SE435999B - Apparat for att rotera reaktionskerl i lutande lege - Google Patents

Description

8307238-9 «~.-.. 2 Vid genomförande av dessa reaktioner är det lämpligt att använda innerväggen av ett kärl såsom bärare för en reaktiv substans, t ex en antikr0PP, som skall insolubiliseras. Ett provrör av plast användes t ex ofta, eftersom detta tjänar både såsom bärare för insolubiliserinq och såsom reaktionskärl och är lätt att hantera. Innerväggen av ett reaktionskärl har emellertid den nackdelen, att den specifika yta på vilken en antikropp eller annan reaktiv substans fixeras är mindre än vid användning av andra bärare, såsom plastpärlor, filterpapper eller cellulosapartiklar, och den kan därför uppbära bara en mindre mängd av den reaktiva substansen. Reaktionstiden blir därför lång vid det kon- ventionella förfarandet, där ettkprovrör eller annat reaktionskärl upp- bärande en insolubiliserad reaktiv substans på ytan av innerväggen _ hålles stillastående i upprätt läge, eller där innehållet omröres inter mittent.

Det är ett ändamål med föreliggande uppfinning att åstadkomma en apparat för att rotera reaktionskärl i lutande läge, vilken apparat effektivt kan bringa en reaktion att äga rum mellan en reaktiv substans fixerad på en fast fas och en reaktiv substans i en flytande fas. Ända~ målet med uppfinningen är särskilt att åstadkomma en apparat för att rotera reaktionskärl i lutande läge, vilken apparat gör det möjligt att bestämma mängden av en reaktiv substans i en flytande fas medelst en reaktiv substans fixerad på en fast fas med förbättrad känslighet och med förkortad reaktionstid. Mera specifikt är ändamålet med uppfin- ningen att åstadkomma en apparat som gör det möjligt att bestämma ett antigen eller en antikropp i en flytande fas med hjälp av en antikropp eller ett antigen eller ett komplex av dessa fixerad(t) på en fast fas med förbättrad känslighet och med förkortad reaktionstid.

Apparaten enligt föreliggande uppfinning innefattar ett transportorgan, såsom en transportkedja, med en transportyta på vilken fritt roterbara rullar är monterade, organ för drivning av transportorganet i en riktning med en föreskriven hastighet, en rem som förflyttas i kontakt med reaktionskärl anbragta på rullarna för att rotera reaktionskärlen i en förutbestämd rikt- ning med förutbestämd hastighet, och organ för att hålla reaktions- kärlen i lutande läge med förutbestämd vinkel mot horisontalplanet och med mynningarna uppâtriktade.

Dessa och andra ändamål med och särdrag hos föreliggande uppfinning framgår av nedanstående beskrivning med bifogade rit- ningar. De beskrivna utföringsformerna är endast exemplifierande, azovzss-9 3 och olika variationer och modifikationer därav är möjliga inom ramen för uppfinningen såsom den definieras i patentkraven.

Fig. 1 på ritningen är en vy som visar en apparat enligt uppfinningen; fig. 2 och 3 är fragmentariska förstorade vyer visan~ de det sätt på vilket reaktionskärl är anbragta i den i fig. 1 vi- sade apparaten; fig. 4 är ett diagram vari en kalibreringskurva erhållen med användning av apparaten enligt uppfinningen jämföres med en kalibreringskurva erhållen med användning av konventionell apparatur; fig. 5 är ett diagram som visar att apparaten enligt uppfinningen gör det möjligt att förkorta reaktionstiden; och fig. 6 är ett diagram som visar en kalibreringskurva för CEA-analysen i utföringsexemplet.

Omfattande studier har genomförts för eliminering av de ovan an- givna nackdelarna med det konventionella förfarandet utnyttjande ett reaktionskärl såsom bärare för insolubiliserade substanser. Såsom resultat härav har man upptäckt, att en högre grad av känslighet och en minskad reaktionstid kan uppnås, om reaktionskärlet lutas i en viss vinkel och roteras med en viss hastighet under reaktionen i stället för att hållas i upprätt läge stillastående eller med inter- mittent omrörning av innehållet. Denna upptäckt har lett till före- liggande uppfinning.

