JPS5836631A - 固相と液相との反応方法及び装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

本発明Ｆ！同相に結合して存在する反応性物質と液相に
存在する反応性物質とを効率よく反応させ為方法及び該
方法番：使用する装置に関する。 体液中書＝微量に存在する物質や生体に投与した薬物の
血中もしくは尿中濃度を測定する手段として抗原抗体反
応を利用した免疫学的測定方法が使用されている。この
測定法にはいくつかの異なった測定原理に基づく方法が
知られておシ、それぞれが集用化されているが、測定感
度が高く、定量性に優れてｉる放射免疫学的測定法（Ｒ
Ｉ人）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）及び螢光免疫測定法
（ＦＩＡ）が広く用いられて−る。なかでもいわゆるサ
ンドイツチ法は測定感度が高く、操作が容易であるので
広く利用されている。 その測定原理は次の過砂である。 サンドイツチ法においては、被測定抗原とその抗原に対
する不溶化した抗体を反応させる（＄１１１反応）と両
者は反応して抗原抗体複合物を形成する。この抗原抗体
複合物に、標識剤で標識した被測定抗原と結合する抗体
（標識抗体）を反応させた（第２反応）６ｔ１抗原抗体
複合物に結合した標識抗体と結合しなかった標識抗体と
に分離し、いずれか一方の標識剤の活性を測定する。同
時に、１１１度既知の抗原について同様に操作して得ら
れた検量線から前記被測定抗原の量を一定する。′＆お
、前記標識剤としては酵素、放射性物質、螢光物質など
が使用される。 このよう表反応を行なうにあたり、抗体等の反応性物質
を不溶化するための担体として容器状の４０の内壁面を
使用すると都合がよい０例えばプフスナック試験管は不
溶化のための担体と反応容器とを兼ねる仁とができるの
で取扱いが便利であ〉、好んで用いられている。しかし
、反応容器の内壁面は抗体等の反応性物質を結合させる
表面積が他の担体、例えばプラスチックビーズ、Ｆ紙、
奄ルロース黴粒子勢に比べて小−ｆ５％ｆ％ので、その
表面に結合させうる反応性物質Ｏ量が少をいという欠点
がある。そのため、このよう表内壁面に反応性物質を不
溶化して有する反応容器で従来性なわれてきた反応方法
、即ち、試験管等の反応容器を直立させて静置もしくは
間歇的に攪拌１７て反応させる方法は長時間を要すると
いう欠点がある。 このような欠点を除去するため１本発明者らは、研究を
重ねた結果、従来〆行かわれてきたように、反応容器を
直立させて静置、もしくは間歇的に攪拌するのではたく
、反応容器を一′の角度に傾斜させて、一定の回転数で
回転さつつ反応を行なわせるととにより１反応容器不溶
仕損体として使用する方法において、従より測定感度を
高めうるとともに測定時間を・縮しうろことを見出し、
本発明を完成した。 すなわち、本発明は反応容器を傾斜させて１転させつつ
、反応を行わしめる反応方法、及びそのような反応方法
を実施するに際して必要ｉ傾斜回転装置を提供するもの
である。以下の記載におかては、説明の便宜上、反応容
器を試験管、反応容器の内壁面ｔ：結合して存在する物
質を抗体、液相中に存在する物質を抗原と（２て説明す
るが、本発明はこれらの組合せのみに限定されるもので
は彦い。 体液中に存在する物質は一般に微量であや、それを會む
体液自体も少量しか得られない場合が多い、そのため、
これらの物質の測定法は極〈少量の試料で高感度の測定
が可能なものでなければならない。したがって、従来、
この種の試薬ｒ−おいて、試験管に抗体を結合させる場
合、・試験管の底部に近い部分（底部から１傷程度）に
結合されているのが通常である。 これに対して本発明においては、前記のように反応容器
を傾斜させて１転させること６＝よって、試料が少量の
場合でも反応容器内面に結合した抗体と十分接触するこ
