CN105473553A - 用于标记糖链试样的化合物 - Google Patents

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Abstract

本发明发现了具有下述结构的化合物。(R1、R2分别独立地表示氢原子或烷基)。

Description

用于标记糖链试样的化合物
技术领域
本发明涉及用于标记糖链试样的新型的化合物、以及利用了该化合物的糖链试样的制备方法和糖链的分析方法。
背景技术
糖链、糖蛋白、糖肽、肽、寡肽、蛋白、核酸、脂质等的生物体高分子在医学、细胞工程、组织工程等生物技术领域中发挥着重要的作用，了解通过这些物质的生物体反应的控制机理关系到生物技术领域的发展。
糖链是葡萄糖、半乳糖、甘露糖、海藻糖、木糖、N－乙酰葡糖胺、N－乙酰半乳糖胺、涎酸等单糖以及它们的衍生物通过糖苷键以链状结合得到的分子的总称。生物体高分子中，糖链非常富有多样性，不断得知其与天然存在的生物具有的各种功能、例如细胞间信息传递、蛋白质的功能和相互作用的调节等密切相关。
糖链在生物体内多作为与蛋白质、脂质等结合的复合糖质存在。作为具有糖链的生物体高分子，可以列举例如参与细胞的稳定化的植物细胞的细胞壁的蛋白多糖、影响细胞的分化、增殖、粘着、移动等的糖脂质、以及参与细胞间相互作用或细胞识别的糖蛋白质等。这些生物体高分子所含的糖链一边与该生物体高分子互相对功能进行代行、辅助、扩增、调节或者抑制，一边控制高度精密的生物体反应的机理逐渐解明。如果明确了这样的糖链与细胞的分化增殖、细胞粘着、免疫和细胞的癌化的关系，就能够期待使该糖链工程与医学、细胞工程或者组织工程密切联系实现新的发展。
在糖蛋白质性医药品中，该糖链多在生物活性表达等中发挥重要的作用。因此，作为糖蛋白质性医药品的品质管理的参数，糖链的评价极为重要。特别是关于抗体医药品，有其糖链结构左右抗体依赖性细胞毒性(ADCC活性)的报告，糖链结构解析的重要性提高。
因此，近年来，需求迅速、简便且高精度地解析糖链结构的方法，通过高效液相色谱(HPLC)、核磁共振法、毛细管电泳法(CE法)、质谱法、凝集素阵列法等多种多样的方法进行糖链解析。
为了使用这些各种方法来解析糖链，需要预先将生物体试样中所含的蛋白质、肽、脂质、核酸等与糖链分离、精制。然而，这些糖链的精制和标记化耗费时间和工时，一次性制备多种大量的试样存在困难。
作为解决该问题的技术，报告了利用具有与糖链的醛基特异性反应的官能团(例如、酰肼基、氨氧基)的糖链捕捉物质制备糖链试样的方法(专利文献1)。在该方法中，将被糖链捕捉物质捕捉的糖链游离，进行标记，然后供于通过质谱或高效液相色谱的分析。而且，特别是供于质谱分析的情况下，作为用于提高作为分析对象的糖链的离子化效率的标记试剂，使用具有下述结构的化合物(N－氨氧基乙酰基－色氨酰－(精氨酸甲酯)，N－Aminooxyacetyl－tryptophyl－(argininemethylester)；以下，称为“aoWR”)。
aoWR在末端具有氨氧基，该氨氧基作用于糖链捕捉物质与糖链之间的腙键或肟键。而且，通过腙－肟交换反应或肟－肟交换反应，糖链从糖链捕捉物质游离的同时，aoWR能够与糖链结合。因此，具有能够有效地标记糖链的优点。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：国际公开第2008/018170号
发明内容
发明所要解决的课题
本发明的目的在于提供通过质谱分析利用糖链捕捉物质制备的糖链试样时，能够更有效地进行分析的标记化合物。本发明的另一个目的在于提供利用了该标记化合物的糖链试样的制备方法及糖链的分析方法。
用于解决课题的方法
本发明的发明者们为了解决上述课题，进行了潜心研究，其结果发现了具有下述结构的化合物。
