WO2015022854A1 - 糖鎖試料を標識するための化合物 - Google Patents

糖鎖試料を標識するための化合物 Download PDF

Info

Publication number
WO2015022854A1
WO2015022854A1 PCT/JP2014/069804 JP2014069804W WO2015022854A1 WO 2015022854 A1 WO2015022854 A1 WO 2015022854A1 JP 2014069804 W JP2014069804 W JP 2014069804W WO 2015022854 A1 WO2015022854 A1 WO 2015022854A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
sugar chain
carrier
compound
group
chain
Prior art date
Application number
PCT/JP2014/069804
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
皓基 阿部
秀行 島岡
Original Assignee
住友ベークライト株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 住友ベークライト株式会社 filed Critical 住友ベークライト株式会社
Priority to EP14836674.3A priority Critical patent/EP3034495A4/en
Priority to US14/906,741 priority patent/US20160168196A1/en
Priority to CN201480045454.9A priority patent/CN105473553A/zh
Priority to JP2014550970A priority patent/JP5682850B1/ja
Priority to PCT/JP2015/050927 priority patent/WO2016017192A1/ja
Publication of WO2015022854A1 publication Critical patent/WO2015022854A1/ja

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0606—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing heteroatoms not provided for by C07K5/06086 - C07K5/06139, e.g. Ser, Met, Cys, Thr
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D209/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D209/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings, condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with one carbocyclic ring
    • C07D209/04—Indoles; Hydrogenated indoles
    • C07D209/10—Indoles; Hydrogenated indoles with substituted hydrocarbon radicals attached to carbon atoms of the hetero ring
    • C07D209/18—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • C07D209/20—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals substituted additionally by nitrogen atoms, e.g. tryptophane
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06139—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C07K5/06156—Dipeptides with the first amino acid being heterocyclic and Trp-amino acid; Derivatives thereof
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2560/00—Chemical aspects of mass spectrometric analysis of biological material