とが可能なので一試験管内壁画の上ｍｔで抗体を結合さ
せることができる。更に１回転による攪拌効果も得られ
るので、短時間で高感度の測定ができるのである。 抗体を結合させた反応容器内面の底部からの高さを一定
とした場合の傾斜角度と抗体結合部分を満たすに必ｌ！
愈試料液量との比率関係は第１表に示す通りであに、試
料液量を一定とした場合の傾斜角度と接触面積との関係
は第２表に示す通ヤである。 第１表 第２表 一般に二つの反応成分の接触が多いはど反応は良く進行
する。第１表から同一接触面積を得るに必要表試料の量
は反応容器の傾斜角が水平Ｃ：近％／ｈ＃ｔど少量で済
むので１反応液がこぼれ出ないＳ＊に水平に近い方が良
い。水平に近くなりても底部に対して試料が接触しなく
なることは１ｋｖｈ０反応容器の傾斜角度の上限には＃
Ｃ：制限はＸ＆いが、試料の節約あるいは測定感度上昇
の効果を得るためには４５度以下とするのが適蟲である
。 傾斜させた反応容器の回転数は１０〜１１００ｒｐが連
幽である。１０口ｒｐｍよ抄速いと試料が管壁に沿って
流下せず、−緒に回転してしまうので抗体と十分接触し
なくなるためであ％、１０ｒｐｍよシ遅−と攪拌効果が
著しく減少するからである。 本発明の反応方法は次のような利点を有する。 ：）反応容器はたえず回転しているため、反応ｉ［Ｏ攪
拌が十分に行なわれるので反応効率が嵐＜ｉｋｂ、高感
度の測定が可能で、測定精度が向上する。 １）　ＩＥ来、高感度の測定系を得るには試料液量を層
中すなどの処置が行なわれていたが１本発明にシーで第
１表（＝示したように、従来の一！−〜１の試料液量で
済むので実質上、従来の２　　　１０ 方法で試料液量を２〜１０倍に増加させたと同様の効果
を有する。 Ｉ）従来、反応の一方の成分の量が少ないと検量線の勾
配が小さいため測定の精度が低下する問題があつた。こ
れＣ二対して１本発明においては第２表に示したように
試料液量を従来と同一とすると試料と接触しうる反応容
器内面の面積は従来の１５〜４倍に拡大される。 従って、この拡大された部分にも抗体を結合させること
ができるので高感度、かつ高精度の測定系を得ることが
できる０例えば、アルファーフェトプロティン（ＡＦＰ
）の測定で同一試薬を用い、同一試料液量を使用し、各
濃度で５回づつ測定して第３表に示す結果を得た。第１
図はこの結果をもとに描いた検量線を比較したものであ
る０本発明の方法による検量線の方が従来法による検量
線より勾配が大きく、精度が高いことがわかる。なお、
とのＡＰＰの測定は傾斜角１０度、回転数３０ｒｐｍで
行なった。 第５表 −）反応時間を大巾に短縮することができる。 例えば％１ｓ４表はムＦＰの測定で同一試薬を使用して
同程度の測定感度及び精度、すなわち、同程度の勾配を
有する標準−線を得るに必要ｆｋ１１定時間を比較した
ものである。従来法で合計１２時間要した反応が本発明
の反応方法によって１時間で実施でき、測定時間が大中
Ｃ−４１ｉ輪されて−ることがわかる。この場合の傾斜
角は２０度、回転数は５０ｒｐｎｎであ抄、得られた標
準−線を第２図に示した。なお、ｌｉ来の静置反応で反
応時間を短縮すると、第２図

〔０〕のような著シ、〈勾
配の小さなＩＩＡ＝−纏に１ｈ実質上、測定を実施し得
ない。 第４表 本発明の方法に使用すΣ反応容器としては容器の内側に
反応性物質を固定化させ得るもので、その容器内で少量
の試料との反応を行ない得るものであれば良く、試験管
、光学セル、各種サンプルカッグ壜どが使用できる。本
発明の反応方法ＦｉＩ）反応容器の内面に結合して存在
している抗体と液相中に存在する抗原とを反応せしめる
場合の他、例えばサンドイツチ法にょる１ｉｉＩムにお
いては、−）前記１）の反応によって生じた抗体−抗！
１に複合体に標識抗体を反応させて不溶化抗体−測定抗
原−標識抗体複合体を形成させる工１、−）前記−）の
顎合体に酵素基質を反応させて酵素反応を行わしめる工
