CN102914527A - 一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法 - Google Patents
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Abstract
一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法，涉及一种游离色氨酸含量的检测方法。本发明提供了一种基于荧光功能化的金属有机四面体化合物应用于天然氨基酸和血清样本中游离色氨酸识别和检测并实现生物细胞成像应用的方法。该方法是以三苯胺为母体构筑出的三三齿配体与硝酸铈自组装得到四面体化合物为材料，该材料能够在20种天然氨基酸中高选择性的识别色氨酸，响应范围在0～0.1mM；另外，该材料还能够有效地区分游离的和结合的色氨酸，实现在血清样本中对游离色氨酸含量的检测，也很好的实现了在活体细胞成像上的应用。因此，该材料提供了一种灵敏度高、操作简单的测试血清样本中游离色氨酸含量的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种游离色氨酸含量的检测方法,更具体地说,涉及一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法。
背景技术
在天然的20种氨基酸中，色氨酸具有至关重要的意义，例如血清中色氨酸含量的非正常偏高被认为是某些疾病产生的关键影响要素，如慢性肝炎、帕金森病、再生障碍性贫血和肌肉萎缩等。所以发展有效地在活体内识别和检测色氨酸含量，尤其是应用于血清样本中色氨酸含量的检测方法具有临床上的意义。
然而，设计合成出具有高选择性和有效地识别该类重要的生物小分子的探针在目前是一个极具挑战的课题，经过科学工作者数十年的不懈努力，氨基酸分子荧光探针在基础理论研究方面取得了巨大的进步, 实现了对特定目标氨基酸的高选择性的检测。但是，目前绝大部分的氨基酸识别探针要真正应用到现实生产生活中，科学工作者还需解决如下问题：
1. 基于弱作用识别过程对氨基酸的识别，其中提高识别过程的选择性是重点，因为氨基酸及其衍生物都具有相似的结构，从而具有相同的弱作用识别位点，达到对单一氨基酸分子的识别在目前的研究中还有待解决。
2. 现在大部分高选择性的氨基酸探针都是基于共价键反应型机理，对于氨基酸的识别过程同时也伴随着氨基酸分子结构的变化，识别过程不可逆，不利于现实意义上的检测应用。
3. 小肽和蛋白质对氨基酸识别过程的干扰目前研究的较少，大部分生物样本中都会含有氨基酸、小肽和蛋白质，真正的构筑研究生命体系生物小分子的探针刻不容缓。
发明内容
为了解决上述现有技术中存在的问题，本发明目的是提供一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法。具体是将具有蓝色荧光发射的三苯胺基团作为荧光团和芳香堆积作用位点，协同天然的酰胺基团作为氢键授受体，构筑具有特殊亲疏水空腔的四面体笼状结构，不仅可以在20种天然氨基酸中高选择性的识别色氨酸，小肽的存在对荧光识别过程没有干扰，而且还将其应用到生物活体细胞成像研究，最为有利的是实现了对血清样本中游离色氨酸含量的荧光法检测，通过荧光定量检测生物体内的色氨酸。
为了实现上述发明目的,本发明采取的技术方案是：一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法，所述探针为含有式A的配合物，
[MmLn] （A）
式A中，L为含有三苯胺基团作为荧光团，功能酰胺基团作为氢键作用位点的配体，具有如下B分子结构式；
（B）
M为铈 (Ce3+) 金属离子，m和n分别为金属和配体的个数，其中m=n=4组装为四面体结构。
所述一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法，包括以下步骤：
（a）、按照荧光法对于色氨酸的识别方法；
称取根据权利要求1所述的探针材料，配制成cM的100 ml有机/水混合溶剂的标准探针溶液，再配置2.0×10-2 M的色氨酸有机/水混合溶剂的溶液。量取标准探针溶液2 ml，向其中逐渐加入上述配制的色氨酸溶液，至色氨酸含量达到7.5 mM后，荧光增强直至平衡。
（b）、按照荧光法对色氨酸的选择性识别测试方法；
取探针材料c 
M，加入色氨酸达到7.5 mM，其它19种天然氨基酸，包括Ile, Arg，Ala，Val，Leu，Pro，Met，Thr，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Ser，Gly，Cys，His，Phe和Tyr分别加入15 mM，同时，含有5个色氨酸残基的13肽 (ILPWKWPWW PWRR-NH2) 加入80 mM，在350 nm处激发，测试其荧光发射谱图。
