SE454466B - Immunologiskt forfarande och apparat for omsettning av fasta och flytande faser varvid reaktionskerlet roterar under lutning - Google Patents

Description

454 466 Liknande procedurer upprepas för ett antigen vid kända koncentrationer för upprättande av en kalibreringskurva. Mängden antigen i ett prov bestämmes med hjälp av kalibreringskurvan.

Vid genomförande av dessa reaktioner är det lämpligt att använda innerväggen av ett kärl såsom bärare för en reaktiv substans, t ex en antikropp, som skall insolubiliseras. Ett provrör av plast användes- t ex ofta, eftersom detta tjänar både såsom bärare för insolubilisering och såsom reaktionskärl och är lätt att hantera. Innerväggen av ett reaktionskärl har emellertid den nackdelen, att den specifika yta på vilken en antikropp eller annan reaktiv substans fixeras, är mindre än vid användning av andra bärare, såsom plastpärlor, filterpapper eller cellulosapartiklar, och den kan därför uppbära bara en mindre mängd av den reaktiva substansen. Reaktionstiden blir därför lång vid det kon- ventionella förfarandet, där ett provrör eller annat reaktionskärl upp- bärande en insolubiliserad reaktiv substans på ytan av innerväggen hålles stillastående i upprätt läge, eller där innehållet omröres inter- mittent. Ändamålet med föreliggande uppfinning är att åstadkomma ett för- farande för effektiv omsättning av en reaktiv substans fixerad på en fast fas med en reaktiv substans i en flytande fas. Ändamålet med upp- finningen är särskilt att åstadkomma ett förbättrat förfarande för bestämning av mängden av en reaktiv substans i en flytande fas medelst en reaktiv substans fixerad på en fast fas. Mera specifikt är ändamålet med uppfinningen att åstadkomma ett snabbt förfarande för bestämning av ett antigen eller en antikropp i en flytande fas med hjälp av en antikropp eller ett antigen eller ett komplex av dessa fixerad(t) på en fast fas. Ett annat ändamål med uppfinningen är att åstad- komma en apparat, pà vilken reaktionskärl roteras i lutande läge för genomförande av nämnda förfarande.

Uppfinningen avser sålunda ett ímmunologiskt förfarande för omsättning av en första reaktiv substans bunden till den inre väggytan av ett reaktíonskärl med en andra reaktiv substans i en flytande fas i reaktionskärlet, varvid reaktions- kärlet roteras, och detta förfarande kännetecknas av att reaktionskärlet roteras omkring sin axel med en hastighet av 10-100 varv per min under det att det hålles lutande med en vinkel av mellan 50 och 450 mot horisontalplanet. 454 466 Andra ändamål med och särdrag hos föreliggande uppfin- ning framgår av nedanstående beskrivning med bifogade rit- ningar. De beskrivna utföringsformerna är endast exempli- fierade, och olika variationer och modifikationer därav är möjliga inom ramen för uppfinningen såsom den definieras i patentkraven.

Fig 1 på ritningen är ett diagram som jämför ka- libreringskurvor erhållna genom förfarandet enligt uppfinningen och genom det konventionella förfarandet; fig 2 är ett diagram som visar att reaktionstiden kan förkortas genom förfarandet enligt uppfinningen; fig 3 är ett diagram som visar en stan- dardkurva för AFP-analysen i exemplet; fig 4 visar en apparat enligt uppfinningen; och fig 5 illustrerar ett kraftöver- föringssystem för den i fig 4 visade apparaten.

Omfattande studier har genomförts för eliminering av de ovan angivna nackdelarna med det konventionella förfarandet utnyttjande ett reaktionskärl såsom bärare för insolubiliserade substanser. Såsom resul- tat härav har man upptäckt, att en högre grad av känslighet och en minskad reaktionstid kan uppnås, om reaktionskärlet lutas i en viss vinkel och roteras med en viss hastighet under reaktionen i stället för att hållas i upprätt läge stillastående eller med intermittent omrör- ning av innehållet. Denna upptäckt har lett till föreliggande uppfin- ning.

Föreliggande uppfinning avser sålunda ett reaktionsförfarande, vid vilket ett reaktionskärl roteras i lutande läge, och en apparat för genomförande av förfarandet. I den följande beskrivningen utgöres reak- tionskärlet av ett provrör, den substans som uppbäres på reaktionskärl- ets innervägg utgöres av en antikropp, och substansen i den flytande fasen utgöres av ett antigen. Uppfinningen är emellertid icke begränsad till denna kombination, som användes endast för att göra beskrivningen enklare.

