JP2006087424A - ろ過検査デバイス - Google Patents

Abstract

【課題】本発明は、検体溶液中の細胞、微生物、核酸等を合成高分子製多孔質ろ過膜を用いて分離し顕微鏡観察をするときに合成高分子製多孔質ろ過膜の取扱い性を改良するとともに、顕微鏡観察時の焦点都度調整を不要とすることができるろ過検査デバイスを提供すること。
【解決手段】合成高分子製多孔質ろ過膜１にろ過開口３を備えた外縁構造体２を設け、また外縁構造体７に均等な力を加え合成高分子製多孔質ろ過膜１面を平滑基準台６に押し当てることで合成高分子製多孔質ろ過膜１に対して外周方向に張力を加わえ合成高分子製多孔質ろ過膜１表面を、しわ、たるみのない平滑な面にするよう作用させることができる。
【選択図】図1

Description

本発明は、検体溶液中の細胞、微生物、核酸等を合成高分子製のろ過フィルタを用いて分離や精製し顕微鏡観察をするときに使用するろ過検査デバイスに関する。

溶液化された検体の中に含まれる細胞、微生物、核酸等を顕微鏡観察するために、ろ過フィルタを用いて検体溶液のろ過分離を行なわれる。従来、この種のろ過フィルタにはメンブランフィルタが用いられメンブランフィルタをろ過器に取り付け、ポンプで溶液を吸引する方法が知られている（例えば、特許文献１参照）以下、検体溶液中の細胞、微生物、核酸等をろ過フィルタで分離濃縮し顕微鏡観察をする流れについて図１３を参照しながら説明する。図１３の左側はろ過器の分解図、右側は組み図を示す。ろ過フィルタ１０１をベース器具１０２の焼結ガラスなどで作られている多孔性板１０３の部分に置きファンネル１０４とベース器具１０２でろ過フィルタ１０１を挟み込む。挟み込み部分からの液もれを防ぐためにシール構造（図示せず）挟み込み構造（図示せず）が設けてある。組み立てが終わったろ過器はマニホールド１０５のゴム栓１０６の穴に刺して組み立てが終わる。マニホールド１０５の先には吸引ポンプ（図示せず）が接続されている。

次に顕微鏡にて観察したい細胞、微生物、核酸等が含まれる検体溶液をファンネル１０４の中に入れ吸引ポンプを稼動させるとファンネル１０４中の溶液はろ過フィルタ１０１を通過し細胞、微生物、核酸等がろ過フィルタ１０１上にろ過分離される。すべての溶液をろ過し終えた後にろ過器を分解しろ過フィルタ１０１を取り出し、プレパラート等の平板ガラスに載せ顕微鏡でろ過フィルタ１０１の観察を実施する。これらの作業は１検体毎の観察時に都度実施する。

また、特定の核酸を検出する流れとして図１４を参照しながら説明する。図１４の示すようなＤＮＡチップ１０７表面には、基材１０８上に多数の核酸を検出するＤＮＡプローブ１０９がマイクロアレイ状態に配列されている。ＤＮＡチップ１０７は、シリコンウェーハやガラスなどからなった基板１０８上に数百ないし数十万個の定められた位置に、既知の塩基配列を有する単一束のＤＮＡプローブ１０９をスポットした形態で固定させたチップをいう。一般的に、基材１０８の表面にはＤＮＡプローブ１０９を固定させるためにアミン基またはアルデヒド基よりなるコーティング膜がコートされている。このようなＤＮＡチップ１０７上に分析しようとする標的ＤＮＡを結合反応させた時、ＤＮＡプローブ１０９と標的ＤＮＡ間に塩基配列の対が合えば、結合化され、２重らせん構造を形成し、塩基配列の対が合わないものと差が生じる。塩基配列の合わないものは、その後の処理として洗浄工程により、取り除かれる。その後、塩基配列の合ったＤＮＡプローブ１０９と標的のＤＮＡの結合部を検出すれば、標的ＤＮＡの塩基配列が分析できる。結合したものの検出には、主に蛍光物質や発光物質で表示された標的ＤＮＡをＤＮＡプローブ１０９と結合反応させた後、蛍光物質から発散されるシグナルを検出する光学的方法によって行われる。
特開平８−２５７３１８号公報 米国特許第６１１７６３１号明細書

このような従来のろ過フィルタを膜単品で取り扱う方法では、取扱い性が極めて悪く、また顕微鏡観察時も顕微鏡の焦点がずれて、都度顕微鏡の焦点合わせを行わなくてはならず細胞、微生物、核酸等を顕微鏡観察する上での作業効率が低いという課題があり、ろ過フィルタの取扱い性を改良することが要求されている。

また、作業中ろ過フィルタはピンセット等で取扱い、ろ過フィルタ表面が検体由来物質以外に汚染されないように慎重に行わなくてはならない。

また、ろ過フィルタは厚みが通常１０数μｍと薄く軽く、静電気を帯びやすい。このためろ過フィルタ同士がくっついてはがれなくなり、クリーンベンチ等の風にあおられて所定の位置に置けない等と慎重を要する作業であるにかかわらず極めて作業性が悪い。