Definitions

  • the present invention relates to a novel compound for labeling a sugar chain sample, a method for preparing a sugar chain sample using the compound, and a method for analyzing a sugar chain.
  • Biopolymers such as sugar chains, glycoproteins, glycopeptides, peptides, oligopeptides, proteins, nucleic acids, and lipids play an important role in biotechnology fields such as medicine, cell engineering, and organ engineering. Clarifying the control mechanism of biological reactions will lead to the development of the biotechnology field.
  • Sugar chain is a general term for molecules in which monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, sialic acid, and derivatives thereof are linked in a chain by glycosidic bonds.
  • sugar chains are extremely diverse and are deeply involved in various functions of naturally occurring organisms, such as cell-to-cell information transmission and protein functions and interactions. It is becoming clear.
  • Sugar chains often exist as complex carbohydrates bound to proteins and lipids in vivo.
  • biopolymers having sugar chains include proteoglycans on the cell wall of plant cells that contribute to cell stabilization, glycolipids that affect cell differentiation, proliferation, adhesion, migration, etc., and cell-cell interactions and cells. Examples include glycoproteins involved in recognition.
  • the mechanisms by which sugar chains contained in these biopolymers control advanced and precise biological reactions while acting, assisting, amplifying, regulating, or inhibiting the functions of these biopolymers are gradually being clarified. If the relationship between the sugar chain and cell differentiation / proliferation, cell adhesion, immunity, and cell carcinogenesis is clarified, this sugar chain engineering will be closely related to medicine, cell engineering, or organ engineering. We can expect new developments.
  • sugar chain In glycoprotein drugs, the sugar chain often plays an important role in the expression of biological activity. Therefore, the evaluation of sugar chains is extremely important as a quality control parameter for glycoprotein drugs. Particularly for antibody drugs, it has been reported that the sugar chain structure affects antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC activity), and the importance of sugar chain structure analysis is increasing.
  • ADCC activity antibody-dependent cytotoxic activity
  • Patent Document 1 a method for preparing a sugar chain sample using a sugar chain-capturing substance having a functional group (for example, hydrazide group or aminooxy group) that specifically reacts with the aldehyde group of the sugar chain has been reported.
  • a functional group for example, hydrazide group or aminooxy group
  • the sugar chain captured by the sugar chain-trapping substance is released, labeled, and then subjected to analysis by mass spectrometry or high performance liquid chromatography.
  • AoWR has an aminooxy group at its terminal, and this aminooxy group acts on a hydrazone bond or oxime bond between the sugar chain-trapping substance and the sugar chain. Then, by the hydrazone-oxime exchange reaction or oxime-oxime exchange reaction, aoWR can bind to the sugar chain at the same time as the sugar chain is released from the sugar chain-trapping substance. For this reason, it has the advantage that labeling of an efficient sugar chain is attained.
  • An object of the present invention is to provide a labeled compound that enables more efficient analysis when a sugar chain sample prepared using a sugar chain-trapping substance is analyzed by mass spectrometry.
  • a further object of the present invention is to provide a method for preparing a sugar chain sample and a method for analyzing a sugar chain using the labeled compound.
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group.
  • This compound is a compound in which a methyl ester (—CO—CH 3 ) group of a conventional aoWR is converted to an amide group (—CO—NR 1 R 2 ).
  • a compound in which the amide group is —CO—NH 2 N-Aminooxyethyl-tryptophyl- (argineine amide); hereinafter referred to as “aoWR-NH2”
  • aoWR-NH2 N-Aminooxyethyl-tryptophyl- (argineine amide)
  • the present inventors have found that the compound represented by the above formula (1) not only improves ionization efficiency but also excels in fluorescence intensity and storage stability, and prepares a sugar chain sample with a sugar chain capture substance and sugars.
  • the present inventors have found that the compound is extremely useful in the detection of a chain sample, and have completed the present invention.
  • the present invention relates to a novel compound represented by the above formula (1), a labeling reagent containing the compound as an active ingredient, a method for preparing a sugar chain sample using the compound, and a method for analyzing a sugar chain. More specifically, the following invention is provided.
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group.
  • a method for preparing a labeled sugar chain sample (A) A sample containing a sugar chain is brought into contact with a carrier having a hydrazide group or an aminooxy group as a functional group for capturing the sugar chain, and the aldehyde group of the sugar chain and the hydrazide group or aminooxy group of the carrier A step of capturing the sugar chain on the carrier by reacting (B) a step of washing the carrier having captured the sugar chain; and (c) contacting the carrier having captured the sugar chain with the compound according to any one of [1] to [3], and Releasing the chain and simultaneously binding the compound to the sugar chain; Including methods.
  • R 3 and R 4 each independently represents a hydrocarbon chain having 1 to 20 carbon atoms which may be interrupted by —O—, —S—, —NH—, —CO— or —CONH—, 5 , R 6 , and R 7 each independently represent H, CH 3 , or a hydrocarbon chain having 2 to 5 carbon atoms, and m and n each independently represent the number of monomer units.
  • a method for analyzing a sugar chain comprising a step of subjecting a labeled sugar chain sample prepared by the method according to any one of [5] to [7] to mass spectrometry to detect a sugar chain Method.
  • the present invention it becomes possible to efficiently prepare a labeled sugar chain from an unpurified biological sample containing a large amount of contaminants, and efficiently detect the labeled sugar chain thus prepared by mass spectrometry. It became possible to do.
  • FIG. 1 It is a graph which shows the fluorescence peak detected by aoWR-NH2 and aoWR as a result of detecting the fluorescence intensity of aoWR-NH2 and aoWR using the HPLC apparatus.
  • FIG. 1 it is a graph which shows the peak area value of the fluorescence which aoWR-NH2 and aoWR were detected.
  • FIG. 1 It is a figure which shows the result of having detected the sugar_chain
  • the figure (upper) shows the result of detecting aoWR that was not humidified
  • the figure (middle) shows the result of detecting humidified aoWR
  • the figure (lower) shows the result of detecting aoWR-NH2 that has been humidified. It is the result.
  • the present invention provides a novel compound represented by the following formula (1).
  • R 1 and R 2 each independently represent a hydrogen atom or an alkyl group.
  • R 1 and / or R 2 is an alkyl group, ionization efficiency is increased. Therefore, when a glycan sample labeled with the compound of the present invention is subjected to the following mass spectrometry, MALDI-TOF MS It tends to be easier to analyze this.
  • the alkyl group is preferably a methyl group or an ethyl group.
  • R 1 and / or R 2 is a hydrogen atom, it can be synthesized using a commercially available reagent as it is, so that the manufacturing process can be easily shortened and the cost can be reduced. It becomes possible.
  • both R 1 and R 2 are hydrogen atoms, and a compound having the following structure named aoWR-NH2 is preferable.
  • the compound of the present invention represented by the formula (1) binds to a sugar chain, it exerts an effect of increasing the ionization efficiency of the sugar chain during mass spectrometry. Furthermore, as shown in Example 1 An extremely high fluorescence intensity can also be exhibited.
  • the fluorescence intensity of the compound of the present invention surprisingly reaches, for example, about 2.7 times that of conventional aoWR with aoWR-NH2. Therefore, the present invention also provides a labeling reagent containing the compound of the present invention as an active ingredient for enhancing ionization efficiency or imparting fluorescence properties.
  • the compound of the present invention can be used for releasing and labeling a sugar chain captured by a carrier in a method for preparing a sugar chain using a carrier having a functional group for capturing the sugar chain. Accordingly, the present invention provides a method for preparing a labeled sugar chain sample, wherein (a) a sample containing a sugar chain is contacted with a carrier having a hydrazide group or an aminooxy group as a functional group for capturing the sugar chain.
  • step of capturing the sugar chain on the carrier by reacting the aldehyde group of the sugar chain with the hydrazide group or aminooxy group of the carrier, (b) the step of washing the carrier capturing the sugar chain, And (c) bringing the compound of the present invention into contact with a carrier capturing the sugar chain to release the sugar chain from the carrier, and at the same time, binding the compound of the present invention to the sugar chain and labeling with the compound of the present invention.
  • the carrier used in the step (a) it is preferable to use polymer particles. If the polymer particles are solid particles or gel particles, sugar chains can be captured by the polymer particles and then easily collected by means such as centrifugation or filtration. It is also possible to use polymer particles packed in a column. The method of filling the column and using it is particularly important from the viewpoint of continuous operation.