Substanser i kroppsvätskor förekommer vanligen i mycket små mängder, och kroppsvätskorna såsom sådana är ofta tillgängliga endast i små volymer. Vilken metod som än användes för bestämning av dylika substanser, måste metoden nödvändigtvis ha en hög grad av analytisk känslighet för ett prov som är tillgängligt endast i en mycket liten mängd. Det har därför varit vanligt att fixera en antikropp vid inner- väggen av ett provrör endast i närheten av rörets botten, t ex på en . area upp till en höjd av 1 cm från rörets botten. 454 .466 Föreliggande uppfinning gör det däremot möjligt att fixera en antikropp på en större area, inklusive den övre delen av provröret, eftersom provet, även om det är tillgängligt endast i en liten volym, kan bringas i vidsträckt kontakt med antikroppen, om reaktionskärlet roteras i lutande läge på ovan beskrivet sätt. Rotationen av provröret bidrager dessutom till omrörning av innehållet däri, och härigenom möjliggöres mätning med hög känslighet på kort tid.

I nedanstående tabell 1 visas sambandet mellan reaktionskärlets lutningsvinkel och den relativa mängd prov som erfordras för vätning av den antikroppbärande delen av reaktionskärlet,_när arean med fixerad antikropp i kärlet är konstant. I tabell 2 visas sambandet mellan reak- tionskârlets lutningsvinkel och arean för kontakt mellan provet och kärlets inneryta om mängden prov är konstant.

Tabell 1 Lutningsvinkel Erforderlig relativ provvolym so° (upprättståenae) 1 45° _ ca 1/2 30° ca 1/3 20° ca 1/5 1o° ca 1/10 Tabell 2 Lutningsvinkel Relativ storlek av kontaktarean 9o° (upprättståæae) “ 1 40° ca 1,5 30° ca 2 20° ca 3 1o° ca 4 Det är vanligen så, att ju större kontaktytan är för två reak- tionskomponenter, desto effektivare kan de omsâttas med varandra. Så- som framgår av tabell 1 minskar den provvolym som erfordras för att väta den konstanta kontaktarean med minskning av reaktionskärlets lut- ningsvinkel mot horisontalplanet. Det är följaktligen önskvärt att luta.reaktionskärlet så nära horisontalplanet som möjligt förutsatt att vätskan i kärlet icke rinner ut. Även när reaktionskärlet har en mycket liten lutningsvinkel mot horisontalplanet, t ex 5°, är det ingen risk att provet icke skall komma i kontakt med kärlets botten, om icke' 454 466 provvolymen är ytterst liten. Den övre gränsen för reaktions- kärlets lutningsvinkel är 45°, allra helst 10-20°, för att man skall spara provvolym och öka den analytiska känsligheten.

Det lutande reaktionskärlet roteras med en hastighet av 10-100 varv per min, allra helst 25-55 varv per min. Om rotationshastígheten överstiger 100 varv per min, strömmar provet icke ned längs rörväggen, utan det roterar med kärlet, varvid kontakten mellan provet och antikroppen försämras. Om á andra sidan rotationshastigheten är mindre än 10 varv per min, försämras avsevärt den omrörningseffekt som skall skapas genom kärlets rotation.