また、ろ過フィルタをプレパラート等の平板ガラスに載せ顕微鏡で観察を行う時、ろ過フィルタとプレパラート等の間に入ったろ過フィルタに含む水分の量の異なりにより、顕微鏡観察の焦点合わせを都度行う必要がある。

また、顕微鏡観察中にろ過フィルタの乾燥が進みろ過フィルタの反りかえり等の変形を起こす。

また、同様に核酸を検出するＤＮＡチップでも、スライドガラスに核酸と反応する核酸プローブを固定化し、標的の核酸を核酸プローブと反応させた後、標的核酸についている蛍光基を検出する方法において、スライドガラスを移動にあたり蛍光基検出するため都度顕微鏡観察の焦点合わせを行う必要がある。

また、ＤＮＡなど検出する際に、ＤＮＡプローブが固定化された基材表面に検体液を滴下し、反応後の溶液以外を洗い流す方法として、表面に洗浄する液を滴下し、さらには、その液を取り除く必要があり、一度に検体液を検出できるデバイスが要望されている。

また、ろ過フィルタの孔径が異なると検体液と流れやすい部分と流れ難い部分と起り、ろ過フィルタ表面に不均一な反応が生じることがあり、ろ過フィルタ表面にＤＮＡプローブなどの反応基との接触が行われずに、未反応状態になる部分があり、孔径が均一なろ過フィルタが要望されている。

また、検出手段として、ろ過フィルタ表面の蛍光もしくは発光体を検出する工程において、ろ過フィルタの孔径がランダムの場合、孔径部分でのバックグランド処理や核酸などの添着位置が明確にできず、検出する部分の動作ソフトや蛍光・発光の解析することに時間が必要となり、簡単に検出工程でろ過フィルタ表面の検体反応を検出するデバイスが要望されている。

また、蛍光試薬等は自家蛍光・発光を発生させる場合もあり、自家蛍光・発光が、基材に反射してさらに検出されやすくなることがあり、自家蛍光・発光を抑制するろ過フィルタの表面が要求されている。

また、ろ過フィルタ表面で外部の力例えば検査デバイスを振動させるなどの影響で核酸や微生物が移動することがあり、検出する微生物または検出するための核酸を移動しづらくすることが要求されている。

また、ＤＮＡプローブなどは、高価のため少量を用いる必要があり、少量でろ過フィルタ上に固定することが要望されている。

また、検出する際に、反応が不均一に行われることが必要であり、ろ過フィルタ上に反応物を均一もしくは同量を固定することが要望されている。

また、反応物を検出する際に、焦点が調整しやすい構造が必要であり、ろ過フィルタ表面が平滑になるようなろ過フィルタと反応物の構成が要望されている。

また、ＤＮＡ配列などは、配置したＤＮＡプローブを１つずつ観察するため、観察者が顕微鏡等の検出する際に容易に設置し、ＸＹ移動の移動も容易にできる構造が用意されている。

本発明は、このような従来の課題を解決するものでありろ過フィルタの取扱い性を改良することができ、また、顕微鏡観察時の焦点都度調整することを不要とすることができるろ過検査デバイスを提供することを目的としている。

本発明のろ過検査デバイスは上記目的を達成するために、ろ過フィルタに内側にろ過開口を備えた外縁の構造体を設けたものである。

この手段によりろ過フィルタに直接触れず外縁の構造体を介して取り扱うことことができる。

また、外縁構造体に力を均等に加えながらろ過フィルタ面を平滑の基準となる台に押し当てることでろ過フィルタに対して外周方向に張力を加え、ろ過フィルタ表面のしわ、そりのない平滑な面とし、かつ平滑の基準となる台の基準面プラスろ過フィルタの膜厚という高さ精度を維持した面にすることで、ろ過フィルタ表面の捕集した細胞、微生物、核酸の顕微鏡観察が光学焦点を固定してできるろ過検査デバイスが得られる。

また、核酸検出の洗い流し工程を抑え、反応物との接触効率をあげ、光学的な検出が容易にできるろ過検査デバイスが得られる。

また、顕微鏡へのセットおよび観察を短時間で行えるようなろ過検査デバイスが得られる。

本発明によれば検体溶液中の細胞、微生物、核酸等をろ過フィルタで分離し顕微鏡で観察するときにろ過フィルタの取扱いが容易になる、顕微鏡観察の都度焦点合わせが不要となり簡便に観察ができるという効果があるろ過検査デバイスを提供できる。

また、高感度で検出することができるため、使用する検体量を低下させ、環境負荷になる反応物を低減することができるろ過検査デバイスを提供できる。

また、金属等の滅菌や殺菌ができる材料を用いることで一度使用したろ過検査デバイスをリユースすることができるろ過検査デバイスを提供できる。

本発明の請求項１記載の発明は多孔質ろ過膜に内側にろ過開口を備えた外縁構造体を設けたことを特徴とするろ過検査デバイスであり、ろ過時、顕微鏡観察作業時に多孔質ろ過膜の取扱いが容易になるという作用を有する。