Föreliggande uppfinning avser sålunda en apparat avsedd att an- vändas vid en reaktion, där ett reaktionskärl roteras i lutande läge.

I den följande beskrivningen utgöres reaktionskärlet av ett provrör, den substans som uppbäres på reaktionskärlets innervägg utgöres av en antikropp, och substansen i den flytande fasen utgöres av ett anti gen. Uppfinningen är emellertid icke begränsad till denna kombination som användes endast för att göra beskrivningen enklare.

Substanser i kroppsvätskor förekommer vanligen i mycket små mängder, och kroppsvätskorna såsom sådana är ofta tillgängliga endast i små volymer. Vilken metod som än användes för bestämning av dylika substanser, måste metoden nödvändigtvis ha en hög grad av analytisk känslighet för ett prov som är tillgängligt endast i en mycket'iiten mängd. Det har därför varit vanligt att fixera en antikropp vid inner väggen av ett provrör endast i närheten av rörets botten, t ex på en area upp till en höjd av 1 cm från rörets botten. 8307238-9 4 Föreliggande uppfinning gör det däremot möjligt att fixera en antikropp på en större area, inklusive den övre delen av provröret, eftersom provet, även om det är tillgängligt endast i en liten volym, kan bringas i vidsträckt kontakt med antikroppen, om reaktionskärlet roteras i lutande läge på ovan beskrivet sätt. Rotationen av provröret bidrager dessutom till omrörning av innehållet däri, och härigenom möjliggöres mätning med hög känslighet på kort tid.

I nedanstående tabell 1 visas sambandet mellan reaktionskärlets lutningsvinkel och den relativa mängd prov som erfordras för vätning av den antikroppbärande delen av reaktionskärlet, när arean med fixe- rad antikropp i kärlet är konstant. I tabell 2 visas sambandet mellan reaktionskärlets lutningsvinkel och arean för kontakt mellan provet och kärlets inneryta om mängden prov är konstant. 7 Éfjßl 1 Lutningsvinkel Erforderlig relativ_provvolym 900 (upprättstâende) 1 450 ca 1/2 3o° _ ca 1/3 2o° ca 1/5 1o° ca 1/10 Tabell 2 Relativ storlek av kontaktarean Lutningsvinkel 90°_hqmmättstâemmà 1 40°> ca 1,5 3o° ca 2 2o° _ ca 3 0 10 ca 4 Det är vanligen så, att ju större kontaktytan'är för två reak- tionskomponenter, desto effektivare kan de omsättas med varandra.

Såsom framgår av tabell 1 minskar den provvolym som erfordras för att väta den konstanta kontaktarean med minskning av reaktionskärlets lutningsvinkel mot horisontalplanet. Det är följaktligen önskvärt :'att luta reaktionskärlet så nära horisontalplanet som möjligt förut- satt att vätskan i kärlet icke rinner ut, Även när reaktionskärlet har en mycket liten lutningsvinkel mot horisontalplanet, t ex Sot är det ingen risk att provet icke skall komma i kontakt med kärlets bott- en, om icke provvolymen är ytterst liten. Även om det icke finns nå- gon övre gräns för reaktionskärlets lutningsvinkel, är denna vinkel 8307238-9 5 företrädesvis mindre än 4s°, allra helst 1o-2o°, för att man skall spara provvolym och öka den analytiska känsligheten.

Man föredrager även att rotera det lutande reaktionskärlet med en hastighet av 10-100 varv per minut; allra helst 25-55 varv per mi- nut. Om rotationshastigheten överstiger 100 varv per minut, strömmar provet icke ned längs rörväggen, utan det roterar med kärlet, varvid kontakten mellan provet och antikroppen försämras. Om å andra sidan rotationshastigheten är mindre än 10 varv per minut, försämras avse- värt den omrörningseffekt som skapas genom kärlets rotation.