Förfarandet enligt uppfinningen har följande fördelar. (i) Den kontinuerliga rotationen av reaktionskärlet säkerställer tillräcklig omrörning av reaktionsblandningen, förbättrad reaktionseffektivitet, hög analyskänslighet och förbättrad analysnoggrannhet. (ii) För erhållande av ett analyssystem med hög känslighet har det hittills varit vanligt att använda en ökad provvolym. Enligt upp- finningen är det emellertid tillräckligt att använda en provvolym som är endast 1/2 till 1/10 av den hittills erforderliga volymen (se tabell 1). Detta har samma effekt som om det konventionella förfarandet genom- fördes med 2-10 gånger större provvolym än vad som vanligen användes. (iii) När provvolymen är liten vid det konventionella förfaran- det, blir kalibreringskurvans lutning mindre, vilket försämrar mätnog- grannheten. Enligt uppfinningen kan emellertid arean för kontakt mellan provet och reaktionskärlets inneryta ökas till 1,5-4 gånger den hit- tills erhållna kontaktarean, även om samma lilla provvolym användes (se tabell 2). Eftersom antikroppen kan bindas till en större area, är det möjligt att erhålla ett analyssystem med hög känslighet och noggrannhet. I tabell 3 visas resultat av analyser för bestämning av N-fetoprotein (AFP) genomförda med användning av samma reagens och samma provvolym. Man genomförde fem analyser vid varje koncentration, dels i enlighet med uppfinningen och dels enligt det konventionella förfarandet. I figur 1 visas kalibreringskurvor baserade på resultaten i tabell 3. Man kan observera, att kalibreringskurvan enligt uppfinning- en har en större lutning än den kurva som erhålles med det konvention- ella förfaradet. Förfarandet enligt uppfinningen har sålunda en större noggrannhet. Dessa AFP-analyser genomfördes i ett reaktionskärl, som lutade 10° mot horisontalplanet och roterade med en hastighet av 30 varv per minut. 454 _466 s 'raben 3 AFP4«xræmtration (ns/ml) 0 1 10 1oo Kßflríiefnflafianfie optisk täthet* o,19s¿o,oo1 o,z4o¿o,oo7 o,34s¿o,oo9 o,s39¿o,o19 W % 8.5 6,2 6,0 6,7 flëšiëfifllrbfi optisk täthet* o,o2s_¿o,oo1 o,1s4¿o,uo2 o,412_+_o,1os o,97o¿o,oos CV% 7,4 2,4 2,6 1,3 * :neaeivärae 3; neaelfei (iv) Reaktionstiden kan minskas kraftigt. I tabell 4 visas de analystider som erfordras för erhållande av liknande analytisk käns- lighet och noggrannhet, dvs kalibreringskurvor med liknande lutning, vid det konventionella förfarandet och förfarandet enligt uppfinningen, varvid samma reagens användes i en analys för bestämning av AFP. Enligt uppfinningen lutades reaktionskärlet 20° mot horisontalplanet, under det att det roterades med en hastighet av 50 varv per minut. De erhåll- na standardkurvorna.visas i fig 2. Man kan se att minskningen av ana- lystiden var så stor att de reaktioner som krävde totalt 12 timmar vid det konventionella förfarandet kunde genomföras på 1 timme vid förfaran- det enligt uppfinningen. Förkortning av reaktionstiden vid det konven- tionella förfarandet resulterade däremot i en standardkurva med en mycket liten lutning (se fig 2), och godtagbara analysresultat kunde därför icke erhållas.

Tabell 4 Kmuæmmionellt förfarande Eörfiææufie enligt1mpfflv (stillastående, upprätt- ningen (luuæfk:och:xme- stående reaktionskärl) rande reaktionskärl) Eïrsta reaktfl1 60 min 20 min Andra reaktion 60 min 20 nån Emqmmeádfirm 10 h 20nun Det vid förfarandet enligt uppfinningen använda reaktionskärlet kan t ex vara ett provrör, en optisk cell eller en provkyvett, vari en reaktiv substans är fixerad på innerytan i och för omsättning med en liten mängd prov i kärlet. Reaktionskärlet är företrädesvis en 454 466 cylinder av glas eller plast med cirkulär eller polygonal botten och med en innerdiameter av 5-20 mm. Förfarandet enligt uppfinningen kan t ex användas (i) för omsättning av en antikropp fixerad på innerytan av ett reaktionskärl med ett antigen i en flytande fas, och vid EIA enligt sandwichmetoden även t ex (ii) för omsättning av en märkt anti- kropp med det vid reaktion (i) ovan bildade antikropp-antigen-komplexet till bildning av ett komplex innefattande den insolubiliserade anti- kroppen, det antigen som skall bestämmas och den märkta antikroppen, eller (iii) för omsättning av ett enzymsubstrat med det under (ii) bildade komplexet för genomförande av en enzymreaktion.

Vid den konkurrerande reaktionsmetoden kan förfarandet enligt uppfinningen användas när det antigen som skall bestämmas och det märkta antigenet omsättes med den insolubiliserade antikroppen. Fack- mannen inser naturligtvis att det finns många andra användningsområden för förfarandet och apparaten enligt uppfinningen, och uppfiningen är icke begränsad till denna speciella användning.

För att luta och rotera reaktionskärlet vid genomförande av för- farandet enligt uppfinningen är det möjligt att använda vilken som helst anordning eller apparat som kan hålla kärlet i en föreskriven vinkel och rotera det med en föreskriven hastighet. För detta ändamål kan det emellertid vara fördelaktigt att använda den speciellt utforma- de apparaten enligt uppfinningen, med vilken det är lätt att genomföra förfarandet på lämpligt sätt.