また、外縁構造体部を均等な力で押え多孔質ろ過膜面を平滑基準台に押し当て膜面外周方向に 張力を発生させることで多孔質ろ過膜表面をしわ、そりのない平滑な面とし、かつ平滑基準台の基準面プラス合成高分子製多孔質ろ過膜の膜厚という高さ精度を維持した面にすることで、ろ過膜表面の捕集した細胞、微生物、核酸の顕微鏡観察が光学焦点を固定してできるという作用を有する。

また、平滑基準台の基準面直径を多孔質ろ過膜外縁構造体のろ過開口径より小さくすることで、顕微鏡観察時に検体溶液中の細胞、微生物、核酸などに対して光学焦点が合い安定化し、正確に計測することができるという作用を有する。

また、外縁構造体部を均等な圧力で押えるデバイス押え機構を有しデバイス押え機構を所定の位置に維持固定することで、多孔質ろ過膜は平滑基準台に所定の圧力で押し当たり多孔質ろ過膜に対して外周方向に所定の張力を加えることができるという作用を有する。

また、ろ過検査デバイスにおいて外縁構造体底部の一部を平滑基準台に当てることで多孔質ろ過膜に対して外周方向に張力を加える張力の上限を設けるようにしたものであり、多孔質ろ過膜に対して外周方向に加わる張力が過剰となり破損にいたることを防止するという作用を有する。

また、外縁構造体のろ過上流側先端において、多孔質ろ過膜に接する面にろ過開口径より大きい直径の凹溝を備え、平滑基準台の平滑基準面にもその凹溝と位置、直径が一致する凸状の突起部を外周部に沿って備え、多孔質ろ過膜をこの凹溝と凸突起で挟み込むことで膜面外周方向に張力を加えるようにしたものであり、多孔質ろ過膜表面をしわ、そりのない平滑な面とし、かつ平滑基準台の基準面プラス多孔質ろ過膜の膜厚という高さ精度を維持した面にすることでろ過膜表面の捕集した細胞、微生物、核酸の顕微鏡観察が光学焦点を固定してできるという作用を有する。

また、外縁構造体のろ過上流側先端において、多孔質ろ過膜膜厚みの３０％程の低い凸突起部を円周状に形成し、多孔質ろ過膜表面を前記凸突起部で圧接しながら溶液ろ過をするようにしたものであり、溶液中の細胞、微生物、核酸が外縁構造体開口端先端部から外縁構造体内側へ流れることを防ぐという作用を有する。

また、外縁構造体のろ過上流側先端に凹溝を円周状に形成することで、溶液ろ過をするとき溶液が表面張力効果で外縁構造体ろ過開口先端部から外縁構造体内側へ浸透し、細胞、微生物、核酸も水浸透に合わせて流れることを防ぐという作用を有する。

また、外縁構造体ろ過開口より小さい内径をもち、ろ過内開口が丸形状の第２の縁部材を備え、顕微鏡観察時は第２の縁部材を取り外して行うようにしたものであり、ろ過時溶液中の細胞、微生物、核酸が外縁構造体のろ過開口先端部外周端に集まることを防ぐという作用を有する。

また、第２の縁部材のろ過内開口が、四角開口、複数開口等と丸開口以外の形状としたものであり、多孔質ろ過膜表面に溶液ろ過による溶液中の細胞、微生物、核酸が第２の縁部材の開口形状と同様な形状、位置にろ過分布させ顕微鏡観察位置の限定という作用を有する。

また、平滑基準台部に水分、空気を排出する手段を備えたものであり、多孔質ろ過膜面を平滑基準台に押し当てた時に多孔質ろ過膜面との間に水分、空気を残存させないという作用を有する。

また、多孔質ろ過膜の孔が均一ピッチで整列していることを特長としたものであり、ろ過膜表面に均一検体内の細胞、微生物、核酸が分布し、顕微観察などでの個数を検出する際に容易に正確に検出するという作用を有する。

また、多孔質ろ過膜の孔径が均一であることを特長としたものであり、検体ろ過を行う際、均一な吸引圧が生じ、検体と反応物の反応のバラツキを抑える作用を有する。

また、多孔質ろ過膜の孔の形状が格子状の形状としたことを特長したものであり、顕微観察において、ろ過膜表面の長さや細胞、微生物等の寸法を簡易的に読み取り、観察者が、細胞以外の夾雑物との差異を把握することが容易に、高感度で検出することができるという作用を有する。

また、多孔質ろ過膜の孔の形状が格子状で格子の辺が認識できることを特長とするもので、さらには、顕微鏡観察時のXY軸でのステージ移動において、多孔質ろ過膜上の堆積物や反応物を素早く観察することができるという作用を有する。

また、多孔質ろ過膜の表面に検出時の背景とを検出物の輝度に差をつける表面処理を行ったことを特長としたものであり、観察時の反応物と蛍光や発光した輝点を容易に判断でき、高感度で検出することができるという作用を有する。

また、表面処理として金属蒸着を行ったことを特長としたものであり、顕微観察において、ろ過フィルタ自体のバックグランドを防止し反射光もしくは蛍光発光の検出感度を高めることができ、有機物成分の固定を高め、生きた細胞、微生物の固定し安定して観察することができるという作用を有する。

