JP2006201091A - 捕捉ビーズ用マイクロ粒子およびそれを用いた捕捉ビーズならびにバイオチップ - Google Patents
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Images
Abstract
【解決手段】 捕捉ビーズの表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と、電子求引性の置換基がカルボニル基に結合されてなるカルボン酸誘導基を有する第二単位と、を含む高分子物質が被覆されている。そして、カルボン酸誘導基と、生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合を形成しており、生理活性物質を捕捉する捕捉物質が固定化されている。この捕捉ビーズを用いて試験液中の前記生理活性物質の処理を行う。
【選択図】 なし
Description
まず、ビーズアレイや微細流路内での免疫分析を行なう際に用いられるマイクロビーズとしては、大きさが10〜500μm程度の大きさのものが用いられるが、このような大きさのビーズの取り扱いの際に、流路壁面にビーズが付着したり、ビーズが凝集し、流路内に滞ったりするという不具合が生じる場合があった。また、DNAにおけるハイブリダイゼーションや抗原抗体反応について、反応効率が高く、高いシグナルが得られるビーズが切望されている。
生理活性物質を捕捉する捕捉物質が固定化され、捕捉ビーズ用担体として使用されるマイクロ粒子であって、
ホスホリルコリン基を有する第一単位と、電子求引性の置換基がカルボニル基に結合されてなるカルボン酸誘導基を有する第二単位と、を含む高分子物質が、表面に被覆されていることを特徴とする捕捉ビーズ用マイクロ粒子が提供される。
生理活性物質を捕捉する捕捉物質が固定化され、捕捉ビーズ用担体として使用されるマイクロ粒子であって、
ホスホリルコリン基を有する第一単位と、下記式(1)に示される一価の基を有する第二単位と、を含む高分子物質が、表面に被覆されていることを特徴とする捕捉ビーズ用マイクロ粒子が提供される。
−COA (1)
(ただし、上記式(1)において、Aは水酸基およびアルコキシル基を除く一価の脱離基である。)
粒子表面に生理活性物質を捕捉する捕捉物質が固定化されており、試験液中の前記生理活性物質の処理に用いられる捕捉ビーズであって、
前記捕捉ビーズ用マイクロ粒子の前記カルボン酸誘導基と、前記捕捉物質とが反応して、共有結合を形成していることを特徴とする捕捉ビーズが提供される。
粒子表面に生理活性物質を捕捉する捕捉物質が固定化されており、試験液中の前記生理活性物質の処理に用いられる捕捉ビーズであって、
前記捕捉ビーズ用マイクロ粒子の前記式(1)で示される一価の基と、前記捕捉物質とが反応して、共有結合を形成していることを特徴とする捕捉ビーズが提供される。
ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質は、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質と生理活性物質を補足する捕捉物質を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。第一単位に含まれるホスホリルコリン基は生理活性物質の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基は捕捉分子を化学的に固定化する役割を果たす。
2−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および10−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の(メタ)アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基;
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基;
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。
コハク酸イミド基やフタル酸イミド基等のイミド基;
―Cl、−F等のハロゲン;
等の基を有することができる。なお、活性エステル基の定義および具体例については、さらに詳細に後述する。
−COA (1)
(ただし、上記式(1)において、Aは水酸基およびアルコキシル基を除く脱離基である。)
−COOCR1 (p)
−COONR2 (q)