  • a filter plate as a reaction vessel (for example, MultiScreen Solvinert Filter Plate manufactured by Millipore)
  • multiple samples can be processed at the same time. For example, compared with conventional purification means by column operation typified by gel filtration Thus, the throughput of sugar chain purification is greatly improved.
  • magnetic beads are used as the particles, the beads can be easily washed because the beads can be accumulated on the container wall surface or the like using magnetic force.
  • the shape of the polymer particles is not particularly limited, but a spherical shape or a similar shape is preferable.
  • the average particle size is preferably 0.05 to 1000 ⁇ m, more preferably 0.05 to 200 ⁇ m, still more preferably 0.1 to 200 ⁇ m, and most preferably 0.1 to 200 ⁇ m. 100 ⁇ m. If the average particle diameter is less than the lower limit, when the polymer particles are packed in a column and used, liquid permeability becomes poor, and it is necessary to apply a large pressure. Moreover, it becomes difficult to collect the polymer particles by centrifugation or filtration. When the average particle size exceeds the upper limit, the contact area between the polymer particles and the sample solution decreases, and the sugar chain capture efficiency decreases.
  • the carrier has a hydrazide group or an aminooxy group as a functional group for capturing a sugar chain on at least a part of the surface. These functional groups can react with the aldehyde group of the sugar chain to capture the sugar chain.
  • a crosslinked polymer (polymer substance) having a crosslinked polymer structure represented by the following formula (2) or formula (3), or coated with the polymer substance It is particularly preferred to use one as a carrier.
  • R 3 and R 4 each independently represents a hydrocarbon chain having 1 to 20 carbon atoms which may be interrupted by —O—, —S—, —NH—, —CO— or —CONH—
  • 5 , R 6 , and R 7 each independently represent H, CH 3 , or a hydrocarbon chain having 2 to 5 carbon atoms, and m and n each independently represent the number of monomer units.
  • Examples of the crosslinkable polymer include crosslinkable polymers having the following structure.
  • a hydrazide group-containing polymer particles "BlotGlyco (R)" (Sumitomo Bakelite Co., Ltd., # BS-45603) can be suitably used.
  • the pH of the reaction system when capturing sugar chains with polymer particles that capture sugar chains is preferably 2 to 9, more preferably 2 to 7, and even more preferably 2 to 6.
  • Various buffers can be used for pH adjustment.
  • the temperature at the time of sugar chain capture is preferably 4 to 90 ° C., more preferably 4 to 70 ° C., still more preferably 30 to 80 ° C., and most preferably 40 to 80 ° C.
  • the reaction time can be appropriately set.
  • the sample solution may be passed through a column filled with polymer particles.
  • substances other than sugar chains (substances adsorbed nonspecifically) among substances captured by the carrier can be removed by washing the carrier that has captured the sugar chain.
  • Methods for removing substances other than sugar chains include washing with a guanidine aqueous solution that is a chaotropic reagent capable of dissociating hydrophobic bonds, pure water and water-soluble buffers (eg, phosphate buffer, Tris buffer, etc.) ) Can be used.
  • the cleaning conditions in the cleaning step are a temperature of 4 to 40 ° C. and a cleaning time of 10 seconds to 30 minutes.
  • the carrier when the carrier is polymer particles, the carrier can be cleaned by dipping in a cleaning solution and repeating the replacement of the cleaning solution.
  • the polymer particles are put into a centrifuge tube or tube, a washing solution is added, and after shaking, the polymer particles are precipitated by centrifugation and washed by repeating the operation of removing the supernatant.
  • a washing solution is added
  • the polymer particles are precipitated by centrifugation and washed by repeating the operation of removing the supernatant.
  • it can be washed by repeating the operation of putting polymer particles in a centrifuge tube, adding a washing liquid, and allowing the polymer particles to settle naturally or by centrifugal separation and then removing the supernatant.
  • the washing operation is preferably performed 3 to 6 times. When magnetic beads are used, centrifugation is unnecessary and simple.
  • a filter tube which is a tube-like container and is equipped with a filter having a pore size that allows liquid permeation and does not allow permeation of the beads to the bottom surface portion.
  • 96-well multiwell plate has been developed as a solution dispensing device, a suction removal system, a plate transport system, and the like, and is optimal for high throughput.
  • the washing treatment may be performed continuously from the sugar chain capture reaction by passing a washing solution through the column.
  • substances other than the carrier that has captured the sugar chain may be removed by filtration or centrifugation.
  • the surplus functional group on the carrier can be capped using, for example, acetic anhydride.
  • step (c) the compound of the present invention is brought into contact with a carrier that has captured the sugar chain to release the sugar chain from the carrier, and at the same time, the compound of the present invention is bound to the sugar chain.
  • a carrier having a hydrazide group is used as a carrier for capturing a sugar chain
  • the aminooxy group present at the terminal of the compound of the present invention acts on the hydrazone bond between the carrier and the sugar chain, and hydrazide- This step is achieved by an oxime exchange reaction.
  • the aminooxy group present at the terminal of the compound of the present invention acts on the oxime bond between the carrier and the sugar chain, and the oxime -This step is achieved by an oxime exchange reaction.
  • the compound of the present invention it is possible to release the sugar chain from the carrier and label the sugar chain in one treatment.
  • the pH of the reaction solution during the exchange reaction is preferably pH 2 to 7, more preferably pH 3 to 6, and most preferably pH 3.5 to 5.5.
  • the reaction solution can be adjusted to the above pH by adding an acetic acid / acetonitrile solution.
  • the temperature during the exchange reaction is preferably 50 to 95 ° C, more preferably 60 to 90 ° C, and most preferably 70 to 90 ° C.
  • the collected labeled sugar chain solution can be analyzed as it is, or after removing the excessively contained labeled compound, by an analysis means such as mass spectrometry.
  • the present invention also provides a method for analyzing a sugar chain, comprising a step of subjecting a labeled sugar chain sample prepared by the above method to mass spectrometry to detect the sugar chain.
  • a labeled sugar chain sample prepared by the above method
  • mass spectrometry As shown in Example 2, when the sugar chain labeled with the compound of the present invention (aoWR-NH2) is subjected to mass spectrometry, the degradation product peak is not detected in the vicinity of the sugar chain peak. For this reason, it becomes possible to efficiently perform detection of sugar chains using mass spectrometry.
  • mass spectrometry method for example, MALDI-TOF MS can be preferably used.
  • the mass spectrum obtained as a result of mass spectrometry can be analyzed using analysis software or the like.
  • the peak of the sample sugar chain can be detected. Furthermore, sugar chain quantification and sugar chain structure can be analyzed from mass-to-charge ratio and peak intensity (arbitrary index such as peak height and peak area). In the analysis of sugar chains, various databases (for example, GlycoSuite etc.) can be used.
  • Example 1 For 20 mM aoWR and 20 mM aoWR-NH 2 , HPLC was performed under the following conditions using Nexera (Shimadzu Corporation) as an HPLC apparatus, and the fluorescence intensity of each was measured.
  • Nexera Shiadzu Corporation
  • the sugar chain solution 20 ⁇ L and 180 ⁇ L of 2% acetic acid / acetonitrile in a disposable column containing 5 mg of particles having a hydrazide group (BlotGlyco®), manufactured by Sumitomo Bakelite Co., Ltd., BS-45603) as a carrier for capturing sugar chains.
  • the solution was added and reacted at 80 ° C. for 1 hour. The reaction was carried out in an open system, and it was visually confirmed that the solvent was completely evaporated and the particles were dried.
  • sugar chains were cut out from the particles and labeled.
  • 20 ⁇ L of aoWR-NH 2 aqueous solution and 180 ⁇ L of 2% acetic acid / acetonitrile solution were added and reacted at 80 ° C. for 1 hour.
  • the aoWR-NH2 aqueous solution was adjusted to a 20 mM aqueous solution by adding a pure water after humidification treatment (100% humidity in powder state and left at 37 ° C. for 15 hours). The reaction was carried out in an open system, and it was visually confirmed that the solvent was completely evaporated and the particles were dried. 50 ⁇ L of 2 mM hydrochloric acid was added to the dried beads, and N-linked sugar chains were recovered.
  • Example 2 Purification was carried out in the same manner as in Example 2 except that aoWR (no humidification treatment) was used for labeling and that 50 ⁇ L of ultrapure water was added to the dried beads to recover the N-linked sugar chain.
  • aoWR no humidification treatment
  • the present invention it is possible to efficiently prepare a labeled sugar chain sample from a biological sample, and to efficiently detect the prepared labeled sugar chain sample by mass spectrometry or the like. Is possible. Therefore, the present invention can be widely used in the field of test and research related to sugar chains, and can also be applied to fields such as characteristic analysis and quality control of pharmaceuticals and foods containing sugar chains.