（c）、按照荧光法得到色氨酸含量的标准曲线方法；
称取根据权利要求1所述的探针材料，配制成c 
M的100 ml有机/水混合溶剂的标准探针溶液，再配置2.0×10-2 M的色氨酸有机/水混合溶剂的溶液。量取标准探针溶液2 ml，加入计算量的色氨酸溶液，配制成标准测试溶液。上述溶液在350 nm处激发，测得荧光发射谱图，然后以色氨酸的加入量为横坐标，相对荧光强度为纵坐标，得到标准曲线。
（d）、荧光法直接检测血清样本中色氨酸含量的技术；
血清样本从合作医院取来后，未经任何处理，直接用微量注射器加入到
含有c 
M 2 ml的有机/水混合溶剂的标准探针溶液，在350 nm处激发，测得荧光增强曲线，按照荧光标准曲线计算样本中所含游离色氨酸的浓度。
所述浓度c为10 
M至20 
M，浓度太低荧光发射峰较差，浓度太高则发生自淬灭。
所述探针材料所用有机/水混合溶剂选自DMF和水，其比例为9:1或8:2。
所述配制色氨酸所用有机/水混合溶剂选自DMF和水，其比例为1:1或 4:6。
本发明有益效果是：本发明利用具有限域结构的金属有机超分子四面体结构协同各种弱的相互作用，包括氢键作用、芳香堆积作用，大小结构匹配等，实现了在20种天然氨基酸中高选择性的识别色氨酸，能够有效地区分出血清样本中游离态的和结合态的色氨酸，能够推广应用于血清样本的实际检测领域，具有临床上的意义；与传统的高效液相色谱检测法相比，利用该荧光探针材料在溶液中对血清样本中色氨酸含量检测过程操作简单，灵敏度高，并能够实现实时实地检测，有效地打破阻碍生物小分子荧光探针在选择性差、检测过程不可逆等识别过程的难题，并突破血清样本检测等方面的实际应用的瓶颈。该探针材料合成简单，易于大规模制备。
附图说明
图1 是利用实施例1的探针材料组装成金属有机四面体的过程。
图2 是利用实施例2的探针材料对色氨酸识别过程的荧光强度及浓度强度工作曲线。
图3 是利用实施例2的探针材料对色氨酸的选择、竞争实验柱状图。
图4 是利用实施例2的探针材料应用在活体细胞中的成像图。
图5 是利用实施例2的探针材料在活体细胞中的毒理性能测试柱状图。
图6 是血清样本的HPLC检测处理及标准曲线图。
图7 是利用实施例2的探针材料应用于小牛血清样本中色氨酸含量检测的荧光滴定图和测试结果柱状图。
图8 是利用实施例2的探针材料应用于正常人血清样本中色氨酸含量检测的荧光滴定图和测试结果柱状图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步地说明。
实施例1（探针材料的合成）
在甲醇溶液中加入4,4',4''-三苯胺酰肼 (0.76 g, 1.8 mmol) 和水杨醛 (0.80 g, 6.6 mmol)，滴加5滴冰醋酸作为催化剂。搅拌下回流24小时，过滤干燥得黄色固体1.06 g，产率：80.0 %。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 12.10 (s, 3H, H -NH- ), 11.33 (s, 3H, H -OH ), 8.65 (s, 3H, H -CH=N ), 7.97 (d, 6H, J = 7.5 Hz, H Ar ), 7.55 (d, 3H, J = 7.2 Hz, H Ar ), 7.31 (s, 3H, H Ar ), 7.24 (m, 6H, H Ar ), 6.93 (m, 6H, H Ar ). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 162.1 (C -C=O ), 157.5 (C -OH ), 149.2 (C Ar ), 148.2 (C -CH=N ), 131.3 (C Ar ), 129.6 (C Ar ), 129.5 (C Ar ), 127.8 (C Ar ), 123.7 (C Ar ), 119.3 (C Ar ), 118.7 (C Ar ), 116.4 (C Ar ). Anal. Calc. for C42H33N7O6 : H 4.55, C 68.94, N 13.40. Found: H 4.68 ,C 68.51, N 13.12。
实施例2（探针材料金属有机四面体的合成）