(ただし、上記式(p)および式(q)において、R1およびR2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式(p)において、R1はCとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式(q)において、R2はNとともに環を形成する二価の基であってもよい。)
下記式(t)に示される酸ハロゲン化物由来の基;
下記式(u)、式(w)に示される活性エステル由来の基;または
下記式(v)に示される活性化アミド由来の基とすることができる。
チオフェノールエステル類;
N−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)基等のN−ヒドロキシアミンエステル類;
5−ノルボルネン−2,3−ジカルボキシイミド基、N−ヒドロキシ−5−ノルボルネン−2,3−ジカルボキシイミド等の複素環ヒドロキシ化合物のエステル類;および
シアノメチルエステル基;
等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、t−ブチルペルオキシネオデカノエート、t−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物;
などが用いられる。
本発明に使用する捕捉ビーズに用いるコア粒子の材料としては、ガラス、プラスチック、金属等が挙げられる。このうち、表面処理の容易性および量産性から、プラスチックが好ましく、熱可塑性樹脂がより好ましい。熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることができる。蛍光発生量の少ない樹脂を用いることにより、生理活性物質の検出反応におけるバックグラウンドを低下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。
生理活性物質を捕捉する捕捉物質は、生理活性物質に特異的に相互作用する物質とすることができる。特異的な相互作用は物理的な相互作用であっても化学的な相互作用であってもよい。また、捕捉物質は生理活性を有することができる。生理活性を有する捕捉物質としては、たとえば、核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、または糖タンパク質とすることができる。
まず、コアとなる粒子を準備する。コア粒子の材料は、前述した構成とする。具体的には、10μm以上500μm以下、好ましくは直径20μm以上100μm以下のポリスチレンに代表される樹脂製の微細粒子を準備することができる。
(a)ホスホリルコリン基を含む第一単位と活性エステル基を有する第二単位とを必須成分とし、ブチルメタクリレート基を有する第三単位を任意成分とする高分子
(b)ホスホリルコリン基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する高分子
以下の実験例では、生理活性物質を含む試料として、タンパク質、核酸等を含む試料を用い、これらの分析を行う際に用いる補足物質を捕捉ビーズ作製用のマイクロ粒子に固定化し、これらの検出を行った。
DNA溶液1:5'末端にアミノ基を有した鎖長24bpのオリゴDNA(TAGAAGCATTTGCGGTGGACGATG(配列番号1)(シグマジェノシス社製)を5μg/mLの濃度になるように所定の緩衝液に溶解し調製した。
DNA溶液2:5'末端にビオチン標識を有した鎖長24bpのオリゴDNA(CATCGTCCACCGCAAATGCTTCTA(配列番号2)を2μg/mLの濃度になるように3×SSC(standard saline citrate)、0.2%SDS(ドデシル硫酸ナトリウム)の溶液に溶解した。
抗原溶液1:FBS(fetal bovine serum)中にマウスIgG2a抗体を1μg/mL濃度で溶解し、pH9.5の炭酸バッファー1mL中に、上記マウスIgG2a抗体を含むFBSを100μLを加え、さらに1mg/mL濃度でNHS活性エステルを導入したビオチンを超純水に溶解させた溶液を10μL添加し、25℃で2時間放置し、ゲルろ過カラムにより未反応のNHS化ビオチンを除き、マウスIgG2aおよびFBS中のタンパク質にビオチンを導入した。ビオチンを導入したタンパクをPBS中に溶解させ抗原溶液1とした。
抗原溶液2:上記抗原溶液1の調製において、マウスIgG2a抗体を除き、同じ条件でFBSのタンパク質をビオチン標識した。ビオチンを導入したFBSタンパク質をPBS中に溶解させ、抗原溶液2とした。
発色基質液:ELISA用TMBZ(3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine)発色試薬(住友ベークライト社製)を所定の方法で調製した。