程等に利用することができる。 本発明の方法を実施するために反応容器を傾斜させて一
転させるには、反応容器を一定の角度に保持しつつ一定
の同転数を与え得れば、どのような方法　＊置を用いて
も良いが、この目的のために、特に設計された本発明の
反応容器傾斜回転装置を用いれば実施が確実かつ容易で
あるので有利である。 本発明の反応容器傾斜回転装置は、支持枠の外面に等間
隔で横方向に並べて突設したホルダー、各ホルダーを同
一方向に１０な−シ１１００ｒｐの任意の回転数で回転
させる手段、および前記ホルダーの突出方向を水平方向
に対して上方口ないし？Ｏ度の任意の角度に向けて前記
支持枠全体を固定するための固定手段とからなる。 次に上記の装置を図面に基づいて詳しく説明する。第５
ｇは本発明装置の一実施例を表わす。 反応容器人を載架する軸状のホルダー１Ｆｉ、支持枠２
の外面ｒ−岬間隔で横方向に並べて突設され、後記’８
６ＷＪに示す動力伝達系を介してモーター５によシ全て
同一方向に回転するようになっている。その回転数は調
節＠７によって１０〜１１００ｒｐの任意の回転数Ｃ：
設定できる。支持枠２はその外面に突設されたホルダー
１の突出方向を水平方向に対して上方０ないし９０ｇの
任意の角度に向けて固定しうるよう、固定台４にネジ５
で固定できるようになっている。容器ホルダー１には任
意の太さの鞘を堆付けて隣接するホルダー１間の距離を
調節することによ塾。 各種の太さの反応容器を載架して回転させることができ
る。 第６図は第５図の装置の動力伝達系の機構を示すため、
該装置をホルダ−１突設面の裏側から見た図である。モ
ーター３０口転数は減速器６で所定回転数に減速され、
かさ歯車８を介してホルダー１と同軸の同軸歯車９０１
つを回転させる。この同軸歯車９０回転は、回転方向調
豊川の中間歯車１０を介して次々と隣接する同軸歯車！
に伝達され、これによって各ホルダー１を同一方向に回
転させる。ホルダー１の各列の上下間隔を広く取シたい
ときは、支持枠２の裏面の上下に間隔を広くあけて設け
た中間歯車の間をチェーンで結ぶこと本できる。 本発明の倫の反応容器傾斜回転装置は、自由−転するロ
ーラーを運搬面に取付けたコンベアチェーン、骸チェー
ンを一定範囲の任意の゛速度で一方肉に駆動させる手段
、そして前記ローラー上に載架した反応容器に接触しな
がら運動して該反応容器を１０ないし１１００ｒｐの任
意の回転数で一定方向に回転２〆嘔ためのベルト１及び
前記ローラー上に載架した反応容器の口を水平方向よシ
上方０表いし９０度の任意の角変に保持する手段とから
なる。 次に、この装置を図面に基づいてさらに詳しく説明する
。第７図は本発明装置の一笑施例を表わし、第８図およ
び第９図は第７図の装置の反応容器載架部の拡大図であ
る。１０１は自由回転するｍ−う−１１７を運搬面に取
付けたコンベア用チェーンであり、ローラー１１７上に
反応容器人を載架するようになりている。チェーン１０
１はスズロケット１０２．回転軸１０３．歯車１０４゜
減速器１０５を通じて、モーター１０６４’：より駆動
させることによシ１反応容器を順次一方向に送る役目を
果す。一つの位置のローラーを隣のローラーの位置まで
送るための送り時間は調節器１０７によ？）、（１５〜
５分間の任意の間隔で設定できる。 反応容器は、押えローラー１０Ｂにより反応容器側に圧
迫されたベルト１０９によ抄回転させる。 ベル）　ＩＯ２＃ｉプーリー１１Ｑ、回転軸１１１　　
歯車１１２、減速器１１５を通じて、モーター１１４に
よシ駆動され、その速度は調節器１１５により調節して
反応容器を１０〜１１００ｒｐの範囲の任意の回転数に
設定できるように表っている。 この装置は例えば支持板１１６で支持して使用するが、
そのとき反応容器の口が水平より上方０〜９０度の範囲
の任意の角度になるように設定する。 この装置の使用によ）反応容器を連続回転攪拌しながら