式(1)中，R1、R2分别独立地表示氢原子或烷基。该化合物为将以往的aoWR的甲酯(－CO－CH3)基转化为酰胺基(－CO－NR1R2)后的化合物，但测定其荧光强度时，例如，上述酰胺基为－CO－NH2的化合物N－氨氧基乙酰基－色氨酰－(精氨酰胺)((N－Aminooxyacetyl－tryptophyl－(arginineamide)；以下称为“aoWR－NH2”)的情况下，与aoWR相比较竟显示约2.7倍的显著的荧光强度(图1、图2)。另外，在利用糖链捕捉物质的糖链试样的制备中，在作为标记试剂使用加湿处理后的aoWR的情况下，通过质谱分析检测糖链时，在糖链的峰的附近产生标记试剂的分解产物的峰，但上述化合物中，例如在使用aoWR－NH2的情况下，不产生这样的分解产物的峰(图3)。
由以上可知，本发明的发明者们发现上述式(1)所示的化合物不仅提高离子化效率，而且荧光强度和保存稳定性优异，在利用糖链捕捉物质的糖链试样的制备及糖链试样的检测中是极为有用的化合物，从而完成了本发明。
因此，本发明涉及上述式(1)所示的新型化合物、以该化合物为有效成分的标记试剂、以及利用了该化合物的糖链试样的制备方法和糖链的分析方法，更详细而言，提供以下的发明。
[1]下述的式(1)所示的化合物。
(R1、R2分别独立地表示氢原子或烷基。)
[2]如[1]所述的化合物，其中，上述式(1)中的R1、R2分别独立地表示氢原子、甲基或乙基。
[3]如[1]或[2]所述的化合物，其由下述式所示。
[4]以[1]～[3]中任一项所述的化合物为有效成分的标记试剂。
[5]一种标记后糖链试样的制备方法，其包括：
(a)使包含糖链的试样与具有酰肼基或氨氧基作为用于捕捉糖链的官能团的载体接触，使该糖链的醛基与该载体的酰肼基或氨氧基反应，由此将该糖链捕捉到该载体的工序；
(b)对捕捉了糖链的载体进行清洗的工序；和
(c)使[1]～[3]中任一项所述的化合物与捕捉了糖链的载体接触，使糖链从该载体游离，同时使上述化合物与糖链结合的工序。
[6]如[5]所述的方法，其中，所述载体被具有下述式(2)所示的交联型聚合物结构的高分子物质包覆。
(R3、R4分别独立地表示可以被－O－、－S－、－NH－、－CO－、－CONH－中断的碳原子数1～20的烃链，R5、R6、R7分别独立地表示H、CH3或碳原子数2～5的烃链。m、n分别独立地表示单体单元数。)
[7]如[6]所述的方法，其中，上述载体被具有下述式(3)所示的交联型聚合物结构的高分子物质包覆。
(m、n分别独立地表示单体单元数。)
[8]一种糖链的分析方法，其包括：将由[5]～[7]中任一项所述的方法所制备的标记后糖链试样供于质谱分析，检测糖链的工序。发明的效果
根据本发明，能够从混入大量夹杂物的未精制的生物体试样中有效地制备标记后糖链，并且能够通过质谱分析有效地检测这样制备的标记后糖链。
附图说明
图1是表示利用HPLC装置检测aoWR－NH2和aoWR的荧光强度的结果、aoWR－NH2和aoWR的被检测到的荧光的峰的图谱。
图2是表示图1中，aoWR－NH2和aoWR的被检测到的荧光的峰面积值的图表。
图3是表示通过质谱(MALDI－TOFMS)检测由aoWR－NH2或aoWR标记后糖链试样的结果的图。图(上)是检测没有进行加湿处理的aoWR的结果，图(中)是检测进行了加湿处理的aoWR的结果，图(下)检测进行了加湿处理的aoWR－NH2的结果。
具体实施方式
本发明提供下述的式(1)所示的新型化合物。
式(1)中，R1、R2分别独立地表示氢原子或烷基。上述R1和/或R2为烷基时，离子化效率提高，因此，将由本发明的化合物标记后糖链试样供于下述的质谱分析时，存在由MALDI－TOFMS的分析更容易的倾向。作为上述烷基，优选甲基或乙基。另一方面，在上述R1和/或R2为氢原子时，能够直接使用通常市场销售的试剂进行合成，因此制造工序的短缩化变得容易，能够进行成本的降低。
