung von 0,250 ml HCG enthaltendem Serum und anschließend 0,150 ml Anti-HCG-Antikörper:alkalische Phosphataserezeptor:Enzymkonjugat. Das Rezeptor:Enzymkonjugat wurde mit dem immobilisierten Antikörper:HCG-Komplex 1 Minute inkubiert und dann wurde eine Trennung gebunden/ungebunden durchgeführt durch Zugabe von 1 ml wäßriger Waschlösung. 0,150 ml einer Lösung, die Indoxylphosphat enthielt, wurden mit der immobilisierten alkalischen Phosphatase 1 Minute reagieren gelassen. Ohne p-Nitroblautetrazolium entwickelt sich bei der Reaktion ein Blau, das charakteristisch für Indigoblau ist. Auf der Membran, die sowohl eingeschlossene Mikrokügelchen gegen HCG als auch adsorbiertes Tetrazolium enthielt, war die entwickelte Farbe rötlich, was charakteristisch ist für die Formazanform von p- Nitroblautetrazoliumchlorid.

=Beispiel II

Bindung von Tetrazoliumsalz an Latexmikrokügelchen vor dem Einschluß in einen porösen festen Träger

Eine Lösung, deren Zusammensetzung 10 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, 0,1 Gew.-% Natriumazid, 10 Gew.-% Saccharose und ungefähr 1 g/l p-Nitroblautetrazoliumchlorid war, mit einem Lösungs-pH von 7,0, wurde verwendet, um unbeschichtete Latexmikrokügelchen in einer Konzentration von ungefähr 1 Gew.-% zu suspendieren. Die Mikrokügelchen wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit gelegentlichem leichtem Umrühren inkubiert. Die Mikrokügelchensuspension wurde zentrifugiert, um die Mikrokügelchen zu pelletisieren und die Tetrazolium enthaltende Lösung wurde abdekantiert. Die tetrazoliumbeschichteten Mikrokügelchen wurden wieder in einer Lösung der Zusammensetzung 10 mM Natriumphosphat, 150 mM Natriumchlorid, 0,1 Gew.-% Natriumazid und 10 Gew.-% Saccharose mit einem pH von 7,0 auf eine Konzentration von 1 Gew.-% Latexmikrokügelchen resuspendiert. Die resuspendierten tetrazoliumbeschichteten Mikrokügelchen wurden dann in einem Verhältnis von 1 : 1 mit Latexmikrokügelchen, die mit monoklonalem Antikörper gegen HCG beschichtet waren, vermischt. Ein Volumen der entstehenden Mischung von tetrazoliumbeschichteten und antikörperbeschichteten Mikrokügelchen wurden auf eine poröse Nylonmembran gebracht und lufttrocknen gelassen. Die Mikrokügelchen enthaltende Membran wurde in eine ICON-Vorrichtung eingesetzt und ein Immunoassay auf HCG wurde durchgeführt wie folgt: 0,250 ml einer HCG enthaltenden Probe wurden zugegeben und anschließend wurden 0,150 ml Anti-HCG-Antikörper: alkalische Phosphataserezeptor:Enzymkonjugat zugegeben und 1 Minute inkubiert. Eine Trennung gebunden/ungebunden Rezeptor: Enzymkonjugat wurde erreicht durch Zugabe von ungefähr 1 ml Waschlösung. Nachdem die Waschlösung ablaufen gelassen worden war, wurden 0,150 ml Enzymsubstratlösung enthaltend Indoxylphosphat zugegeben und 1 Minute das Substrat durch das Enzym umwandeln gelassen. Die entstehende Reaktionszone war von rötlicher Farbe, was die Gegenwart der Formazanform des p-Nitroblautetrazoliumchlorids zeigt, und nicht Indigoblau, was von dem einfachen Reaktionsprodukt von Indoxylposphat und alkalischer Phosphatase erwartet würde.

Claims

1. Festphasensystem zur Verwendung in einem Liganden-Rezeptor- Assay für den Nachweis eines ausgewählten Analyten in einer Probeflüssigkeit, umfassend einen festen Träger, auf dem im gleichen Bereich lokalisiert sind:

a) ein Rezeptor, der mit einem Zielliganden binden kann, und b) ein Tetrazoliumsalz, das die indigogene enzymatische Farbentwicklung verstärken kann.