Ce(NO3)3·6H2O (44.2 mg, 0.15 mmol)和实施例1的材料 (73.0 mg, 0.10 mmol) 溶于DMF中，搅拌2小时后过滤，用甲醇扩散，得到黑色晶体，过滤干燥，产率为65 %。1H NMR (400 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 13.17 (s, 8H, H -NH- ), 8.61 (s, 12H, H -CH=N ), 8.09 (s, 12H, 5), 7.41–7.18 (m, 48H, H Ar ), 6.56 (s, 24H, H Ar ), 5.66 (s, 12H, H Ar ). 13C NMR (100 MHz, DMSO-d 6 , ppm): δ 166.8 (C -C=O ), 157.4 (C -OH ), 152.5 (C Ar ), 132.6 (C -CH=N ), 129.5 (C Ar ), 129.3 (C Ar ), 124.0 (C Ar ), 123.3 (C Ar ), 122.9 (C Ar ), 119.4 (C Ar ), 117.2 (C Ar ), 116.6 (C Ar ). Anal. Calc. for Ce4(C42H29N7O6)4: H 3.37, C 58.13, N 11.30; Found: H 3.85, C 57.35, N 11.26. ESI-MS:m/z:1155.7824[Ce4(HTTS)3(H2TTS)]3-,1734.1365[Ce4(HTTS)2(H2TTS)2]2-合成结果如图1所示。
实施例3（荧光强度及浓度强度工作曲线）
称取探针材料，配制成15 
M的100 ml DMF/H2O=9/1的标准探针溶液，再配置2.0×10-2 M的色氨酸DMF/H2O=1/1的溶液。量取标准探针溶液2 ml，加入计算量的色氨酸溶液，配制成标准测试溶液。在350 nm处激发，测得荧光发射谱图，然后以色氨酸的加入量为横坐标，相对荧光强度为纵坐标，得到标准曲线，测试结果如图2所示。
实施例4（对色氨酸的选择竞争实验）
称取探针材料，配制成15 
M的100 ml DMF/H2O=9/1的标准探针溶液，20种天然的氨基酸和含有5个色氨酸残基的小肽配制成2.0×10-2 M的DMF/H2O=1/1的溶液，且现配现用。选择性测试实验中，取探针溶液2 ml到石英比色皿中，色氨酸利用微量注射器逐渐加入到上述比色皿中，直至7.5 mM，其它氨基酸加入15.0 mM，小肽加入80 mM；在350 nm处激发，测试其荧光强度变化，以氨基酸种类为横坐标，相对荧光强度为纵坐标，得到选择性图。然后再向上述溶液中再加入7.5 mM的色氨酸溶液，同样在350 nm处激发，测试其荧光强度变化，得到竞争实验图，结果如图3所示。
实施例5（在活体细胞中的应用）
在室温下，用5 M的探针材料孵化人宫颈癌细胞(Hela)30分钟，用PBS缓冲溶液冲洗掉细胞外面的探针分子，放在荧光显微镜下，用405 nm的激光器激发，观察并记录细胞的荧光强度。然后用100 
M的色氨酸溶液继续孵化细胞半个小时，观测加入色氨酸后的细胞荧光强度变化，结果如图4所示。
实施例6（在活体细胞中的毒理性能研究）
在37 °C下，培养的48孔细胞(Costar, Corning, USA)分别用1.25 nM，2.5 nM，5 nM和10 nM浓度的探针材料孵化48小时。然后用PBS缓冲液洗涤，换成新鲜培养基，细胞成活率用MTT(3-(4,5-dimethyl-2-thiazoyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)测试。MTT (Merck)加入量为250 μg/mL，继续孵化2小时，浮在表面的细胞被移除，底部的细胞用iso-propanol/0.04 N HCl溶解，测试540 nm处的紫外吸收，对照试验不加入探针材料，其它步骤一样，整个实验重复3次，结果如图5所示。
实施例7（血清样本的HPLC检测处理及标准曲线的制备）
高效液相色谱测试中样本的处理方法：取1份血清于塑料离心管内，加入等体积的5.0 %高氯酸溶液，加盖后于旋涡混匀器上混匀1分钟，室温下放置15分钟以充分沉淀血清中的蛋白质，然后以10000 r/min的速率离心5分钟，取上清液进样分析。
标准曲线：先用体积分数为2.5 %的高氯酸溶液配置5.0 mM的色氨酸标准溶液，依次稀释至浓度为5，10，15，20，25
M，HPLC测试，得到标准曲线如图6所示。
实施例8（小牛血清样本上的使用）
小牛血清样本从本系研究药理活性的合作老师处取来后，未经任何处理，直接用微量注射器加入到含有15 M 探针材料的DMF/H2O=9/1的水性溶液中，以350 nm的光激发，测得其荧光增强了34 %，按照荧光标准曲线计算该样本中所含游离色氨酸的浓度为13.14 M，同时和HPLC测试结果10.8 
M对照，具有较好的吻合，如图7所示。
实施例9（正常人血清样本上的使用）
正常人血清样本从合作医院取来后，未经任何处理，直接用微量注射器加入到含有15 
M 探针材料的DMF/H2O=9/1的水性溶液中，以350 nm的光激发，测得其荧光增强了50 %，按照荧光标准曲线计算该样本中所含游离色氨酸的浓度为37.43 M，同时和HPLC测试结果43.0 