ブロッキング溶液1:pH9.5の炭酸バッファー中に20mMの濃度でグリシンを溶解させ調製した。
ブロッキング溶液2:水素化ホウ素ナトリウムを0.5重量%の濃度でPBS中に溶解させ調製した。
ブロッキング溶液3:BSAを1重量%濃度でPBS中に溶解させ調製した。
3−メタクリロイルオキシエチルホシホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の0.5重量%エタノール溶液中に、市販の直径40μmのポリスチレン樹脂製粒子を分散させた。これを1時間放置した後、遠心分離により粒子を回収した。洗浄のため、回収した粒子を純水中に分散させた。そして、再び遠心分離により粒子を回収した。こうして、捕捉ビーズ用のマイクロ粒子を得た。
3−メタクリロイルオキシエチルホシホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルカルボニルオキシエチルメタクリレート共重合体の0.5重量%エタノール溶液中に、市販の直径40μmのポリスチレン樹脂製粒子を分散させた。これを1時間放置した後、遠心分離により粒子を回収した。洗浄のため回収した粒子を純水中に分散し、再び遠心操作により粒子を回収した。こうして、捕捉ビーズ用のマイクロ粒子を得た。
直径40μmのポリスチレン樹脂粒子の表面に親水化処理を施した後、アミノアルキルシラン2重量%溶液中に分散させて1時間放置した。そして、純水熱処理を施し粒子の表面にアミノ基を導入した。この粒子を1重量%グルタルアルデヒド水溶液に分散させて、1時間放置することにより、粒子表面のアミノ基とグルタルアルデヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。遠心分離により粒子を回収した。そして、回収した粒子を純水中に分散させて洗浄した後、再び遠心操作により回収した。
直径40μmのポリスチレン樹脂粒子の表面に親水化処理を施した後、アミノアルキルシラン2重量%溶液中に分散させて1時間放置した。そして、純水熱処理を施し粒子の表面にアミノ基を導入した。この粒子を1重量%グルタルアルデヒド水溶液に分散させて、1時間放置することにより、粒子表面のアミノ基とグルタルアルデヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。遠心分離により粒子を回収した。そして、回収した粒子を純水中に分散させて洗浄した後、再び遠心操作により回収した。
抗体溶液中に直径40μmのポリスチレン樹脂粒子を分散させて1時間放置した後、遠心操作により粒子を回収した。そして、回収した粒子を純水により洗浄した後、遠心操作により粒子を回収した。つづいて、回収した粒子をブロッキング溶液3中に分散させて1時間放置し、純水で洗浄した後、遠心操作により粒子を回収した。回収した粒子を、後述する抗原抗体反応による評価に供した。
実験例1および実験例3で得られた粒子(捕捉ビーズ)を用いて評価を行った。評価には、幅200μm、深さ60μmの流路を有し、流路の途中に捕捉ビーズを保持するためのせき止め手段を設けたアクリル樹脂製の微細流路チップを用いた。捕捉ビーズをせき止める手段として、孔径100nm(0.1μm)のメンブランフィルタを流路の両側面および底面に固定して用いた。
実験例2、実験例4および実験例5を用いて評価を行った。評価には、幅200μm、深さ60μmの流路を有し、流路の途中に捕捉ビーズを保持するためのせき止め手段をもったアクリル製微細流路チップを準備して用いた。捕捉ビーズをせき止める手段として、孔径100nm(0.1μm)のメンブランフィルタを流路の両側面および底面に固定して用いた。
101 基板
103 導入孔
105 排出孔
107 溝
109 フィルタ
111 捕捉ビーズ
Claims (19)
- 生理活性物質を捕捉する捕捉物質が固定化され、捕捉ビーズ用担体として使用されるマイクロ粒子であって、
ホスホリルコリン基を有する第一単位と、電子求引性の置換基がカルボニル基に結合されてなるカルボン酸誘導基を有する第二単位と、を含む高分子物質が、表面に被覆されていることを特徴とする捕捉ビーズ用マイクロ粒子。 - 請求項1に記載の捕捉ビーズ用マイクロ粒子において、
前記カルボン酸誘導基が、エステル基のアルコール側に電子求引性の置換基を有する活性エステル基であることを特徴とする捕捉ビーズ用マイクロ粒子。 - 請求項2に記載の捕捉ビーズ用マイクロ粒子において、前記エステル基がp−ニトロフェニルエステル基またはN−ヒドロキシスクシンイミドエステル基であることを特徴とする捕捉ビーズ用マイクロ粒子。