Abstract

　下記構造を有する化合物を見出した。 （１）（Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素原子又はアルキル基を示す。）

Description

糖鎖試料を標識するための化合物
　本発明は、糖鎖試料を標識するための新規な化合物、並びに当該化合物を利用した糖鎖試料の調製方法及び糖鎖の分析方法に関するものである。
　糖鎖、糖タンパク、糖ペプチド、ペプチド、オリゴペプチド、タンパク、核酸、脂質などといった生体高分子は、医学、細胞工学、臓器工学などのバイオテクノロジー分野において重要な役割を担っており、これら物質による生体反応の制御機構を明らかにすることはバイオテクノロジー分野の発展に繋がることになる。
　糖鎖は、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸などの単糖及びこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子の総称である。生体高分子の中でも、糖鎖は、非常に多様性に富んでおり、天然に存在する生物が有する様々な機能、例えば、細胞間情報伝達や、タンパク質の機能や相互作用の調整などに深く関わっていることが明らかになりつつある。
　糖鎖は生体内でタンパク質や脂質などに結合した複合糖質として存在することが多い。糖鎖を有する生体高分子としては、例えば、細胞の安定化に寄与する植物細胞の細胞壁のプロテオグリカン、細胞の分化、増殖、接着、移動等に影響を与える糖脂質、及び細胞間相互作用や細胞認識に関与している糖タンパク質等が挙げられる。これらの生体高分子に含まれる糖鎖が、この生体高分子と互いに機能を代行、補助、増幅、調節、あるいは阻害しあいながら高度で精密な生体反応を制御する機構が次第に明らかにされつつある。このような糖鎖と細胞の分化増殖、細胞接着、免疫、及び細胞の癌化との関係が明確にされれば、この糖鎖工学と、医学、細胞工学、あるいは臓器工学とを密接に関連させて新たな展開を図ることが期待できる。
　糖タンパク質性医薬品では、その糖鎖が生物活性発現等に重要な役割を担っている場合が多い。したがって、糖タンパク質性医薬品の品質管理のパラメーターとして、糖鎖の評価はきわめて重要である。特に抗体医薬品については、その糖鎖構造が抗体依存性細胞傷害活性（ＡＤＣＣ活性）を左右するとの報告がされており、糖鎖構造解析の重要性が高まっている。
　このため、近年、糖鎖構造を迅速、簡便、かつ精度高く解析する方法が求められるようになり、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、核磁気共鳴法、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ法）、質量分析法、レクチンアレイ法などの多種多様の方法により糖鎖解析が行われている。
　これら種々の手法を用いて糖鎖を解析するためには、あらかじめ生体試料中に含まれるタンパク質、ペプチド、脂質、核酸などと糖鎖を分離・精製することが必要である。しかしながら、これら糖鎖の精製や標識化は時間と工数がかかり、一度に多種多量の試料を調製するのは困難を要する。
　この問題を解決する技術として、糖鎖のアルデヒド基と特異的に反応する官能基（例えば、ヒドラジド基やアミノオキシ基）を持つ糖鎖捕捉物質を利用して糖鎖試料を調製する方法が報告されている（特許文献１）。この方法においては、糖鎖捕捉物質に捕捉された糖鎖を遊離し、標識した上で質量分析や高速液体クロマトグラフィーによる分析に供する。そして、特に、質量分析に供する場合には、分析対象である糖鎖のイオン化効率を高めるための標識試薬として、下記の構造を有する化合物（Ｎ－Ａｍｉｎｏｏｘｙａｃｅｔｙｌ－ｔｒｙｐｔｏｐｈｙｌ－（ａｒｇｉｎｉｎｅ　ｍｅｔｈｙｌ　ｅｓｔｅｒ）；以下、「ａｏＷＲ」と称する）が用いられている。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
　ａｏＷＲは末端にアミノオキシ基を有し、このアミノオキシ基が糖鎖捕捉物質と糖鎖との間のヒドラゾン結合又はオキシム結合に作用する。そして、ヒドラゾン－オキシム交換反応又はオキシム－オキシム交換反応により、糖鎖捕捉物質から糖鎖が遊離すると同時に、ａｏＷＲが糖鎖に結合することができる。このため効率的な糖鎖の標識が可能となるという利点を有する。
国際公開第２００８／０１８１７０号
　本発明の目的は、糖鎖捕捉物質を利用して調製した糖鎖試料を質量分析により分析するに際して、より効率的な分析を可能とする標識化合物を提供することにある。さらなる本発明の目的は、当該標識化合物を利用した糖鎖試料の調製方法及び糖鎖の分析方法を提供することにある。
　本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意検討を行った結果、下記構造を有する化合物を見出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
　式（１）中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素原子又はアルキル基を示す。この化合物は、従来のａｏＷＲのメチルエステル（－ＣＯ－ＣＨ３）基がアミド基（－ＣＯ－ＮＲ１Ｒ２）に変換された化合物であるが、その蛍光強度を測定したところ、例えば、前記アミド基が－ＣＯ－ＮＨ２である化合物（Ｎ－Ａｍｉｎｏｏｘｙａｃｅｔｙｌ－ｔｒｙｐｔｏｐｈｙｌ－（ａｒｇｉｎｉｎｅ　ａｍｉｄｅ）；以下、「ａｏＷＲ－ＮＨ２」と称する）では、ａｏＷＲと比較して約２．７倍もの顕著な蛍光強度を示した（図１、図２）。また、糖鎖捕捉物質による糖鎖試料の調製において、標識試薬として加湿処理したａｏＷＲを用いた場合には、質量分析により糖鎖を検出する際に、糖鎖のピークの近傍に標識試薬の分解産物のピークが生じたが、上記化合物のうち、例えば、ａｏＷＲ－ＮＨ２を用いた場合には、このような分解産物のピークが生じなかった（図３）。
　以上から、本発明者らは、上記式（１）で表される化合物が、イオン化効率の向上のみならず、蛍光強度や保存安定性に優れ、糖鎖捕捉物質による糖鎖試料の調製及び糖鎖試料の検出において極めて有用な化合物であることを見出し、本発明を完成するに至った。
　従って、本発明は、上記式（１）で表される新規化合物、当該化合物を有効成分とする標識試薬、並びに当該化合物を利用した糖鎖試料の調製方法及び糖鎖の分析方法に関するものであり、より詳しくは、以下の発明を提供するものである。
　［１］　下記の式（１）で表される化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素原子又はアルキル基を示す。）
　［２］　前記式（１）中のＲ１、Ｒ２が、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、又はエチル基を示す、［１］に記載の化合物。
　［３］　下記式で表される、［１］又は［２］に記載の化合物。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
　［４］　［１］～［３］のうちのいずれかに記載の化合物を有効成分とする標識試薬。
　［５］　標識された糖鎖試料の調製方法であって、
　（ａ）糖鎖を含む試料を、糖鎖を捕捉するための官能基としてヒドラジド基又はアミノオキシ基を有する担体に接触させ、当該糖鎖のアルデヒド基と当該担体のヒドラジド基又はアミノオキシ基とを反応させることにより、当該糖鎖を当該担体に捕捉する工程、
　（ｂ）糖鎖を捕捉した担体を洗浄する工程、及び
　（ｃ）糖鎖を捕捉した担体に［１］～［３］のうちのいずれかに記載の化合物を接触させて、当該担体から糖鎖を遊離させると同時に、前記化合物を糖鎖に結合させる工程、
を含む方法。
　［６］　前記担体が下記の式（２）で表される架橋型ポリマー構造を有する高分子物質により被覆されているものである、［５］に記載の方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
（Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立に、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＯＮＨ－で中断されてもよい炭素数１～２０の炭化水素鎖を示し、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は、それぞれ独立に、Ｈ、ＣＨ３、又は炭素数２～５の炭化水素鎖を示す。ｍ、ｎは、それぞれ独立に、モノマーユニット数を示す。）
　［７］　前記担体が下記の式（３）で表される架橋型ポリマー構造を有する高分子物質により被覆されているものである、［６］に記載の方法。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
（ｍ、ｎは、それぞれ独立に、モノマーユニット数を示す。）
　［８］　糖鎖の分析方法であって、［５］から［７］のいずれかに記載の方法により調製された標識された糖鎖試料を質量分析に供して糖鎖を検出する工程を含む方法。
　本発明により、夾雑物の混入の多い未精製の生体試料から標識された糖鎖を効率的に調製することが可能となるとともに、こうして調製した標識された糖鎖を質量分析により効率的に検出することが可能となった。
