JPH07209191A - 多孔性膜上の発光反応による物質の検出法およびその装置 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】ドットブロット法の発光本来の検出感度・測定
範囲を維持・向上し、更には操作の不便さを解消する方
法を提供する。 【構成】検出しようとする目的物質のリガンド・レセプ
ター反応を多孔性膜上にて行い、次いで発光反応を行
い、多孔性膜上から生じる発光の強度を測定することに
より、該目的物質を検出する方法において、該多孔性膜
上面から発せられる光の強度を直接に積分球を備えた光
検出装置にて測定する多孔性膜上の発光反応による物質
の検出法およびそのための装置。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は試料中の核酸、抗原、抗
体あるいはホルモン等の目的物質を多孔性膜上の発光反
応を利用して検出する方法およびその装置に関し、特に
発光性標識からの光を直接的に測定する、簡便で高感度
な検出法およびその装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】近年分子生物学の発展にともない、試料
中の遺伝子類やタンパク質類をサザンブロット、ノーザ
ンブロット、ウエスタンブロットなど多孔性膜（ニトロ
セルロース、セルロースアセテート等）を利用して検
出、同定する手法が確立された。例えば遺伝子を検出、
同定しようとする場合には、まず患者の白血球から遺伝
子を抽出し、制限酵素等で適当な長さに切断したのち電
気泳動等で長さに応じて分離する。引き続き、分離した
核酸を多孔性膜に転写後、放射性同位元素などの標識を
結合した、目的の遺伝子に相補的な塩基配列を持つ核酸
を多孔性膜上の核酸に反応させる。次いで多孔性膜に対
して非特異的に結合した標識結合核酸を洗浄により除去
する。最後にオートラジオグラフィーを実施して多孔性
膜上に残存する標識結合体の標識を可視化して測定す
る。この方法はサザン(Southern)ブロット法として知ら
れ、基本的な概念は J. Mol. Biol.,98, 503(1975)に記
載されている。

【０００３】またタンパク質を測定、同定しようとする
場合は、例えば患者血清を電気泳動で分離後、分離され
たタンパク質を多孔性膜に転写する。続いて放射性同位
元素等の標識を結合した、目的のタンパク質に特異的に
結合する抗体を多孔性膜上のタンパク質に作用させる。
多孔性膜に非特異的に結合した標識結合抗体を洗浄除去
後、遺伝子の場合と同様にオートラジオグラフィーを実
施して多孔性膜上に残存する標識結合体の標識を可視化
して測定する。本法はウエスタン(Western) ブロット法
として知られており、Proc. Natl. Acad. Sci., USA 7
6, 4350(1979)等に、この方法を利用した例が記載され
ている。

【０００４】しかし、これらの手法は着色、感光箇所の
有無、出現位置から目的とする物質が存在するか、また
本当に目的とする物質なのかを同定するという性格が強
く、さらに遺伝子、タンパク質等の分離の工程が煩雑で
多数の検体処理には一般的には向かない。

【０００５】また物質の同定が特に必要ない場合や、殆
ど目的物質にしか結合しない核酸、抗体を標識した場合
であって、多数の検体中の目的物質を定量的に把握する
必要がある場合はドットブロット法が適している。この
方法は試料を制限酵素などによる遺伝子の切断、血球分
離操作等の適当な処理をした後、試料或いは既知濃度の
目的物質を多孔性膜上の別々の位置にスポットして吸着
せしめる。次いで目的物質に対し特異的に結合する物質
と酵素あるいは放射性同位元素などの標識を結合した標
識物質を作用させる。非特異的に結合した標識物質を洗
浄除去したのち、適当な方法で標識を可視化して測定す
るものである。この方法の応用例は、Anal. Biochem.,1
27,247(1982)、Anal Biochem.,119,142(1982) 、Anal.
Biochem., 128,415(1983) 等に記載されている。