作为本发明的化合物，从降低成本的观点考虑，R1和R2优选均为氢原子，优选被称为aoWR－NH2的具有下述结构的化合物。
上述式(1)所示的本发明的化合物如果与糖链结合，则在进行质谱分析时，发挥提高糖链的离子化效率的作用，进而如本实施例1所示也能够发挥极高的荧光强度。令人惊讶的是本发明的化合物本身的荧光强度例如在aoWR－NH2时，竟然达到以往的aoWR的约2.7倍。因此，本发明提供用于提高离子化效率的或用于赋予荧光特性的以本发明的化合物为有效成分的标记试剂。
本发明的化合物在使用了具有用于捕捉糖链的官能团的载体的糖链的制备方法中，能够用于被载体捕捉的糖链的游离和标记化。因此，本发明提供一种标记后糖链试样的制备方法，其包括：(a)使包含糖链的试样与具有酰肼基或氨氧基作为用于捕捉糖链的官能团的载体接触，使该糖链的醛基与该载体的酰肼基或氨氧基反应，由此将该糖链捕捉到该载体的工序；(b)对捕捉了糖链的载体进行清洗的工序；和(c)使本发明的化合物与捕捉了糖链的载体接触，在使糖链从该载体游离的同时，使上述本发明的化合物与糖链结合，得到被本发明的化合物标记后糖链试样的工序。
作为工序(a)中使用的“载体”，优选使用聚合物颗粒。聚合物颗粒只要为固体颗粒或者凝胶颗粒，则在使糖链捕捉于聚合物颗粒之后，能够利用离心分离或过滤等手段容易地回收。另外，也能够将聚合物颗粒填充于柱中使用。填充于柱中使用的方法特别是从连续操作化的观点考虑很重要。通过使用滤板(例如、Millipore公司制的MultiScreenSolvinertFilterPlate)作为反应容器，能够同时处理多个样品，例如与以凝胶过滤为代表的通过柱操作的以往的精制手段相比较，糖链精制的产量被大幅提高。另外，如果作为该颗粒使用磁性体珠，则能够利用磁力将珠子聚集在容器壁面等，因此能够容易地进行珠子的清洗。
聚合物颗粒的形状没有特别限定，优选球状或与其类似的形状。聚合物颗粒为球状时，平均粒径优选为0.05～1000μm，更优选为0.05～200μm，更加优选为0.1～200μm，最优选为0.1～100μm。平均粒径低于下限值时，将聚合物颗粒填充于柱时，通液性变差，因此需要施加大的压力。另外，通过离心分离或过滤回收聚合物颗粒也变得困难。如果平均粒径超过上限值，则聚合物颗粒与试样溶液的接触面积变少，糖链捕捉的效率降低。
在载体的至少一部分表面上具有酰肼基或氨氧基作为用于捕捉糖链的官能团。这些官能团能够与糖链的醛基反应来捕捉糖链。
作为用于捕捉糖链的载体，特别优选使用由具有下述式(2)或式(3)所示的交联型聚合物结构的交联型聚合物(高分子物质)或者上述高分子物质包覆后的载体作为载体。
(R3、R4分别独立地表示可以被－O－、－S－、－NH－、－CO－、－CONH－中断的碳原子数1～20的烃链，R5、R6、R7分别独立地表示H、CH3或碳原子数2～5的烃链。m、n分别独立地表示单体单元数。)
作为交联型聚合物，例如能够列举具有下述结构的交联型聚合物。
(m、n分别独立地表示单体单元数。)
本发明中，能够适合使用作为含酰肼基聚合物颗粒的“BlotGlyco(R)”(住友电木株式会社制、#BS－45603)。
利用捕捉糖链的聚合物颗粒捕捉糖链时的反应体系的pH优选为2～9，更优选为2～7，更加优选为2～6。为了pH，可以使用各种缓冲液。捕捉糖链时的温度优选为4～90℃，更优选为4～70℃，更加优选为30～80℃，最优选为40～80℃。反应时间能够适当设定。可以将聚合物颗粒填充于柱，使试样溶液通过。
通过工序(b)中的捕捉糖链的载体的清洗，能够将捕捉到载体的物质中糖链以外的物质(非特异性吸附的物质)除去。