ＨＰＬＣ装置を用いてａｏＷＲ－ＮＨ２及びａｏＷＲの蛍光強度を検出した結果、ａｏＷＲ－ＮＨ２及びａｏＷＲの検出された蛍光のピークを示すグラフである。 図１において、ａｏＷＲ－ＮＨ２及びａｏＷＲの検出された蛍光のピーク面積値を示すグラフである。。 ａｏＷＲ－ＮＨ２又はａｏＷＲで標識された糖鎖試料を質量分析（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ）により検出した結果を示す図である。図（上）は、加湿処理しなかったａｏＷＲを検出した結果であり、図（中）は、加湿処理したａｏＷＲを検出した結果であり、図（下）は、加湿処理したａｏＷＲ－ＮＨ２を検出した結果である。
　本発明は、下記の式（１）で表される新規化合物を提供する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
　式（１）中、Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素原子又はアルキル基を示す。前記Ｒ１及び／又はＲ２がアルキル基である場合にはイオン化効率が高くなるため、本発明の化合物で標識された糖鎖試料を下記の質量分析に供した場合に、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳでの分析が更に容易になる傾向にある。前記アルキル基としては、メチル基又はエチル基が好ましい。他方、前記Ｒ１及び／又はＲ２が水素原子である場合には、一般に市販されている試薬をそのまま使用して合成することができるため製造工程の短縮化が容易となり、コストの低減を行うことが可能となる。
　本発明の化合物としては、コスト低減の観点からは、Ｒ１及びＲ２がいずれも水素原子であることが好ましく、ａｏＷＲ－ＮＨ２と名付けられた下記の構造を有する化合物が好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　前記式（１）で表される本発明の化合物は、糖鎖に結合すると、質量分析の際に、糖鎖のイオン化効率を高める作用を発揮するが、さらに、本実施例１に示すように極めて高い蛍光強度を発揮することもできる。本発明の化合物自体の蛍光強度は、驚くべきことに、例えば、ａｏＷＲ－ＮＨ２では、従来のａｏＷＲの約２．７倍にも達する。従って、本発明は、イオン化効率を高めるための、又は蛍光特性を付与するための、本発明の化合物を有効成分とする標識試薬をも提供するものである。
　本発明の化合物は、糖鎖を捕捉するための官能基を有する担体を用いた糖鎖の調製方法において、担体に捕捉された糖鎖の遊離及び標識化に用いることができる。従って、本発明は、標識された糖鎖試料の調製方法であって、（ａ）糖鎖を含む試料を、糖鎖を捕捉するための官能基としてヒドラジド基又はアミノオキシ基を有する担体に接触させ、当該糖鎖のアルデヒド基と当該担体のヒドラジド基又はアミノオキシ基とを反応させることにより、当該糖鎖を当該担体に捕捉する工程、（ｂ）糖鎖を捕捉した担体を洗浄する工程、及び（ｃ）糖鎖を捕捉した担体に本発明の化合物を接触させて、当該担体から糖鎖を遊離させると同時に、前記本発明の化合物を糖鎖に結合させて本発明の化合物で標識された糖鎖試料を得る工程、を含む方法を提供する。
　工程（ａ）に用いる「担体」としては、ポリマー粒子を用いることが好ましい。ポリマー粒子が固体粒子あるいはゲル粒子であれば、ポリマー粒子に糖鎖を捕捉させたのち、遠心分離やろ過などの手段によって容易に回収することができる。また、ポリマー粒子をカラムに充填して用いることも可能である。カラムに充填して用いる方法は、特に連続操作化の観点から重要となる。反応容器としてフィルタープレート（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ　Ｓｏｌｖｉｎｅｒｔ　Ｆｉｌｔｅｒ　Ｐｌａｔｅ）を用いることにより、複数のサンプルを同時に処理することが可能となり、例えばゲルろ過に代表されるカラム操作による従来の精製手段と比較して、糖鎖精製のスループットが大幅に向上される。また、当該粒子として磁性体ビーズを用いれば、磁力を使って容器壁面等にビーズを集積できるため、ビーズの洗浄を容易に行うことができる。
　ポリマー粒子の形状は特に限定しないが、球状又はそれに類する形状が好ましい。ポリマー粒子が球状の場合、平均粒径は好ましくは０．０５～１０００μｍであり、より好ましくは０．０５～２００μｍであり、さらに好ましくは０．１～２００μｍであり、最も好ましくは０．１～１００μｍである。平均粒径が下限値未満では、ポリマー粒子をカラムに充填して用いる際、通液性が悪くなるために大きな圧力を加える必要がある。また、ポリマー粒子を遠心分離やろ過で回収することも困難となる。平均粒径が上限値を超えると、ポリマー粒子と試料溶液の接触面積が少なくなり、糖鎖捕捉の効率が低下する。
　担体は、少なくとも表面の一部に糖鎖を捕捉するための官能基として、ヒドラジド基又はアミノオキシ基を有している。これら官能基は、糖鎖のアルデヒド基と反応して、糖鎖を捕捉することができる。
　糖鎖を捕捉するための担体としては、下記式（２）又は式（３）で表される架橋型ポリマー構造を有する架橋型ポリマー（高分子物質）、或いは、前記高分子物質により被覆されたものを担体として用いることが特に好ましい。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
（Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立に、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＯＮＨ－で中断されてもよい炭素数１～２０の炭化水素鎖を示し、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は、それぞれ独立に、Ｈ、ＣＨ３、又は炭素数２～５の炭化水素鎖を示す。ｍ、ｎは、それぞれ独立に、モノマーユニット数を示す。）
　架橋型ポリマーとして、例えば、下記の構造を有する架橋型ポリマーを挙げることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
（ｍ、ｎは、それぞれ独立に、モノマーユニット数を示す。）
　本発明においては、ヒドラジド基含有ポリマー粒子である「ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（Ｒ）」（住友ベークライト株式会社製、＃ＢＳ－４５６０３）を好適に用いることができる。
　糖鎖を捕捉するポリマー粒子によって糖鎖を捕捉する際の反応系のｐＨは、好ましくは２～９、より好ましくは２～７であり、さらに好ましくは２～６である。ｐＨ調整のためには、各種緩衝液を用いることができる。糖鎖捕捉時の温度は、好ましくは４～９０℃、より好ましくは４～７０℃、さらに好ましくは３０～８０℃であり、最も好ましくは４０～８０℃である。反応時間は適宜設定することができる。ポリマー粒子をカラムに充填して試料溶液を通過させてもよい。
　工程（ｂ）における、糖鎖を捕捉した担体の洗浄により、担体に捕捉された物質のうち糖鎖以外の物質（非特異的に吸着した物質）を除去することができる。
　糖鎖以外の物質を除去する方法としては、疎水結合を解離する能力のあるカオトロピック試薬であるグアニジン水溶液で洗浄する方法や、純水や水溶性緩衝液（例えばリン酸緩衝液、トリス緩衝液等）で洗浄する方法を用いることができる。洗浄工程における洗浄条件としては、温度が４～４０℃、洗浄時間が１０秒～３０分である。洗浄方法としては、担体がポリマー粒子の場合は、洗浄液に浸漬し、洗浄液の交換を繰り返すことで洗浄することができる。
　具体的には、遠沈管やチューブにポリマー粒子を入れ、洗浄液を加え、振とうの後、遠心操作によりポリマー粒子を沈殿させて、上清を除去する操作を繰り返すことにより洗浄する。例えば、遠心チューブ内にポリマー粒子を入れ、洗浄液を加え、ポリマー粒子を自然沈降、又は、遠心分離により強制的に沈降させた後、上清を除去する操作を繰り返すことで洗浄することができる。前記洗浄操作は３～６回行うことが好ましい。磁性ビーズを用いる場合には、遠心操作は不要であり、簡便である。
　また、チューブ状の容器であって、底面部に、液体透過可能で該ビーズが不透過な孔径を有するフィルターを装着するフィルターチューブを用いることも可能である。該フィルターチューブにポリマー粒子を入れて使用することで、洗浄に要した洗浄液を、フィルターを介して除去することが可能となり、前記の遠心操作後の上清除去の工程が必要なくなり、作業性の向上を図ることができる。
　また、６～３８４穴のマルチウェルプレートの底部が前記フィルターを装着したものが各種市販されており、これらのプレートを用いることでハイスループット化することが可能である。特に９６穴マルチウェルプレートは、溶液分注機器、吸引除去システム、及びプレートの搬送システム等が開発されており、ハイスループット化に最適である。
　連続式にて糖鎖捕捉反応を行った場合には、洗浄処理は、カラムに洗浄溶液を通して糖鎖捕捉反応から連続的に処理してもよい。また、マルチプレートを用いた場合には、ろ過操作あるいは遠心操作により糖鎖を捕捉した担体以外の物質を除去してもよい。
　なお、担体上の余剰官能基は、例えば、無水酢酸などを利用してキャッピングすることができる。
　工程（ｃ）では、糖鎖を捕捉した担体に本発明の化合物を接触させて、当該担体から糖鎖を遊離させると同時に、本発明の化合物を糖鎖に結合させる。糖鎖を捕捉するための担体としてヒドラジド基を有する担体を用いた場合には、本発明の化合物の末端に存在するアミノオキシ基が、担体と糖鎖の間のヒドラゾン結合に作用し、ヒドラジド－オキシム交換反応により、本工程が達成される。糖鎖を捕捉するための担体としてアミノオキシ基を有する担体を用いた場合には、本発明の化合物の末端に存在するアミノオキシ基が、担体と糖鎖の間のオキシム結合に作用し、オキシム－オキシム交換反応により、本工程が達成される。このように本発明の化合物によれば、一つの処理で、担体からの糖鎖の遊離と糖鎖の標識を行うことが可能となる。