【０００６】上記ドットブロット法では目的物質量は同
時にスポットした既知濃度の目的物質と各試料との可視
化の程度（着色の濃淡、感光の強弱など）を比較するこ
とで推定可能である。この目的のためには着色の濃淡、
フィルムの感光の濃淡を反射光（デンシトメーター）で
測定する方法がとられる。最近では、多孔性膜を挟んだ
時に一般のマイクロプレートのウェルに対応する位置に
液体が通過可能なチャンネルを形成するよう工夫された
ドット・ブロティング装置が市販(Bio Rad社、Pharmaci
a社等）されるようになり、マイクロプレート用の分注
器等を流用して大量処理が可能になったこと、標識物質
として放射性同位元素の代わりに発光物質あるいは発光
に関与する酵素を使用し、発光でフィルムを感光させる
方法が開発され、試薬取扱いが容易で特殊な設備を必要
としなくなったことなどから簡便な定量法として普及し
ている。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記ド
ットブロット法での感度は発光反応を利用しているにも
拘わらず、実質的には発色反応と同程度であり、しかも
定量域も１０の２乗程度しかないという大きな問題が存
在する。そのほか感光状態が現像、定着後でなければわ
からず、予め感光時間等の至適化が必要なこと、発光が
短寿命な場合の感光が困難なことなど測定上の面や大量
処理が可能な装置ができたとはいえ、多孔性膜が濡れて
脆い状態での装置との着脱による多孔性膜の損傷等を避
けるために慎重な操作を行わざるを得ず、操作の遅延を
来すなどの時間的な面、多孔性膜全体を試薬に浸漬する
操作が必須なため、反応に関与していない部分にまで試
薬を供給するなど経済的な面でも問題がある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】本発明者らはドットブロ
ット法でも発光本来の検出感度・測定範囲を維持・向上
し、更には操作の不便さを解消する方法を鋭意検討した
結果、発光物質あるいは発光反応を触媒する酵素を標識
しているにも拘らず発色並の感度しか有せず、定量域も
１０の２乗程度と狭い理由が発光の性質に由来するもの
ではなく、感光したフィルムの濃淡を反射光で測定する
ことに由来することを見い出し、多孔性膜上面から発せ
られる光の強度を直接に光検出装置にて測定するという
改良を行った。

【０００９】すなわち本発明は検出しようとする目的物
質から直接的にあるいは最終的に発光反応を多孔性膜上
にて行い、多孔性膜上から生じる発光の強度を測定する
ことにより、該目的物質を検出する方法において、該多
孔性膜上面から発せられる光の強度を直接に光検出装置
にて測定することを特徴とする多孔性膜上の発光反応に
よる物質の検出法である。

【００１０】また本発明は検出しようとする目的物質の
リガンド・レセプター反応を多孔性膜上にて行い、次い
で発光反応を行い、生成した多孔性膜上の反応物質から
生じる発光の強度を測定することにより該目的物質を検
出する方法において、該多孔性膜上面から発せられる光
の強度を直接に光検出装置にて測定することを特徴とす
る多孔性膜上の発光反応による物質の検出法である。

【００１１】また本発明は多孔性膜および該膜下面に直
接あるいは間接的に液体収納層を配置するリガンド・レ
セプター反応容器および積分球を備えた光検出装置を有
することを特徴とする多孔性膜上の発光反応による物質
の検出装置である。

【００１２】本発明の反応系は多孔性膜上の検出しよう
とする物質の量が、直接的にあるいは最終的に発光反応
の強度と相関する系であれば、いかなる反応系であって
もよい。直接的に発光反応の強度と相関する系として
は、検出しようとする目的物質そのものが発光性物質で
あるか、発光性物質を誘導する物質、例えば発光性基質
あるいは発光反応を触媒する物質などを多孔性膜上で検
出する系であり、目的物質の量そのもののが発光強度と
相関する系である。本発明では発光反応の強度と相関さ
せる反応系と他の反応系を共役した系であってもよい。
他の反応系としては化学反応、物理反応、酵素反応、核
酸類のハイブリダイゼーション、免疫反応などあるいは
これらを組み合わせた反応がある。

【００１３】本発明ではこのような共役の結果、最終的
に生じる発光強度は、検出しようとする酵素、酵素基
質、抗原、抗体、核酸等の共役した反応に関与する物質
の量と相関するため、これらを目的物質を検出する場合
はこの発光強度を測定する。

【００１４】本発明におけるリガンド・レセプター反応
としては、核酸類のハイブリダイゼーション、免疫反応
などが挙げられ、例えば検出しようとする目的物質（リ
ガンド）、多孔性膜上に結合した該物質に特異的に反応
する物質（レセプター）および発光性標識を結合した目
的物質と特異的に結合する物質（標識レセプター）との
反応がある。また多孔性膜上に結合した検出しようとす
る物質（リガンド）および発光性標識を結合した目的物
質と特異的に結合する物質（標識レセプター）との反応
がある。本発明では該リガンド・レセプター反応を多孔
性膜上にて行い、必要により洗浄した後、生成した多孔
性膜上の標識結合反応物質から生じる光の強度を測定す
ることにより、目的物質を検出する。