また、金属蒸着として特定の光を反射しない金を特長としたものであり、紫外線や赤外線の波長を吸収し、さらに観察を妨害するバックグランドの輝点を低下させ、高感度で検出することができるという作用を有する。

また、多孔質ろ過膜の表面にＤＮＡプローブを固定したものを特長としたものであり、核酸検出において洗浄工程を容易にし、簡単な作業でＤＮＡを検出することができるという作用を有する。

また、多孔質ろ過膜表面の孔の内壁面部分にＤＮＡプローブを固定したことを特長としたものであり、ろ過膜表面の凹凸に依存することなく焦点を合わせることができ、さらに、ろ過膜の孔へ反応しうる物質が確実に通るため、ＤＮＡプローブと確実に接触し、精度良くＤＮＡを検出することができるという作用を有する。

また、多孔質ろ過膜表面の孔の内壁面部分にＤＮＡプローブを均一に固定したことを特長としたものであり、ろ過膜表面の凹凸やによる乱反射を防止し、さらに精度よく高感度でＤＮＡを検出することができるという作用を有する。

また、多孔質ろ過膜の表面の孔がない部分にＤＮＡプローブを均一な厚みになるように固定したことを特長としたものであり、ろ過膜表面の凹凸やによる乱反射を防止は勿論、検体とＤＮＡプローブの反応を均一に促進し、反応量を高感度で検出することができるという作用を有する。

また、多孔質ろ過膜の表面に凹溝があることを特長としたものであり、焦点を安定させ、検体を凹溝に流すことでＤＮＡプローブとの接触時間を長くし、また凹溝の部分を観察するため、さらに容易に感度良く観察することができるという作用を有する。

また、多孔質ろ過膜の表面に凹溝があり、ＤＮＡプローブを固定化したことを特長としたものであり、焦点をさらに安定させ、さらに感度良くまた高い精度を保つことができるという作用を有する。

また、多孔質ろ過膜を合成高分子製としたものであり、リユースし易く、さらにはリサイクルが容易に行えるという作用を有する。

なお、材質がガラスや金属膜などの多孔質ろ過膜でも同様な効果を得ることができ、ガラス基材、金属膜などは蒸気殺菌が可能となり、リユースし易く、さらにはリサイクルが容易に行えるという作用を有する。

以下、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。

（実施の形態１）
図１に合成高分子製多孔質ろ過膜１に外縁構造体２を備える形態を示す。外縁構造体の構成の違いにより３種類の形態を示す。図１（ａ）は外縁構造体２を二枚のシート状材で、好ましくは吸水性を有しない合成樹脂材で構成し合成高分子製多孔質ろ過膜１を挟むように構成したもの、図１（ｂ）は外縁構造体２を１枚のシート状材で、好ましくは吸水性を有しない合成樹脂材で構成し合成高分子製多孔質ろ過膜１を外縁構造体２に溶着させて構成したもの、図１（ｃ）は外縁構造体２を二個の樹脂成形材で構成し合成高分子製多孔質ろ過膜１を挟み込むように構成したものである。これらのろ過検査デバイスにはろ過開口３を備える。また検体溶液をろ過するには、図２に示すろ過器を用いればよい。多孔性台４の下にベース５が配置され、多孔性台４は外縁構造体の厚みを避け、合成高分子製多孔質ろ過膜１が多孔性台４に密着できるように凸形状を備えている点が前述のろ過器とは異なる。ベース５にろ過検査デバイスを置く、あるいはベース５よりはずすときには、ろ過検査デバイスの外縁構造体２をつまんで行えばよく、膜を汚染させたり、傷つけたりすることなく取扱いが容易となる。

なお、合成高分子製多孔質ろ過膜としては、ろ過する際に１個以上の穴持つろ過膜とするものである。

また、合成高分子製多孔質ろ過膜の種類はＰＰ（Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ）、ＰＶＣ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌ ｃｈｌｏｒｉｄｅ） ＰＣ（Ｐｏｌｙｃａｒｂｏｎａｔｅ）、ＰＴＦＥ（Ｐｏｌｙｔｅｔｒａｆｌｕｏｒｏｅｔｈｙｌｅｎｅ）、ＰＶＤＦ（Ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｉｅｎｅ ｆｌｕｏｒｉｄｅ）、ＭＣＥ（Ｍｉｘｅｄ ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ ｅｓｔｅｒｓ）、ＰＥＳ（Ｐｏｌｙｅｔｈｅｒ ｓｕｌｆｏｎｅ）、ＮＹＬ（Ｎｙｌｏｎ）などがあり、高分子もしくは高分子と単分子を合成したものも含んでいる。例えば金属メッシュに高分子を皮膜したものも同様効果を得ることができる。

（実施の形態２）
ろ過が終わったろ過検査デバイスは顕微鏡にて観察をする。図３と図４に示すように、顕微鏡ステージ部分に平滑基準台６が備えておく。平滑基準台は上面の平滑度が好ましくは２μｍほどに仕上げた錆びにくい硬質体で、好ましくはステンレス材、セラミックス材などで構成されている。図４（ａ）はろ過検査デバイスの断面図であり、図４（ｂ）は同Ａ部詳細断面図である。