2. Festphasensystem nach Anspruch 1, worin der feste Träger eine poröse Matrix, ein Kügelchen, eine Membran oder ein Filter ist.

3. Festphasensystem nach Anspruch 2, worin das Material für die poröse Matrix, das Kügelchen, die Membran oder der Filter ausgewählt ist aus Nylon, Polystyrol, Latex, Polyethylen, Polypropylen, Polystyrol, Glasfasern gemischt mit organischen Bindemitteln oder keramische Materialien, die behandelt wurden, um hydrophobe Bindungsstellen zu schaffen.

4. Festphasensystem nach Anspruch 1, worin der feste Träger eine poröse Matrix ist, worin mit Rezeptor beschichtete Mikrokügelchen durch Einschluß lokalisiert sind.

5. Festphasensystem nach Anspruch 1, worin der feste Träger eine poröse Matrix ist, worin mit Tetrazoliumsalz beschichtete Mikrokügelchen durch Einschluß lokalisiert sind.

6. Festphasensystem nach Anspruch 1, worin der feste Träger eine poröse Matrix ist, worin sowohl rezeptorbeschichtete Mikrokügelchen als auch tetrazoliumsalzbeschichtete Mikrokügelchen durch Einschluß lokalisiert sind.

7. Festphasensystem nach Anspruch 5, worin der Rezeptor auf dem festen Träger durch chemische Kupplung lokalisiert ist.

8. Festphasensystem nach Anspruch 4, worin das Tetrazoliumsalz auf dem festen Träger durch Adsorption aufgrund hydrophober Wechselwirkungen lokalisiert ist.

9. Festphasensystem nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Tetrazoliumsalz p-Nitroblautetrazoliumchlorid, m-Nitroneotetrazoliumchlorid oder Tetranitroblautetrazoliumchlorid ist.

10. Festphasensystem nach Anspruch 1, worin der Liganden-Rezeptor-Assay ein Immunoassay ist.

11. Festphasensystem nach Anspruch 1, worin der Liganden-Rezeptor-Assay ein Nukleinsäuresonden-Assay ist.

12. Festphasensystem nach Anspruch 1, worin der Rezeptor ein Antikörper oder ein Antigen ist, das fähig ist, den Zielliganden einzufangen.

13. Festphasensystem nach Anspruch 12, worin der Antikörper ein monoklonaler Antikörper ist.

14. Festphasensystem nach Anspruch 1, worin der feste Träger weiterhin mindestens eine diskrete Testzone und mindestens eine diskrete Referenzzone umfaßt, auf denen Rezeptor und Tetrazoliumsalz bzw. Referenzrezeptor und Tetrazoliumsalz lokalisiert sind.

15. Vorrichtung zur Verwendung in einem Liganden-Rezeptor-Assay für den Nachweis von mindestens einem ausgewählten Analyten in einer Probeflüssigkeit umfassend:

a) ein erstes poröses Glied umfassend ein Festphasensystem nach einem der Ansprüche 1 bis 14 und

b) ein Mittel, das mit dem ersten porösen Glied zusammenwirkt, um das Fließen der Probeflüssigkeit und der flüssigen Reagenzien, die in dem Test verwendet werden, durch das erste poröse Glied zu erleichtern.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, worin die das Fließen erleichternde Einrichtung ein absorbierendes Glied umfaßt, das mit dem ersten Glied in Verbindung steht, so daß das Fließen der Probeflüssigkeit und der flüssigen Reagenzien, die in dem Test verwendet werden, durch das erste Glied und zu dem absorbierenden Glied möglich wird, wobei das absorbierende Glied eine Oberfläche hat, oberhalb der das erste Glied angeordnet ist, und Kapillaren aufweist in einer Richtung, die im wesentlichen diagonal ist zur Oberfläche, oberhalb der das erste Glied angeordnet ist, wobei die Kapillaren in Verbindung stehen mit den Poren des ersten Glieds, um die Flüssigkeit, die durch das erste Glied gewandert ist, in die Kapillaren des absorbierenden Gliedes zu ziehen.