　交換反応時の反応液のｐＨは、ｐＨ２～７が好ましく、ｐＨ３～６がより好ましく、ｐＨ３．５～５．５が最も好ましい。酢酸／アセトニトリル溶液を加えることにより、反応液を上記のｐＨに調整することができる。交換反応時の温度は、５０～９５℃が好ましく、６０～９０℃がより好ましく、７０～９０℃が最も好ましい。交換反応時、反応容器を開放して加熱操作を行うことにより、溶媒を蒸発させながら反応を進め、最終的に乾固させることにより、効率よく交換反応を行うことができる。
　回収した標識された糖鎖溶液はそのまま、あるいは、過剰に含まれる標識化合物を除去したのち、質量分析法などの分析手段によって分析することができる。
　また、本発明は、糖鎖の分析方法であって、上記方法により調製された標識された糖鎖試料を質量分析に供して糖鎖を検出する工程を含む方法を提供する。実施例２に示すように、本発明の化合物（ａｏＷＲ－ＮＨ２）で標識された糖鎖は、質量分析に供した場合に、その分解産物のピークが糖鎖のピークの近傍に検出されない。このため質量分析を利用した糖鎖の検出を効率的に実施することが可能となる。質量分析の手法としては、例えば、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳを好適に利用することができる。質量分析の結果得られたマススペクトルは、解析ソフト等を用いて解析することができる。質量電荷比（ｍ／ｚ値）を読み取ることにより、試料糖鎖のピークを検出することができる。さらに、質量電荷比やピーク強度（ピーク高さ、ピーク面積など任意の指標）から、糖鎖の定量や糖鎖の構造を分析することができる。糖鎖の分析においては、各種データベース（例えば、ＧｌｙｃｏＳｕｉｔｅなど）を利用することができる。
　以下、合成例、実施例、及び比較例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、本発明は、以下の合成例や実施例に限定されるものではない。
［合成例１］　ａｏＷＲ－ＮＨ２の合成
　合成スキームを以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　Ｂｏｃ－Ｔｒｐ－ＯＨ（メルク：８５３０３８、４．６６ｇ）にＴＨＦ（４０ｍＬ）を添加し、溶液を－５０℃に冷却した。前記溶液に４－メチルモルホリン（１．８６ｇ）とクロロギ酸イソブチル（２．５１ｇ）を添加し、－４０℃で１０分間、その後０℃に昇温しながら３０分間攪拌することで、混合酸無水物（Ａ）を調製した。次に、Ｈ－Ａｒｇ－ＮＨ２・２ＨＣｌ（渡辺化学工業：Ｋ００１２５、４．５３ｇ）にメタノール（４０ｍＬ）を添加して５℃に冷却し、トリエチルアミン（１．８６ｇ）を添加して調製した溶液を（Ａ）に添加した。０℃で１０分間、その後室温に昇温しながら９０分間攪拌し、反応溶液を減圧濃縮することで、化合物１（１５．９６ｇ）を得た。
　化合物１（１５．９６ｇ）にメタノール（２６ｍＬ）を添加して０℃に冷却し、続いて４Ｍ　ＨＣｌ／ジオキサン溶液（２６ｍＬ）を添加した。０℃にて３０分間、その後室温に昇温しながら３時間撹拌し、反応溶液を減圧濃縮することで、化合物２（１３．８２ｇ）を得た。
　Ｂｏｃ－ａｍｉｎｏ－ｏｘｙａｃｅｔｉｃ　ａｃｉｄ（メルク：８５１０１７、２．４５ｇ）にＴＨＦ（４０ｍＬ）を添加し、溶液を－４０℃に冷却した。前記溶液に４－メチルモルホリン（１．５５ｇ）とクロロギ酸イソブチル（２．０９ｇ）を添加し、－３０℃で１５分間、その後０℃に昇温しながら３５分間攪拌することで、混合酸無水物（Ｂ）を調製した。次に、化合物２（１３．８２ｇ）に蒸留水（２０ｍＬ）を添加して５℃に冷却し、炭酸水素ナトリウム（１．２９ｇ）を添加して調製した溶液を（Ｂ）に添加した。５℃で１時間、その後室温に昇温しながら６時間攪拌し、反応溶液を減圧濃縮した。続いてＯＤＳ中圧クロマトグラフィーにより精製することで、化合物３（４．８２ｇ）を得た。
　化合物３（４．８２ｇ）にメタノール（１４．５ｍＬ）を添加して０℃に冷却し、続いて４Ｍ　ＨＣｌ／ジオキサン溶液（１４．５ｍＬ）を添加した。室温に昇温しながら２時間撹拌し、反応溶液を減圧濃縮した。得られた残留物３．９６ｇのうち３．２ｇをＯＤＳ中圧クロマトグラフィーにより精製することで、化合物４（ａｏＷＲ－ＮＨ２、１．２９ｇ）を得た。
　［実施例１］
　２０ｍＭ　ａｏＷＲ及び２０ｍＭ　ａｏＷＲ－ＮＨ２について、ＨＰＬＣ装置としてＮｅｘｅｒａ（島津製作所）を用いて、以下の条件によりＨＰＬＣを実施し、それぞれの蛍光強度を測定した。
　＜ＨＰＬＣ条件＞
カラム：ＡＣＱＵＩＴＹ　ＵＰＬＣ　ＢＥＨ　Ｇｌｙｃａｎ　１．７μｍ　２．１ｘ１５０ｍｍ
溶媒Ａ：５０ｍＭ　ギ酸／アンモニア水溶液（ｐＨ４．４）
溶媒Ｂ：アセトニトリル
勾配：Ａ液　２５％（０分）→Ａ液　４２％（３８．５分）
カラム温度：６０℃→流速：０．５ｍＬ／分
Ｅｘ：２８０ｎｍ　Ｅｍ：３５０ｎｍ  インジェクト量：１μＬ
　その結果、ａｏＷＲ－ＮＨ２は、ａｏＷＲと比較して、約２．７倍もの蛍光強度を示した（図１、図２）。
　［実施例２］
　（糖タンパク質からのＮ－結合型糖鎖の遊離）
　ヒト血清由来ＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ、Ｉ４５０６）４０ｍｇに、超純水２ｍＬ、１Ｍ重炭酸アンモニウム（和光純薬、０１７－０２８７５）水溶液及び１２０ｍＭ　ＤＴＴ（ジチオスレイトール、ＳＩＧＭＡ、Ｄ９７７９）水溶液を２００μＬずつ添加し、６０℃で３０分間反応させた。反応後、１２３ｍＭ　ＩＡＡ（ヨードアセトアミド、和光純薬、０９３－０２１５２）水溶液４００μＬを加えて遮光下、室温で１時間反応させた。続いて１６０００Ｕのトリプシン（ＳＩＧＭＡ、Ｔ０３０３）を４００μＬの１ｍＭ塩酸に溶解した溶液を全量添加し、３７℃で１．５時間反応させてタンパク質部分をペプチド断片化した。溶液を９０℃で１０分間加熱してトリプシンを失活させた後に、８０Ｕのペプチド－Ｎ－グリコシダーゼＦ（Ｒｏｃｈｅ、１－３６５－１９３）による処理を行って糖鎖をペプチドから遊離させ、糖鎖溶液を得た。
　（Ｎ－結合型糖鎖の標識及び精製）
　糖鎖捕捉用の担体であるヒドラジド基を有する粒子５ｍｇ（ＢｌｏｔＧｌｙｃｏ（Ｒ））、住友ベークライト株式会社製、ＢＳ－４５６０３）が入ったディスポカラムに上記糖鎖溶液２０μＬ及び１８０μＬの２％酢酸／アセトニトリル溶液を加え、８０℃で１時間反応させた。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発し粒子が乾固した状態であることを目視で確認した。
　Ｎ－結合型糖鎖が結合した粒子を２Ｍグアニジン水溶液、水、及び１％トリエチルアミン／メタノール溶液にて洗浄後、１０％無水酢酸／メタノール溶液を添加し、室温で３０分間反応させ、未反応のヒドラジド基をキャッピングした。キャッピング後、１０ｍＭ塩酸、メタノール、及びジメチルスルホキシドにてビーズを洗浄した。
　続いて、シアル酸残基のカルボン酸のメチルエステル化を行った。５００ｍＭの１－メチル－３－ｐ－トリルトリアゼン（ＭＴＴ）（東京化成、Ｍ０６４１）／ジメチルスルホキシド溶液を１００μＬ加え、６０℃で１時間反応させた。反応後、メタノール及び水で洗浄した。
　最後に、粒子から糖鎖の切り出し及び標識反応を行った。ａｏＷＲ－ＮＨ２水溶液２０μＬ及び２％酢酸／アセトニトリル溶液１８０μＬを加え、８０℃で１時間反応させた。ａｏＷＲ－ＮＨ２水溶液は、加湿処理（粉末状態で湿度１００％、３７℃で１５時間放置）後、超純水を添加し、２０ｍＭの水溶液に調整した。反応は開放系で行い、溶媒が完全に蒸発し粒子が乾固した状態であることを目視で確認した。乾燥したビーズに２ｍＭ塩酸を５０μＬ加え、Ｎ－結合型糖鎖を回収した。
　（余剰標識試薬の除去）
　回収した糖鎖溶液をアセトニトリルで１０倍に希釈した後に、シリカカラム（ＢｌｏｔＧｌｙｃｏキット付属品）に添加してシリカゲルに標識糖鎖を吸着させた。アセトニトリルにてカラムを洗浄後、超純水５０μＬにて標識糖鎖を回収した。
［比較例１］
　標識にａｏＷＲを使用したこと、及び、乾燥したビーズに超純水を５０μＬ加え、Ｎ－結合型糖鎖を回収したこと以外は、実施例２と同様に精製を行った。
［比較例２］
　標識にａｏＷＲ（加湿処理なし）を使用したこと、及び、乾燥したビーズに超純水を５０μＬ加え、Ｎ－結合型糖鎖を回収したこと以外は、実施例２と同様に精製を行った。
　（標識糖鎖の分析）
　回収した標識糖鎖溶液をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ　ＭＳ（Ａｕｔｏｆｌｅｘ　ＩＩＩ　ｓｍａｒｔｂｅａｍ、　Ｂｒｕｋｅｒ　Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ社製）によりリフレクターモード、ポジティブイオンモードにて分析した。マトリックスには２，５－ジヒドロキシ安息香酸（Ｂｒｕｋｅｒ、２０１３４６）を用いた。
　図３に示した結果から明らかなように、ａｏＷＲでは加湿すると本来の質量電荷比よりも約１４小さい、メチルエステル基の加水分解が原因と思われる夾雑ピークが生じたが、前記官能基をアミド基に置換したａｏＷＲ－ＮＨ２では、夾雑ピークは生じなかった。
　本発明によれば、生物学的試料から効率的に標識された糖鎖試料を調製することが可能となるとともに、調製された標識された糖鎖試料を質量分析などにより効率的に検出することが可能となる。従って、本発明は、糖鎖に関する試験研究の分野において広く利用可能であり、また、例えば、糖鎖を含む医薬品や食品の特性分析や品質管理などの分野にも応用可能である。