また、以下に示す寸法の設定は合成高分子製多孔質ろ過膜１をメンブランフィルタとした例として、外縁構造体２ろ過開口径９ｍｍと設定して説明する。当然ながら合成高分子製多孔質ろ過膜１の種類、寸法が変化すれば突起、溝等の寸法も関連して変化する。

平滑基準台６の基準面７直径は外縁構造体２のろ過開口径より０．４ｍｍほど小さく８．６ｍｍとし、また基準面７高さがろ過検査デバイスの合成高分子製多孔質ろ過膜１面より０．３ｍｍほど高い寸法となっている。ろ過が終わったろ過検査デバイスをこの平滑基準台６に載せ、デバイス押え機構８でろ過検査デバイスの外縁構造体２を軽く押す。デバイス押え機構８の押し代はろ過検査デバイスの外縁構造体２底面が平滑基準台６に当るまでの０．３ｍｍとなっている。この押し代を大きくしすぎると、薄い合成高分子製多孔質ろ過膜１は破れ、またこの押し代が不足すると張力が不足することになる。図４にろ過検査デバイスを平滑基準台６に載せデバイス押え機構８で押えた状態の断面図を示す。図４のＡ部詳細で示すように合成高分子製多孔質ろ過膜１は平滑基準台６の凸部に押されて外周方向に張力が加わっている。これにより合成高分子製多孔質ろ過膜１は平滑基準台６凸面基準面に合わされる。

なお、合成高分子製多孔質ろ過膜１の開口径よりも基準面７を小さくすることで、しわなどの発生を防止し光学焦点が合い、精度良く計測できることはいうまでもない。

また、合成高分子製多孔質ろ過膜１を外縁構造体２に組付け、ろ過検査デバイスとした場合に合成高分子製多孔質ろ過膜１に若干のうねり、しわが残っていても平滑基準台６凸面基準面に合わされ平面化するという作用もある。

顕微鏡観察を１００倍と高倍率で観察する場合、光学レンズ系の被写界深度が１０μｍと極めて小さく被写界深度を超えた部分はボケて鮮明な観察ができなくなる。したがって、平滑基準台は上面の平滑度が好ましくは２μｍほどとなり、また、合成高分子製多孔質ろ過膜面１の厚みばらつきも好ましくは２μｍ程度とすることが必要である。

図３に示すように平滑基準台６の基準面７に、水分、空気を排出する手段としての抜き穴である排水排気孔９を備える。基準面７直径を８．６ｍｍとした場合、排水排気孔９の直径は１ｍｍから２ｍｍ程度とすることで充分な排水排気の作用がある。

（実施の形態３）
図５と図６にろ過検査デバイスの合成高分子製多孔質ろ過膜に対して外周方向に張力を加える別な構成を示す。図６（ａ）はろ過検査デバイスの断面図であり、図６（ｂ）は同Ｂ部詳細断面図である。図５に示すように基準面７には凸突起ａ１０が備えてある。凸突起ａ１０の高さ０．３ｍｍ、根元巾０．５ｍｍとする。また、図６の断面図で示すように外縁構造体２ろ過上流側にあたる部品において合成高分子製多孔質ろ過膜１に接する面に基準面７の凸突起ａ１０と位置、直径が一致する深さ０．５ｍｍ、溝巾１ｍｍの凹溝ａ１１を備える。Ｂ部詳細で示すようにこの凸突起ａ１０と凹溝ａ１１とで合成高分子製多孔質ろ過膜１を全周で挟むことで外周方向に張力を加わえることができる。これにより合成高分子製多孔質ろ過膜１は平滑基準台６凸面基準面に合わされる。また前述例同様、合成高分子製多孔質ろ過膜１を外縁構造体２に組付け、ろ過検査デバイスとした場合に合成高分子製多孔質ろ過膜１に若干のうねり、しわが残っていても平滑基準台６凸面基準面に合わされ平面化するという作用もある。

図５，６と同一形態のろ過検査デバイスをろ過器に組み付け溶液ろ過する場合の条件として、溶液中の細胞、微生物、核酸が外縁構造体２開口端先端部から外縁構造体２内側へ流れることを防ぐ必要がある。図７に示すが外縁構造体２ろ過上流側先端において合成高分子製多孔質ろ過膜膜に対して破損を与えずかつ十分な圧接代を有する合成高分子製多孔質ろ過膜膜厚みの３０％程の高さ、５ないし７μｍの凸突起ｂ１２を円周状に形成し、合成高分子製多孔質ろ過膜１表面を前記凸突起部ｂ１２でろ過器多孔性台４の面と圧接しながら溶液ろ過をすることで溶液中の細胞、微生物、核酸が外縁構造体２開口端先端部から外縁構造体２内側へ流れることを防ぐことができる。