【００１５】本発明のリガントとしては、核酸、抗原、
抗体あるいはホルモンなどが挙げられる。したがって核
酸がＤＮＡの場合、レセプターは該ＤＮＡに相補的なＤ
ＮＡあるいはＲＮＡであり、ＲＮＡの場合、レセプター
は該ＲＮＡに相補的なＤＮＡである。また抗原のレセプ
ターは抗体であり、抗体のレセプターは抗原であり、ホ
ルモンのレセプターはホルモン・レセプターである。

【００１６】本発明の発光反応は化学発光、生物発光等
検出し得る光を発する反応ならばいずれでも良い。本発
明の発光性標識としては発光性物質または発光を誘導す
る物質がある。発光性物質としてはアクリジニウムエス
テルまたはその誘導体、アクリジニウムスルホンアミド
またはその誘導体、ルミノール、イソルミノールおよび
それらの誘導体またはアントラセン誘導体などが挙げら
れる。発光を誘導する物質としては、酵素、発光性基質
または蛍光物質などが挙げられる。酵素としては、アル
カリホスファターゼなどが挙げられる。発光性基質とし
ては１，２−ジオキセタン類（例えばＡＭＰＰＤなど）
などが挙げられる。また蛍光物質としてはルシフェリン
およびその誘導体類、シュウ酸エステルおよびその誘導
体類などが挙げられる。

【００１７】本発明の多孔性膜としては、液体が通過可
能であり、かつ多孔性膜上で発光反応を起こし得るもの
ならば特に限定するものではない。材料としては例えば
ニトロセルロース、ナイロン類、酢酸セルロース類、ポ
リビニリデンフルオライド類、４フッ化エチレン類等か
らなるメンブランフィルターまたはセルロース繊維、ガ
ラス繊維等からなるいわゆる濾紙類が使用し得る。前処
理により澄明化されない検体、例えば血清、血漿などは
メンブランフィルターを詰めやすいので、濾紙類が特に
好ましい。

【００１８】本発明では多孔性膜上面から発せられる光
を直接に光検出装置にて測定する（図６，図７参照）。
光検出装置は積分球を備えた光検出装置であることが好
ましい。

【００１９】本発明の多孔性膜上の発光反応による物質
の検出装置は、多孔性膜および該膜下面に直接あるいは
間接的に液体収納層を配置するリガンド・レセプター反
応容器および積分球を備えた光検出装置を有する（図７
にその一例を示す）。リガンド・レセプター反応容器
は、多孔性膜表面に液体を導くための開口部を有する液
体不透過性物体を多孔性膜上に配置することが好ましい
（図１ａ〜ｄ参照）。開口部は複数個設けられていても
よい（図２参照）。また液体不透過性物体と多孔性膜は
一体化されていてもよい（図３ａ，ｂ参照）。

【００２０】本発明の装置では多孔性膜の特定の領域に
検体、試薬類を添加できる開口部を有する液体不透過性
物体と多孔性膜を一体化してもよい。また該多孔性膜の
試薬類を添加する面と反対の面（下面）に、該多孔性膜
に添加された試薬類を吸収できる層を密着させた状態で
載置してもよい（図３ｂ参照）。また該開口部を有する
液体不透過性物体内に多孔性膜を納めた構成とすること
により、実質的に多孔性膜を補強し、試薬適用位置を固
定できる（図３ｃ参照）。

【００２１】開口部を有する液体不透過性物体と一体化
した多孔性膜を利用する場合、この液体不透過性物体の
試薬等を受け入れる開口部の形状は、添加する試薬の
量、光検出装置への集光の程度、多孔性膜の面積等によ
り、種々な形状を取りうる。最適な測定のために図１ａ
〜ｄに示すものが好ましい。