Claims (8)

  1. 　下記の式（１）で表される化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     （Ｒ１、Ｒ２は、それぞれ独立に、水素原子又はアルキル基を示す。）
  2. 　前記式（１）中のＲ１、Ｒ２が、それぞれ独立に、水素原子、メチル基、又はエチル基を示す、請求項１に記載の化合物。
  3. 　下記式で表される、請求項１又は２に記載の化合物。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
  4. 　請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の化合物を有効成分とする標識試薬。
  5. 　標識された糖鎖試料の調製方法であって、
    　（ａ）糖鎖を含む試料を、糖鎖を捕捉するための官能基としてヒドラジド基又はアミノオキシ基を有する担体に接触させ、当該糖鎖のアルデヒド基と当該担体のヒドラジド基又はアミノオキシ基とを反応させることにより、当該糖鎖を当該担体に捕捉する工程、
    　（ｂ）糖鎖を捕捉した担体を洗浄する工程、及び
    　（ｃ）糖鎖を捕捉した担体に請求項１～３のうちのいずれか一項に記載の化合物を接触させて、当該担体から糖鎖を遊離させると同時に、前記化合物を糖鎖に結合させる工程、
    を含む方法。
  6. 　前記担体が下記の式（２）で表される架橋型ポリマー構造を有する高分子物質により被覆されているものである、請求項５に記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     （Ｒ３、Ｒ４は、それぞれ独立に、－Ｏ－、－Ｓ－、－ＮＨ－、－ＣＯ－、－ＣＯＮＨ－で中断されてもよい炭素数１～２０の炭化水素鎖を示し、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７は、それぞれ独立に、Ｈ、ＣＨ３、又は炭素数２～５の炭化水素鎖を示す。ｍ、ｎは、それぞれ独立に、モノマーユニット数を示す。）
  7. 　前記担体が下記の式（３）で表される架橋型ポリマー構造を有する高分子物質により被覆されているものである、請求項６に記載の方法。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     （ｍ、ｎは、それぞれ独立に、モノマーユニット数を示す。）
  8. 　糖鎖の分析方法であって、請求項５から７のいずれかに記載の方法により調製された標識された糖鎖試料を質量分析に供して糖鎖を検出する工程を含む方法。
PCT/JP2014/069804 2013-08-16 2014-07-28 糖鎖試料を標識するための化合物 WO2015022854A1 (ja)