また、凹溝ｃ１４により、さらに安定して合成高分子製多孔質ろ過膜１の漏れを防止する。

また、同様に図７に示すが、外縁構造体２ろ過上流片側開口先端部には深さ０．５ｍｍ、幅１ｍｍ程の凹溝ｂ１３を円周状に形成し、溶液ろ過をするとき溶液が表面張力効果で外縁構造体２ろ過開口先端部から外縁構造体内側へ浸透し、細胞、微生物、核酸も水浸透に合わせて流れることを防ぐ手段を備えることで、検体中のすべての細胞、微生物、核酸を漏れなく合成高分子製多孔質ろ過膜１の観察領域に分布させることができる。図７（ａ）はろ過検査デバイスの断面図であり、図７（ｂ）は同Ｃ部詳細断面図である。

（実施の形態４）
図８（ａ）は外縁構造体２ろ過開口ａ１６より小さい内径をもち、ろ過内開口ａ１６が丸形状の第２の縁部材１５を備えた姿を示す。

また、図８（ｂ）は顕微鏡観察時は第２の縁部材１５を取り外した断面図を示し、これによりろ過時溶液中の細胞、微生物、核酸が外縁構造体２のろ過開口ａ１６先端部外周端に集まることを防ぐことができる。

これにより、ろ過時溶液中の細胞、微生物、核酸が外縁構造体２のろ過開口ａ１６先端部の外周端に集まると顕微鏡観察時外縁構造体２に対物レンズが当り観察しずらいという点が解消できる。

また、図３，４の構成例において平滑基準台６の基準面直径と外縁構造体２内にあるろ過開口ａ径の隙間０．４ｍｍほどの合成高分子製多孔質ろ過膜１は図４のＡ部詳細に示すように平面度が維持されず顕微鏡の焦点がずれて観察ができない。第２の縁部材１５を使用してろ過することで、この部分にろ過時溶液中の細胞、微生物、核酸がろ過時分布しないようにすることができる。

図９は第２の縁部材１５のろ過開口ａ１６形状を丸形状以外に、図９（ａ）に示されて鋳いる四角形状、図９（ｂ）に示されている複数の丸形状などとすることで合成高分子製多孔質ろ過膜１表面に溶液ろ過による溶液中の細胞、微生物、核酸を第２の縁部材１５の開口形状と同様な形状、位置にろ過分布させることができる。顕微鏡観察時には合成高分子製多孔質ろ過膜１表面をくまなく観察する代わりに第２の縁部材１５の開口形状で規定される特定の場所のみの観察ですべての面を観察したことと同一の効果をあげることができる。特に顕微鏡にＣＣＤカメラを取り付け、顕微鏡のステージを電動化して自動観察する場合は観察時間が短くなる等、有用となる。

（実施の形態５）
図１０は、ＤＮＡプローブ１０９を合成高分子製多孔質ろ過膜１の孔以外の部分に固定化したものを示す。ＤＮＡを含んだ検体は、ろ過開口ａ１６に注がれ、合成高分子製多孔質ろ過膜１に固定してあるＤＮＡプローブ１０９と反応し結合する。結合後、図には示していないが、合成高分子多孔質ろ過膜１の下に設けた多孔性台４にＤＮＡプローブ１０９と反応しない液体が吸引除去され、反応したＤＮＡのみを合成高分子多孔質ろ過膜１上に残存することができる。残存したＤＮＡは事前に染色もしくは蛍光基や発光基が標識されており、標識を検出することで、反応部が容易に検出することができる。

また、このとき通常の検出方法とは異なり、洗浄せずにも検出することができる。特に蛍光基を検出する方法としては、合成高分子多孔質ろ過膜１表面に金属を表面処理したものを用いることで顕微での高感度に検出する。蛍光波長によって検出しやすい表面処理が必要であり、標識されたＤＮＡ検出等は、数種蛍光基を検出するため、表面処理としては、白金、金もしくは銀のような金属が望ましく、酸化などの影響を考えると白金や金の処理が最も良いとされる。さらにＤＮＡプローブや抗体などを固定化して１種類の検体より、様々な反応を検出ことも可能となる。例えば、検体が食品であれば、黄色ブドウ球菌のエンテロトキシンや微生物等を一度に存在を判定したい場合があり、個々のＤＮＡプローブや抗体の位置が特定できる構成が望まれており、合成高分子多孔質ろ過膜１での位置が確認できる方法が要望されている。格子状に孔のない部分に上記個々のＤＮＡプローブや抗体を固定化することで、顕微観察におけるＸＹの移動において、位置が明確になり、抗体で反応した部分やＤＮＡで反応した部分を短時間で検出することが可能となる。さらに、格子状の孔内に抗体やＤＮＡプローブを固定化することで、焦点での調整作業の容易にすることができる。

なお、表面処理として金を用いることを示したが、金表面はタンパク質中の硫黄などと結合しやすく、ＤＮＡプローブや抗体の結合し、容易に固定化することができる。

なお、金属は薄膜の上に固定化するプローブをつけるため、アミノ酸処理等を実施しても検出する波長に吸収もしくは反射しなければ、検出する際の感度は同様に得ることができる。