Apparaten enligt uppfinningen avsedd att rotera ett reaktions- kärl i lutande läge innefattar en eller flera i sidled anordnade rader av på lika avstånd från varandra anordnade hållare utskjutande från en ytteryta av en ram, organ för att rotera hållarna i samma riktning med förutbestämd hastighet, och organ för att inställa ramen på sådant sätt att hållarna kan lutas uppåt med en förutbestämd vinkel mot horisontal- planet. _ Apparaten beskrives nedan mera i detalj under hänvisning till ritningen. Fig 4 visar en apparat enligt uppfinning- en. På lika avstånd från varandra anordnade, lângsträckta hållare 1 skjuter ut från en ytteryta av en ram 2 och uppbär reaktionskärl A.

Hållarna 2 roteras i samma riktning medelst en motor 3 genom ett kraft- överföringssystem, som beskrives nedan under hänvisning till fig 6.

Hàllarnas rotationshastighet kan väljas inom intervallet 10-100 varv per minut med hjälp av ett regleringsorgan 7. Ramen 2 fästes genom en skruv 5 på en stationär basplatta 4 så att hållarna 1 utskjutande från ramens ytteryta kan lutas uppåt i en vinkel av mellan OO och 900 mot 4s4_466 horisontalplanet. Fodral med önskad diameter kan anbringas utanpå hållar- na 1 för reglering av avståndet mellan två angränsande hållare så att hållarna 1 kan uppbära och rotera reaktionskärl med önskad diameter.

Pig 5 visar apparaten i fig 4 sedd från baksidan mitt emot hâllarna 1 och illustrerar kraftöverföringssystemet. Rotationen av motorn 3 minskas genom ett hastighetsreducerande organ 6 till före- skriven nivå och överföres via ett koniskt kugghjul 8 till ett av kugg- hjulen 9, vilka är koaxiala med hållarna 1. Rotationen av det koaxiala kugghjulet 9 överföres till de angränsande koaxiala kugghjulen 9 ett efter ett genom mellanliggande kugghjul 10, vilka reglerar rotations- riktningen så att alla hållarna 1 roteras i samma riktning. Om ett stort vertikalt avstånd önskas mellan de angränsande raderna av hållare 1, är det möjligt att öka avståndet mellan raderna av mellanliggande kugghjul 10 på ramens 2 baksida och anordna en kedja 11 mellan ett av de mellanliggande kugghjulen i en rad och ett av de mellanliggande kugghjulen i en annan rad.

Förfarandet enligt uppfinningen illustreras i följande exempel.

Exempel Analys för bestämning av AFP. (a) Framställning av reaktionsprovrör. 2 ml monoklonala anti-AFP-antikroppar (A) (1 mg/ml) infördes i vart och ett av polystyrenprovrör (diameter 12 mm; höjd 100 mm), varpå man inkuberade rören vid 50°C under 20 minuter. Varje provrör tvättades sedan med 0,05 M fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med pH 6,4. Härvid erhölls provrör sensibiliserade med antikroppen (A). En annan mono- klonal antikropp (B), från en klon som skiljer sig från (A)-klonen, märktes med pepparrots-peroxidas (Boehringer Mannheim, kvalitet I; nedan kallat HRPO) enligt den metod som har beskrivits av Nakane et al i J. Histochem. Cytochem., 22, 1084 (1974). Antikroppen utspäddes med PBS (49:1), och 1 ml av den utspädda antikroppen infördes i varje polystyrenprovrör sensibiliserat med antikroppen. (A). Sedan prov- rören hade lyofiliserats, tillslöts de tätt. (b) AFP-analys.

I provrör för AFP-analys framställda på det sätt som beskrives under (a) ovan infördes 0,9 ml PBS. Därefter tillsattes 0,1 ml stand- ard-AFP-lösning framställd genom utspädning av AFP med normalt human- serum till en koncentration av 1, 10, 100 eller 1000 ng AFP per ml.