- 生理活性物質を捕捉する捕捉物質が固定化され、捕捉ビーズ用担体として使用されるマイクロ粒子であって、
ホスホリルコリン基を有する第一単位と、下記式(1)に示される一価の基を有する第二単位と、を含む高分子物質が、表面に被覆されていることを特徴とする捕捉ビーズ用マイクロ粒子。
−COA (1)
(ただし、上記式(1)において、Aは水酸基およびアルコキシル基を除く一価の脱離基である。) - 請求項4に記載の捕捉ビーズ用マイクロ粒子において、前記式(1)に示される一価の基が、下記式(p)または式(q)から選択されるいずれかの基であることを特徴とする捕捉ビーズ用マイクロ粒子。
−COOCR1 (p)
−COONR2 (q)
(ただし、上記式(p)および式(q)において、R1およびR2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式(p)において、R1はCとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式(q)において、R2はNとともに環を形成する二価の基であってもよい。) - 請求項1乃至5いずれかに記載の捕捉ビーズ用マイクロ粒子において、直径10μm以上500μm以下の球状であることを特徴とする捕捉ビーズ用マイクロ粒子。
- 請求項1乃至6いずれかに記載の捕捉ビーズ用マイクロ粒子において、ホスホリルコリン基を含む前記第一単位が、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有することを特徴とする捕捉ビーズ用マイクロ粒子。
- 請求項1乃至7いずれかに記載の捕捉ビーズ用マイクロ粒子において、プラスチック材料からなるコア粒子を有することを特徴とする捕捉ビーズ用マイクロ粒子。
- 請求項1乃至7いずれかに記載の捕捉ビーズ用マイクロ粒子において、ガラス材料からなるコア粒子を有することを特徴とする捕捉ビーズ用マイクロ粒子。
- 粒子表面に生理活性物質を捕捉する捕捉物質が固定化されており、試験液中の前記生理活性物質の処理に用いられる捕捉ビーズであって、
請求項1乃至3いずれかに記載の捕捉ビーズ用マイクロ粒子の前記カルボン酸誘導基と、前記捕捉物質とが反応して、共有結合を形成していることを特徴とする捕捉ビーズ。 - 請求項10に記載の捕捉ビーズにおいて、複数の前記カルボン酸誘導基を有し、前記複数のカルボン酸誘導基は、前記捕捉物質と反応して共有結合を形成しているか、または不活化されていることを特徴とする捕捉ビーズ。
- 粒子表面に生理活性物質を捕捉する捕捉物質が固定化されており、試験液中の前記生理活性物質の処理に用いられる捕捉ビーズであって、
請求項4または5に記載の捕捉ビーズ用マイクロ粒子の前記式(1)で示される一価の基と、前記捕捉物質とが反応して、共有結合を形成していることを特徴とする捕捉ビーズ。 - 請求項12に記載の捕捉ビーズにおいて、複数の前記式(1)で示される一価の基を有し、前記複数の式(1)で示される一価の基は、前記捕捉物質と反応して共有結合を形成しているか、または不活化されていることを特徴とする捕捉ビーズ。
- 請求項10乃至13いずれかに記載の捕捉ビーズにおいて、前記捕捉ビーズ用マイクロ粒子が、直径10μm以上500μm以下の球状であることを特徴とする捕捉ビーズ。
- 請求項10乃至14いずれかに記載の捕捉ビーズにおいて、ホスホリルコリン基を含む前記第一単位が2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有することを特徴とする捕捉ビーズ。
- 請求項10乃至15いずれかに記載の捕捉ビーズにおいて、前記捕捉物質が、核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖および糖タンパク質からなる群から選択される一または二以上の物質であることを特徴とする捕捉ビーズ。
- 請求項10乃至16いずれかに記載の捕捉ビーズにおいて、前記生理活性物質が、核酸、アプタマー、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖および糖タンパク質からなる群から選択される一または二以上の物質であることを特徴とする捕捉ビーズ。
- 流路と、
前記流路中に設けられた捕捉ビーズと、
を含み、前記捕捉ビーズが請求項10乃至17いずれかに記載の捕捉ビーズであることを特徴とするバイオチップ。 - 請求項18に記載のバイオチップにおいて、
前記流路が基板に設けられるとともに、
前記捕捉ビーズの透過を制限するせきが前記流路に設けられていることを特徴とするバイオチップ。
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