なお、図には示していないが、核酸プローブや抗体や反応基と受容体などは、合成高分子製多孔質ろ過膜１に事前に添着や付着する方法を用いる。

なお、洗浄工程を除く内容で記載したが、結合後、洗浄液を合成高分子多孔質ろ過膜１に通過させ、洗浄してもその差異は生じない。さらには洗浄も検体吸引後に同時に実施できるため、作業時間が短時間にできることは言うまでもない。

なお、合成高分子製多孔質ろ過膜１の孔の壁面にＤＮＡプローブを固定化することで、
合成高分子製多孔質ろ過膜表面での焦点とほぼ同じ位置となり、容易に観察することができる。さらに、孔の壁面に反応するＤＮＡプローブを固定化することで、検体接触を確実に行える構成になることは、言うまでもない。

なお、合成高分子製多孔質ろ過膜１表面に凹形の溝を形成しＤＮＡプローブ等を固定化することで、検体液を接触後、検体液は凹形の溝を通り、合成高分子製多孔質ろ過膜に形成した孔より、排出されるため、凹形の溝を滞留する時間が長くなり、検体との反応時間が長くさらには検体液が乱流状態となるため、凹形の溝の壁面に付いたＤＮＡプローブと反応性が高くなることは、言うまでもない。

なお、多孔質ろ過膜に合成高分子製を用いてこれまで説明しているが、材質がガラスや金属膜などの多孔質ろ過膜でも同様な効果を得ることができ、リユースが容易に行われ、さらには、使用後のリサイクルも容易に実施できることは言うまでもない。

（実施の形態６）
図１１に格子状の孔を持つ格子状多孔質ろ過膜１７と顕微鏡観察時のＸＹステージを利用する概要を示すが、観察者はＸＹステージを移動させると同時に格子状多孔質ろ過膜１７の孔の格子に従うように観察することができ、格子の辺の位置を明確にするため、 格子位置決めマーカ１８を外縁構造体２に設置してある。格子位置決めマーカ１８によりＸＹステージ移動時、Ｘ軸に対し０℃、９０℃の位置に合わせることでＸＹ移動とともに格子状多孔質ろ過膜１７が移動し、格子状多孔質ろ過膜１７の孔内で反応した現象を容易に観察できる。図１２には、格子状多孔質ろ過膜１７の詳細を示す。格子部分の孔内部にＤＮＡプローブ109を固定化することで、焦点の合わせは勿論容易になる。

また、図１１には、マーカ位置を格子状多孔質ろ過膜１７の上下に設置したが、左右や上部と左等、格子の辺が認識できる方法で有ればよい。

また、格子位置決めマーカ１８は、外縁構造体２の表面に位置したが、外縁構造体２を変形させ、格子状多孔質ろ過膜１７の辺が認識できる構造であれば、同様な効果を得る。

また、同時に格子状多孔質ろ過膜１７のステージを鏡面にすることで、反応後の蛍光や発光を集光し、輝度を高めることも容易にでき、さらには、格子内に水分等の屈性率の異なる液体や固体をはめ込むことで、反応した輝度を高めることも容易にできることは言うまでもない。

本発明は、検体溶液中の細胞、微生物、核酸等を合成高分子製多孔質ろ過膜を用いて分離し顕微鏡観察をするときに合成高分子製多孔質ろ過膜の取扱いが容易になり、顕微鏡観察の都度焦点合わせが不要となり簡便に観察ができるようになる。この構成を用い検体溶液のろ過、顕微鏡観察の一連の流れを自動化、装置化へと展開応用へと適用できる。

本発明の実施の形態１のろ過検査デバイスの図 同ろ過検査デバイスのろ過器組み付け図 本発明の実施の形態２のろ過検査デバイス顕微鏡観察構成の図 同ろ過検査デバイスの断面図 本発明の実施の形態３のろ過検査デバイス顕微鏡観察の図 同ろ過検査デバイスの断面図 同ろ過検査デバイスの断面図 本発明の実施の形態４の第２の縁部材を持つろ過検査デバイスの図 同円形状以外の第２の縁部材を持つろ過検査デバイスの図 本発明の実施の形態５のＤＮＡ検査デバイスの図 本発明の実施の形態６の格子状の孔を持ち、格子の辺が認識できるＤＮＡ検査デバイスの図 同ＤＮＡプローブ固定化した格子状合成高分子製多孔質ろ過膜の断面詳細図 従来のろ過器の図 同既存ＤＮＡチップの図

符号の説明

１ 合成高分子製多孔質ろ過膜
２ 外縁構造体
３ ろ過開口
４ 多孔性台
５ ベース
６ 平滑基準台
７ 基準面
８ デバイス押え機構
９ 排水排気孔
１０ 凸突起ａ
１１ 凹溝ａ
１２ 凸突起ｂ
１３ 凹溝ｂ
１４ 凹溝ｃ
１５ 第２の縁部材
１６ ろ過開口ａ
１７ 格子状多孔質ろ過膜

Claims (29)