Provrören monterades på hållarna i den i fig 4visade apparaten så att de lutade uppåt med en vinkel av 200 mot horisontalplanet. Reaktionen fick äga rum under 30 minuter, varvid provrören roterades med en has- tighet av 50 varv per minut. Efter avslutad reaktion tvättades prov-

Claims (14)

454 466 9 rören med fysiologisk saltlösning innehållande 0,005 % Tween 20 (kallas nedan tvättningsmedel). I varje provörr infördes därpå 2 ml av en enzymsubstratlösning innehållande 50 mg 5-aminosalicylsyra per dl och 0,01 % väteperoxid. Provrören monterades ånyo uppåtlutande på hållarna med en vinkel av 20° mot horisontalplanet. Reaktionen fick äga rum under 30 minuter, varvid provrören roterades med en hastighet av 50 varv per minut. Därefter avbröts reaktionen genom tillsättning av 50 Pl 2 %-ig natriumazidlösning. Reaktionsblandningens absorbans vid våglängden 500 nm mättes medelst en spektrofotometer. Den erhållna kalibrerings- kurvan visas i fig 3. P a t e n t k r a v

1. Immunologiskt förfarande för omsättning av en första reaktiv substans bunden till den inre väggytan av ett reaktionskärl med en andra reaktiv substans i en flytande fas i reaktionskärlet, varvid reaktionskärlet roteras, k ä n n e t e c k n a t av att reaktions- kärlet roteras omkring sin axel med en hastighet av 10-100varv per minut under det att det hålles lutande med en vinkel av mellan 50 och 45° mot horisontalplanet.

2. Förfarande enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a t av att reaktionskärlet hålles lutande med en vinkel av mellan 100 och 200 mot horisontalplanet.

3. Förfarande enligt krav 1 eller 2, k ä n n e t e c k n a t a v att rotationshastigheten är från 25 till 55 varv per minut.

4. Förfarande enligt något av kraven 1-3, k ä n n e t e c k n a t a v att den första reaktiva substansen är ett antigen eller en anti- kropp, och att den andra reaktiva substansen är en motsvarande anti- kropp respektive ett motsvarande antigen.

5. Förfarandc enligt något av kraven 1-3, k ä n n e t e c k n a t a v att den första reaktiva substansen är en antikropp, och att den andra reaktiva substansen är en blandning av ett motsvarande antigen och ett märkt antigen erhållet genom märkning av nämnda antigen med ett märkningsmedel valt bland radioaktiva isotoper, enzymer och fluore-É scerande substanser. 454 466 10

6. Förfarande enligt något av kraven 1-3, k ä n n e t e c k n a t a v att den första reaktiva substansen är ett komplex av en insolu- biliserad antikropp och ett motsvarande antigen, och att den andra reaktiva substansen är en märkt antikropp motsvarande den insolubili- serade reaktiva substansen och märkt med ett märkningsmedel valt bland radioaktiva isotoper, enzymer och fluorescerande substanser.

7. Förfarande enligt något av kraven 1-3, k ä n n e t e c k n a t a v att den första reaktiva substansen är ett komplex av en insolu- biliserad antikropp och ett motsvarande märkt antigen, och att den andra reaktiva substansen är ett enzymsubstrat.

8. Förfarande enligt något av kraven 1-3, k ä n n e t e c k n a t. a v att den första reaktiva substansen är ett komplex av en insolubi- liserad antikropp, ett motsvarande antigen och en antikropp märkt med ett enzym, och att den andra reaktiva substansen är ett enzymsubstrat.

9. Förfarande enligt något av kraven 1-3, k ä n n e t e c k n a t a v att reaktionskärlet är en cylinder av glas eller plast med cirku- lär botten och med en innerdiameter av 5-20 mm.

10. Förfarande enligt något av kraven 1-3, k ä_n n e t e c k n a t a v att reaktionskärlet är en cylinder av glas eller plast med poly- gonal botten och med en innerdiameter av 5-20 mm. _

11. Apparat avsedd för genomförande av immunanalyser och avsedd att rotera ett eller flera reaktionskärl i lutande läge, k ä n n e- t e c k n a d av att den innefattar en eller flera i sidled an- ordnade rader av på lika avstånd från varandra anordnade hållare (1) utskjutande från en ytteryta av en ram (2): organ (3, 6-11) för att rotera hâllarna (1) i samma riktning med förutbestämd hastighet; och organ (4, 5) för att inställa ramen (2) på sådant sätt att hål- larna (1) kan lutas uppåt med en förutbestämd vinkel mot horison- talplanet.

12. Apparat enligt krav 11, k ä n n e t e c k n a d a v att den förutbestämda hastigheten är frân_10 till 100 varv per minut, och att den förutbestämda vinkeln är från s° till 4s°.

13. Apparat enligt krav 12, k ä n n e t e c k n a d a v att den förutbestämda hastigheten är från 25 till 55 varv per minut.

14. Apparat enligt krav 12 eller 13, k ä n n e t e c k n a d a v att den förutbestämda vinkeln är från 1o° till 2o°. H