CN104450926A - 基于滚环扩增技术的检测左旋色氨酸的方法 - Google Patents

基于滚环扩增技术的检测左旋色氨酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于滚环扩增（rollingcircleamplification,RCA）技术的检测左旋色氨酸（L-Trp）的方法。该方法中，左旋色氨酸结合于色氨酸阻遏蛋白（trprepressor,trpR），导致trpR发生构象变化，并能够特异性地结合在DNA双链的识别序列上，从而抑制RCA的发生。通过检测RCA的扩增效率，进而计算出L-Trp的浓度。该方法为检测L-Trp提供了快速、简便、定量的测量技术，具有重要的科学价值和广阔的应用前景。

Description

基于滚环扩增技术的检测左旋色氨酸的方法
技术领域
本发明涉及生物化学、分子生物学、氨基酸成分确认的检测方法，具体涉及一种基于滚环扩增技术的检测左旋色氨酸的方法。
背景技术
左旋色氨酸(L-Trp)是构成蛋白质的20种天然氨基酸之一，是人体的8种必需氨基酸之一。作为重要的营养物质，许多的食物(原料、半成品、产品等)、饮料和调味品中都含有色氨酸。如何方便、快捷和准确的对色氨酸进行定量分析在食品检测中具有重要意义。
色氨酸在生物体内除了合成蛋白质外，其很多代谢产物具有重要的生物学功能及意义。人体内的色氨酸主要通过两种途径代谢：血清素途径和犬尿氨酸途径。在血清素代谢途径即5-羟色胺途径中，首先色氨酸羟化酶催化色氨酸生成5-羟色氨酸，然后在脱羧酶作用下5-羟色氨酸生成5-羟色胺。在犬尿氨酸途径中，吲哚胺2,3双加氧酶(IDO)和色氨酸2,3双加氧酶(TDO)催化色氨酸生成N-甲酰犬尿氨酸。代谢过程中产生的5羟色胺是一种重要的神经递质，参与神经系统的众多生理功能的调节。犬尿喹啉酸是一种兴奋性氨基酸受体的拮抗剂。色氨酸代谢途径的异常可以引起体液中色氨酸浓度的变化。因此，对色氨酸浓度进行定量检测具有重要的医学诊断和治疗价值。
目前，最常用的检测色氨酸的方法有HPLC法、质谱法、层析法、紫外吸收法、荧光光谱法等。但是，这些检测分析方法均需要大型专业分析仪器设备，不仅需要专业人员来进行操作，而且对设备维护和标准化的要求也比较高。不能制备方便的小型化试剂盒。目前，可用于试剂盒检测色氨酸的仅有ELISA法，该方法利用色氨酸抗体与色氨酸的结合检测色氨酸，虽然降低了大型专业仪器设备的要求，但是该检测方法需要包被、铺板、加样、加抗体、显色以及每一步之间的多次洗涤步骤，操作繁琐，易于出现人为误差。因此，开发新的检测方法，实现简便、快捷、特异性高、性价比高的色氨酸检测具有重要的意义。
发明内容
本发明针对上述现有技术存在的问题而提出一种基于滚环扩增技术的全新的检测左旋色氨酸的方法，该方法原理是利用色氨酸操纵子的阻遏蛋白以及滚环扩增，通过该方法可以实现左旋色氨酸的简便、快捷、可定量的检测。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种基于滚环扩增技术的检测左旋色氨酸的方法，其特征在于包括下述步骤：待检测的左旋色氨酸与色氨酸阻遏蛋白结合，结合了左旋色氨酸的色氨酸阻遏蛋白通过识别由环形单链模板DNA与线性单链引物DNA形成的双链上的特异性识别序列，进而抑制DNA聚合酶对线性单链引物DNA的延伸和扩增，滚环扩增反应的抑制程度与左旋色氨酸的浓度成正比，通过制备左旋色氨酸浓度与滚环扩增抑制率的标准曲线，检测待测样品对滚环扩增的抑制率，确定出待测样品中的左旋色氨酸含量。