1. 多孔質ろ過膜の内側にろ過開口を備えた外縁構造体を設けたことを特徴とするろ過検査デバイス。
2. 外縁構造体部を均等な力で押え多孔質ろ過膜面を平滑基準台に押し当てることで膜面外周方向に張力を発生させることを特徴とする請求項１記載のろ過検査デバイス。
3. 平滑基準台の基準面直径を多孔質ろ過膜外縁構造体のろ過開口径より小さくしたことを特徴とする請求項２記載のろ過検査デバイス。
4. 外縁構造体部を均等な圧力で押えるデバイス押え機構を有しデバイス押え機構を所定の位置に維持固定し、多孔質ろ過膜面を平滑基準台に押し当てて膜面外周方向に張力を発生させることを特徴とする請求項２記載のろ過検査デバイス。
5. 外縁構造体底部の一部を平滑基準台に当てることで多孔質ろ過膜に対して外周方向に加える張力の上限を設けることを特徴とする請求項２記載のろ過検査デバイス。
6. 外縁構造体のろ過上流側先端において、多孔質ろ過膜に接する面にろ過開口径より大きい直径の凹溝を備え、平滑基準台の平滑基準面にもその凹溝と位置、直径が一致する凸状の突起部を外周部に沿って備え、多孔質ろ過膜をこの凹溝と凸突起で挟み込むことで膜面外周方向に張力を発生させることを特徴とする請求項２記載のろ過検査デバイス。
7. 外縁構造体のろ過上流側先端において、多孔質ろ過膜膜厚みの３０％程の低い凸突起部を円周状に形成し、多孔質ろ過膜表面を前記凸突起部で圧接しながら溶液ろ過をすることを特徴とする請求項１記載のろ過検査デバイス。
8. 外縁構造体のろ過上流側先端に凹溝を円周状に形成することを特徴とする請求項１記載のろ過検査デバイス。
9. 外縁構造体のろ過開口より小さい内径をもち、ろ過内開口が丸形状の第２の縁部材を備え、顕微鏡観察時は第２の縁部材を取り外して行うことを特徴とする請求項１記載のろ過検査デバイス。
10. 第２の縁部材のろ過内開口が、四角開口、複数開口等と丸開口以外の形状とすることを特徴とする請求項９記載のろ過検査デバイス。
11. 平滑基準台部に水分、空気を排出する手段を備えことを特徴とする請求項２記載のろ過検査デバイス。
12. 平滑基準台部の水分、空気を排出する手段として平滑基準台に抜き穴を有することを特徴とする請求項１１記載のろ過検査デバイス。
13. 外縁構造体を二枚のシート状材で構成し多孔質ろ過膜を挟むことを特徴とする請求項１記載のろ過検査デバイス。
14. 外縁構造体を１枚のシート状材で構成し多孔質ろ過膜を溶着させることを特徴とする請求項１記載のろ過検査デバイス。
15. 外縁構造体を二個の樹脂成形材で構成し多孔質ろ過膜を挟み込むことを特徴とする請求項１記載のろ過検査デバイス。
16. 多孔質ろ過膜の孔が均一なピッチで整列していることを特長とする請求項１乃至７または１３乃至１５のいずれかに記載のろ過検査デバイス。
17. 多孔質ろ過膜の孔径が均一であることを特長とする請求項１乃至７または１３乃至１６のいずれかに記載のろ過検査デバイス。
18. 多孔質ろ過膜の孔の形状が格子状の形状としたことを特長とする請求項１乃至７または１３乃至１７のいずれかに記載のろ過検査デバイス。
19. 多孔質ろ過膜の孔の形状が格子状で格子の辺が認識できることを特長とする請求項１８記載のろ過検査デバイス。
20. 多孔質ろ過膜の表面に検出時の背景とを検出物の輝度に差をつける表面処理を行ったことを特長とする請求項１乃至７または１３乃至１９のいずれかに記載のろ過検査デバイス。
21. 表面処理として金属蒸着を行ったことを特長とする請求項２０記載のろ過検査デバイス。
22. 金属蒸着として金を特長とする請求項２１記載のろ過検査デバイス。
23. 多孔質ろ過膜の表面にＤＮＡプローブを固定したものを特長とする請求項１乃至７または１３乃至２０のいずれかに記載のろ過検査デバイス。
24. 多孔質ろ過膜表面の孔の内壁面部分にＤＮＡプローブを固定したことを特長とする請求項１乃至７または１３乃至２３のいずれかに記載のろ過検査デバイス。
25. 多孔質ろ過膜表面の孔の内壁面部分にＤＮＡプローブを均一にを固定したことを特長とする請求項２４記載のろ過検査デバイス。
26. 多孔質ろ過膜表面の孔の内壁面部分にＤＮＡプローブを均一な厚みになるように固定したことを特長とする請求項２５記載のろ過検査デバイス。
27. 多孔質ろ過膜の表面に凹溝があることを特長とする請求項１乃至７または１３乃至２０または２３乃至２６のいずれかに記載のろ過検査デバイス。
28. 多孔質ろ過膜の表面に凹溝があり、ＤＮＡプローブを固定化したことを特長とする請求項２７記載のろ過検査デバイス。
29. 多孔質ろ過膜を合成高分子製としたことを特長とする請求項１乃至２８のいずれかに記載のろ過検査デバイス。

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