Det är sålunda ett ändamål med föreliggande uppfinning att åstad komma en apparat avsedd att användas vid omsättning av fasta och flytande faser, där ett reaktionskärl roteras i lutande läge under reaktionen.

Användning av apparaten enligt uppfinningen ger följande för- delar. (i) Den kontinuerliga rotationen av reaktionskärlet säkerstäl ler tillräcklig omrörning av reaktionsblandningen, förbättrad reaktnxm effektivitet, hög analyskänslighet och förßättrad analysnoggrannhet. (ii) För erhållande av ett analyssystem med hög känslighet har det hittills varit vanligt att använda en ökad provvolym. Enligt upp- finningen är det emellertid tillräckligt att använda en provvolym som är endast 1/2 till 1/10 av den hittills erforderliga volymen (se tabel 1). Detta har samma effekt som om det konventionella förfarandet genom fördes med 2-10 gånger större provvolym än vad som vanligen användes. (iii) När provvolymen är liten vid det konventionella förfaran- det, blir kalibreringskurvans lutning mindre, vilket försämrar mätnog- .grannheten. Enligt uppfinningen kan emellertid arean för kontakt mella provet och reaktionskärlets inneryta ökas till 1,5-4 gånger den hit- tills erhållna kontaktarean, även om samma lilla provvolym användes (se tabell 2). Eftersom antikroppen kan bindas till en större area, är det möjligt att erhålla ett analyssystem med hög känslighet och noggrannhet. I tabell 3 visas resultat av analyser för bestämning av ü-fetoprotein (AFP) genomförda med användning av samma reagens och samma provvolym. Man genomförde fem analyser vid varje koncentration, dels i enlighet med uppfinningen och dels enligt det konventionella förfarandet. I figur 4 visas kalibreringskurvor baserade på resultata i tabell 3. Man kan observera, att kalibreringskurvan enligt uppfinnm en har en större lutning än den kurva som erhålles med den konvention- ella êPParateD-. Apparaten enligt uppfinningen ger sålunda en störr noggrannhet. Dessa AFP-analyser genomfördes i ett reaktionskärl, som lutade 10° mot horisontalplanet och roterade med en hastighet av 30 varv per minut. g__ *azovzss-9 Éabell 3 AFP-koncentration *(ng/ml) 0 1 10 100 emrazfeasas Optisk täthet* 0,193f0,007 0,24Qi0,007 0,34§i0,009 0,63Q:0,019 CV % 8,5 6,2 6,0 6,7 êPParflisf2_1_-_9P1>f- Optisk täthet* 0,025:0,001 0,154i0,002 O,412:0,105 0,970i0,006 CV % 7,4 2,4 2,6 1,3 * nedeivärae 3 mdafei (iv) Reaktionstiden kan minskas kraftigt. I tabell 4 visas de analystider som erfordras för erhållande av liknande analytisk känslighet och noggrannhet, dvs. kalibreringskurvor med liknande lutning, med den konventionella apparaten och apparaten enligt upp- finningen, varvid samma reagens användes i en analys för bestämning av AFP. Enligt uppfinningen lutades reaktionskärlet 200 mot hori- sontalplanet, under det att det roterades med en hastighet av 50 varv per minut. De erhållna standardkurvorna visas i fig. 5. Man kan se att minskningen av analystiden var så stor att de reaktioner som krävde totalt 12 timmar med den konventionella apparaten kunde genomföras på 1 timme med apparaten enligt uppfinningen. Förkort- ning av reaktionstiden med den konventionella apparaten resulterade däremot i en standardkurva med en mycket liten lutning (se fig. 5), och godtagbara analysresultat kunde därför icke erhållas.