Priority Applications (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP14836674.3A EP3034495A4 (en) 2013-08-16 2014-07-28 CONNECTION TO MARKING A SUGAR CHAIN SAMPLE
US14/906,741 US20160168196A1 (en) 2013-08-16 2014-07-28 Compound for labeling sugar chain sample
CN201480045454.9A CN105473553A (zh) 2013-08-16 2014-07-28 用于标记糖链试样的化合物
JP2014550970A JP5682850B1 (ja) 2013-08-16 2014-07-28 糖鎖試料を標識するための化合物
PCT/JP2015/050927 WO2016017192A1 (ja) 2014-07-28 2015-01-15 ラベル化剤、ラベル化された糖鎖試料の調製方法、糖鎖の分析方法及び化合物の分解抑制方法

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013-169090 2013-08-16
JP2013169090 2013-08-16

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2015022854A1 true WO2015022854A1 (ja) 2015-02-19

Family

ID=52468241

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/JP2014/069804 WO2015022854A1 (ja) 2013-08-16 2014-07-28 糖鎖試料を標識するための化合物

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20160168196A1 (ja)
EP (1) EP3034495A4 (ja)
JP (1) JP5682850B1 (ja)
CN (1) CN105473553A (ja)
WO (1) WO2015022854A1 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016017192A1 (ja) * 2014-07-28 2016-02-04 住友ベークライト株式会社 ラベル化剤、ラベル化された糖鎖試料の調製方法、糖鎖の分析方法及び化合物の分解抑制方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005291958A (ja) * 2004-03-31 2005-10-20 Shionogi & Co Ltd 糖鎖標識試薬
WO2007108204A1 (ja) * 2006-03-16 2007-09-27 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. 分析試料調製方法および分析試料ならびに糖鎖捕捉物質
WO2008018170A1 (fr) 2006-08-09 2008-02-14 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Substance capable de capturer les chaînes glucidiques et procédé l'utilisant

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4783292B2 (ja) * 2004-09-14 2011-09-28 住友ベークライト株式会社 分析試料調製方法および分析試料ならびに分析試料調製用化合物
JP5076878B2 (ja) * 2007-12-25 2012-11-21 住友ベークライト株式会社 糖タンパク質糖鎖の分析方法
WO2009150834A1 (ja) * 2008-06-12 2009-12-17 住友ベークライト株式会社 糖鎖試料調製方法、糖鎖試料および糖鎖分析法
JP6048036B2 (ja) * 2011-09-29 2016-12-21 住友ベークライト株式会社 糖鎖の精製方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005291958A (ja) * 2004-03-31 2005-10-20 Shionogi & Co Ltd 糖鎖標識試薬
WO2007108204A1 (ja) * 2006-03-16 2007-09-27 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. 分析試料調製方法および分析試料ならびに糖鎖捕捉物質
WO2008018170A1 (fr) 2006-08-09 2008-02-14 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Substance capable de capturer les chaînes glucidiques et procédé l'utilisant

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
See also references of EP3034495A4

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016017192A1 (ja) * 2014-07-28 2016-02-04 住友ベークライト株式会社 ラベル化剤、ラベル化された糖鎖試料の調製方法、糖鎖の分析方法及び化合物の分解抑制方法

Also Published As

Publication number Publication date
US20160168196A1 (en) 2016-06-16
EP3034495A1 (en) 2016-06-22
CN105473553A (zh) 2016-04-06
JPWO2015022854A1 (ja) 2017-03-02
JP5682850B1 (ja) 2015-03-11
EP3034495A4 (en) 2016-06-22

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP5500067B2 (ja) 糖鎖標識方法
JP5872768B2 (ja) 糖鎖試料調製方法
JP5026070B2 (ja) ポリマー粒子
WO2012124609A1 (ja) 糖鎖蛍光標識方法
JP5076878B2 (ja) 糖タンパク質糖鎖の分析方法
JP5125637B2 (ja) 糖鎖試料調製方法
JP2009142238A (ja) 細胞表面糖鎖の遊離方法及び検出方法
JP5682850B1 (ja) 糖鎖試料を標識するための化合物
JPWO2015033743A1 (ja) 標識糖鎖試料の調製方法
US20130123470A1 (en) Method for preparing sugar chains from antibodies
JP6048036B2 (ja) 糖鎖の精製方法
WO2016017192A1 (ja) ラベル化剤、ラベル化された糖鎖試料の調製方法、糖鎖の分析方法及び化合物の分解抑制方法
JP5983347B2 (ja) 糖鎖精製方法
WO2015146514A1 (ja) 標識された糖鎖試料の調製において糖鎖からのシアル酸の脱離を抑制する方法
JP2012189439A (ja) 糖鎖試料の製造方法
WO2015108020A1 (ja) 組成物、糖鎖試料の調製方法及び糖鎖の分析方法
JP2022026938A (ja) 糖鎖を標識する方法及びキット
JP2022122455A (ja) 糖鎖を標識する方法及びキット
JP6064541B2 (ja) 糖鎖精製方法
JP6214999B2 (ja) 電気化学的検出のための糖鎖試料の調製方法
JP2013076649A (ja) 単糖分析用試料の製造方法
JP2015040817A (ja) 糖タンパク質試料の調製方法
WO2020122072A1 (ja) 糖タンパク質から糖鎖を調製する方法、キット、及び、装置
JP2017025177A (ja) 組成物、組成物の製造方法、糖鎖試料の調製方法及び糖鎖の分析方法
JP2017067677A (ja) 標識糖の精製物を調製する方法

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201480045454.9

Country of ref document: CN

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2014550970

Country of ref document: JP

Kind code of ref document: A

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 14836674

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 14906741

Country of ref document: US

REEP Request for entry into the european phase

Ref document number: 2014836674

Country of ref document: EP

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2014836674

Country of ref document: EP

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE