WO2019088167A1 - 糖鎖又は糖ペプチドの精製剤及びその使用 - Google Patents
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Abstract
ベタイン構造を有する化合物からなる、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製剤。
Description
本発明は、糖鎖精製用担体及びその使用に関する。より具体的には、本発明は、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製剤、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製用担体、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製方法、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチド精製のためのキット、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチド精製のための装置に関する。本願は、2017年10月31日に日本に出願された特願2017-210150号、及び2017年11月27日に日本に出願された特願2017-227180に基づき優先権を主張し、それらの内容をここに援用する。
生体を構成するタンパク質の多くは糖鎖修飾を受け、糖鎖が結合した糖タンパク質として存在している。かかる糖鎖修飾によって、タンパク質は、高次構造形成、細胞間シグナル伝達や分子認識等の機能、及び、体内動態等が調節されている。この糖タンパク質の糖鎖の構造及び分布がタンパク質の機能発現に関与し、数多くの疾患の発症や進行に伴って糖鎖構造が変化することが知られている。糖タンパク質の構造解析は、糖鎖構造変化を伴う種々の疾患の発症機構の解明や、疾患治療及び診断技術の開発等、生命科学や医療、創薬等の種々の技術分野において重要な役割を果たすことが期待される。
糖タンパク質の構造解析は、一般に糖タンパク質を酵素消化等によって分解した糖ペプチドや糖鎖を分析することにより行われる。しかしながら、糖タンパク質の分解物中における糖ペプチドや糖鎖の存在量は微量であり、圧倒的多量で存在するペプチドにより解析が困難になる。そのため、糖鎖が結合していないペプチドを除去し、糖鎖が結合している糖ペプチド及び糖鎖のみを特異的に濃縮できる技術の構築が強く望まれている。
従来において、糖ペプチド等の濃縮技術として様々な技術が報告されている。例えば、親水性相互作用を利用する濃縮技術、フェニルボロン酸等を利用する共有結合形成による濃縮技術、レクチンとの相互作用を利用する濃縮技術、チタン(例えば、酸化チタン(TiO2))やジルコニウム、銀等とのキレート相互作用を利用する濃縮技術等が報告されている(例えば、非特許文献1等を参照のこと)。ここで、親水性相互作用を利用する濃縮技術は、糖ペプチド等の理化学的性質を利用するものであり、セファロースの水酸基と糖鎖との間での形成される水素結合を利用し、セファロースビーズにより糖ペプチド等を選択的に捕捉し回収するものである(例えば、非特許文献1及び2等を参照のこと)。詳細には、トリプシンとリシルエンドペプチダーゼとの混合物やキモトリプシン等で糖タンパク質を酵素消化した消化物を、有機溶媒(1-ブタノール/エタノール/水)(5:1:1,v/v)等でセファロースビーズと混合し、糖ペプチド等をセファロースビーズに吸着させ、上記有機溶媒で洗浄後、水性溶媒(エタノール/水)(1:1,v/v)等で溶出するものである。
Chen-Chun Chen et al., "Interaction modes and approaches to glycopeptide and glycoprotein enrichment", Analyst, 2014, vol. 139, p.688-704
Michiko Tagiri et al., "Differential analysis of site-specific glycans on plasma and cellular fibronectins: Application of a hydrophilic affinity method for glycopeptide enrichment", Glycobiology, 2005, vol. 15, no.12, p.1332-1340
しかしながら、非特許文献1、2等で報告されるセファロースビーズを用いる濃縮技術は、セファロースと糖鎖の相互作用が弱いため、分子量が小さなO-グルコシド結合型糖鎖を持つ糖ペプチドや長いペプチド領域を持つ糖ペプチドは、ペプチドの影響を受けることからセファロースビーズへの保持が弱くなる。そのため、糖ペプチド等の濃縮効率や再現性低下を招くとの問題がある。
ここで、生体分子の濃縮及び精製に際しては、バッチ法や、スピンカラム法等のカラム法が汎用される。バッチ法は、試料と担体を同一の容器に投入し一定時間攪拌し、目的物質を担体に吸着後、遠心力や磁気等を利用して液相部分を除去して目的物質を濃縮する方法である。セファロースビーズを担体としてバッチ法に適用した場合、セファロースビーズは水分を吸収し膨張するため明確な固液分離面が形成されない。そのため、遊離のペプチド断片等を含む液相部分を効果的に除去できず、また、糖ペプチド等が吸着しているセファロースビーズを液相部分と共に除去してしまう等のサンプルロスのリスク等があり、糖ペプチド等の濃縮効率や再現性低下の要因となる。
スピンカラム法は、担体が充填されたフィルターカップ等に試料を投入し、重力や遠心力等を利用して担体に試料を通液させて目的物質を吸着させ、通液後の排液を除去することで目的物質を濃縮する方法である。しかしながら、セファロースビーズの担体としてのスピンカラム法への適用は、フィルターカップ等を用いることで簡便に固液分離を実現できる反面、セファロースビーズ表面が乾燥状態となる。セファロースビーズは乾燥に弱いため糖ペプチドの回収率の低下を招くことから取り扱いに注意が必要である。
そこで、本発明は、親水性の糖ペプチド及び糖鎖を特異的かつ効率的に捕捉可能な技術の提供を目的とする。また、遊離のペプチド断片等が夾雑している試料から、簡便な操作で、糖ペプチド及び糖鎖を効率的、高純度かつ高濃度に濃縮できる技術を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、ベタイン構造を有する側鎖が主鎖に結合しているポリマーを、不溶性支持体に固定することにより、当該担体の親水度を効果的に高められることを見出した。更に、当該担体は、親水性相互作用により親水度の高い糖ペプチド及び糖鎖を強く保持できる特性を有し、かかる特性を利用することにより糖ペプチド及び糖鎖を簡便な操作で、効率的、高純度かつ高濃度に濃縮できることを見出した。
すなわち、本発明は、担体、当該担体を用いる糖ペプチド濃縮方法、糖鎖濃縮方法、糖ペプチド濃縮のためのキット、糖鎖濃縮のためのキット、糖ペプチド濃縮のための装置、及び、糖鎖濃縮のための装置を提供するものであり、詳細には、以下の構成を含む。
〔1〕ベタイン構造を有する化合物からなる、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製剤。
〔2〕前記ベタイン構造が下記式(1)で表される構造である、[1]に記載の精製剤。
[式(1)中、Zは、2級アミノ基、3級アミノ基、4級アンモニウム基及びイミノ基からなる群より選択されるカチオン性基を表し、Lは炭素数1~10のアルキレン基を表し、Aは、リン酸基、カルボキシル基、ホスホン酸基、ホスフィン酸基、スルホン酸基、スルフィン基、スルフェン基、水酸基、チオール基及びボロン酸基からなる群より選択されるアニオン性基を表す。]
〔3〕前記カチオン性基が4級アンモニウム基である、〔1〕又は〔2〕に記載の精製剤。
〔4〕前記アニオン性基がリン酸基である、〔1〕~〔3〕のいずれかに記載の精製剤。
〔5〕前記ベタイン構造が、ホスホリルコリン基である、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載の精製剤。
〔6〕前記化合物が、ベタイン構造を有する側鎖が主鎖に結合したポリマーである、〔1〕~〔5〕のいずれか一項に記載の精製剤。
〔7〕前記ポリマーが、(メタ)アクリル化合物を含む単量体の重合体である、〔6〕に記載の精製剤。
〔8〕〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の精製剤が、不溶性支持体に固定された、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製用担体。
〔9〕〔6〕又は〔7〕に記載の精製剤が、不溶性支持体に固定された、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製用担体。
〔10〕前記不溶性支持体に固定された前記ポリマーの重量が、前記不溶性支持体の単位表面積(m2)当たり0.5mg~1.5mgである、〔9〕に記載の精製用担体。
〔11〕前記不溶性支持体が、無機物質により構成されている、〔8〕~〔10〕のいずれかに記載の精製用担体。
〔12〕比重が、1.05~3.00である、〔8〕~〔11〕のいずれかに記載の精製用担体。
〔13〕形状が球状であり、平均粒径が0.5μm~100μmである、〔8〕~〔12〕のいずれかに記載の精製用担体。
〔14〕〔1〕~〔7〕のいずれかに記載の精製剤又は〔8〕~〔13〕のいずれかに記載の精製用担体と、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドと有機溶剤を含む試料とを接触させ、前記精製剤又は精製用担体に前記糖鎖又は前記糖ペプチドを吸着させることと、上記精製剤又は精製用担体を水に接触させ、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドを溶出させることと、を含む、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製方法。
〔15〕〔1〕~〔7〕のいずれかに記載の精製剤又は〔8〕~〔13〕のいずれかに記載の精製用担体、及び、キット使用のためのプロトコル情報を含む、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチド精製のためのキット。
〔16〕〔1〕~〔7〕のいずれかに記載の精製剤又は〔8〕~〔13〕のいずれかに記載の精製用担体を収容した容器を保持する容器保持部と、前記容器に試薬類を導入する試薬導入部と、を備える、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチド精製のための装置。
〔2〕前記ベタイン構造が下記式(1)で表される構造である、[1]に記載の精製剤。
〔3〕前記カチオン性基が4級アンモニウム基である、〔1〕又は〔2〕に記載の精製剤。
〔4〕前記アニオン性基がリン酸基である、〔1〕~〔3〕のいずれかに記載の精製剤。
〔5〕前記ベタイン構造が、ホスホリルコリン基である、〔1〕~〔4〕のいずれかに記載の精製剤。
〔6〕前記化合物が、ベタイン構造を有する側鎖が主鎖に結合したポリマーである、〔1〕~〔5〕のいずれか一項に記載の精製剤。
〔7〕前記ポリマーが、(メタ)アクリル化合物を含む単量体の重合体である、〔6〕に記載の精製剤。
〔8〕〔1〕~〔5〕のいずれかに記載の精製剤が、不溶性支持体に固定された、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製用担体。
〔9〕〔6〕又は〔7〕に記載の精製剤が、不溶性支持体に固定された、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製用担体。
〔10〕前記不溶性支持体に固定された前記ポリマーの重量が、前記不溶性支持体の単位表面積(m2)当たり0.5mg~1.5mgである、〔9〕に記載の精製用担体。
〔11〕前記不溶性支持体が、無機物質により構成されている、〔8〕~〔10〕のいずれかに記載の精製用担体。
〔12〕比重が、1.05~3.00である、〔8〕~〔11〕のいずれかに記載の精製用担体。
〔13〕形状が球状であり、平均粒径が0.5μm~100μmである、〔8〕~〔12〕のいずれかに記載の精製用担体。
〔14〕〔1〕~〔7〕のいずれかに記載の精製剤又は〔8〕~〔13〕のいずれかに記載の精製用担体と、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドと有機溶剤を含む試料とを接触させ、前記精製剤又は精製用担体に前記糖鎖又は前記糖ペプチドを吸着させることと、上記精製剤又は精製用担体を水に接触させ、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドを溶出させることと、を含む、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製方法。
〔15〕〔1〕~〔7〕のいずれかに記載の精製剤又は〔8〕~〔13〕のいずれかに記載の精製用担体、及び、キット使用のためのプロトコル情報を含む、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチド精製のためのキット。
〔16〕〔1〕~〔7〕のいずれかに記載の精製剤又は〔8〕~〔13〕のいずれかに記載の精製用担体を収容した容器を保持する容器保持部と、前記容器に試薬類を導入する試薬導入部と、を備える、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチド精製のための装置。
〔P1〕ベタイン構造を有する側鎖が主鎖に結合しているポリマーが、不溶性支持体に固定されている担体。