Tabell 4 Konventionell apparat (stillastående, upprätt- stående reaktionskärl) Apparat enligt uppfin- ningen (lutande och rote- rande reaktionskärl) Första reaktion 60 Hin 20 min Andra reaktion 60 nfin 20 min Enzymreaktion 10 h 20 min Det enligt uppfinningen använda reaktionskärlet kan t.ex. vara ett provrör, en optisk cell eller en provkyvett, vari en reaktiv substans är fixerad på innerytan i och för omsättning med en liten mängd prov i kärlet. Reaktionskärlet ärföreträdesvis en cylinder av glas eller plast med cirkulär eller polygonal botten och med en innerdiameter av 5-20 mm. Apparaten enligt uppfinningen kan t.ex. användas (i) för omsättning av en antikropp fixerad på 8-507238-9 7 innerytan av ett reaktionskärl med ett antigen i en flytande fas, och vid EIA enligt sandwichmetoden även t.ex. (ii) för omsättning av -en märkt antikropp med det vid reaktion di) ovan bildade antikropp- antigen-komplexet till bildning av ett komplex innefattande den insolubiliserade antikroppen, det antigen som skall bestämmas och den märkta antikroppen, eller (iii) för omsättning av ett enzym- substrat med det under (ii) bildade komplexet för genomförande av en enzymreaktion.

Vid den konkurrerande reaktionsmetoden kan apparaten enligt uppfinningen användas när det antigen som skall bestämmas och det märkta antigenet omsättes med den insolubiliserade antikroppen.

Fackmannen inser naturligtvis att det finns många andra användnings- områden för apparaten enligt uppfinningen, och uppfinningen är icke begränsad till denna speciella användning.

Apparaten enligt uppfinningen innefattar ett transportorgan, såsom en transportkedja, med en transportyta på vilken fritt roter- bara rullar är monterade, organ för drivning av transportorganet i en riktning med en föreskriven hastighet, en rem som förflyttas i kontakt med reaktionskärl anbragta på rullarna för att rotera reaktionskärlen i en förutbestämd riktning med förutbestämd hastig- het, och organ för att hålla reaktionskärlen i lutande läge med förutbestämd vinkel mot horisontalplanet och med mynningarna uppåt- riktade.

Denna apparat beskrives närmare nedan under hänvisning till ri ningen, på vilken fig 1 visar en utföringsform av apparaten enligt u finningen, och fig 2 och 3 är fragmentariska förstorade vyer som vis det sätt på vilket reaktionskärlen är uppburna i den i fig 1 visade apparaten. Apparaten innefattar en transportkedja 101 med en transpo yta på vilken fritt roterbara rullar 117 är monterade. Reaktionskärl uppbäres på ru11arna117. Kedjan 101 drives av en motor 106 via ett hastighetsreducerande organ 105, kugghjul 104, axlar 103 och kedjehj 102 så att reaktionskärlen förflyttas i en riktning. Tiden för förfl ning av en rulle från ett läge till ett angränsande läge kan väljas efter önskemål med hjälp av ett regleringsorgan 107, företrädesvis i intervallet 0,5-5 minuter. _ l Reaktionskärlen roteras medelst en rem 109, vilken pressas mot kärlen med hjälp av pressrullar 108. Remmen 109 drives av en motor 1 via ett hastighetsreducerande organ 113, kugghjul 112, axlar 111 och remskivor 110. Remmens hastighet kan regleras genom ett reglerings- organ 115 så att reaktionskärlen roterar med en hastighet av 10-100 varv per minut. &307238-9 Apparaten är t ex monterad på stödplattor 116 så att reaktions- kärlen kan ha mynningarna uppåtriktade och ha sina âxlar anordnade med en vinkel av mellan Oo och 90° mot horisontalplanet.

Apparaten kan användas för automatisk förflyttning av reaktions- à kärlen ett efter ett, under det att kärlen roteraš_kontinuerligt och deras innehåll omröres kontinuerligt. Det är följaktligen möjligt att anbringa ett flertal reaktionskärl innehållande en provvätska ett eftez ett på transportkedjan vid dennas startposition. Den önskade reaktion- en får äga rum i varje kärl, under det att kärlet roteras och automa- tiskt förflyttas framåt, och reaktionsresultatet kan undersökas auto- matiskt i ett förutbestämt läge, t ex med hjälp av en spektrofotometer.