所述的待检测的左旋色氨酸可以是配制的L-Trp溶液，或是各种提取或制备的生物样本。
所述的色氨酸阻遏蛋白是细菌中调控色氨酸操纵子表达的阻遏蛋白(trpR)，该蛋白能够特异性地结合L-Trp，并发生构象变化，提高了结合色氨酸操纵子识别序列的亲和力。
所述的环形单链模板DNA，是作为扩增模板用于滚环扩增的单链DNA，并含有trpR的识别序列。
所述的线性单链引物DNA，是作为扩增引物用于滚环扩增的线性单链DNA，并含有trpR的识别序列，该线性单链引物DNA序列与环形单链模板DNA的序列碱基具有序列互补性。
所述的DNA聚合酶是用于滚环扩增的DNA聚合酶，包括但不限于phi29DNA聚合酶。
与传统的HPLC、质谱、ELISA方法相比，本发明具有如下优点：
1、操作简单、步骤简便；
2、不需专业的大型仪器设备。
附图说明
图1是本发明的流程图。
图2是本发明检测L-Trp的原理示意图。
图中，1、含有trpR识别序列的单链模板DNA：“ON-CT”；2、含有trpR识别序列的单链引物DNA：“ON-P”；3、DNA聚合酶；4、未结合L-Trp的trpR蛋白；5、结合L-Trp的trpR蛋白；6、L-Trp。
图3是本发明定量测定不同浓度L-Trp的实验结果。(A)L-Trp不同浓度时的RCA反应的荧光时间曲线；(B)L-Trp浓度和IRR的线性关系。Fluorescence intensity(FI)：荧光强度；Time：时间；Inhibited RCA rate(IRR)：RCA速率抑制率；L-Trp Concentration(μM)：左旋色氨酸浓度(微摩尔每升)。
图4是本发明特异性检测L-Trp和其他19种氨基酸的实验结果。该柱状图表示相对抑制效率。Relative inhibited RCA rate(RIRR)：相对RCA速率抑制率；L-Trp：左旋色氨酸；L-Phe：左旋苯丙氨酸；L-Tyr：左旋酪氨酸；L-Ser：左旋丝氨酸；L-Thr：左旋苏氨酸；L-Met：左旋甲硫氨酸；L-Cys：左旋半胱氨酸；L-Gln：左旋谷氨酰胺；L-Asn：左旋天冬酰胺；L-Pro：左旋脯氨酸；Gly：甘氨酸；L-Ala：左旋丙氨酸；L-Leu：左旋亮氨酸；L-Ile：左旋异亮氨酸；L-Val：左旋缬氨酸；L-Glu：左旋谷氨酸；L-Asp：左旋天冬氨酸；L-Lys：左旋赖氨酸；L-Arg：左旋精氨酸；L-His：左旋组氨酸。
图5是本发明定性鉴别L-Trp和六种L-Trp类似物的实验结果。Relative inhibited RCArate(RIRR)：相对RCA速率抑制率；L-Trp：左旋色氨酸；D-Trp：右旋色氨酸；L-Kynurenine：左旋犬尿氨酸；IAA：吲哚乙酸；Melatonin：褪黑素；Tryptamine：色胺；5-HT：5-羟色胺。
图6是本发明定量检测LB培养液中的L-Trp含量的实验结果。Inhibited RCA rate(IRR)：RCA速率抑制率。L-Trp Concentration(mM)：左旋色氨酸浓度(毫摩尔每升)。■表示的各数据点构建了标准曲线，▲表示的是待测样品中的IRR值。
具体实施方式
下面结合附图和实施例详细描述本发明。