上記構成によれば、ベタイン構造を有する側鎖が主鎖に結合しているポリマーを、不溶性支持体に固定することにより、親水度が効果的に高められた担体を提供することができる。当該担体は、親水性相互作用により親水度の高い糖ペプチドや糖鎖を強く保持できる特性を有する。しかも、当該担体は、O-グリコシド結合型糖鎖を持つ糖ペプチドや長いペプチド領域を持つ糖ペプチドをも、ペプチドの影響を受けることなく捕捉することができる。したがって、当該担体は、かかる特性を利用することにより糖ペプチドや糖鎖を簡便な操作で、効率的、高純度かつ高濃度に濃縮することができ、優れた操作性及び機能性を有する担体を提供することができる。
〔P2〕前記ベタイン構造のカチオン部位が、4級アンモニウム基を含む上記〔P1〕の担体。
〔P3〕前記ベタイン構造のアニオン部位が、リン酸基を含む上記〔P1〕又は〔P2〕の担体。
〔P4〕前記ベタイン構造が、ホスホリルコリンである前記〔P1〕~〔P3〕のいずれかの担体。
〔P5〕前記ポリマーが、(メタ)アクリル化合物を含む単量体由来の重合体により構成されている上記〔P1〕~〔P4〕のいずれかの担体。
〔P3〕前記ベタイン構造のアニオン部位が、リン酸基を含む上記〔P1〕又は〔P2〕の担体。
〔P4〕前記ベタイン構造が、ホスホリルコリンである前記〔P1〕~〔P3〕のいずれかの担体。
〔P5〕前記ポリマーが、(メタ)アクリル化合物を含む単量体由来の重合体により構成されている上記〔P1〕~〔P4〕のいずれかの担体。
上記構成によれば、非常に高い親水性及び生体適合性を有し、かつ、入手及び合成が容易なポリマーを用いた担体を提供することができ、糖ペプチドや糖鎖を、より効率的、高純度かつ高濃度に濃縮することができる担体を提供することができる。
〔P6〕前記不溶性支持体に結合している前記ポリマーの重量が、前記不溶性支持体の単位表面積(m2)当たり0.5mg~1.5mgである上記〔P1〕~〔P5〕のいずれかの担体。
〔P7〕前記不溶性支持体が、無機物質により構成されている上記〔P1〕~〔P6〕のいずれか一項に記載の担体。
〔P8〕比重が、1.05~3.00である上記〔P1〕~〔P7〕のいずれか一項に記載の担体。
〔P9〕形状が球状であり、平均粒径が0.5μm~100μmである上記〔P1〕~〔P8〕のいずれかの担体。
〔P7〕前記不溶性支持体が、無機物質により構成されている上記〔P1〕~〔P6〕のいずれか一項に記載の担体。
〔P8〕比重が、1.05~3.00である上記〔P1〕~〔P7〕のいずれか一項に記載の担体。
〔P9〕形状が球状であり、平均粒径が0.5μm~100μmである上記〔P1〕~〔P8〕のいずれかの担体。
上記構成によれば、沈降性及び分散性等が良好でより操作性に優れた担体を提供できる。また、糖ペプチドや糖鎖の濃縮のために適用する場合等に、糖ペプチドや糖鎖の捕捉効率及び遊離のペプチド断片等との分離効率の点でより優れた担体を提供することができる。
〔P10〕糖ペプチドの濃縮のための上記〔P1〕~〔P9〕のいずれかに記載の担体。
上記構成によれば、糖ペプチドの濃縮のための担体を提供でき、当該担体は、親水性相互作用により親水度の高い糖ペプチドを強く保持できる特性を有することから、糖ペプチドを簡便な操作で、効率的、高純度かつ高濃度に濃縮することができる。
〔P11〕糖鎖の濃縮のための上記〔P1〕~〔P9〕のいずれかに記載の担体。
上記構成によれば、糖鎖の濃縮のための担体を提供でき、当該担体は、親水性相互作用により親水度の高い糖鎖を強く保持できる特性を有することから、糖鎖を簡便な操作で、効率的、高純度かつ高濃度に濃縮することができる。
〔P12〕糖ペプチドの濃縮方法であって、上記〔P1〕~〔P10〕のいずれかに記載の担体を使用して糖ペプチドを濃縮する工程を含む、糖ペプチドの濃縮方法。
〔P13〕前記糖ペプチドを濃縮する工程が、バッチ法、又は、スピンカラム法による濃縮工程である上記〔P12〕に記載の糖ペプチドの濃縮方法。
〔P13〕前記糖ペプチドを濃縮する工程が、バッチ法、又は、スピンカラム法による濃縮工程である上記〔P12〕に記載の糖ペプチドの濃縮方法。
上記構成によれば、本発明の担体を用いる糖ペプチドの濃縮方法を提供でき、糖ペプチドを簡便な操作で、効率的、高純度かつ高濃度に濃縮することができる。また、バッチ法やスピンカラム法等に好適に適用でき、より簡便な操作で、糖ペプチドを効率的、高純度かつ高濃度に濃縮することができる。
〔P14〕糖鎖の濃縮方法であって、上記〔P1〕~〔P9〕、〔P11〕のいずれかに記載の担体を使用して糖鎖を濃縮する工程を含む、糖鎖の濃縮方法。
〔P15〕前記糖鎖を濃縮する工程が、バッチ法、又は、スピンカラム法による濃縮工程である上記〔P14〕に記載の糖鎖の濃縮方法。
〔P15〕前記糖鎖を濃縮する工程が、バッチ法、又は、スピンカラム法による濃縮工程である上記〔P14〕に記載の糖鎖の濃縮方法。
上記構成によれば、本発明の担体を用いる糖鎖の濃縮方法を提供でき、糖鎖を簡便な操作で、効率的、高純度かつ高濃度に濃縮することができる。また、バッチ法やスピンカラム法等に好適に適用でき、より簡便な操作で、糖鎖を効率的、高純度かつ高濃度に濃縮することができる。
〔P16〕上記〔P1〕~〔P10〕のいずれかの担体、及び、キット使用のためのプロトコル情報を含む糖ペプチド濃縮のためのキット。
上記構成によれば、糖ペプチドの濃縮に必要な担体及び情報をキット化することにより、糖ペプチドの濃縮をより簡便に行うことができる。
〔P17〕上記〔P1〕~〔P9〕、〔P11〕のいずれかの担体、及び、キット使用のためのプロトコル情報を含む糖鎖濃縮のためのキット。
上記構成によれば、糖鎖の濃縮に必要な担体及び情報をキット化することにより、糖鎖の濃縮をより簡便に行うことができる。
〔P18〕上記〔P1〕~〔P10〕のいずれかの担体が導入されておりかつ糖ペプチドを含む試料を収容可能な容器を保持する容器保持部と、前記容器に試薬類を導入する試薬導入部と、を備える糖ペプチド濃縮のための装置。
〔P19〕前記容器の収容物を固液分離する固液分離部を更に備える上記〔P18〕の糖ペプチド濃縮のための装置。
〔P19〕前記容器の収容物を固液分離する固液分離部を更に備える上記〔P18〕の糖ペプチド濃縮のための装置。
上記構成によれば、糖ペプチドの濃縮に必要な担体及び部材類を装置化することにより、糖ペプチドの濃縮をより簡便に行うことができる。
〔P20〕上記〔P1〕~〔P9〕、〔P11〕のいずれかの担体が導入されておりかつ糖鎖を含む試料を収容可能な容器を保持する容器保持部と、前記容器に試薬類を導入する試薬導入部と、を備える糖鎖濃縮のための装置。
〔P21〕前記容器の収容物を固液分離する固液分離部を更に備える上記〔P20〕の糖鎖濃縮のための装置。
〔P21〕前記容器の収容物を固液分離する固液分離部を更に備える上記〔P20〕の糖鎖濃縮のための装置。
上記構成によれば、糖鎖の濃縮に必要な担体及び部材類を装置化することにより、糖鎖の濃縮をより簡便に行うことができる。
本発明によれば、親水性の糖ペプチド及び糖鎖を特異的かつ効率的に捕捉可能な技術を提供することができる。
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。ただし、本発明は、後述する実施形態に限定されるものではない。
〔精製剤〕
1実施形態において、本発明は、ベタイン構造を有する化合物からなる、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製剤を提供する。実施例において後述するように、本実施形態の精製剤により、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドを効率よく精製することができる。
1実施形態において、本発明は、ベタイン構造を有する化合物からなる、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製剤を提供する。実施例において後述するように、本実施形態の精製剤により、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドを効率よく精製することができる。
本実施形態の精製剤は、ベタイン構造を有する化合物を有効成分として含有する、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製剤といいかえることもできる。つまり、本実施形態の精製剤は、ベタイン構造を有する化合物を含んでいる限り、ベタイン構造を有しない化合物との混合物の状態であっても、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドを精製することができる。
本実施形態の精製剤は、不溶性支持体に固定されて、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製用担体を形成していてもよい。本明細書において、「精製用担体」を単に「担体」という場合がある。
上述のベタイン構造は下記式(1)で表される構造であってもよい。
上述のベタイン構造を有する化合物は、ベタインであってもよいし、ベタイン構造を有する側鎖が主鎖に結合したポリマーであってもよい。
実施例において後述するように、本実施形態の精製剤は、従来の精製剤と比較して、短い糖鎖を精製する性能が格段に高い。「精製」は「濃縮」といいかえることもできる。
本明細書において、主鎖とはポリマー構造中で最も長い炭素鎖を指し、主鎖から分岐する構造を側鎖という。また、本明細書では、糖鎖は単糖を含むものとする。したがって、単糖以上の長さの糖鎖とは、単糖、二糖、三糖、四糖以上の長さの糖鎖を含む。単糖以上の長さの糖鎖の分子量は、例えば、150~3000程度であってもよい。
実施形態に係る担体は、ポリマーが不溶性支持体に固定化されており、当該ポリマーは、ベタイン構造を有する側鎖が主鎖に結合しているものである。実施形態に係る担体は、ベタイン構造を有することにより親水度が非常に高められ、親水性相互作用により親水度の高い糖ペプチドや糖鎖を強く保持することができる。
実施形態に係る担体は、ポリマーが不溶性支持体に固定化されており、好ましくは、ポリマーは不溶性支持体表面の全部又は一部を被覆し、ポリマー層を形成している。ここで、被覆とは、不溶性支持体の表面にポリマーが付着していることを意味する。図1に、実施形態に係る担体の一例を模式的に表す。図1の担体は、不溶性支持体表面に、ベタイン構造を有するポリマー層が形成されている。
ポリマー層は、ベタイン構造を有する側鎖が主鎖に結合したポリマーに加えて、ベタイン構造を有しないポリマーを含んでいてもよい。実施形態に係る担体の表面に、ベタイン構造が存在する限り、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドを精製することができる。
不溶性支持体は、水及び糖鎖又は糖ペプチドの精製過程で使用する有機溶媒に不溶な基材であり、実施形態に係るポリマーを固定化できるものである限り特に制限はなく、公知の基材を用いることができる。不溶性支持体の材質は、無機物質及び有機物質のいずれであってもよく、それらを併用した複合物質であってもよい。無機物質としては、シリカ等のケイ素化合物、ケイ酸塩ガラス等のガラス、酸化鉄(フェライト、マグネタイト等)、アルミナ、チタニア、ジルコニア等の酸化物、鉄、銅、金、銀、白金、コバルト、アルミニウム、パラジウム、イリジウム、ロジウム等の金属及びその合金、グラファイト等の炭素材料等が挙げられる。これらは1種を単独で用いてもよいし、2種以上を組み合わせて用いてもよい。有機物質としては、架橋ポリビニルアルコール、架橋ポリアクリレート、架橋ポリアクリルアミド、架橋ポリスチレン等の合成高分子、架橋セファロース、結晶性セルロース、架橋セルロース、架橋アミロース、架橋アガロース、架橋デキストラン等の多糖類等が挙げられる。これらは1種を単独で用いてもよいし、2種以上を組み合わせて用いてもよい。また、ベタイン構造を有する側鎖が主鎖に結合したポリマー自体が不溶性支持体を形成していてもよい。
不溶性支持体としては、無機物質を用いることが好ましく、特に好ましくは、ケイ素化合物、中でもシリカが好ましい。一般的に、不溶性支持体となりうる有機物質は比重が1前後であり、糖ペプチド溶液や糖鎖溶液との比重差が小さいことから固液分離が煩雑になることが多い。無機物質を用いることにより、例えば、実施形態に係る担体を糖ペプチドや糖鎖の濃縮のために適用する場合等に、容易かつ簡便に固液分離でき、担体に捕捉された糖ペプチドや糖鎖と遊離のペプチド断片等の夾雑物とを効果的に分離することができる。これにより、濃縮効率の向上に寄与することができる。また、無機物質は、担体に適度な強度を付与することができる。
不溶性支持体は、多孔質体や中空体等の空隙を有するであってもよい。例えば、多孔質体としては、モノリスタイプのシリカ等が挙げられる。モノリスタイプのシリカは、マイクロメートルサイズの三次元網目状の細孔(マクロ孔)と、三次元網目状構造を形成するシリカ骨格にナノメートルサイズの細孔(メソ孔)とを有する、シリカの多孔質構造体である。マイクロ孔の孔径は、例えば1μm以上100μm以下、好ましくは1μm以上50μm以下、メソ孔の孔径は、例えば1nm以上100nm以下、好ましくは1nm以上70nm以下等の範囲に独立して制御することができる。このような空隙を有する不溶性支持体を用いることにより、実施形態に係る担体は、比表面積が大きくなり、不溶性支持体表面に固定化できる精製剤の量を増加することができる。これにより、実施形態の担体を糖ペプチドや糖鎖の濃縮に用いる場合に、糖ペプチドや糖鎖との接触効率が向上し糖ペプチドや糖鎖を効率的に捕捉することができ、濃縮効率の向上に寄与することができる。また、後述する不溶性支持体の比重の調整のために用いることもできる。