、順次、自動送シさせることができる。このように自動
送シさせることにより、例えば試料液を添加した多数の
反応容器を次々にコンベアチェーンのスタート位置に戟
架し、この反応容器を回転させ慶から自動送）する間に
反応を完了せしめ、所定位置で反応の結果を例えば分光
光度針で自動的に測定することもできる。したがって、
本発明の装置は反応の自動化ｃ−ＩＩ＃に適する。 次に本発明の反応方法の実施例を示す。 実施例１　人ＦＦの測定 ａ）反応用試験管の製造 ポリスチレン製試験管を（ＬＤ５ＭＩＪン酸緩衝生理食
塩液ｐＨ６，４（以下ＰＢＳと略す）にて洗浄した後、
単りローン性抗ＡＦＰ抗体（Ａ）　（１吟−Ｊ）　　２
づを入れて、５６℃２０分間反応させた０反応後ＰＢＳ
で洗浄して抗ＡＰＩ’抗体（Ａ）感作試験管を製造した
。 また、［ジャーナル・オブ・ヒストケミストリー・アン
ドウサイトケミストリー（Ｊ、Ｈｉｓｔ−ｏｃｈｅｍ、
　Ｏｙｔｏｃｈｅｍ、　）　Ｊ第２２巻、第１０８４頁
（１９７４年）に記載されたＦ長；中機等の方法により
前記（Ａ）とけクローンの異なる単り−−ノ性抗体〔Ｂ
〕に西洋ワサビパーオキシデース（ベーリンガー　ｉン
ハ４４社ｇｒａｄｅ　１：以後ＨＲＰＯと略す）を標識
した後、ＰＢ８にて５０倍に稀釈して、１ｆｎｊずつ充
填した。 次いでこの両者を凍結乾燥した後密栓して、ＡＦＰ＠定
禁儂用試験管を製造した。 ｂ）ＡＦＰの測定 前記ａ）で製造したＡＦＰ測定用試験管にＦ　Ｂ　８０
．９　ｍｌを加えた後、ＡＦＰを１００へ１０Ｑ、　１
ａ　１　ｎｆｌ／ｍｌとなるよう健常人血清で稀釈した
各濃度の標準液０．１　ｍｌを加え前記第５図の装置の
容器支持ホルダー上に乗せ、傾斜角２０度、回転数５Ｏ
ｒｐｍで５０分間反応を行った。反応終了後、０００５
％Ｔ％ｖｅｅｎ２Ｑを含む生理食塩水（以下洗浄剤と略
す）で洗浄し、　ｓ　Ｏ呪々！の５−アミノサリチル酸
シよびａＯ％−過酸化水素を含む酵素基質液２ｇＩ＠Ｉ
を加え再び容器支持ボルダ−上に乗せ。 傾斜角２０度、嬬転数５０ｒｐｍで３０分間反応を行う
た。 鷹応終了後、２−アジ化ナトリクム５０−！を加え反応
を停止し１分光光度計を用いて、液長ｓＯＯ層場でａ光
度を測定した。得られた標準−曽を第３！ｌｒ−示した
。 実施例２　０Ｆｆムの橢迦 ａ）反応用試験管の製造 ４シスチレン製試験管をＰＨ１にて洗浄した後、単タロ
ーｙ性抗癌胎児抗原（０１人）抗体（Ａ’ｌ　＜　を暫
ζ）２４を入れて、５６℃。 ２０分間反応させた０反応後ＰＢ８で洗浄しで抗ＯＢム
抗体〔Ｘ〕感作試験管を製造した。 又、前記実施例ト１）と同様の操作で前記〔Ｘ〕とはり
一一ノの異なる単り四−ン性抗Ｏｌム抗体〔「〕にＨＲ
ＰＯを標識した後、ＰＢ８ｒ？ＳＯ＠ｉ’：稀釈し？　
１　ｍ７−ｂ充填した０次いで両者を凍結乾燥した後密
栓して、０８人測定用試験管を製造した。 ｂ）ｏｎムの測定 前記りで製造したＯＢＡ測定用試験管にＰＨ１（１９惰
ｊを加えた後、ＯＩＡを１０へ３Ｑ、１へ　＆１　　ｍ
９／−となるよう健常人血清で稀釈した各一度の標準液
α１１ＩＩ１１ｊを加え、前記第７図の装置のコンベア
用チェーン上に乗せ、傾斜角１０度１回転数３Ｏｒｐｍ
で２０分間反応を行った。反応終了後、洗浄剤で洗浄し
１００　ＷＩＮ／ｄｌの０−フェニレンシアミンおよび
Ｃ１５％過酸化水素水を含む酵素基質液２ｍｊを加え、
再びコンベア用チェーン上に乗せ傾斜角１０度％回転数
！１０ｒｐ翔で２０分間反応を行りた０反応終了後４Ｎ
塩酸（Ｌ　５　ｍ／を加え反応を停止し、分光光度計を
用いて波長４９２　ａｍで吸光変を測定した。得られた
標準曲線を第４図に示した。

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明の反応方法と従来の反応方法の検量線を
比較したグラフ、 第２１１は本発明の反応方法で反応時間の短縮が可能で