本发明基于滚环扩增的左旋色氨酸检测方法包括下述步骤：待检测的左旋色氨酸与色氨酸阻遏蛋白结合，增加色氨酸阻遏蛋白对环形模板中识别序列的亲和力，结合在环形单链模板DNA与线性单链引物DNA形成的DNA双链上，进而抑制DNA聚合酶对环形单链模板DNA和线性单链引物DNA的扩增。滚环扩增的抑制程度与左旋色氨酸的浓度成正比。通过制备一系列左旋色氨酸浓度与滚环扩增抑制率的标准曲线，以及测定待测样品对滚环扩增的抑制率，可以分析出待测样品中的左旋色氨酸浓度。该方法包括待检测的左旋色氨酸、色氨酸阻遏蛋白、环形单链模板DNA、线性单链引物DNA、DNA聚合酶以及滚环扩增所需的酶反应体系。其中，待检测的左旋色氨酸可以是配制的L-Trp溶液，或是提取或制备的生物样本。色氨酸阻遏蛋白是细菌中调控色氨酸操纵子表达的阻遏蛋白(trpR)。该蛋白可以特异的结合L-Trp，进而发生变构，增加对色氨酸操纵子中识别序列的亲和力。环形单链模板DNA，是作为扩增模板用于滚环扩增的环形单链DNA，并含有trpR的特异识别序列。线性单链引物DNA，是作为扩增引物用于滚环扩增的线性单链DNA，并含有trpR的特异识别序列，并且与环形单链模板DNA的序列碱基互补配对。DNA聚合酶是用于滚环扩增的DNA聚合酶，包括但不限于phi29DNA聚合酶。
实施例1
本发明定量测定L-Trp浓度与RCA抑制率之间的关系(图3)。具体步骤如下：
(1)环形模板的制备：
配制10μl的连接反应体系缓冲液(50mM Tris pH 8.0,10mM MgCl2,5mM DTT和0.1mM ATP)，加入10pmol线性单链模板DNA“ON-CT”、10pmol线性单链引物DNA“ON-P”和175U T4DNA连接酶，16℃孵育1小时。DNA序列见表1。
(2)制备样品：
配制摩尔浓度为0、5、10、20、40、60和80μM的左旋色氨酸水溶液。
(3)滚环扩增检测：
配制100μl的聚合反应体系缓冲液(50mM Tris pH 7.5、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mM DTT、SYB Green II(1:10000)、3U phi29DNA聚合酶、0.5pmol连接反应产物和trpR2.5μM)，分别加入不同量的L-Trp，使其终浓度为0、0.5、1、2、4、6、8μM，并进行滚环扩增反应。
利用多功能酶标仪(Microplate Reader，Infinite M200,Tecan,USA)检测滚环扩增反应的荧光信号。实验温度为37℃，激发波长480nm，发射波长524nm。信号采集时间为20微秒，每60秒采集一次信号，检测时间为30分钟。
(4)数据分析：
RCA的荧光时间曲线的斜率作为滚环扩增效率RR，滚环扩增抑制率IRR＝RR0-RRTrp。空白对照(即不含色氨酸时)的RR为RR0，含有色氨酸的RR为RRTrp。滚环扩增抑制率IRR与色氨酸浓度呈线性相关(图3)。
实施例2
本发明特异性鉴别L-Trp和其他19种氨基酸(图4)的具体步骤如下：
(1)环形模板的制备：
配制10μl的连接反应体系缓冲液(50mM Tris pH 8.0,10mM MgCl2,5mM DTT和0.1mM ATP)，加入10pmol线性单链模板DNA“ON-CT”、10pmol线性单链引物DNA“ON-P”和175U T4DNA连接酶，16℃孵育1小时。DNA序列见表1。
(2)制备样品：
配制摩尔浓度为80μM的左旋色氨酸的水溶液，配制摩尔浓度为10mM的甘氨酸(Gly)、左旋丙氨酸(L-Ala)、左旋异亮氨酸(L-Ile)、左旋亮氨酸(L-Leu)、左旋甲硫氨酸(L-Met)、左旋缬氨酸(L-Val)、左旋精氨酸(L-Arg)、左旋组氨酸(L-His)、左旋赖氨酸(L-Lys)、左旋天冬氨酸(L-Asp)、左旋谷氨酸(L-Glu)、左旋天冬酰胺(L-Asn)、左旋谷氨酰胺(L-Gln)、左旋丝氨酸(L-Ser)、左旋苏氨酸(L-Thr)、左旋苯丙氨酸(L-Phe)、左旋酪氨酸(L-Tyr)、左旋半胱氨酸(L-Cys)、左旋脯氨酸(L-Pro)的水溶液。