作为除去糖链以外的物质的方法，能够采用使用作为具有将疏水键解离的能力的离液(Chaotropicity)试剂的胍类水溶液进行清洗的方法、用纯水或水溶性缓冲液(例如磷酸缓冲液、Tris缓冲液等)进行清洗的方法。作为清洗工序中的清洗条件，温度为4～40℃，清洗时间为10秒～30分钟。作为清洗方法，在载体为聚合物颗粒的情况下，能够浸渍于清洗液，通过重复清洗液的更换来进行清洗。
具体而言，能够重复进行下述通过在离心沉降管或试管中加入聚合物颗粒，加入清洗液，振荡后，利用离心操作使聚合物颗粒沉淀，除去上清的操作来进行清洗。例如，能够重复进行下述通过在离心管内加入聚合物颗粒，加入清洗液，使聚合物颗粒利用自然沉降或离心分离强制性地沉降后，除去上清的操作，来进行清洗。上述清洗操作优选进行3～6次。在使用磁性珠的情况下，不需要离心操作，较为简便。
另外，也能够使用管状的容器，其为在底面部安装具有能够透过液体但不透过该珠的孔径的过滤器的过滤试管。通过在该过滤试管中加入聚合物颗粒来使用，能够将清洗所需要的清洗液经过过滤器除去，不需要上述的离心操作后的上清除去的工序，能够实现作业性的提高。
另外，市场销售有各种6～384孔的多孔板的底部安装有上述过滤器的商品，通过使用这些板能够提高产量。特别是对于96孔多孔板开发了溶液分注机器、抽吸除去系统以及板的输送系统等，在提高产量中最为适合。
以连续式进行糖链捕捉反应的情况下，清洗处理可以在柱中通清洗溶液从糖链捕捉反应连续地处理。另外，在使用多孔板的情况下，也可以利用过滤操作或者离心操作将捕捉到糖链的载体以外的物质除去。
此外，载体上的剩余官能团例如能够利用乙酸酐等进行带帽(capping)。
在工序(c)中，使本发明的化合物与捕捉到糖链的载体接触，使糖链从该载体游离，与此同时，使本发明的化合物与糖链结合。作为用于捕捉糖链的载体使用具有酰肼基的载体的情况下，在本发明的化合物的末端存在的氨氧基作用于载体与糖链之间的腙键，通过酰肼－肟交换反应，完成本工序。作为用于捕捉糖链的载体使用具有氨氧基的载体的情况下，在本发明的化合物的末端存在的氨氧基作用于载体与糖链之间的肟键，通过肟－肟交换反应，完成本工序。这样，根据本发明的化合物，能够以一个处理，进行从载体的糖链的游离和糖链的标记。
交换反应时的反应液的pH优选为pH2～7，更优选为pH3～6，最优选为pH3.5～5.5。通过加入乙酸/乙腈溶液，能够将反应液调节为上述的pH。交换反应时的温度优选为50～95℃，更优选为60～90℃，最优选为70～90℃。交换反应时，通过将反应容器开放进行加热操作，一边使溶剂蒸发一边进行反应，最终使其干燥固化，由此能够高效地进行交换反应。
能够对回收的标记后糖链溶液直接或者将过量包含的标记化合物除去后，利用质谱法等分析手段进行分析。
另外，本发明提供一种糖链的分析方法，其包括将由上述方法所制备的标记后糖链试样供于质谱分析来检测糖链的工序。如实施例2所示，本发明的化合物(aoWR－NH2)所标记的糖链在供于质谱分析的情况下，在糖链的峰的附近没有检测到其分解产物的峰。因此，能够利用质谱分析有效地实施糖链的检测。作为质谱分析的方式，例如能够适合利用MALDI－TOFMS。质谱分析的结果所得到的质谱谱图能够利用解析软件等进行解析。通过读取荷质比(m/z值)，能够检测试样糖链的峰。此外，能够从荷质比或峰强度(峰高、峰面积等任意的指标)，分析糖链的定量和糖链的结构。在糖链的分析中，能够利用各种数据库(例如、GlycoSuite等)。
实施例
以下，根据合成例、实施例以及比较例更加具体地说明本发明，本发明不限于以下的合成例和实施例。
[合成例1]aoWR－NH2的合成
合成路线如下所示。