【００２２】また液体不透過性物体には検体の数、光検
出装置の性能等を考慮し、多数の開口部が有っても構わ
ない (図２参照）。多孔性膜と該液体不透過性物体の位
置関係は図３ａ〜ｃに示すものが挙げられる。典型的に
は図３ａに示す通りであるが、相対的な大きさ等は任意
に設定可能である。試薬を素早く適用するためには図３
ｂのように試薬類を吸収可能な層を密着させた状態で適
用することが望ましいが、長い反応時間を必要とする場
合は試薬添加後、必要な時間だけ反応を行った後、多孔
性膜の下部に試薬類を吸収可能な層を密着してもよい。
さらに該多孔性膜の試薬類を添加する面の反対の面（下
面）に多孔性膜に添加された試薬類を吸収可能な層を密
着させた状態で、開口部を有する液体不透過性容器に多
孔性膜を納めた構成を利用する場合は、例えば図３ｃの
ような構成が一般的である。

【００２３】いずれの場合も該液体不透過性物体の色に
ついては光の反射率が高い色、特に白系統の色が感度向
上のために特に望ましい。積分球で集光したのち光検出
装置で測定する場合、積分球の大きさ、光検出装置の位
置、積分球の開口部と多孔性膜との位置関係等は目的に
あうよう任意に選択可能である。

【００２４】光強度を測定する装置としては光電子増倍
管、ＣＣＤカメラ等が使用できる。多孔性膜上の発光強
度の測定に際しては、多孔性膜上に直接光検出装置を押
し当ててもよいし、光検出装置が汚染されることを嫌う
場合には、隙間を設けてもよい。

【００２５】光検出装置の積分球の有無と多孔性膜の構
成は、目的物質の性状、量等を考慮して、いかようにも
組合せ可能であるが、高感度、広測定範囲、操作の簡便
性から考慮すれば、多孔性膜の特定の領域に検体、試薬
類を添加できる開口部を有する白色系統の色彩を持った
液体不透過性物体と一体化した多孔性膜とするか、ある
いは多孔性膜の試薬類を添加する面の反対の面（下面）
に該多孔性膜に添加された試薬類を吸収可能な層を密着
させた状態で、該開口部を有する白色系統の色彩を持っ
た液体不透過性容器に多孔性膜を納めた構成として、任
意の光検出装置にて多孔性膜上の発光強度を測定する装
置が特に望ましい。

【００２６】本発明の検出装置の一例を図７にて説明す
る。図中、１は光検出装置、２は多孔性膜、３は開口
部、４は液体不透過性物体、５はリガンド・レセプター
反応容器、６は液体収納層、７は積分球である。本発明
の検出装置は多孔性膜２および該膜下面に直接あるいは
間接的に液体収納層６を配置するリガンド・レセプター
反応容器および積分球７を備えた光検出装置１を有す
る。本発明の検出装置では多孔性膜２上の特定領域に、
開口部３を有する液体不透過性物体４から検体または試
薬類を添加して、リガンド・レセプター反応および発光
反応を行う。液体は多孔性膜２を通過して、該多孔性膜
下面に配置された液体収納層６へ直接あるいは間接的に
導かれる。次いで多孔性膜２上の発光反応の光強度を光
検出装置１にて測定する。

【００２７】

【発明の効果】本発明では発光強度を直接に光検出装置
にて測定することにより、フィルムに感光させた場合に
得られる検出感度以上の検出感度を有し、定量域も１０
の４乗と広い結果が得られる。

【００２８】さらに、本発明の検出装置は多孔性膜の特
定の領域に検体、試薬類を添加可能な開口部を有する液
体不透過性物体と多孔性膜を一体化するか、あるいは該
多孔性膜の試薬類を添加する面の反対の面（下面）に、
該多孔性膜に添加された試薬類を吸収できる層を密着さ
せた状態で載置して、該開口部を有する液体不透過性物
体内に多孔性膜を納めた構成とすることにより、実質的
に多孔性膜を補強し、試薬添加位置を固定できる。この
ため多孔性膜の取扱い、試薬適用に特別の注意を必要と
せず、迅速な操作が可能となる。この点は単に操作性の
改善のみではなく、短寿命の発光測定の実施、定量域の
拡大にも密接な関連をもつ。操作性改善や試薬適用位置
を固定し特別な注意を払わずに試薬添加が可能になった
ことで該多孔性膜を試薬添加後、すばやく光検出装置へ
セットしたり、光検出装置にセットした状態での試薬添
加が可能となる。この結果、短寿命の発光測定が可能と
なったほか、早い時期からの発光反応速度のモニターを
することで定量域を１０の５乗と更に拡大することが可
能となる。さらに液体不透過性物体を光の反射率の高い
色とすることや、光検出装置に積分球を備え付け、積分
球で多孔性膜からの光を集光した後、光検出装置にて発
光強度を測定することにより更なる高感度化が可能とな
る。本発明により多孔性膜上の目的物質の量が最終的に
発光の強度と相関する系において、目的物質を高感度か
つ広範囲で測定が可能となり、かつ操作も簡便となる。