(3)滚环扩增检测：
配制100μl的聚合反应体系缓冲液(50mM Tris pH 7.5、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mM DTT、SYB Green II(1:10000)、3U phi29DNA聚合酶、0.5pmol连接反应产物和trpR2.5μM)，分别加入一种氨基酸进行滚环扩增反应。氨基酸的终浓度分别是8μM(L-Trp)和1.0mM(其他氨基酸：Gly、L-Ala、L-Ile、L-Leu、L-Met、L-Val、L-Arg、L-His、L-Lys、L-Asp、L-Asn、L-Glu、L-Gln、L-Ser、L-Thr、L-Phe、L-Tyr、L-Cys和L-Pro)。
用多功能酶标仪(Microplate Reader，Infinite M200,Tecan,USA)检测滚环扩增反应的荧光信号。实验温度为37℃，激发波长480nm，发射波长524nm。信号采集时间为20微秒，每60秒采集一次信号，检测时间为30分钟。
(4)数据分析：
RCA的荧光时间曲线的斜率作为滚环扩增效率RR，滚环扩增抑制率IRR＝RR0-RRTrp，空白对照(即不含色氨酸时)的RR为RR0，含有不同氨基酸的RR为RRaa。滚环扩增相对抑制率RIRR＝(RR0-RRaa)/(RR0-RRTrp)。(图4)。
实施例3
本发明定性鉴别L-Trp和六种L-Trp类似物(图5)。具体步骤如下：
(1)环形模板的制备：
配制10μl连接反应体系缓冲液(50mM Tris pH 8.0,10mM MgCl2,5mM DTT和0.1mM ATP)，加入10pmol线性单链模板DNA“ON-CT”、10pmol线性单链引物DNA“ON-P”和175U T4DNA连接酶，16℃孵育1小时。DNA序列见表1。
(2)制备样品：
配制摩尔浓度为80μM的左旋色氨酸的水溶液，配制摩尔浓度为10mM的左旋犬尿氨酸(L-Kynurenine)、吲哚乙酸(IAA)、褪黑素(Melatonin)、5-羟色胺(5-HT)的水溶液，和摩尔浓度为400μM的色胺(Trytamine)和右旋色氨酸(D-Trp)的水溶液。
(3)滚环扩增检测：
配制100μl的聚合反应体系缓冲液(50mM Tris pH 7.5、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mM DTT、SYB Green II(1:10000)、3U phi29DNA聚合酶、0.5pmol连接反应产物和trpR 2.5μM)，分别加入L-Trp(终浓度8μM)，L-Kynurenine、IAA、Melatonin、5-HT(终浓度1mM)，Trytamine、D-Trp(终浓度40μM)。进行滚环扩增。
利用多功能酶标仪(Microplate Reader，Infinite M200,Tecan,USA)检测滚环扩增反应的荧光信号。实验温度为37℃，激发波长480nm，发射波长524nm。信号采集时间为20微秒，每60秒采集一次信号，检测时间为30分钟。
(4)数据分析：
RCA的荧光时间曲线的斜率作为滚环扩增效率RR，滚环扩增抑制率IRR＝RR0-RRTrp，空白对照(即不含色氨酸及类似物时)的RR为RR0，含有不同氨基酸及类似物的RR为RRaa。滚环扩增相对抑制率RIRR＝(RR0-RRaa)/(RR0-RRTrp)。(图5)。
实施例4
本发明定量测定LB培养液中的L-Trp(图6)。具体步骤如下：