Apparaten enligt uppfinningen är sålunda särskilt lämplig vid automati- sering av analyssystemet. Det är uppenbart att den beskrivna appa- raten kan modifieras inom det skyddsomfång som illustreras i följan- de exempel.

Exempel. Analys för bestämning av,CEA (karcinoembryoniskt antigen). (a) Framställning av reaktionsprovrör.

I vart och ett av polystyrenprovrör (diameter 8 mm; höjd 100 mm) infördes 2 ml monoklonala anti-CEA-antikroppar (A') (1 mg/ml), varpå man inkuberade rören vid 56°C under 20 minuter. Varje prov- rör tvättades sedan med PBS. Härvid erhölls provrör sensibilisera- de med anti-CEA-antikroppen (A').

*En annan monoklonal antikropp (B') från en klon som skiljer sig från (A')-klonen, märktes med pepparrots-peroxidas (Boehringer Mannheim, kvalitet I; nedan kallat HRPO) enligt den metod som har beskrivits av Nakane et al. i J. Histochem. Cytochem., gå, 1084 1 (1974). den utspädda antikroppen infördes i varje provrör sensibiliserat Antikroppen utspäddes med PBS till 50 volymer, och 1 ml av med antikroppen (A'). de tätt. (b) CEA-analys.

I vart och ett av provrör framställda på det sätt som beskrives under (a) infördes 0,9 ml PBS och 0,1 ml standard-CEA-lösning framställd genom utspädning av CEA med normalt humanserum till en koncentration av 1, 3, 10, 30 eller 100 ng CEA per ml. Provrören placerades på transport- kedjan i den i fig 1_visade apparaten så att de lutade uppåt med en vinkel av 10° mot horisontalplanet. Reaktionen fick äga rum under 20 minuter, varvid provrören roterades med en hastighet av 30 varv per Sedan provrören hade lyofiliserats, tillslöts .v minut. Därefter tvättades varje provrör med tvättningsmedlet. I varje

Claims (5)

8307238-9 9 provrör infördes därpå 2 ml av en enzymsubstratlösning innehållande 100 mg o-fenylendiamin per dl och en 0,3 %-ig vattenlösning av vätepez oxid. Provrören placerades ånyo uppåtlutande på transportkedjan med ex vinkel av 10° mot horisontalplanet. Reaktionen fick äga rum under 20 minuter, varvid provrören roterades med en hastighet av 30 varv per minut. Därefter avbröts reaktionen genom tillsättning av 0,5 ml 4 N saltsyra. Reaktionsblandningens absorbans vid våglängden 492 nm mättes medelst en spektrofotometer. Den erhållna kalibreringskurvan visas i fig 6. Patentkrav

1. Apparat för att rotera minst ett reaktionskärl i lutande läge, k ä n n e t e c k n a d a v att den innefattar ett transportorgan (101) med en transportyta på vilken fritt roterbara rullar (117) är monterade; organ (102-106) för drivning av transportorganet (101) i e riktning med en föreskriven hastighet; en rem (109) anordnad att för- flyttas i kontakt med reaktionskärl anhragta på rullarna (117) för att rotera reaktionskärlen i en förutbestämd riktning med en förutbe- stämd hastighet; och organ (116) för att hållartaktionskärlen i ett uppåtlutande läge med en förutbestämd vinkel mot horisontalplanet.

2. Apparat enligt krav 1, k ä n n e t e c k n a d a v att den förutbestämda hastigheten är från 10 till 100 varv per minut, och att den förutbestämda vinkeln är från s° :111 4s°.

3. Apparat enligt krav 2, k ä n n e t e c k n a d a v att den förutbestämda hastigheten är från 25 till 55 varv per minut.

4. Apparat enligt krav 2 eller 3, k ä n n e t e c k n a d a v att den förutbestämda vinkeln är från 100 till 200.

5. _ Apparat enligt något av kraven 1-4, k ä n n e t e c k n a d a v att transportorganet är en transportkedja (101).