【００２９】

【実施例】以下、実施例により本発明を詳細に説明す
る。 実施例１ ４フッ化エチレンメンブランを水で濡らした後、ドット
・ブロティング装置（商品名、ＢＩＯ−ＤＯＴ ＡＰＰ
ＡＲＡＴＵＳ、ＢＩＯ−ＲＡＤ社製）に挟んだ。この装
置のウェルを通して、４フッ化エチレンメンブランの表
面に捕促プローブ（腸炎ビブリオＴＤＨ遺伝子の 339番
目から 364番目のヌクレオチドに相同性を有するＤＮ
Ａ、塩基数26 )を結合させた。次いで種々の微生物から
得られ、制限酵素(Alu1)で処理したＤＮＡ（塩基数 200
〜400bp 程度）または既知濃度のＴＤＨ標準遺伝子（捕
促プローブと標識プローブ配列に相補的な配列を有する
合成核酸、塩基数 100) をウェルを通して添加してハイ
ブリダイズさせた。その後、アルカリ性フォスファター
ゼを標識した標識プローブ (ＴＤＨ遺伝子の 102番目か
ら 125番目のヌクレオチド配列と相同性を有するＤＮ
Ａ、塩基数24）をウェルを通して、膜上にハイブリダイ
ズしたＤＮＡへさらにハイブリダイズした。４フッ化エ
チレンメンブランを上記装置から取り外し、十分な洗浄
を行った後、発光性基質である１，２−ジオキセタン
（ＡＭＰＰＤ、ルミジェン社製）を含む溶液を反応させ
た。このメンブランフィルターからの発光速度をＣＣＤ
カメラにて一定な時間毎に１時間にわたって測定してハ
イブリダイズしたＤＮＡを算出した。その結果を図４に
示す。この結果からＴＤＨ遺伝子０．３fmole から１２
０fmole 程度まで測定が可能であることが判明した。ま
た、この標準曲線から検体中のＴＤＨ遺伝子の定量が可
能であった。

【００３０】比較例１ 実施例１と同様にメンブランフィルターに結合したＴＤ
Ｈ遺伝子の 339番目から 364番目のヌクレオチドに相同
性を有するＤＮＡとハイブリダイズした微生物由来のＤ
ＮＡに、アルカリ性ホスファターゼ標識ＤＮＡ（ＴＤＨ
遺伝子の 102番目から 125番目のヌクレオチド配列と相
同性を有するＤＮＡ）をハイブリダイズした後、メンブ
ランフィルターを装置から取り外し、十分な洗浄を行っ
た後、ＡＭＰＰＤを含む溶液を反応させた。この膜上に
フィルムを重層し、１時間暗所にて感光させた。次いで
現像後のフィルムをヘレナ製のデンシトメーターで走査
し反射吸光度を求めた。この結果を実施例１の結果とあ
わせて図４に示す。比較例１の場合は１fmole から３０
fmole 程度の測定範囲であった。この標準曲線から検体
中のＴＤＨ遺伝子の定量が可能であったが、３０fmole
以上の量の場合、判別ができなかった。このようにフィ
ルムに転写せずそのまま発光を測定することで測定感度
は約３倍、定量域が約４倍に拡大した。

【００３１】実施例２ セルロース濾紙を塩化シアヌルで活性後、抗クラミジア
・トラコマティス抗体を固定化し、乾燥した。この濾紙
上に図３ｃに示すように濾紙の特定の領域に検体、試薬
類を添加できる開口部を有する艶消し黒色の液体不透過
性の板を接着剤で固定した。このような構成の濾紙をテ
ィッシュペーパーの上部に、濾紙がティッシュペーパー
に接するように置いた後、開口部より１００μＬのクラ
ミジア・トラコマティス抗原を含む検体を添加した。約
１０分の反応ののち、開口部から１００μＬのアクリジ
ニウムを標識した抗クラミジア・トラコマティス抗体を
添加した。約１０分の反応の後、開口部から緩衝化生理
食塩水を適用して十分洗浄した。この後、濾紙下面のテ
ィッシュペーパーを除き、液体不透過性板の開口部が光
電子増倍管の直下にくるよう、試薬添加ノズルを挿入す
る間隔をあけ、迷光が入射しないよう設置した。試薬添
加ノズルから開口部を通して発光補助試薬を濾紙上に添
加し、発光強度(intensity) を測定した。その結果を表
１に示す。