M对照，也具有较好的吻合，如图8所示。
Claims (5)
1.一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法，其特征在于探针含有式A的配合物，
[MmLn] （A）
式A中，L为含有三苯胺基团作为荧光团，功能酰胺基团作为氢键作用位点的配体，具有如下B分子结构式；
（B）
M为铈 (Ce3+) 金属离子，m和n分别为金属和配体的个数，其中m=n=4组装为四面体结构。
2.根据权利要求1所述一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法，其特征在于包括以下步骤：
（a）、按照荧光法对于色氨酸的识别方法；
称取根据权利要求1所述的探针材料，配制成c 
M的100 ml有机/水混合溶剂的标准探针溶液，再配置2.0×10-2 M的色氨酸有机/水混合溶剂的溶液；
量取标准探针溶液2 ml，向其中逐渐加入上述配制的色氨酸溶液，至色氨酸含量达到7.5 mM后，荧光增强直至平衡；
（b）、按照荧光法对色氨酸的选择性识别测试方法；
取探针材料c 
M，加入色氨酸达到7.5 mM，其它19种天然氨基酸，包括Ile, Arg，Ala，Val，Leu，Pro，Met，Thr，Asp，Glu，Gln，Asn，Lys，Ser，Gly，Cys，His，Phe和Tyr分别加入15 mM，同时，含有5个色氨酸残基的13肽 (ILPWKWPWW PWRR-NH2) 加入80 mM，在350 nm处激发，测试其荧光发射谱图；
（c）、按照荧光法得到色氨酸含量的标准曲线方法；
称取根据权利要求1所述的探针材料，配制成c M的100 ml有机/水混合溶剂的标准探针溶液，再配置2.0×10-2 M的色氨酸有机/水混合溶剂的溶液；
量取标准探针溶液2 ml，加入计算量的色氨酸溶液，配制成标准测试溶液；上述溶液在350 nm处激发，测得荧光发射谱图，然后以色氨酸的加入量为横坐标，相对荧光强度为纵坐标，得到标准曲线；
（d）、荧光法直接检测血清样本中色氨酸含量的技术；
血清样本从合作医院取来后，未经任何处理，直接用微量注射器加入到
含有c 
M 2 ml的有机/水混合溶剂的标准探针溶液，在350 nm处激发，测得荧光增强曲线，按照荧光标准曲线计算样本中所含游离色氨酸的浓度。
3.根据权利要求2所述一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法，其特征在于：所述浓度c为10 M至20 M，浓度太低荧光发射峰较差，浓度太高则发生自淬灭。
4.根据权利要求2所述一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法，其特征在于：所述探针材料所用有机/水混合溶剂选自DMF和水，其比例为9:1或8:2。
5.根据权利要求2所述一种色氨酸及血清样本中游离色氨酸含量的检测方法，其特征在于：所述配制色氨酸所用有机/水混合溶剂选自DMF和水，其比例为1:1或4:6。
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Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104450926A (zh) * | 2014-12-17 | 2015-03-25 | 中国医科大学 | 基于滚环扩增技术的检测左旋色氨酸的方法 |
| CN105699354A (zh) * | 2016-04-01 | 2016-06-22 | 西北师范大学 | 对称性柱[5]芳烃作为受体比色荧光识别l-色氨酸的应用 |
| CN106432117A (zh) * | 2016-09-12 | 2017-02-22 | 济南大学 | 一种功能性纳米铈配合物的制备方法和应用 |
| CN107434850A (zh) * | 2017-07-06 | 2017-12-05 | 浙江大学 | 用于色氨酸探测的金属‑有机框架材料及其制备方法 |
| CN112345508A (zh) * | 2020-11-12 | 2021-02-09 | 青岛大学 | 绿色荧光碳量子点在检测色氨酸中的应用和色氨酸的检测方法 |
| CN113548981A (zh) * | 2021-08-05 | 2021-10-26 | 齐鲁工业大学 | 三苯胺酚类化合物及其制备方法与其检测色氨酸的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101818055A (zh) * | 2010-04-22 | 2010-09-01 | 苏州科技学院 | 一种含三苯胺基团的快速荧光增强剂 |