精製剤がポリマーである場合、当該ポリマーは、重合性単量体の重合体であってもよい。重合性単量体は、重合反応により重合体を形成可能な単量体である限り特に制限はなく、好ましくは、(メタ)アクリロイル基を有する(メタ)アクリル化合物であり、例えば、(メタ)アクリル酸エステル及びその誘導体等が含まれる。更に、ビニル基、アリル基、α-アルコキシメチルアクリロイル基、マレイン酸残基、フマル酸残基、イタコン酸残基、クロトン酸残基、イソクロトン酸残基、及びシトラコン酸残基などを有する化合物及びその誘導体等を挙げることができるが、これらに限定するものでない。重合性単量体は、1種を単独で用いてもよく、また2種以上を併用してもよい。なお、「(メタ)アクリロイル基」とは「アクリロイル基」又は「メタクリロイル基」を表し、「(メタ)アクリル」とは「アクリル」又は「メタクリル」を表すものとする。
実施形態に係る不溶性支持体に固定化されるポリマーの側鎖は、上記した重合性単量体の重合体から構成される主鎖から分岐した分子鎖であり、一部または全てにベタイン構造を有する。ベタイン構造とは、カチオン部位とアニオン部位を、同一分子内の分離した隣り合わない位置に持つ構造を意味する。
カチオン部位とは、正電荷を帯びた原子団であり、所謂カチオン性基を意味する。カチオン性基として、例えは、1級アミノ基、2級アミノ基(-NHR)、3級アミノ基(-NR2)、4級アンモニウム基(-NR3
+)、及び、イミノ基等が挙げられるが、これらに限定するものではない。2級アミノ基、3級アミノ基、4級アンモニウム基におけるRは、アルキル基又はアリール基であり、1の基に複数のRを有する場合にはそれぞれ異なっていても同一であってよく、例えば、メチル基、エチル基、プロプル基等が挙げられるが、これらに限定するものではない。好ましくは、4級アンモニウム基であり、特に好ましくはトリメチルアンモニウム基である。また、フッ化物イオン、塩化物イオン、臭化物イオン、ヨウ化物イオン、塩酸イオン、酢酸イオン、硫酸イオン、フッ化水素酸イオン、及び、炭酸イオン等と塩を形成した塩形態のものもカチオン性基に含まれる。
アニオン部位とは、負電荷を帯びた原子団であり、所謂アニオン性基を意味する。アニオン性基としては、例えば、リン酸基、ホスホン酸基、ホスフィン酸基、スルホン酸基、スルフィン基、スルフェン基、カルボキシル基、水酸基、チオール基、及び、ボロン酸基等が挙げられるが、これらに限定するものではない。好ましくは、リン酸基である。また、ナトリウムイオンやカリウムイオン等のアルカリ金属イオン及びカルシウムイオン等のアルカリ土類金属イオン等と塩を形成した塩形態ものもアニオン性基に含まれる。
ベタイン構造は、上記したカチオン部位とアニオン部位を有する構造である限り特に制限はなく、カチオン部位とアニオン部位の組み合わせは特に制限はない。好ましくは、カチオン部位が4級アンモニウム基であり、アニオン部位がリン酸基である。
実施形態に係る不溶性支持体に固定化されるポリマーは、重合性単量体の重合体から構成される主鎖に対して、ベタイン構造を有する側鎖が結合している限り特に制限はない。したがって、ポリマーは、ベタイン構造を有する重合性単量体のホモ重合体の他、カチオン部位を有する重合性単量体とアニオン部位を有する重合性単量体の共重合体であってもよい。また、荷電を有しない重合性単量体を含めた共重合体であってよく、このような重合性単量体を含めることによりポリマーの水への溶解性等を制御することができる。共重合体は、2種類以上の単量体から得られる重合体を意味し、交互共重合体、ブロック共重合体、ランダム共重合体、及び、グラフト共重合体等のいずれであってもよい。したがって、ベタイン構造は、ポリマーの単量体単位毎に導入されていてもよいし、単量体単位の一定単位毎に導入されていてもよく、ランダムに導入されていてもよい。
好ましくは、ポリマー側鎖はベタイン構造を有する重合性単量体のホモ重合体である。この場合、ベタイン構造を有する重合性単量体は、アニオン部位とカチオン部位が同一分子鎖に存在することになる。両者を連結するリンカーは、2価以上の基を有するものであれば特に制限はなく、公知のリンカーを用いることができる。好ましくはアルキレンリンカーであり、アルキレンリンカーとしては、例えば炭素原子数1~10、好ましくは2~5の炭素原子数を有するアルキレンリンカーが挙げられる。
このようなベタイン構造を有する重合性単量体としては、例えば、ホスホリルコリン基等のホスホベタイン基を有するホスホベタイン系単量体、カルボキシベタイン基を有するカルボキシベタイン系単量体、スルホベタイン基を有するスルホベタイン系単量体等が挙げられるが、これらに限定するものではない。好ましくは、ホスホベタイン系単量体であり、中でもホスホリルコリン基を有するホスホベタイン系単量体である。
ホスホベタイン系単量体としては、ホスホリルコリン基を有する重合性単量体が好ましくは、例えば、2-(メタ)アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、2-(メタ)アクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン、6-(メタ)アクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン、10-(メタ)アクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン、2-(メタ)アクリロイルオキシプロピルホスホリルコリン、2-(メタ)アクリロイルオキシブチルホスホリルコリン等が挙げられる。なかでも、入手容易性から2-(メタ)アクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが特に好ましい。更に、ホスホベタイン系単量体として、例えば、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(2-ホスホナトエチル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(2-ホスホナトエチル)アミニウム、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(3-ホスホナトプロピル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(3-ホスホナトプロピル)アミニウム、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(4-ホスホナトブチル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(4-ホスホナトブチル)アミニウム、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(ホスホナトメチル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(ホスホナトメチル)アミニウム等も挙げられる。
カルボキシベタイン系単量体としては、例えば、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(2-カルボキシラトエチル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(2-カルボキシラトエチル)アミニウム、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(3-カルボキシラトプロピル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(3-カルボキシラトプロピル)アミニウム、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(4-カルボキシラトブチル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(4-カルボキシラトブチル)アミニウム、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(カルボキシラトメチル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(カルボキシラトメチル)アミニウム等が挙げられる。
スルホベタイン系単量体としては、例えば、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(2-スルホナトエチル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(2-スルホナトエチル)アミニウム、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(3-スルホナトプロピル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(3-スルホナトプロピル)アミニウム、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(4-スルホナトブチル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(4-スルホナトブチル)アミニウム、ジメチル(2-メタクリロイルオキシエチル)(スルホナトメチル)アミニウム、ジメチル(2-アクリロイルオキシエチル)(スルホナトメチル)アミニウム等が挙げられる。
前記不溶性支持体に結合しているポリマーの重量が、前記不溶性支持体の単位表面積(m2)当たり0.5mg以上1.5mg以下程度であることが好ましく、特には0.6mg以上1.3mg以下、更には0.7mg以上1.2mg以下であることが好ましい。単位表面積当たりのポリマー重量が上記範囲であると、ポリマー合成時のハンドリングが良好であり、また、糖ペプチドや糖鎖との良好な接触効率を確保でき、糖ペプチドや糖鎖を効率よく捕捉することができる。
実施形態に係る担体は、比重が1.05~3.00程度のものが好ましく、特には1.1~2.7、更には1.5~2.5であることが好ましい。比重が下限値未満では沈降性が低下し、また、上限値を超えると分散性が悪化することから、いずれの場合にも操作性が悪化する。したがって、実施形態に係る担体の比重が上記範囲内であると、糖ペプチドや糖鎖の濃縮のために適用する場合等に、沈降性が良好であることから重力による自然沈降や遠心分離等により容易かつ簡便に固液分離でき、担体に捕捉された糖ペプチドや糖鎖を遊離のペプチド断片等の夾雑物と効果的に分離することができる。また、分散性が良好であることから糖ペプチドや糖鎖との接触効率が向上し、糖ペプチドや糖鎖を効率よく捕捉することができる。したがって、操作性の点で優れた担体を提供できると共に、糖ペプチドや糖鎖の濃縮のために適用する場合等に、遊離のペプチド断片等との分離及び糖ペプチドや糖鎖の捕捉効率の点でも優れた担体を提供することができる。
実施形態の担体の形状は、特に制限されず、公知のいずれの形状であってもよい。例えば、ビーズ等の球状、基板やマルチウェルプレート等の板状、シートやフィルム、メンブレン等の膜状、繊維状等を挙げることができる。担体は固相と言いかえることもできる。好ましくは、取り扱いが容易な、球状又はそれに類する形状である。球状である場合には、平均粒径は、0.5μm以上100μm以下程度のものが好ましく、特には、1μm以上50μm以下、若しくは1μm以上10μm以下が好ましい。特に好ましくは3μm以上10μm以下である。平均粒径が下限値未満では、担体を遠心分離やろ過で回収することが困難となると共に、担体をカラム等に充填して用いる際、通液性が悪くなり通液に際して大きな圧力を加える必要が生じる。一方、平均粒径が上限値を超えると、担体と試料溶液の接触面積が少なくなり、糖ペプチドや糖鎖の捕捉効率が低下し濃縮効率が低下する。したがって、実施形態に係る担体の平均粒径が上記範囲内であると、操作性の点で優れた担体を提供できると共に、糖ペプチドや糖鎖の濃縮のために適用する場合等に、遊離のペプチド断片等との分離及び糖ペプチドや糖鎖の捕捉効率の点でも優れた担体を提供することができる。平均粒径は、例えば、粒度分布計等で測定することができる。
実施形態に係る担体は、スピンカラム等のフィルターカップ、マルチウェルプレートの各ウェル、フィルタープレートの各ウェル、マイクロチューブ等の容器の中に充填された状態で用いてもよい。
ポリマーは、上記重合性単量体を重合することにより得ることができるが、ポリマーの重合方法に特に制限はなく、重合性単量体の種類等に応じて適宜選択することができる。好ましくは、ラジカル重合である。
不溶性支持体へのポリマーの固定化は、物理吸着、又は、化学結合のいずれを用いて行ってもよい。好ましくは、安定性の観点から化学結合であり、ポリマーの不溶性支持体からの溶出を抑制することができる。また、不溶性支持体表面で重合性単量体を重合することによりポリマーを不溶性支持体表面に固定化してもよいし、予め重合させたポリマーを不溶性支持体表面に固定化してもよい。
不溶性支持体表面で重合性単量体を重合することによりポリマーを不溶性支持体表面に固定化する場合、例えば、不溶性支持体の表面に、重合開始点を導入し、重合開始点を導入した不溶性支持体を重合性単量体溶液に浸漬して、重合開始剤を添加することにより重合開始点からポリマーを成長させることができる。これにより、ポリマーを不溶性支持体表面に化学結合により固定化することができる。重合開始点としては、重合性官能基や連鎖移動基、リビングラジカル重合におけるドーマント種等を用いることができる。
重合性官能基としては、ビニル基、アリル基(2-プロペニル基)、(メタ)アクリロイル基、エポキシ基、スチレン基等が挙げられる。連鎖移動基としては、メルカプト基、アミノ基等が挙げられるが、反応性に優れている点でメルカプト基が好ましい。
不溶性支持体表面に重合性官能基、又は、連鎖移動基を導入する方法としては、特に限定されないが、重合性官能基、又は、連鎖移動基を有するシランカップリング剤を用いることが好ましい。
重合性官能基を有するシランカップリング剤としては、例えば、(3-メタクリロキシプロピル)ジメチルメトキシシラン、(3-メタクリロキシプロピル)ジエチルメトキシシラン、(3-メタクリロキシプロピル)ジメチルエトキシシラン、(3-メタクリロキシプロピル)ジエチルエトキシシラン、(3-メタクリロキシプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-メタクリロキシプロピル)エチルジメトキシシラン、(3-メタクリロキシプロピル)メチルジエトキシシラン、(3-メタクリロキシプロピル)エチルジエトキシシラン、(3-メタクリロキシプロピル)トリメトキシシラン、(3-メタクリロキシプロピル)トリエトキシシラン等が挙げられるが、反応性、及び入手性の点から(3-メタクリロキシプロピル)トリメトキシシランや(3-メタクリロキシプロピル)トリエトキシシランが好ましい。これらのシランカップリング剤は、単独、又は、2種以上の組み合わせで用いることができる。
連鎖移動基を有するシランカップリング剤としては、例えば(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)ジメチルメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)トリエトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)メチルジエトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)ジメチルエトキシシラン、(メルカプトメチル)トリメトキシシラン、(メルカプトメチル)メチルジメトキシシラン、(メルカプトメチル)ジメチルメトキシシラン、(メルカプトメチル)トリエトキシシラン、(メルカプトメチル)メチルジエトキシシラン、(メルカプトメチル)ジメチルエトキシシランなどが挙げられるが、入手性から(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシランや(3-メルカプトプロピル)トリエトキシシランが好ましい。これらのシランカップリング剤は、単独、又は、2種以上の組み合わせで用いることができる。
重合性官能基、又は、連鎖移動基を有するシランカップリング剤を用いての、重合性官能基、又は、連鎖移動基の不溶性支持体への導入は、例えば、シランカップリング剤と不溶性支持体表面の官能基との間で共有結合を形成させることにより行うことができる。例えば、シランカップリング剤として、トリメトキシシラン類やトリエトキシシラン類等のアルコキシシラン類を用いる場合、加水分解により生成されたシラノール基が、不溶性支持体表面の水酸基、アミノ基、カルボニル基、シラノール基等と脱水縮合して共有結合を形成することにより行うことができる。
不溶性支持体表面に重合性官能基、又は、連鎖移動基を導入した後に、不溶性支持体と重合性単量体を混合して重合反応を進行させることで、不溶性支持体表面にポリマー層が形成される。重合反応は、限定するものではないが、例えば重合性単量体、及び重合開始剤を溶解した溶媒中に不溶性支持体を投入し、撹拌下、0℃以上80℃以下の温度にて1時間以上30時間以下で加熱することにより行われる。その後、不溶性支持体は減圧下ろ過され、洗浄後乾燥される。
不溶性支持体と重合性単量体、及び重合開始剤の使用割合は特に制限されるものではないが、通常、不溶性支持体1gに対し、重合性単量体0.1mmol以上10mmol
以下、重合開始剤0.01mmol以上10mmol以下の割合で用いられる。
以下、重合開始剤0.01mmol以上10mmol以下の割合で用いられる。
溶媒としてはそれぞれの重合性単量体が溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、n-ブタノール、t-ブチルアルコール、n-ペンタノール等のアルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、シクロヘキサノン、N,N-ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独、又は、2種以上の組み合わせで用いられる。
重合開始剤としては特に限定されないが、例えば、2,2’-アゾビスイソブチルニトリル(以下「AIBN」と略する場合がある)、1,1’-アゾビス(シクロヘキサン-1-カルボニトリル)等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル、過酸化tert-ブチル等の有機過酸化物、過酸化水素-第1鉄イオン等のレドックス開始剤等を挙げることができる。
一方、予め重合させたポリマーを不溶性支持体表面に固定化する場合、不溶性支持体に予め重合したポリマーを物理吸着させる方法、又は、化学結合させる方法が挙げられる。好ましくは、ポリマーには、不溶性支持体に吸着しやすい成分や、不溶性支持体表面に存在する反応性官能基と反応し得る官能基を有する成分を、ポリマーの重合の際に共重合体として組み込む。例えば、不溶性支持体表面に存在する反応性官能基と反応し得る官能基としては、例えば、シランカップリング剤を加水分解して得られるシラノール基等が高い反応性を有することから好ましく、固体支持体表面の水酸基、アミノ基、カルボニル基、シラノール基等と脱水縮合して共有結合を形成することができる。重合性単量体の重合反応は上記に準じて行うことができる。
不溶性支持体表面に、上記ポリマーを塗布することにより、ポリマーが不溶性支持体表面に吸着、又は、化学的に結合させることができる。塗布方法は、ポリマーの溶液を調製し、浸漬、噴霧等の公知の方法が挙げられる。塗布後、室温ないし加温下で乾燥させることが好ましい。化学的結合による場合には、それぞれに応じた反応条件で実施するとよい。これにより、不溶性支持体表面にポリマー層が形成される。
図2に、実施形態に係る担体のポリマー層の合成方法の一例を模式的に示す。図2の担体は、不溶性支持体としてのシリカビーズなどの表面に水酸基を有する無機粒子の表面にメルカプト基等の連鎖移動基を導入し、ベタイン構造を含むポリマー層を合成したものである。まず、連鎖移動基を有するシランカップリング剤を用いて無機粒子の表面に連鎖移動基を導入する。このとき、シランカップリング剤のアルコキシ基等の加水分解性基の加水分解により生成されたシラノール基が、無機粒子表面の水酸基と脱水縮合して共有結合を形成することにより連鎖移動基が導入される。続いて、連鎖移動基を導入した無機粒子と少なくとも一部のモノマーがベタイン構造を有する(メタ)アクリルモノマーを適当な溶媒下で重合開始剤を添加してラジカル重合させる。無機粒子に導入した連鎖移動基が重合開始点となり、無機粒子表面がベタイン構造を有するポリマー層に被覆されてポリマー層が形成される。
(精製剤の用途)
1.糖ペプチドの濃縮
本実施形態に係る精製剤は、糖ペプチドの濃縮のために好適に用いることができ、糖ペプチドを特異的に捕捉するため、糖鎖を有しない遊離のペプチド断片等の夾雑物を除去して糖ペプチドを濃縮することができる。ここで、濃縮とは、濃縮前に比べて糖ペプチドの濃度や存在比を高めることを意味し、例えば、糖タンパク質の分解物等の糖ペプチドと遊離のペプチド断片等の夾雑物が混在する試料から、糖ペプチドを選択的に回収すること等が含まれる。
1.糖ペプチドの濃縮
本実施形態に係る精製剤は、糖ペプチドの濃縮のために好適に用いることができ、糖ペプチドを特異的に捕捉するため、糖鎖を有しない遊離のペプチド断片等の夾雑物を除去して糖ペプチドを濃縮することができる。ここで、濃縮とは、濃縮前に比べて糖ペプチドの濃度や存在比を高めることを意味し、例えば、糖タンパク質の分解物等の糖ペプチドと遊離のペプチド断片等の夾雑物が混在する試料から、糖ペプチドを選択的に回収すること等が含まれる。
糖ペプチドは、1以上の単糖又はその誘導体、若しくは、2以上の単糖及び/又はその誘導体がグリコシド結合によって直鎖状又は分枝鎖状につながった糖鎖にペプチドを構成するアミノ酸の一部が結合したものであり、本実施形態に係る精製剤はあらゆる糖ペプチドを濃縮対象とする。糖ペプチドの糖鎖は、主にアスパラギン残基に糖鎖が結合するN-グリコシド結合糖鎖(N型糖鎖)、及び、セリン及びスレオニン等と結合するO-グリコシド結合糖鎖(O型糖鎖)の2種類に大別される。本実施形態に係る精製剤は、いずれの糖ペプチドをも濃縮対象とし、糖ペプチドの種類、鎖長、構造等は特に制限されない。したがって、分子量が小さなO結合型糖鎖を持つ糖ペプチドや長いペプチド領域を持つ糖ペプチドに対しても、多量に存在する遊離のペプチド断片や糖ペプチドのペプチド領域等のペプチド等の夾雑物の影響を最小限に抑え、糖ペプチドを特異的かつ効率的に濃縮することができる。
2.糖鎖の濃縮
本実施形態に係る精製剤は、糖鎖の濃縮のために好適に用いることができ、糖鎖を特異的に捕捉するため、糖鎖以外の夾雑物(タンパク、ペプチド、脂質、塩等)を除去して糖鎖を濃縮することができる。ここで、濃縮とは、濃縮前に比べて糖鎖の濃度や存在比を高めることを意味し、例えば、糖タンパク質から遊離した糖鎖とペプチド断片等の夾雑物が混在する試料から、糖鎖を選択的に回収すること等が含まれる。
本実施形態に係る精製剤は、糖鎖の濃縮のために好適に用いることができ、糖鎖を特異的に捕捉するため、糖鎖以外の夾雑物(タンパク、ペプチド、脂質、塩等)を除去して糖鎖を濃縮することができる。ここで、濃縮とは、濃縮前に比べて糖鎖の濃度や存在比を高めることを意味し、例えば、糖タンパク質から遊離した糖鎖とペプチド断片等の夾雑物が混在する試料から、糖鎖を選択的に回収すること等が含まれる。
糖鎖は、1以上の単糖又はその誘導体、若しくは、2以上の単糖及び/又はその誘導体がグリコシド結合によって直鎖状又は分枝鎖状につながった化合物であり、実施形態に係る担体はあらゆる糖鎖を濃縮対象とする。糖鎖を構成する単糖又はその誘導体としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、N-アセチルグルコサミン、N-アセチルガラクトサミン、フコース、シアル酸、及び、アラビノース等、及び、これらの誘導体が挙げられる。糖鎖としては、単糖及びその誘導体、多糖類、糖タンパク質、並びに、糖ペプチド、プロテオグリカン、及び、糖脂質等の複合糖質から遊離又は誘導された糖鎖等が挙げられるが、これらに限定されない。特に、実施形態に係る担体は、単糖や二糖等の小さな糖をも効率的に濃縮することができる。ここで、糖タンパク質を構成する糖鎖は、主にアスパラギン残基に糖鎖が結合するN-グリコシド結合糖鎖(N型糖鎖)、及び、セリン及びスレオニン等と結合するO-グリコシド結合糖鎖(O型糖鎖)の2種類に大別される。実施形態に係る担体は、いずれの糖鎖をも濃縮対象とし、糖鎖の種類、鎖長、構造等は特に制限されない。したがって、分子量が小さなO結合型糖鎖等を、多量に存在する糖鎖以外の夾雑物(タンパク、ペプチド、脂質、塩等)の影響を最小限に抑え、糖鎖を特異的かつ効率的に濃縮することができる。
〔糖ペプチドの濃縮方法〕
1実施形態において、本発明は、上述した精製剤と、単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドと有機溶剤を含む試料とを接触させ、前記精製剤に単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドを吸着させることと、上記精製剤を水に接触させ、単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドを溶出させることと、を含む、単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製方法を提供する。
1実施形態において、本発明は、上述した精製剤と、単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドと有機溶剤を含む試料とを接触させ、前記精製剤に単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドを吸着させることと、上記精製剤を水に接触させ、単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドを溶出させることと、を含む、単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製方法を提供する。
本実施形態に係る糖ペプチドの濃縮方法は、実施形態に係る精製剤を用いて糖ペプチドを濃縮する工程を含むものである。詳細には、糖ペプチドを含む試料から糖ペプチドを濃縮するものであり、実施形態に係る精製剤は、親水度が非常に向上しているため、ペプチドと比較して親水度が高い糖ペプチドに対して親和性を有する。一方、ペプチドは糖ペプチドに比べて親水度が低いため、実施形態に係る精製剤に対しての親和性は低い。よって、実施形態に係る精製剤は、糖ペプチドを特異的かつ効率的に捕捉し濃縮することができる。本実施形態に係る糖ペプチドの濃縮方法は、上記したあらゆる糖ペプチドを濃縮対象とする。
糖ペプチドを含む試料としては、糖ペプチドを含有している可能性のある試料であれば特に制限はなく、例えば、糖タンパク質を含む試料に対して糖タンパク質の断片化処理を施したものを挙げることができる。糖タンパク質を含む試料としては、生体試料及び環境試料等であり、例えば、全血、血清、血漿、尿、唾液、糞便、脳脊髄液、細胞及び細胞培養物、組織等の生体試料が挙げられる。生体試料は、未精製のものであってもよいし、糖タンパク質を公知の技術により精製したものであってもよいし、脱脂、脱塩、タンパク質分画等の処理を行ったものであってもよい。