【００３２】実施例３ 実施例２において使用した光電子増倍管に、直径５０ｍ
ｍの積分球を取り付け、積分球の開口部直下に液体不透
過性板の開口部がくるよう、迷光が入射しないよう設置
した。その後、実施例２と同様に試薬を適用し、発光強
度(intensity)を測定した。その結果を表１に示す。

【００３３】比較例２ セルロース濾紙を塩化シアヌルで活性後、抗クラミジア
・トラコマティス抗体をウェル上部から適用して化学的
に固定化後、十分に洗浄した。引き続きウェルの上部か
ら実施例２と同様に検体、アクリジニウム標識抗体を適
用した。発光補助試薬にこのニトロセルロースメンブラ
ンを浸せき後、表面の液体を除き光電子増倍管の直下
に、迷光が入射しないよう設置した。しかしながらアク
リジニウムの発光が既に終了しており、セルロース濾紙
からの光を検出することができなかった。表１に示すよ
うに比較例２では全くクラミジア・トラコマティス抗原
の測定ができなかったが、実施例２、実施例３とも十分
に測定が可能であった。また光の検出感度は実施例２よ
りも実施例３の方が約５倍高かった。なお、抗原濃度が
０ｎｇ／ｍＬの場合、実施例２、３および比較例では発
光強度(intensity) は約１０程度であり、定量域が実施
例２では１０の４乗、実施例３では１０の５条に拡大し
た。

【００３４】

【表１】

【００３５】実施例４ ガラスフィルターに物理的に抗ヘモグロビンモノクロー
ナル抗体を吸着させ、乾燥した。このガラスフィルター
を直径約８ｍｍに打ち抜き、下部にティッシュペーパー
を密着させた状態で、ガラスフィルターに検体・試薬類
を添加可能な開口部を有する液体不透過性容器に納め
た。この際、液体不透過性容器は艶消し黒色と、二酸化
チタンを含有した白いものの２種類準備した。この構成
のガラスフィルターに、液体不透過性容器の開口部から
種々の濃度のヘモグロビン溶液を５０μＬずつ添加し２
分間反応させた。界面活性剤を含む緩衝化生理食塩水を
開口部から５０μＬ×２回添加して洗浄後、アルカリ性
イソルミノール試薬を開口部を通して添加した。その
後、光電子増倍管にて発光を測定したが、この際にも積
分球を備えた光電子増倍管と、備えていない光電子増倍
管の２種で測定を試み、組み合わせの効果の検討を実施
した。相対的な発光強度とヘモグロビンの濃度の関係を
図５に示した。艶消し黒色の液体不透過性容器と積分球
を備えていない光電子増倍管の組み合わせが最も光の検
出感度が低く、以下、艶消し黒色液体不透過性容器と積
分球を備えた光電子増倍管の組み合わせ、白色液体不透
過性容器と積分球を備えていない光電子増倍管の組み合
わせ、白色液体不透過性容器と積分球を備えた光電子増
倍管の組み合わせの順に感度が高くなることが確認でき
た。

【００３６】実施例５ ガラスフィルターの下部にタバコフィルターを密着させ
た状態でガラスフィルターに検体・試薬類を添加可能な
開口部を有する白色の液体不透過性性容器に納めた。次
いで抗ＨＣＧポリクローナル抗体を含む溶液を開口部か
ら１００μＬ適用して抗体を吸着させ、最後に容器全体
を乾燥した。ＨＣＧを含む可能性のある体液を容器の開
口部から適用し液体収納可能層に吸収させ、３７℃で２
分間反応した。次にアルカリ性フォスファターゼ標識抗
ＨＣＧモノクローナル抗体を開口部から添加し、３７℃
で２分間反応した。洗浄液で洗浄後、ＡＭＰＰＤを含む
試薬を開口部から添加し、その直後から２分間、積分球
を備えた検出器で発光強度を測定した。短時間の測定に
も係わらず約１ｍＩＵ／ｍＬのＨＣＧが検出できた。

【図面の簡単な説明】

【図１】多孔性膜上の水不透過性物体の形状ａ〜ｄを示
す。

【図２】多孔性膜上の水不透過性物体の一例を示す。

【図３】水不透過性物体を備えた多孔性膜の構成ａ〜ｃ
を示す。

【図４】実施例１と比較例１のＴＤＨ遺伝子測定結果を
示す。

【図５】液体不透過性物体色と積分球の有無組み合わせ
とヘモグロビン測定感度を示す。

【図６】本発明の物質の検出法の一例を示す。

【図７】本発明の物質の検出装置の一例を示す。

【符号の説明】

１は光検出装置、２は多孔性膜、３は開口部、４は水不
透過性物体、５は液体不透過性容器、６は吸収層、７は
積分球を示す。

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 検出しようとする目的物質から直接的に
   あるいは最終的に発光反応を多孔性膜上にて行い、多孔
   性膜上から生じる発光の強度を測定することにより、該
   目的物質を検出する方法において、該多孔性膜上面から
   発せられる光の強度を直接に光検出装置にて測定するこ
   とを特徴とする多孔性膜上の発光反応による物質の検出
   法。
2. 【請求項２】 検出しようとする目的物質が発光性物質
   であるか、または発光を誘導する物質であり、該目的物
   質から直接的に発光反応を多孔性膜上にて行うことを特
   徴とする請求項１記載の多孔性膜上の発光反応による物
   質の検出法。
3. 【請求項３】 光検出装置が積分球を備えた光検出装置
   であることを特徴とする請求項１記載の多孔性膜上の発
   光反応による物質の検出法。
4. 【請求項４】 検出しようとする目的物質のリガンド・
   レセプター反応を多孔性膜上にて行い、次いで発光反応
   を行い、生成した多孔性膜上の反応物質から生じる発光
   の強度を測定することにより、該目的物質を検出する方
   法において、該多孔性膜上面から発せられる光の強度を
   直接に光検出装置にて測定することを特徴とする多孔性
   膜上の発光反応による物質の検出法。
5. 【請求項５】 光検出装置が積分球を備えた光検出装置
   であることを特徴とする請求項４記載の多孔性膜上の発
   光反応による物質の検出法。
6. 【請求項６】 リガンド・レセプター反応が、多孔性膜
   上に結合した検出しようとする目的物質（リガンド）お
   よび発光性標識を結合した目的物質と特異的に結合する
   物質（標識レセプター）との反応であることを特徴とす
   る請求項４または５記載の多孔性膜上の発光反応による
   物質の検出法。
7. 【請求項７】 リガンド・レセプター反応が、検出しよ
   うとする目的物質（リガンド）、多孔性膜上に結合した
   該物質に特異的に反応する物質（レセプター）および発
   光性標識を結合した目的物質と特異的に結合する物質
   （標識レセプター）との反応であることを特徴とする請
   求項４または５記載の多孔性膜上の発光反応による物質
   の検出法。
8. 【請求項８】 発光性標識が発光性物質または発光を誘
   導する物質であることを特徴とする請求項６または７記
   載の多孔性膜上の発光反応による物質の検出法。
9. 【請求項９】 発光性物質がアクリジニウムエステルま
   たはその誘導体、アクリジニウムスルホンアミドまたは
   その誘導体、ルミノール、イソルミノールまたはアント
   ラセン誘導体であることを特徴とする請求項８記載の多
   孔性膜上の発光反応による物質の検出法。
10. 【請求項１０】 発光を誘導する物質が酵素、発光性基
    質または蛍光物質であることを特徴とする請求項８記載
    の多孔性膜上の発光反応による物質の検出法。
11. 【請求項１１】 リガンドが核酸、抗原、抗体またはホ
    ルモンであることを特徴とする請求項４記載の多孔性膜
    上の発光反応による物質の検出法。
12. 【請求項１２】 多孔性膜および該膜下面に直接あるい
    は間接的に液体収納層を配置するリガンド・レセプター
    反応容器および積分球を備えた光検出装置を有すること
    を特徴とする多孔性膜上の発光反応による物質の検出装
    置。
13. 【請求項１３】 リガンド・レセプター反応容器が、多
    孔性膜上に該多孔性膜表面に液体を導くための開口部を
    有する液体不透過性物体を配置したことを特徴とする請
    求項１２記載の多孔性膜上の発光による物質の検出装
    置。
14. 【請求項１４】 開口部を有する液体不透過性物体が光
    反射率の高い色を有することを特徴とする請求項１３記
    載の多孔性膜上の発光反応による物質の検出装置。