あるととを示すグラフ。 第１図は実施例１０ムＦＰの測定における標準曲線を示
すグラフ。 第４図は実施例２のＯＩＡの測定における標準白−を示
すグラフ。 ＊Ｓａａは本発明装置の一実施例を表わす図Ｓ第４ｍは
纂Ｓ図の装置の動力伝達系の説明°図、＃！７１１け本
発明の他の装置の一実施例を表わす図、 第＊＊＞よび第９図は第７図の装置の反応容器載架部の
拡大図である。 ム・・・反応容器、　　　　１・・・反応容器ホルダー
、２・・・支持枠、　　　　　＆　１０４１１４・・・
毫−ター、４・・・−室台１　　　５・・・ネ　　ジ。 ４１ａ翫１１３・・・減速Ｓ％　ス１０ス１１５・・・
調節器１・・・・かさ歯車％　　　　９・・・同軸歯車
、１０・・・中間歯車、　　　　１１・・・チェーン勤
１０１・・・コンベア用チェーン、１０２・・、スプロ
ケット、１０！Ｌ　１１１・・・同転軸、　　１１０４
．１１２・・・歯　車、１０日・・・押えローラー、１
０？・・・ベルト、１１０・・・ブー’）−ｓ　　　　
１１６・・・支持板、１１７・・・ローラー 特許出願人 持田製薬株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）　　反応ｌＩ優の内壁面に結合して存在する第１
   の反応性物質と液相に存在する第２の反応性物質との反
   応を行なわせるに轟り、前記部２の反応性物質を含む液
   を入れた該反応容器の口を水平方向よ〕上方５カいし４
   ５度の任意の角ｍｍ保持しつつ、１０ないし１１００ｆ
   ｐの任意の回転数で、該反応容器の軸を中心に回転させ
   ながら行なわせる反応方法。 （２）反応容器の内壁面に結合して存在する反応性物質
   が抗原又は抗体で′Ｉりシ、液相に存在する反応性物質
   が対応する抗体又は抗原である特許請求の範囲第１項記
   載の反応方法。 （３）反応容器の内壁面に結合して存在する反応性物質
   が抗体であシ、液相に存在する反応性物質が前記抗体に
   対応する抗原と腋抗原を放射性同位体元素、酵素又は螢
   光物質で標識した標識抗原との混合物である特許請求の
   範囲ｌＩｉ項記載の反応方法。 （４）反応容器の内壁面に結合して存在する反応性物質
   が不溶化した抗体とその抗体に対応する抗原との複合物
   であシ、液相に存在する反応性物質が放射性同位元素、
   酵素又は螢光物質で標識された腋下溶化反応性物質に対
   応する標識抗体である特許請求の範１１＃１１項記載の
   反応方法。 （５）反応容器の内壁面に結合して存在する反応性物質
   が不溶化した抗体とその抗体に対応する標識抗原との複
   合物又は不溶化した抗体、その抗体に対応する抗原及び
   酵素標識抗体との５者の複合物であシ、液相に存在する
   反応性物質が酵素基質である特許請求の範囲第１項記戦
   の反応方法。 （６）反応容器が、ガラス又はプラスチック製でＴｏＩ
   内径が５〜２０簡の円柱状又は角柱状の容器で参る特許
   請求の範囲第１項記載の反応方法。 ｆｆ）支持枠の外面に等間隔で横方向に並べて突設した
   ホルダー、各ホルダーを同一方向（：１０＆％ＡシＩＱ
   Ｑｒｐ１ｍの任意の回転数で回転させる手段、シよび前
   記ホルダーの突出方向を水平方向ζ対して上方０ないし
   ９０度の任意の角度Ｃ；向けて前記支持枠全体を固定す
   るための固定手段とから表る反応容器傾斜回転装置。 （８）自由回転するローラーを運搬面に取付けたコンベ
   アチェーン、該チェーンを一定範囲の任意の速度で一方
   向に駆動させる手段、そして前記ローラー上に載架した
   反応容器に接触し念から運動して該反応容器を１０ない
   し１１００ｒｐの任意の回転数で一定方向に回転さ也る
   ためのベルト、及び前記ローラー上に載架した反応容器
   の口を水平方向よシ上方口ないし９０度の任意の角変に
   保持する手段とからなる反応容器傾斜回転装置。