糖タンパク質の断片化処理は、糖タンパク質のタンパク質部分を断片化することができるものであれば、特に制限はなく、プロテアーゼ等を用いることにより行うことができる。例えば、トリプシン、キモトリプシン、ペプシン、V8プロテアーゼ、プロナーゼ、プロテイナーゼK、リジルエンドプロテアーゼ、プロメライン、サーモリシン、フィシン、
カスパーゼ、サブチリシン等が挙げられるが、これらに限定するものではない。
カスパーゼ、サブチリシン等が挙げられるが、これらに限定するものではない。
プロテアーゼによる切断を容易にするため、プロテアーゼ処理の前に、試料中の糖タンパク質を変性、又は、還元してもよい。変性剤としては、例えば、界面活性剤やカオトロピック剤等を挙げることができ、還元剤としては、例えば、β-メルカプトエタノール、ジチオトレイトール、グルタチオン、トリス-2-カルボキシエチルホスフィン、トリブチルホスフィン等が挙げられるが、これらに限定するものではない。
本実施形態に係る糖ペプチドの濃縮方法は、まず、糖ペプチドを含む試料と実施形態に係る精製剤とを接触させ、当該担体に糖ペプチドを捕捉させる。実施形態に係る精製剤は、親水度が高められていることから、親水性相互作用により糖ペプチドを特異的に捕捉することができ、試料中に多量に存在するペプチド断片等は当該担体に捕捉されず遊離状態で残存する。
実施形態に係る精製剤による糖ペプチドの保持力は、有機溶剤濃度に比例する。したがって、当該精製剤が糖ペプチドを捕捉する際の反応液の溶媒としては、有機溶剤、又は、有機溶剤と水の混合溶媒を用いることができる。溶媒は、濃縮対象となる糖ペプチドの種類等により適宜選択することができる。有機溶剤としては、糖ペプチドを溶解可能なものである限り特に制限はないが、例えば、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、アセトン、ジオキサン、ピリジン、メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、および1-ブタノール等を挙げることができる。好ましくは、1-ブタノール、エタノール等の有機溶剤が好適に用いられる。pH調整のために各種緩衝液を用いることができる。また、有機溶剤と水の混合溶媒を使用する場合、有機溶剤と水の混合比率は、例えば体積比で3:1~10:1である。
続いて、必要に応じて、糖ペプチドを捕捉した精製剤を洗浄する。精製剤は不溶性支持体に固定されていることが好ましい。洗浄により、担体に捕捉された糖ペプチド以外の物質、特には遊離のペプチド断片を除去することができる。洗浄液は、例えば上述した溶媒を用いることができる。
洗浄後、糖ペプチドを捕捉した担体から糖ペプチドを遊離させることで、糖ペプチドを特異的に濃縮することができる。
糖ペプチドの遊離のための溶出液は、有機溶剤、又は、有機溶剤と水の混合溶媒を用いることができ、濃縮対象となる糖ペプチドやポリマーの種類等により適宜選択することができる。有機溶剤としては、上記したものを用いることができる。また、本工程では、親水性を高めた溶媒を使用することで、効率よく糖ペプチドを遊離させることができる。例えば、有機溶剤を使用せず水のみを使用することもできるし、有機溶剤と水の混合溶媒を使用することもできる。混合溶媒を使用する場合は、水に対して有機溶剤は体積比で3倍以下であることが挙げられる。
本実施形態に係る糖ペプチドの濃縮方法は、担体を用いる公知の濃縮形態を選択して実施することができる。例えば、バッチ法や、スピンカラム法等を挙げることができるが、これらに限定するものではない。バッチ法及びスピンカラム法について詳述するが、試薬類及び反応条件等は上記した通りである。
(バッチ法)
バッチ法による濃縮の場合には、糖ペプチドを含む試料と実施形態に係る精製剤を適当な容器(例えば、マイクロチューブや遠心管、マイクロプレート等)中で反応液に浸漬させ、当該精製剤に糖ペプチドを捕捉させる。精製剤は不溶性支持体に固定されていることが好ましい。続いて、担体-糖ペプチド複合体を固液分離し、遊離のペプチド断片等の夾雑物を含む液相部分を除去し当該担体を回収する。固液分離は、重力による自然沈降や遠心分離等により行うことができ、吸引等により液相部分を除去することができる。また、フェライト等の磁性材料を当該担体の不溶性支持体に含ませることで磁力を用いて当該担体を集積することにより固液分離を行ってもよい。その場合には遠心分離等を行う必要はない。また、フィルターに通液させるろ過によって固液分離を行ってもよく、その際には、減圧下又は加圧下で行ってもよい。
バッチ法による濃縮の場合には、糖ペプチドを含む試料と実施形態に係る精製剤を適当な容器(例えば、マイクロチューブや遠心管、マイクロプレート等)中で反応液に浸漬させ、当該精製剤に糖ペプチドを捕捉させる。精製剤は不溶性支持体に固定されていることが好ましい。続いて、担体-糖ペプチド複合体を固液分離し、遊離のペプチド断片等の夾雑物を含む液相部分を除去し当該担体を回収する。固液分離は、重力による自然沈降や遠心分離等により行うことができ、吸引等により液相部分を除去することができる。また、フェライト等の磁性材料を当該担体の不溶性支持体に含ませることで磁力を用いて当該担体を集積することにより固液分離を行ってもよい。その場合には遠心分離等を行う必要はない。また、フィルターに通液させるろ過によって固液分離を行ってもよく、その際には、減圧下又は加圧下で行ってもよい。
続いて、糖ペプチドを捕捉した担体を洗浄する。洗浄により、担体に捕捉された糖ペプチド以外の夾雑物、特には遊離のペプチド断片を除去することができる。洗浄は、糖ペプチドを捕捉した担体を上記した適当な容器中で洗浄液に浸漬し、洗浄液の交換を繰り返すことにより行うことができる。例えば、適当な容器に糖ペプチドを捕捉した担体を入れ、洗浄液を加え、振とう又は撹拌した後、固液分離により液相部分を除去する操作を繰り返すことにより洗浄を行うことができる。固液分離は上記した通りに行うことができる。
洗浄後、糖ペプチドを捕捉した担体から糖ペプチドを遊離させる。糖ペプチドの遊離は、当該担体を溶出液に浸漬することによって行うことができる。例えば、十分に洗浄液を取り除いた後、糖ペプチドを捕捉した担体に溶出液を適当量加えて振とう又は撹拌する。続いて、固液分離により当該担体を回収し、溶出液を新しい適当な容器(例えば、コレクションチューブやコレクションプレート等)に収集する。固液分離は上記した通りに行うことができる。必要に応じて溶出液を留去することにより、糖ペプチドを濃縮することができる。
(スピンカラム法)
スピンカラム法による濃縮の場合には、フィルター等を内蔵した容器、例えば、フィルターカップ等を用いて行うことができる。フィルターカップとしては、例えば上部と下部に開口部を有し、下部の開口部がフィルターで被覆されているものを用いることができる。フィルターカップを用いる場合には、実施形態に係る精製剤を充填したフィルターカップに、糖ペプチドを含有する試料溶液を投入して通液により当該担体と試料を反応液下で接触させる。精製剤は不溶性支持体に固定されていることが好ましい。通液は、重力による自然落下、及び遠心分離等を行ってもよく、また、減圧下若しくは加圧下で通液させてもよい。通液後、担体を通過した遊離のペプチド断片等が含まれる排液を除去する。
スピンカラム法による濃縮の場合には、フィルター等を内蔵した容器、例えば、フィルターカップ等を用いて行うことができる。フィルターカップとしては、例えば上部と下部に開口部を有し、下部の開口部がフィルターで被覆されているものを用いることができる。フィルターカップを用いる場合には、実施形態に係る精製剤を充填したフィルターカップに、糖ペプチドを含有する試料溶液を投入して通液により当該担体と試料を反応液下で接触させる。精製剤は不溶性支持体に固定されていることが好ましい。通液は、重力による自然落下、及び遠心分離等を行ってもよく、また、減圧下若しくは加圧下で通液させてもよい。通液後、担体を通過した遊離のペプチド断片等が含まれる排液を除去する。
続いて、糖ペプチドを捕捉した担体を洗浄する。洗浄により、当該担体に捕捉された糖ペプチド以外の夾雑物、特には遊離のペプチド断片を除去することができる。洗浄は、フィルターカップ内の当該担体に洗浄液を通液させることによって行うことができ、糖ペプチド捕捉反応から連続的に洗浄を行うことができる。通液は上記した通り行うことができる。
洗浄後、糖ペプチドを捕捉した担体から糖ペプチドを遊離させる。糖ペプチドの遊離は、フィルターカップ内の当該担体に溶出液を通液させることによって行うことができ、糖ペプチド捕捉反応から洗浄操作を経て連続的に行うことができる。担体通液後の溶出液を適当な容器(例えば、コレクションチューブやコレクションプレート等)に収集する。通液は上記した通り行うことができる。必要に応じて溶出液を留去することにより、糖ペプチドを濃縮することができる。
本実施形態に係る糖ペプチドの濃縮方法により濃縮を行った糖ペプチドは、糖ペプチドの構造解析等の分析手段にそのまま供することができる。
〔糖鎖の濃縮方法〕
1実施形態において、本発明は、上述した精製剤と、単糖以上の長さの糖鎖と有機溶剤を含む試料とを接触させることと、前記精製剤に単糖以上の長さの糖鎖を吸着させることと、上記精製剤を水に接触させ、単糖以上の長さの糖鎖を溶出させることと、を含む、単糖以上の長さの糖鎖の精製方法を提供する。
1実施形態において、本発明は、上述した精製剤と、単糖以上の長さの糖鎖と有機溶剤を含む試料とを接触させることと、前記精製剤に単糖以上の長さの糖鎖を吸着させることと、上記精製剤を水に接触させ、単糖以上の長さの糖鎖を溶出させることと、を含む、単糖以上の長さの糖鎖の精製方法を提供する。
本実施形態に係る糖鎖の濃縮方法は、本実施形態に係る精製剤を用いて糖鎖を濃縮する工程を含むものである。詳細には、糖鎖を含む試料から糖鎖を濃縮するものであり、本実施形態に係る精製剤は、親水度が非常に向上しているため、ペプチドや脂質等と比較して親水度が高い糖鎖に対して親和性を有する。一方、ペプチドや脂質等は糖鎖に比べて親水度が低いため、本実施形態に係る精製剤に対しての親和性は低い。よって、本実施形態に係る精製剤は、糖鎖を特異的かつ効率的に捕捉し濃縮することができる。本実施形態に係る糖鎖の濃縮方法は、上記したあらゆる糖鎖を濃縮対象とする。
糖鎖を含む試料としては、糖鎖を含有している可能性のある試料であれば特に制限はなく、例えば、単糖や多糖類等の糖鎖そのものを含む試料の他、多糖類に対して加水分解処理を施したもの、糖タンパク質等の複合糖質を含む試料に対して糖鎖遊離処理等を施したものを挙げることができる。単糖、多糖類、糖タンパク質等の複合糖鎖を含む試料としては、生体試料及び環境試料等であり、例えば、全血、血清、血漿、尿、唾液、糞便、脳脊髄液、細胞及び細胞培養物、組織等の生体試料が挙げられる。生体試料は、未精製のものであってもよいし、単糖や多糖類、糖タンパク質等の複合糖類を公知の技術により精製したものであってもよいし、脱脂、脱塩、タンパク質分画、熱変性等の処理を行ったものであってもよい。
糖タンパク質等の複合糖類からの糖鎖遊離処理は、複合糖類から糖鎖を遊離することができるものであれば、特に制限はなく、酵素的処理及び化学的処理等の別は問わない。例えば、ペプチドN-グリカナーゼ(PNGase F、PNGase A)消化、エンド-β-Nアセチルグルコサミニダーゼ(Endo-H、Endo-F、Endo-A、Endo-M)消化、エンドO-グリカナーゼ消化、ヒドラジン分解、トリフルオロ酢酸分解、アルカリ処理によるβ脱離等により行うことができるが、これらに限定するものではない。また、糖鎖遊離処理に先立って、糖タンパク質や糖ペプチド等に対して上記したプロテアーゼ等によりタンパク質及びペプチド部分の断片化処理等を行ってもよい。
本実施形態に係る糖鎖の濃縮方法は、まず、糖鎖を含む試料と実施形態に係る精製剤とを接触させ、当該精製剤に糖鎖を捕捉させる。精製剤は不溶性支持体に固定されていることが好ましい。本実施形態に係る担体は、親水度が高められていることから、親水性相互作用により糖鎖を特異的に捕捉することができ、試料中に多量に存在する糖鎖以外の夾雑物(タンパク、ペプチド、脂質、塩等)は当該担体に捕捉されず遊離状態で残存する。
本実施形態に係る担体による糖鎖の保持力は、有機溶剤濃度に比例する。したがって、当該担体が糖鎖を捕捉する際の反応液の溶媒としては、有機溶剤、又は、有機溶剤と水の混合溶媒を用いることができる。溶媒は、濃縮対象となる糖鎖の種類等により適宜選択することができる。有機溶剤としては、糖鎖を溶解可能なものである限り特に制限はないが、例えば、アセトニトリル、テトラヒドロフラン、アセトン、ジオキサン、ピリジン、メタノール、エタノール、1-プロパノール、2-プロパノール、および1-ブタノール等を挙げることができる。好ましくは、アセトニトリル、1-ブタノール、エタノール等の有機溶剤が好適に用いられる。pH調整のために各種緩衝液を用いることができる。また、有機溶剤と水の混合溶媒を使用する場合、有機溶剤と水の混合比率は、例えば体積比で50:50~100:0であり、好ましくは90:10~100:0、より好ましくは95:5~100:0である。
続いて、必要に応じて、糖鎖を捕捉した担体を洗浄する。洗浄により、担体に捕捉された糖鎖以外の夾雑物(タンパク、ペプチド、脂質、塩等)を除去することができる。洗浄液は、例えば上述した溶媒を用いることができる。
洗浄後、糖鎖を捕捉した担体から糖鎖を再遊離させることで、糖鎖を特異的に濃縮することができる。
糖鎖の再遊離のための溶出液は、有機溶剤、又は、有機溶剤と水の混合溶媒を用いることができ、濃縮対象となる糖鎖やポリマーの種類等により適宜選択することができる。有機溶剤としては、上記したものを用いることができる。また、本工程では、親水性を高めた溶媒を使用することで、効率よく糖鎖を遊離させることができる。例えば、有機溶剤を使用せず水のみを使用することもできるし、有機溶剤と水の混合溶媒を使用することもできる。混合溶媒を使用する場合は、水に対して有機溶剤は体積比で3倍以下であることが挙げられるが、特に好ましくは、有機溶剤を使用せず水のみを使用することができる。