(1)环形模板的制备：
配制10μl的连接反应体系缓冲液(50mM Tris pH 8.0、10mM MgCl2、5mM DTT和0.1mM ATP)，加入10pmol线性单链模板DNA“ON-CT”、10pmol线性单链引物DNA“ON-P”和175U T4DNA连接酶，16℃孵育1小时。DNA序列见表1。
(2)制备样品：
配制摩尔浓度为0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8mM的左旋色氨酸的LB溶液。
(3)滚环扩增检测：
配制100μl的聚合反应体系缓冲液(50mM Tris pH 7.5、10mM MgCl2、10mM(NH4)2SO4、4mM DTT、SYB Green II(1:10000)、3U phi29DNA聚合酶、0.5pmol连接反应产物和trpR2.5μM)，分别加入含有不同浓度L-Trp的LB溶液(终浓度0、1、2、4、6、8μM)进行滚环扩增。
用多功能酶标仪(Microplate Reader，Infinite M200,Tecan,USA)检测滚环扩增反应的荧光信号。实验温度为37℃，激发波长480nm，发射波长524nm。信号采集时间为20微秒，每60秒采集一次信号，检测时间为30分钟。
(4)数据分析：
RCA的荧光时间曲线的斜率作为滚环扩增效率RR，滚环扩增抑制率IRR＝RR0-RRTrp，空白对照(即不含色氨酸时)的RR为RR0，含有不同浓度色氨酸的RR为RRTrp。利用在不同浓度时滚环扩增抑制率IRR建立标准曲线。测量待测样品的IRR值，利用标准曲线推算出待测样品中的L-Trp浓度为0.59mM，与理论值0.6mM高度一致(图6)。
表1.实施例中所用DNA序列

Claims (6)

1.一种基于滚环扩增技术的检测左旋色氨酸的方法，其特征在于包括下述步骤：待检测的左旋色氨酸与色氨酸阻遏蛋白结合，结合了左旋色氨酸的色氨酸阻遏蛋白通过识别并结合由环形单链模板DNA与线性单链引物DNA形成的双链上的特异性识别序列，进而抑制DNA聚合酶对单链引物DNA的延伸和扩增，滚环扩增反应的抑制程度与左旋色氨酸的浓度成正比，通过制备左旋色氨酸浓度与滚环扩增抑制率的标准曲线，检测待测样品对滚环扩增的抑制率，从而确定出待测样品中的左旋色氨酸含量。
2.按照权利要求1所述的基于滚环扩增技术的检测左旋色氨酸的方法，其特征在于：所述的待检测的左旋色氨酸是配制的左旋色氨酸溶液，或是各种提取或制备的生物样本。
3.按照权利要求1所述的基于滚环扩增技术的检测左旋色氨酸的方法，其特征在于：所述的色氨酸阻遏蛋白是细菌中调控色氨酸操纵子表达的阻遏蛋白trpR，该蛋白能够特异性地结合左旋色氨酸，并发生构象变化，提高了结合色氨酸操纵子识别序列的亲和力。
4.按照权利要求1所述的基于滚环扩增技术的检测左旋色氨酸的方法，其特征在于：所述的环形单链模板DNA，是作为扩增模板用于滚环扩增的单链DNA，并含有色氨酸阻遏蛋白的识别序列。
5.按照权利要求1所述的基于滚环扩增技术的检测左旋色氨酸的方法，其特征在于：所述的线性单链引物DNA，是作为扩增引物用于滚环扩增的线性单链DNA，并含有色氨酸阻遏蛋白的识别序列，该线性单链引物DNA序列与环形单链模板DNA的序列碱基具有序列互补性。
6.按照权利要求1所述的基于滚环扩增技术的检测左旋色氨酸的方法，其特征在于：所述的DNA聚合酶是用于滚环扩增的DNA聚合酶，包括但不限于phi29 DNA聚合酶。
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