| CN102183495A (zh) * | 2011-01-26 | 2011-09-14 | 鲁东大学 | 一种半胱氨酸的荧光检测方法 |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101818055A (zh) * | 2010-04-22 | 2010-09-01 | 苏州科技学院 | 一种含三苯胺基团的快速荧光增强剂 |
| CN102183495A (zh) * | 2011-01-26 | 2011-09-14 | 鲁东大学 | 一种半胱氨酸的荧光检测方法 |
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| JIAN WANG. ET AL.: "An Amide-Containing Metal-Organic Tetrahedron Responding to a Spin-Trapping Reaction in a Fluorescent Enhancement Manner for Biological Imaging of NO in living Cells", 《JOURNAL OF THE AMERICAN CHEMICAL SOCIETY》 * |
| YANG JIAO.ET AL.: "Metal-organic polyhedra containing 36 and 24folds of amid groups for selective luminescent recognition of natural disaccharides", 《CHEMICAL COMMUNICATIONS》 * |
| YANG LIU.ET AL.: "Self-assembly of cerium-based metal-organic tetrahedrons for size-selectively luminescent sensing natural saccharides", 《CHEMICAL COMMUNICATIOHNS》 * |
| ZHAO LIANG. ET AL.: "Face-draiven octanuclear cerium(IV)luminescence polyhedra:synthesis and luminescent sensing natural saccharides", 《CHEMICAL COMMUNICATIONS》 * |
| 刘淑芬: "蛋白质（色氨酸）荧光探针及其分析应用", 《山东大学硕士学位论文》 * |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104450926A (zh) * | 2014-12-17 | 2015-03-25 | 中国医科大学 | 基于滚环扩增技术的检测左旋色氨酸的方法 |
| CN105699354A (zh) * | 2016-04-01 | 2016-06-22 | 西北师范大学 | 对称性柱[5]芳烃作为受体比色荧光识别l-色氨酸的应用 |
| CN105699354B (zh) * | 2016-04-01 | 2018-11-09 | 西北师范大学 | 对称性柱[5]芳烃作为受体比色荧光识别l-色氨酸的应用 |
| CN106432117A (zh) * | 2016-09-12 | 2017-02-22 | 济南大学 | 一种功能性纳米铈配合物的制备方法和应用 |
| CN106432117B (zh) * | 2016-09-12 | 2019-02-19 | 济南大学 | 一种功能性纳米铈配合物的制备方法和应用 |
| CN107434850A (zh) * | 2017-07-06 | 2017-12-05 | 浙江大学 | 用于色氨酸探测的金属‑有机框架材料及其制备方法 |
| CN107434850B (zh) * | 2017-07-06 | 2020-04-03 | 浙江大学 | 用于色氨酸探测的金属-有机框架材料及其制备方法 |
| CN112345508A (zh) * | 2020-11-12 | 2021-02-09 | 青岛大学 | 绿色荧光碳量子点在检测色氨酸中的应用和色氨酸的检测方法 |
| CN113548981A (zh) * | 2021-08-05 | 2021-10-26 | 齐鲁工业大学 | 三苯胺酚类化合物及其制备方法与其检测色氨酸的应用 |
| CN113548981B (zh) * | 2021-08-05 | 2023-04-28 | 齐鲁工业大学 | 三苯胺酚类化合物及其制备方法与其检测色氨酸的应用 |
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