本実施形態に係る糖鎖の濃縮方法は、担体を用いる公知の濃縮形態を選択して実施することができる。例えば、バッチ法や、スピンカラム法等を挙げることができるが、これらに限定するものではない。バッチ法及びスピンカラム法の手順は上記〔糖ペプチドの濃縮方法〕の手順に準じて行うことができ、試薬類及び反応条件等は上記した通りである。
本実施形態に係る糖鎖の濃縮方法により濃縮を行った糖鎖は、糖鎖の構造解析等の分析手段にそのまま供することができ、必要に応じて標識等を付すことができる。
〔糖ペプチド濃縮のためのキット〕
本実施形態に係る糖ペプチド濃縮のためのキットは、実施形態に係る精製剤、及び、当該キット使用のためのプロトコル等を使用説明書として含んで構成される。精製剤は不溶性支持体に固定されていることが好ましい。使用説明書は、紙又はその他の媒体に書かれたもの又は印刷されたものでもよく、磁気テープ、磁気ディスク、光ディスク等の電子媒体に記録されたものでもよい。このように、糖ペプチドの濃縮方法の実施に必要な試薬類をキットとして提供することができる。
本実施形態に係る糖ペプチド濃縮のためのキットは、実施形態に係る精製剤、及び、当該キット使用のためのプロトコル等を使用説明書として含んで構成される。精製剤は不溶性支持体に固定されていることが好ましい。使用説明書は、紙又はその他の媒体に書かれたもの又は印刷されたものでもよく、磁気テープ、磁気ディスク、光ディスク等の電子媒体に記録されたものでもよい。このように、糖ペプチドの濃縮方法の実施に必要な試薬類をキットとして提供することができる。
本実施形態に係る糖ペプチド濃縮のためのキットには、更に、当該キットを実施するために必要な試薬類や容器類を含めることができる。例えば、本実施形態に係る担体による糖ペプチドの捕捉のための反応液、当該反応に際してpH等を調整するための緩衝液、洗浄のための洗浄液、糖ペプチドを捕捉した担体から糖ペプチドを遊離させるための溶出液等が挙げられる。これらは、凍結乾燥粉末の形態で提供されてもよく、その場合、糖ペプチド濃縮のためのキットには、更に、使用に際しての希釈のための希釈液を含んでいてよい。また、フィルターカップ、マルチウェルプレート、フィルタープレート、マイクロチューブ等の容器類を含んでいてよく、本実施形態に係る担体を、これらの容器の中に充填された状態で含めてもよい。各用語の定義及び好ましい実施形態については、上述した通りである。このように、糖ペプチドの濃縮に必要な担体、試薬類及び情報等をキット化することにより、糖ペプチドの濃縮をより簡便に行うことができる。
〔糖鎖濃縮のためのキット〕
本実施形態に係る糖鎖濃縮のためのキットは、実施形態に係る精製剤、及び、当該キット使用のためのプロトコル等を使用説明書として含んで構成される。精製剤は不溶性支持体に固定されていることが好ましい。使用説明書は、紙又はその他の媒体に書かれたもの又は印刷されたものでもよく、磁気テープ、磁気ディスク、光ディスク等の電子媒体に記録されたものでもよい。このように、糖鎖の濃縮方法の実施に必要な試薬類をキットとして提供することができる。
本実施形態に係る糖鎖濃縮のためのキットは、実施形態に係る精製剤、及び、当該キット使用のためのプロトコル等を使用説明書として含んで構成される。精製剤は不溶性支持体に固定されていることが好ましい。使用説明書は、紙又はその他の媒体に書かれたもの又は印刷されたものでもよく、磁気テープ、磁気ディスク、光ディスク等の電子媒体に記録されたものでもよい。このように、糖鎖の濃縮方法の実施に必要な試薬類をキットとして提供することができる。
本実施形態に係る糖鎖濃縮のためのキットには、更に、当該キットを実施するために必要な試薬類や容器類を含めることができる。例えば、本実施形態に係る担体による糖鎖の捕捉のための反応液、当該反応に際してpH等を調整するための緩衝液、洗浄のための洗浄液、糖鎖を捕捉した担体から糖鎖を再遊離させるための溶出液等が挙げられる。これらは、凍結乾燥粉末の形態で提供されてもよく、その場合、糖鎖濃縮のためのキットには、更に、使用に際しての希釈のための希釈液を含んでいてよい。また、フィルターカップ、マルチウェルプレート、フィルタープレート、マイクロチューブ等の容器類を含んでいてよく、本実施形態に係る担体を、これらの容器の中に充填された状態で含めてもよい。各用語の定義及び好ましい実施形態については、上述した通りである。このように、糖鎖の濃縮に必要な担体、試薬類及び情報等をキット化することにより、糖鎖の濃縮をより簡便に行うことができる。
〔装置〕
1実施形態において本発明は、上述した精製剤を収容した容器を保持する容器保持部と、前記容器に試薬を導入する試薬導入部とを備える、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチド精製のための装置を提供する。精製剤は不溶性支持体に固定されていることが好ましい。
1実施形態において本発明は、上述した精製剤を収容した容器を保持する容器保持部と、前記容器に試薬を導入する試薬導入部とを備える、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチド精製のための装置を提供する。精製剤は不溶性支持体に固定されていることが好ましい。
図9は、本実施形態の装置を説明する模式図である。なお、以下に説明する装置の構成はあくまで一例であり、本実施形態の装置はこの構成に拘束されるものではない。図9に示すように、装置100は、担体10を収容した容器15を保持する容器保持部20と、容器15に試薬を導入する試薬導入部30とを備える。図9の例では、容器15は、後述する回収容器16(例えばコレクションチューブ、コレクションプレート等)に装着されている。
試薬導入部30は、容器15に単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチド及び有機溶剤を含む試料31を導入する試料導入部35と、容器15に洗浄液32を導入する洗浄液導入部35と、容器15に溶出液33を導入する溶出液導入部35とを含む。本例においては、試料導入部、洗浄液導入部、溶出液導入部は同一の部材35から構成されている。
容器保持部20は、担体10を収容した容器15を保持するためのものである。容器保持部20は、容器15を直接保持してもよいし、図9に示すように、容器15を保持する別の部材(回収容器16)を保持してもよい。容器保持部20が容器15を保持する態様はこれに限定されず、例えば、容器保持部20の保持穴又は保持孔に容器の大部分を嵌入させて保持する態様が挙げられる。このほかにも、容器保持部の係合凸部(係合凹部)に容器の係合凹部(係合凸部)を係合させて保持する態様、容器保持部の挟持部で容器を挟持保持する態様等が挙げられる。
試薬導入部30は、容器保持部20に保持された容器15内に液体類を導入するためのものである。図9の例では、試薬導入部30は、試料31、洗浄液32、溶出液33を収容したタンク34と、タンク34が収容した各試薬を送液する送液管35aと、各試薬の送液を制御する弁(36,37,38)と各試薬を容器15の内部に導入する導入部35とを備えている。
試料導入部35、洗浄液導入部35、溶出液導入部35は、同一の反応容器15内に試料31、洗浄液32、溶出液33を添加する。試薬導入部30が反応容器15内へ液体を導入する態様は特に限定されず、例えば、送液すべき液体が貯留されている送液源(31,32,33)から管状部材を介して反応容器15内へ送液する態様が挙げられる。このほかにも、管状部材中に採取した液体を反応容器内へ注入する態様等が挙げられる。
装置100は、容器15の収容物を固液分離する固液分離部40を更に備えていてもよい。装置100が固液分離部40を含む場合、固液分離部40は、容器15中に含まれる収容物から固体と液体とを分離する。固体は容器15中に残されるものであり、実質的には、担体10及びそれに固定されている物質である。さらに、容器15には、回収容器16(例えばコレクションチューブ、コレクションプレート等)が装着されていてもよい。
固液分離部40の具体的な分離形式としては特に限定されず、遠心分離、減圧、加圧等が挙げられる。図9の例では、固液分離部40の分離形式は遠心分離である。固液分離部40は、容器15(又は16)を保持するラック41と、ドライブシャフト42と、モーター43とを備えている。
図9の例のように、固液分離部40は、容器保持部20から独立した構成部材として構成されていてもよい。この場合、装置100は、容器保持部20から固液分離部40へ、容器15(及び16)を自動移送させる容器移送部50を含んでいてもよい。容器移送部50は、容器15(及び16)の移送において、容器15のみが移送されるように構成されてもよいし、容器15が回収容器16を装着した状態で移送されるように構成されてもよい。容器移送部50は、容器15を直接的又は間接的に(つまり回収容器16を介して)把持及び開放し、かつ移動するように作動するアームと、当該アームの作動を制御するアーム制御部とを含んで構成されていてもよい。
固液分離部40を作動させることで、遠心分離、減圧、加圧等によって、担体10に固定された単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドを容器15内に残すとともに、洗浄液を回収容器16中に廃棄することができる。また、溶出過程においては、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドを含む溶出液を回収容器16中に回収することができる。
装置100は、容器15の収容物の温度を調節する温度調節部60を更に備えていてもよい。装置100が温度調節部60を含む場合、温度調節部60は、少なくともヒータ機能を有していればよい。
装置100は、作動しうる構成部分(例えば、液体導入部35、アーム50、固液分離部40、温度調節部60、液体移送部50)の少なくともいずれか、好ましくは全てが自動制御されてもよい。これによって、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製をより迅速に行うことができる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は、これらの実施例に限定されるものではない。
<合成例>
(2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン由来の構成単位を含むポリマーがシリカビーズに固定化している担体)
本合成例では、シリカビーズ表面上での2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン由来の構成単位を含むポリマー(以下、「MPCポリマー」と記載する。)の合成を例示して説明するが、本発明の範囲を限定する意図ではない。
(2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン由来の構成単位を含むポリマーがシリカビーズに固定化している担体)
本合成例では、シリカビーズ表面上での2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン由来の構成単位を含むポリマー(以下、「MPCポリマー」と記載する。)の合成を例示して説明するが、本発明の範囲を限定する意図ではない。
シリカビーズへの連鎖移動基の導入
連鎖移動基を有するシランカップリング剤である(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン(東京化成工業株式会社製M0928)5gをpH3.0の酢酸水溶液50mLとエタノール50mLとの混合液に添加し、1時間室温で撹拌することでシランカップリング剤を加水分解した後に、不溶性支持体の一例としての無機粒子であるシリカビーズ(平均粒径5μm、細孔径70Å、富士シリシア化学株式会社製SMB70-5)5gを投入し70℃で2時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、100℃で1時間加熱した。その後、エタノールで分散させてよく振盪した後、遠心分離により上澄みを除去し乾燥させた。
連鎖移動基を有するシランカップリング剤である(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン(東京化成工業株式会社製M0928)5gをpH3.0の酢酸水溶液50mLとエタノール50mLとの混合液に添加し、1時間室温で撹拌することでシランカップリング剤を加水分解した後に、不溶性支持体の一例としての無機粒子であるシリカビーズ(平均粒径5μm、細孔径70Å、富士シリシア化学株式会社製SMB70-5)5gを投入し70℃で2時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、100℃で1時間加熱した。その後、エタノールで分散させてよく振盪した後、遠心分離により上澄みを除去し乾燥させた。
ポリマーの合成
ポリマーの構成単位となる2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(以下、「MPCモノマー」と記載、日本油脂株式会社製)を、エタノールに溶解させ、0.8mol/Lのモノマー溶液を20mL作製した。そこにAIBNを0.027mol/Lになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、上記のメタクリロキシプロピルジメチルメトキシシランで処理したシリカビーズ4gを投入し、アルゴンガス雰囲気下、70℃で6時間反応させた。次いで、遠心分離により反応溶液からシリカビーズを回収し、エタノールに分散させ、よく振盪した後、吸引ろ過によりシリカビーズを回収し、乾燥させることで、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン由来の構成単位を含むポリマーがシリカビーズに固定化している担体(以下、単に「担体」と記載する。)を得た。