在Boc－Trp－OH(Merck：853038、4.66g)中添加THF(40mL)，将溶液冷却到－50℃。在上述溶液中添加4－甲基吗啉(1.86g)和氯甲酸异丁酯(2.51g)，在－40℃搅拌10分钟，然后一边升温至0℃一边搅拌30分钟，由此制备混合酸酐(A)。接着，在H－Arg－NH2·2HCl(渡边化学工业：K00125、4.53g)中添加甲醇(40mL)，冷却到5℃，将添加三乙胺(1.86g)制备的溶液添加到(A)中。在0℃搅拌10分钟，然后一边升温到室温一边搅拌90分钟，通过将反应溶液减压浓缩，得到化合物1(15.96g)。
在化合物1(15.96g)中添加甲醇(26mL)，冷却到0℃，接着添加4MHCl/二噁烷溶液(26mL)。在0℃搅拌30分钟，然后一边升温到室温一边搅拌3小时，通过将反应溶液减压浓缩，得到化合物2(13.82g)。
在叔丁氧羰基氨氧基乙酸(Boc－amino－oxyaceticacid)(Merck：851017、2.45g)中添加THF(40mL)，将溶液冷却到－40℃。在上述溶液中添加4－甲基吗啉(1.55g)和氯甲酸异丁酯(2.09g)，在－30℃搅拌15分钟，然后一边升温到0℃一边搅拌35分钟，由此制备混合酸酐(B)。接着，在化合物2(13.82g)中添加蒸馏水(20mL)冷却到5℃，将添加碳酸氢钠(1.29g)制备得到的溶液添加到(B)中。在5℃搅拌1小时，然后一边升温到室温一边搅拌6小时，将反应溶液减压浓缩。接着，利用ODS中压色谱进行精制，由此得到化合物3(4.82g)。
在化合物3(4.82g)中添加甲醇(14.5mL)，冷却到0℃，接着添加4MHCl/二噁烷溶液(14.5mL)。一边升温到室温一边搅拌2小时，将反应溶液减压浓缩。对所得到的残留物3.96g中的3.2g利用ODS中压色谱进行精制，由此得到化合物4(aoWR－NH2、1.29g)。
[实施例1]
对于20mMaoWR和20mMaoWR－NH2，使用Nexera(岛津制作所)作为HPLC装置，根据以下条件实施HPLC，测定各自的荧光强度。
＜HPLC条件＞
柱：ACQUITYUPLCBEHGlycan1.7μm2.1x150mm
溶剂A：50mM甲酸/氨水溶液(pH4.4)
溶剂B：乙腈
梯度：A液25％(0分)→A液42％(38.5分)
柱温度：60℃→流速：0.5mL/分钟
Ex：280nmEm：350nm注射量：1μL
其结果，aoWR－NH2与aoWR相比较，显示约2.7倍的荧光强度(图1、图2)。
[实施例2]
(来自糖蛋白质的N－结合型糖链的游离)
在来自人血清的IgG(SIGMA、I4506)40mg中，添加超纯水2mL，添加1M碳酸氢铵(和光纯药、017－02875)水溶液和120mMDTT(二硫苏糖醇、SIGMA、D9779)水溶液各200μL，在60℃使其反应30分钟。反应后，加入123mMIAA(碘代乙酰胺、和光纯药、093－02152)水溶液400μL，在遮光下，于室温使其反应1小时。接着将16000U的胰蛋白酶(SIGMA、T0303)溶解于400μL的1mM盐酸得到的溶液全量添加，在37℃使其反应1.5小时，将蛋白质部分进行肽片段化。将溶液在90℃加热10分钟，使胰蛋白酶失活后，利用80U的肽－N－糖苷酶F(Roche、1－365－193)进行处理，使糖链从肽游离，得到糖链溶液。
(N－结合型糖链的标记和精制)
在加入作为糖链捕捉用的载体的具有酰肼基的颗粒5mg(BlotGlyco(R))、住友电木株式会社制、BS－45603)的一次性柱中，添加上述糖链溶液20μL和180μL的2％乙酸/乙腈溶液，在80℃使其反应1小时。反应在开放体系中进行，目测确认为溶剂完全蒸发、颗粒干燥固化的状态。
将结合有N－结合型糖链的颗粒用2M胍水溶液、水和1％三乙胺/甲醇溶液清洗后，添加10％乙酸酐/甲醇溶液，在室温使其反应30分钟，对未反应的酰肼基带帽。带帽后，用10mM盐酸、甲醇和二甲基亚砜对珠子进行清洗。