ポリマーの構成単位となる2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(以下、「MPCモノマー」と記載、日本油脂株式会社製)を、エタノールに溶解させ、0.8mol/Lのモノマー溶液を20mL作製した。そこにAIBNを0.027mol/Lになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、上記のメタクリロキシプロピルジメチルメトキシシランで処理したシリカビーズ4gを投入し、アルゴンガス雰囲気下、70℃で6時間反応させた。次いで、遠心分離により反応溶液からシリカビーズを回収し、エタノールに分散させ、よく振盪した後、吸引ろ過によりシリカビーズを回収し、乾燥させることで、2-メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン由来の構成単位を含むポリマーがシリカビーズに固定化している担体(以下、単に「担体」と記載する。)を得た。
(担体の表面に導入された、ポリマーを含む層の重量の測定)
上記で得られた担体の表面に導入された、ポリマーを含む層の重量は、TGA装置(セイコーインスツルメント社製TG/DTA6200)を用いて、空気雰囲気中、室温から500℃へ10℃/分で昇温し、さらに500℃を1時間維持した後の重量減少率を測定した。この値と、別途BET法で求めた単位重量当たりの粒子の表面積から、粒子の表面に導入された、ポリマーを含む層の重量を算出したところ、1.08mg/m2であった。
上記で得られた担体の表面に導入された、ポリマーを含む層の重量は、TGA装置(セイコーインスツルメント社製TG/DTA6200)を用いて、空気雰囲気中、室温から500℃へ10℃/分で昇温し、さらに500℃を1時間維持した後の重量減少率を測定した。この値と、別途BET法で求めた単位重量当たりの粒子の表面積から、粒子の表面に導入された、ポリマーを含む層の重量を算出したところ、1.08mg/m2であった。
実施例1.物性の確認(担体)
本実施例では、上記<合成例>で作製した担体の物性について、固液分離物性の観点から確認した。
本実施例では、上記<合成例>で作製した担体の物性について、固液分離物性の観点から確認した。
上記<合成例>で作製した担体10mgにエタノール:ブタノール(体積比1:5、溶液Aとする)混合溶液200μLを加え、ボルテックスにより激しく分散させたのち、卓上遠心機(TOMY,PMC-060)で遠心し、担体の固液面の分離度合いを確認した。2、3秒の遠心で担体が沈み、固液面が明確になることを確認した。担体が白いため、固液面が明確であること確認した(表1)。
比較例1.物性の確認(セファロースビーズ)
本比較例では、セファロースビーズの物性について、固液分離物性の観点から確認し、実施例1との比較により、上記<合成例>で作製した担体の物性と比較した。
本比較例では、セファロースビーズの物性について、固液分離物性の観点から確認し、実施例1との比較により、上記<合成例>で作製した担体の物性と比較した。
セファロースビーズ(SIGMA、Sepharose CL-4B)100μLに実施例1の溶液Aを200μLを加えボルテックスにより激しく分散させたのち、卓上遠心機(TOMY,PMC-060)で遠心し、セファロースビーズの固液面の分離度合いを確認した。2、3秒の遠心ではまだセファロースビーズが沈んでいないことを確認した。遠心を10秒以上続けることで、セファロースビーズが沈んだが、色が半透明なため固液の境界面が非常に不明瞭であることを確認した(表1)。
実施例1及び比較例1の結果より、上記<合成例>で作製した担体は、固液分離物性において優れた物性を有し、容易かつ簡便、確実に固液分離できることが確認された。
実施例2.担体を用いた糖ペプチドの濃縮
本実施例では、上記<合成例>で作製した担体を用いて試料からの糖ペプチドの濃縮をバッチ式及びスピンカラムの双方により確認した。
本実施例では、上記<合成例>で作製した担体を用いて試料からの糖ペプチドの濃縮をバッチ式及びスピンカラムの双方により確認した。
(1)タンパク質のペプチド断片化
5mg RNaseB(SIGMA)に超純水50μL、1M 重炭酸アンモニウム水溶液5μL、120mM ジチオスレイトール溶液5μLを加えて、60℃で30分間反応させた。その後、123mM ヨードアセトアミド水溶液10μLを加え、遮光して室温で1時間反応させた。トリプシン400unitを加え、一晩反応させた。超純水を適量加えて、タンパク質の濃度が50μg/μLとなるように調製した。
5mg RNaseB(SIGMA)に超純水50μL、1M 重炭酸アンモニウム水溶液5μL、120mM ジチオスレイトール溶液5μLを加えて、60℃で30分間反応させた。その後、123mM ヨードアセトアミド水溶液10μLを加え、遮光して室温で1時間反応させた。トリプシン400unitを加え、一晩反応させた。超純水を適量加えて、タンパク質の濃度が50μg/μLとなるように調製した。
(2)糖ペプチドの回収
A.バッチ式の場合
1.5mLサンプルチューブに当該ビーズ1mgを添加した。実施例1の溶液Aを200μL加えてビーズを分散させたのち、卓上遠心機を用いて数秒間遠心した。溶液を除いたのち、試料溶液(上記(1)で調製した溶液1μL、超純水99μL、実施例1の溶液A600μLの混合液)を上記<合成例>で作製した担体の入ったチューブに加え、激しく撹拌した。その後、卓上遠心機を用いて遠心し、担体を沈ませ、溶液を除去した。続いて、エタノール:ブタノール:水(体積比 1:5:1、洗浄液とする)700μLを加えて激しく撹拌後、遠心により担体を沈ませ、溶液を除去した。さらに、50%エタノール水溶液700μLを加えて激しく撹拌後、遠心により担体を沈ませ、溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレータを用いて乾燥させ超純水13μLに再溶解させた。
A.バッチ式の場合
1.5mLサンプルチューブに当該ビーズ1mgを添加した。実施例1の溶液Aを200μL加えてビーズを分散させたのち、卓上遠心機を用いて数秒間遠心した。溶液を除いたのち、試料溶液(上記(1)で調製した溶液1μL、超純水99μL、実施例1の溶液A600μLの混合液)を上記<合成例>で作製した担体の入ったチューブに加え、激しく撹拌した。その後、卓上遠心機を用いて遠心し、担体を沈ませ、溶液を除去した。続いて、エタノール:ブタノール:水(体積比 1:5:1、洗浄液とする)700μLを加えて激しく撹拌後、遠心により担体を沈ませ、溶液を除去した。さらに、50%エタノール水溶液700μLを加えて激しく撹拌後、遠心により担体を沈ませ、溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレータを用いて乾燥させ超純水13μLに再溶解させた。
B.スピンカラムの場合
スピンカラム(Ultrafree-MC, Millipore Cat#: UFC30HVNB)に上記<合成例>で作製した担体1mgを添加した。実施例1の溶液A 200μLを加えた後、卓上遠心機を用いて数秒間遠心し溶液を除いた。試料溶液(上記(1)で調製した溶液1μL、超純水99μL、実施例1の溶液A 600μLの混合液)を担体の入ったスピンカラムに加え、卓上遠心機を用いて遠心して溶液を除去した。続いて、洗浄液700μLを加え、遠心により溶液を除去した。さらに、50%エタノール水溶液700μLを加えた後、遠心により溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレータを用いて乾燥させ超純水13μLに再溶解させた。
スピンカラム(Ultrafree-MC, Millipore Cat#: UFC30HVNB)に上記<合成例>で作製した担体1mgを添加した。実施例1の溶液A 200μLを加えた後、卓上遠心機を用いて数秒間遠心し溶液を除いた。試料溶液(上記(1)で調製した溶液1μL、超純水99μL、実施例1の溶液A 600μLの混合液)を担体の入ったスピンカラムに加え、卓上遠心機を用いて遠心して溶液を除去した。続いて、洗浄液700μLを加え、遠心により溶液を除去した。さらに、50%エタノール水溶液700μLを加えた後、遠心により溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレータを用いて乾燥させ超純水13μLに再溶解させた。
(3)LC-MS分析
上記(2)で調製した各溶液のうち3μLを用いて、表2の条件を用いてLC-MS分析を実施した。得られたトータルイオンクロマトグラムを図3に示す。図3中、横軸は保持時間を(分)を表し、縦軸はシグナル強度(相対値)を表す。糖ペプチド回収処理をする前のサンプルには、シグナルが多数存在していることが確認された(図3の上図)。一方、本発明の手法により糖ペプチドを回収した試料溶液では、シグナルが大幅に減少し、メインのシグナルが一本になっていることを確認した(図3の下図)。このメインピーク(溶出時間5.2~5.8分)のMS結果を図4に示した。図4中、横軸はm/z値を表し、縦軸はシグナル強度(相対値)を表す。ヘキソース1個に該当する等間隔のピークが多数検出され、RNaseBの代表的な糖鎖である高マンノースが結合したペプチド由来のピークであることを確認した。本発明の手法を用いることで、糖ペプチドを容易に濃縮可能であることを確認した。
上記(2)で調製した各溶液のうち3μLを用いて、表2の条件を用いてLC-MS分析を実施した。得られたトータルイオンクロマトグラムを図3に示す。図3中、横軸は保持時間を(分)を表し、縦軸はシグナル強度(相対値)を表す。糖ペプチド回収処理をする前のサンプルには、シグナルが多数存在していることが確認された(図3の上図)。一方、本発明の手法により糖ペプチドを回収した試料溶液では、シグナルが大幅に減少し、メインのシグナルが一本になっていることを確認した(図3の下図)。このメインピーク(溶出時間5.2~5.8分)のMS結果を図4に示した。図4中、横軸はm/z値を表し、縦軸はシグナル強度(相対値)を表す。ヘキソース1個に該当する等間隔のピークが多数検出され、RNaseBの代表的な糖鎖である高マンノースが結合したペプチド由来のピークであることを確認した。本発明の手法を用いることで、糖ペプチドを容易に濃縮可能であることを確認した。
実施例3.担体を用いた糖鎖の濃縮
本実施例では、上記<合成例>で作製した担体を用いて、試料からの糖鎖濃縮をスピンカラムを用いて確認した。
本実施例では、上記<合成例>で作製した担体を用いて、試料からの糖鎖濃縮をスピンカラムを用いて確認した。
(1)糖鎖溶液の調製
デキストランの加水物分解物より調製したグルコースのオリゴマー(生化学工業製。品番:800111)を1mg/mLになるように超純水に溶解させ、糖鎖溶液とした。
デキストランの加水物分解物より調製したグルコースのオリゴマー(生化学工業製。品番:800111)を1mg/mLになるように超純水に溶解させ、糖鎖溶液とした。
(2)糖鎖の回収
スピンカラム(Ultrafree-MC, Millipore Cat#: UFC30HVNB)に上記<合成例>で作製した担体10mgを添加した。超純水200μLを加えた後、卓上遠心機を用いて数秒間遠心し溶液を除いた。上記(1)で調製した溶液10μLにアセトニトリル990μLを加えてよく混合した後、担体の入ったスピンカラムに加え、卓上遠心機を用いて遠心して溶液を除去した。続いて、アセトニトリル600μLを加え、遠心により溶液を除去した。再度、アセトニトリル600μLを加え、遠心により溶液を除去した。超純水100μLを加えた後、遠心により溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレータを用いて乾燥させた。
スピンカラム(Ultrafree-MC, Millipore Cat#: UFC30HVNB)に上記<合成例>で作製した担体10mgを添加した。超純水200μLを加えた後、卓上遠心機を用いて数秒間遠心し溶液を除いた。上記(1)で調製した溶液10μLにアセトニトリル990μLを加えてよく混合した後、担体の入ったスピンカラムに加え、卓上遠心機を用いて遠心して溶液を除去した。続いて、アセトニトリル600μLを加え、遠心により溶液を除去した。再度、アセトニトリル600μLを加え、遠心により溶液を除去した。超純水100μLを加えた後、遠心により溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレータを用いて乾燥させた。
(3)回収した糖鎖の標識
上記(2)で得られた乾燥体に2AB標識液(0.35M 2-アミノベンズアミド、1M シアノ水素化ホウ素ナトリウムになるように30%酢酸/70%ジメチルスホキシド溶媒に溶解させた溶液)を10μL加えた。60度で2時間反応させた後、超純水90μLを加えた。
上記(2)で得られた乾燥体に2AB標識液(0.35M 2-アミノベンズアミド、1M シアノ水素化ホウ素ナトリウムになるように30%酢酸/70%ジメチルスホキシド溶媒に溶解させた溶液)を10μL加えた。60度で2時間反応させた後、超純水90μLを加えた。
(4)HPLC分析
上記(3)で調製した各溶液のうち1μLを用いて、表2の条件を用いてHPLC分析を実施した。得られたピークのうちグルコース1糖~10糖に該当するピークの面積値を確認した。得られた結果を図5に示す。コントロールサンプルとは、グルコースオリゴマー溶液10μLを乾燥させた後、(3)の工程のみを実施したサンプルを指す。担体により糖鎖回収を実施したサンプルとコントロールのサンプルとで結果がほぼ同じであり、担体を用いて糖鎖を回収するにあたり、糖鎖のロスがほとんど生じないことを確認した。