接着，进行涎酸残基的羧酸的甲酯化。加入500mM的1－甲基－3－对甲苯基三氮烯MTT)(东京化成、M0641)/二甲基亚砜溶液100μL，在60℃使其反应1小时。反应后，用甲醇和水进行清洗。
最后，从颗粒进行糖链的切出和标记反应。加入aoWR－NH2水溶液20μL和2％乙酸/乙腈溶液180μL，在80℃使其反应1小时。aoWR－NH2水溶液在加湿处理(粉末状态下，湿度100％、37℃放置15小时)后，添加超纯水，调整为20mM的水溶液。反应在开放体系中进行，目测确认为溶剂完全蒸发、颗粒干燥固化的状态。在干燥后的珠子中加入2mM盐酸50μL，回收N－结合型糖链。
(剩余标记试剂的除去)
将回收得到的糖链溶液用乙腈稀释到10倍后，添加到二氧化硅柱(BlotGlyco试剂盒附属品)中，使标记糖链吸附到硅胶上。用乙腈清洗柱后，用超纯水50μL回收标记糖链。
[比较例1]
标记中使用aoWR并且在干燥后的珠子中加入超纯水50μL，回收N－结合型糖链，除此以外，与实施例2同样地进行精制。
[比较例2]
标记中使用aoWR(无加湿处理)并且在干燥后的珠子中加入超纯水50μL，回收N－结合型糖链，除此以外，与实施例2同样地进行精制。
(标记糖链的分析)
将回收得到的标记糖链溶液利用MALDI－TOFMS(AutoflexIIIsmartbeam、BrukerDaltonics公司制)以反射模式、正离子模式进行分析。基质使用2,5－二羟基苯甲酸(Bruker、201346)。
从图3所示的结果可知，aoWR时如果进行加湿，则产生比本来的荷质比小约14的被认为原因是甲酯基的水解的夹杂峰，但在将上述官能团取代为酰胺基的aoWR－NH2时，不产生夹杂峰。
工业上的可利用性
根据本发明，能够从生物学的试样有效地制备标记后糖链试样，并且能够通过质谱分析等有效地检测所制备的标记后糖链试样。因此，本发明能够广泛利用于与糖链相关的试验研究的领域，另外例如还能够应用于包含糖链的医药品或食品的特性分析或品质管理等领域。

Claims (8)

1.一种下述式(1)所示的化合物，
R1、R2分别独立地表示氢原子或烷基。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于：
所述式(1)中的R1、R2分别独立地表示氢原子、甲基或乙基。
3.如权利要求1或2所述的化合物，其特征在于：
由下述式所示，
4.一种标记试剂，其特征在于：
以权利要求1～3中任一项所述的化合物为有效成分。
5.一种标记后糖链试样的制备方法，其特征在于，包括：
(a)使包含糖链的试样与具有酰肼基或氨氧基作为用于捕捉糖链的官能团的载体接触，使该糖链的醛基与该载体的酰肼基或氨氧基反应，由此将该糖链捕捉到该载体的工序；
(b)对捕捉了糖链的载体进行清洗的工序；和
(c)使权利要求1～3中任一项所述的化合物与捕捉了糖链的载体接触，使糖链从该载体游离，同时使所述化合物与糖链结合的工序。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述载体被具有下述的式(2)所示的交联型聚合物结构的高分子物质包覆，
R3、R4分别独立地表示被－O－、－S－、－NH－、－CO－、－CONH－中断或不中断的碳原子数1～20的烃链，R5、R6、R7分别独立地表示H、CH3或碳原子数2～5的烃链，m、n分别独立地表示单体单元数。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述载体被具有下述的式(3)所示的交联型聚合物结构的高分子物质包覆，
m、n分别独立地表示单体单元数。
8.一种糖链的分析方法，其特征在于，包括：
将由权利要求5～7中任一项所述的方法所制备的标记后糖链试样供于质谱分析，检测糖链的工序。
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