上記(3)で調製した各溶液のうち1μLを用いて、表2の条件を用いてHPLC分析を実施した。得られたピークのうちグルコース1糖~10糖に該当するピークの面積値を確認した。得られた結果を図5に示す。コントロールサンプルとは、グルコースオリゴマー溶液10μLを乾燥させた後、(3)の工程のみを実施したサンプルを指す。担体により糖鎖回収を実施したサンプルとコントロールのサンプルとで結果がほぼ同じであり、担体を用いて糖鎖を回収するにあたり、糖鎖のロスがほとんど生じないことを確認した。
比較例2.クリーンアップカラムを用いた糖鎖の濃縮
本比較例では、従来公知のクリーンアップカラム(シリカベースの担体を含むカラム)を用いて糖鎖の濃縮を行い、実施例3の上記<合成例>で作製した担体を用いた糖鎖濃縮との比較を行った。
本比較例では、従来公知のクリーンアップカラム(シリカベースの担体を含むカラム)を用いて糖鎖の濃縮を行い、実施例3の上記<合成例>で作製した担体を用いた糖鎖濃縮との比較を行った。
(1)糖鎖溶液の調製
実施例3と同様の手順により行った。
実施例3と同様の手順により行った。
(2)糖鎖の回収
クリーンアップカラム(住友ベークライト、BS-45403付属品)に超純水200μLを加えた後、卓上遠心機を用いて数秒間遠心し溶液を除いた。糖鎖溶液の準備(上記(1))で調製した溶液10μLにアセトニトリル990μLを加えてよく混合した後、クリーンアップカラムに加え、卓上遠心機を用いて遠心して溶液を除去した。続いて、アセトニトリル600μLを加え、遠心により溶液を除去した。再度、アセトニトリル600μLを加え、遠心により溶液を除去した。超純水100μLを加えた後、遠心により溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレータを用いて乾燥させた。
クリーンアップカラム(住友ベークライト、BS-45403付属品)に超純水200μLを加えた後、卓上遠心機を用いて数秒間遠心し溶液を除いた。糖鎖溶液の準備(上記(1))で調製した溶液10μLにアセトニトリル990μLを加えてよく混合した後、クリーンアップカラムに加え、卓上遠心機を用いて遠心して溶液を除去した。続いて、アセトニトリル600μLを加え、遠心により溶液を除去した。再度、アセトニトリル600μLを加え、遠心により溶液を除去した。超純水100μLを加えた後、遠心により溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレータを用いて乾燥させた。
(3)回収した糖鎖の標識
実施例3と同様の手順により行った。
実施例3と同様の手順により行った。
(4)HPLC分析
実施例3と同様の手順により行い、得られたピークのうちグルコース1糖~10糖に該当するピークの面積値を確認した。得られた結果を図6に示す。コントロールサンプルとは、グルコースオリゴマー溶液10μLを乾燥させた後、(3)の工程のみを実施したサンプルを指す。クリーンアップカラムにより糖鎖回収を実施したサンプルからは、単糖、二糖のロスが大きいことを示すデータが得られた。従来公知のクリーンアップカラムは、O型糖鎖のような小さい糖鎖の回収には不十分であることを確認した。
実施例3と同様の手順により行い、得られたピークのうちグルコース1糖~10糖に該当するピークの面積値を確認した。得られた結果を図6に示す。コントロールサンプルとは、グルコースオリゴマー溶液10μLを乾燥させた後、(3)の工程のみを実施したサンプルを指す。クリーンアップカラムにより糖鎖回収を実施したサンプルからは、単糖、二糖のロスが大きいことを示すデータが得られた。従来公知のクリーンアップカラムは、O型糖鎖のような小さい糖鎖の回収には不十分であることを確認した。
比較例3.グラファイトカーボンを用いた糖鎖の濃縮
本比較例では、従来公知のグラファイトカーボンを用いて糖鎖の濃縮を行い、実施例3の上記<合成例>で作製した担体を用いた糖鎖濃縮との比較を行った。
本比較例では、従来公知のグラファイトカーボンを用いて糖鎖の濃縮を行い、実施例3の上記<合成例>で作製した担体を用いた糖鎖濃縮との比較を行った。
(1)糖鎖溶液の調製
実施例3と同様の手順により行った。
実施例3と同様の手順により行った。
(2)糖鎖の回収
グラファイトカーボンカラム(シグマアルドリッチ、スペルクリンENVI-Carb C)にアセトニトリル1mLを通液させた。さらに、水3mLを通液させた。続いて、糖鎖溶液の準備(上記(1))で調製した溶液10μLと0.1%酢酸水90μLを混合し、グラファイトカーボンカラムに通液させた。水3mLを通液させ、グラファイトカーボンを洗浄した。0.22μmのフィルターを装着した後、超純水100μLを通液させ、溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレータを用いて乾燥させた。
グラファイトカーボンカラム(シグマアルドリッチ、スペルクリンENVI-Carb C)にアセトニトリル1mLを通液させた。さらに、水3mLを通液させた。続いて、糖鎖溶液の準備(上記(1))で調製した溶液10μLと0.1%酢酸水90μLを混合し、グラファイトカーボンカラムに通液させた。水3mLを通液させ、グラファイトカーボンを洗浄した。0.22μmのフィルターを装着した後、超純水100μLを通液させ、溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレータを用いて乾燥させた。
(3)回収した糖鎖の標識
実施例3と同様の手順により行った。
実施例3と同様の手順により行った。
(4)HPLC分析
実施例3と同様の手順により行い、得られたピークのうちグルコース1糖~10糖に該当するピークの面積値を確認した。得られた結果を図7に示す。コントロールサンプルとは、グルコースオリゴマー溶液10μLを乾燥させた後、(3)の工程のみを実施したサンプルを指す。グラファイトカーボンカラムにより糖鎖回収を実施したサンプルでは、全体的に糖のロスが発生し、当該サンプルからは、特に、単糖、二糖では全く糖が回収できていないことを示すデータが得られた。従来公知のグラファイトカーボンは、小さい糖鎖(単糖、二糖等)の回収には特に不向きであることを確認した。
実施例3と同様の手順により行い、得られたピークのうちグルコース1糖~10糖に該当するピークの面積値を確認した。得られた結果を図7に示す。コントロールサンプルとは、グルコースオリゴマー溶液10μLを乾燥させた後、(3)の工程のみを実施したサンプルを指す。グラファイトカーボンカラムにより糖鎖回収を実施したサンプルでは、全体的に糖のロスが発生し、当該サンプルからは、特に、単糖、二糖では全く糖が回収できていないことを示すデータが得られた。従来公知のグラファイトカーボンは、小さい糖鎖(単糖、二糖等)の回収には特に不向きであることを確認した。
実施例3の結果、及び、比較例2及び3の結果との比較により、上記<合成例>で作製した担体は、糖鎖を回収する際にロスがほとんど生じず、従来技術では困難であった小さい糖鎖(単糖、二糖等)の回収にも好適に利用できることが理解できる。
実施例4.精製剤を用いた糖鎖の濃縮
本実施例では、架橋ポリスチレン骨格に下記式(2)で表されるベタイン構造を導入した精製剤を用いて、試料からの糖鎖濃縮をスピンカラムを用いて確認した。
本実施例では、架橋ポリスチレン骨格に下記式(2)で表されるベタイン構造を導入した精製剤を用いて、試料からの糖鎖濃縮をスピンカラムを用いて確認した。
(1)糖鎖溶液の調製
実施例3と同様の手順により行った。
実施例3と同様の手順により行った。
(2)糖鎖の回収
スピンカラム(Ultrafree-MC, Millipore Cat#: UFC30HVNB)に、上述の精製剤10mgを添加した。アセトニトリル200μLを加えた後、卓上遠心機を用いて数秒間遠心し溶液を除いた。上記(1)で調製した溶液10μLにアセトニトリル990μLを加えてよく混合した後、精製剤の入ったスピンカラムに加え、卓上遠心機を用いて遠心して溶液を除去した。続いて、アセトニトリル600μLを加え、遠心により溶液を除去した。再度、アセトニトリル600μLを加え、遠心により溶液を除去した。超純水100μLを加えた後、遠心により溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレータを用いて乾燥させた。
スピンカラム(Ultrafree-MC, Millipore Cat#: UFC30HVNB)に、上述の精製剤10mgを添加した。アセトニトリル200μLを加えた後、卓上遠心機を用いて数秒間遠心し溶液を除いた。上記(1)で調製した溶液10μLにアセトニトリル990μLを加えてよく混合した後、精製剤の入ったスピンカラムに加え、卓上遠心機を用いて遠心して溶液を除去した。続いて、アセトニトリル600μLを加え、遠心により溶液を除去した。再度、アセトニトリル600μLを加え、遠心により溶液を除去した。超純水100μLを加えた後、遠心により溶液を回収した。回収した溶液は遠心エバポレータを用いて乾燥させた。
(3)回収した糖鎖の標識
実施例3と同様の手順により行った。
実施例3と同様の手順により行った。
(4)HPLC分析
実施例3と同様の手順により行い、得られたピークのうちグルコース1糖~10糖に該当するピークの面積値を確認した。得られた結果を図8に示す。コントロールサンプルとは、グルコースオリゴマー溶液10μLを乾燥させた後、(3)の工程のみを実施したサンプルを指す。精製剤により糖鎖回収を実施したサンプルはコントロールのサンプルと比較して多少ロスがあるものの単糖、二糖といった小さい糖も回収できることを確認した。
実施例3と同様の手順により行い、得られたピークのうちグルコース1糖~10糖に該当するピークの面積値を確認した。得られた結果を図8に示す。コントロールサンプルとは、グルコースオリゴマー溶液10μLを乾燥させた後、(3)の工程のみを実施したサンプルを指す。精製剤により糖鎖回収を実施したサンプルはコントロールのサンプルと比較して多少ロスがあるものの単糖、二糖といった小さい糖も回収できることを確認した。
本発明は、本発明によれば、親水性の糖ペプチド及び糖鎖を特異的かつ効率的に捕捉可能な技術を提供することができる。したがって、本発明は、糖ペプチドや糖鎖の濃縮を必要とする技術分野、例えば、糖鎖構造変化を伴う種々の疾患の発症機構や、疾患治療及び診断技術の開発等、生命科学や医療、創薬等の技術分野で利用することができる。
100…糖タンパク質の糖鎖を調製する装置、10…担体、15…容器、16…回収容器、20…容器保持部、30…試薬導入部、31…試料、32…洗浄液、33…溶出液、34…タンク、35…試料導入部(洗浄液導入部、溶出液導入部)、35a…送液管、36,37,38…弁、40…固液分離部、41…ラック、42…ドライブシャフト、43…モーター、50…容器移送部(液体移送部)、60…温度調節部。
Claims (16)
- ベタイン構造を有する化合物からなる、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製剤。
- 前記カチオン性基が4級アンモニウム基である、請求項1又は2に記載の精製剤。
- 前記アニオン性基がリン酸基である、請求項1~3のいずれか一項に記載の精製剤。
- 前記ベタイン構造が、ホスホリルコリン基である、請求項1~4のいずれか一項に記載の精製剤。
- 前記化合物が、ベタイン構造を有する側鎖が主鎖に結合したポリマーである、請求項1~5のいずれか一項に記載の精製剤。
- 前記ポリマーが、(メタ)アクリル化合物を含む単量体の重合体である、請求項6に記載の精製剤。
- 請求項1~5のいずれか一項に記載の精製剤が、不溶性支持体に固定された、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製用担体。
- 請求項6又は7に記載の精製剤が、不溶性支持体に固定された、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製用担体。
- 前記不溶性支持体に固定された前記ポリマーの重量が、前記不溶性支持体の単位表面積(m2)当たり0.5mg~1.5mgである、請求項9に記載の担体。
- 前記不溶性支持体が、無機物質により構成されている、請求項8~10のいずれか一項に記載の精製用担体。
- 比重が、1.05~3.00である、請求項8~11のいずれか一項に記載の精製用担体。
- 形状が球状であり、平均粒径が0.5μm~100μmである、請求項8~12のいずれか一項に記載の精製用担体。
- 請求項1~7のいずれか一項に記載の精製剤又は請求項8~13のいずれか一項に記載の精製用担体と、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドと有機溶剤を含む試料とを接触させ、前記精製剤又は精製用担体に前記糖鎖又は前記糖ペプチドを吸着させることと、
前記精製剤又は精製用担体を水に接触させ、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドを溶出させることと、を含む、
単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチドの精製方法。 - 請求項1~7のいずれか一項に記載の精製剤又は請求項8~13のいずれか一項に記載の精製用担体、及び、キット使用のためのプロトコル情報を含む、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチド精製のためのキット。
- 請求項1~7のいずれか一項に記載の精製剤又は請求項8~13のいずれか一項に記載の精製用担体を収容した容器を保持する容器保持部と、
前記容器に試薬類を導入する試薬導入部と、
を備える、単糖以上の長さの糖鎖又は単糖以上の長さの糖鎖を有する糖ペプチド精製のための装置。
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